تقييم ضعف المحرك في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري

ملخص

يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة للتمييز بين خفيفة, معتدلة, وضعف الحركة الشديدة في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري, مع فائدة عامة لسلالات C. elegans , مع تغيير الحركة.

الملخص

يتميز التصلب الجانبي الضموري العصبي (ALS) بفقدان تدريجي للخلايا العصبية الحركية مصحوبا بضعف العضلات وضعف الحركة الذي يزداد سوءا مع مرور الوقت. في حين تم إحراز تقدم كبير في تحديد الدوافع الوراثية لمرض القاعدة في لوس لمجموعة فرعية من المرضى ، فإن غالبية الحالات لديها مسببات غير معروفة. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء خلل الخلايا العصبية الحركية وانحطاط ليست مفهومة جيدا. ولذلك، هناك حاجة مستمرة إلى تطوير وتوصيف نماذج تمثيلية لدراسة هذه العمليات. يمكن للكينورفهابيتيز elegans تكييف حركتهم مع القيود المادية لمحيطهم ، مع اثنين من نماذج الحركة الأولية التي تمت دراستها في بيئة مختبرية - الزحف على سطح صلب والسباحة في السائل. هذه تمثل تفاعل معقد بين الإحساس والخلايا العصبية الحركية والعضلات. C. elegans نماذج ALS يمكن أن تظهر ضعف في واحد أو كل من هذه النماذج الحركة. يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة لتقييم الحركة في C. elegans: فحص الحركة الشعاعية الأمثل قياس الزحف على سطح صلب وطريقة آلية لتتبع وتحليل السباحة في السائل (سحق). بالإضافة إلى توصيف الضعف الحركي الأساسي لنماذج ALS ، يمكن لهذه المقايسات الكشف عن قمع أو تعزيز الأنماط الظاهرية من التدخلات الجينية أو الصغيرة. وهكذا، هذه الأساليب لها فائدة لدراسة نماذج ALS وأي سلالة C. elegans أن المعارض تغيير الحركة.

المقدمة

التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو مرض عصبي موهن مرتبط بالشيخوخة له تأثير خاص على الخلايا العصبية الحركية. يتميز المرض بفقدان الخلايا العصبية الحركية في الدماغ والحبل الشوكي وضعف المحرك التدريجي. وهذا يؤدي إلى إعاقة وظيفية كبيرة والوفاة المبكرة، وعادة في غضون 3-5 سنوات بعد ^{التشخيص1}. الطفرات في ما لا يقل عن 38 الجينات يمكن أن يسبب ALS; ومع ذلك ، فإن معظم المرضى الذين يعانون من المرض تتراكم إدراجات في كل مكان من البروتين TDP - 43 وعلم الأمراض الأساسي في الخلايا العصبية والخلايا ^{الدبقية2،3،4}. وقد تم تطوير عدد من النماذج الحيوانية لدراسة الآليات الكامنة التي تسبب أو تساهم في المرض في الجسم الحي (استعرضت ^in5).10 في C. elegans، وتشمل هذه النماذج الطفرات الوراثية فقدان وظيفة في homologs من الجينات المسببة للأمراض القاعدة أو التعبير المعدل وراثيا من الجينات ALS الإنسان. هناك العديد من المزايا لنمذجة ALS في C. elegans. C. elegans هي بسيط قابل للسحب مع نظام عصبي متميز ، ونماذج سلوكية متميزة ، وولوجيا هوولوجيا جينية كبيرة ^{للبشر6،7}. توجد العديد من الأدوات للعمل مع C. elegans ، بما في ذلك قدرات تحرير الجينوم القوية ، في المراسلين الفلوريين في الجسم الحي من التنكس العصبي ، ونماذج فحص RNAi ، وعلم الوراثة القابل للسحب ، والمقايسات السلوكية والفينوتينية الراسخة. C. elegans نماذج من ALS تلخيص جوانب من الأمراض البشرية, بما في ذلك تراكم البروتين غير قابل للذوبان, تنكس الأعصاب, والموت ^{المبكر8,9}. علاوة على ذلك ، فإن الخلل الحركي الذي يتميز باضطراب في كل من سلوكيات الزحف والسباحة موجود في العديد من طرازات C. elegans ALS.

يصف هذا البروتوكول طريقتين لتوصيف الأنماط الظاهرية الحركية C. elegans : المقايسة الحركية الشعاعية لتقييم الزحف على سطح صلب وتقييم السباحة في السائل (سحق) باستخدام تتبع وورملاب الآلي والتحليل. هذه الأساليب الحساسة لوصف العجز الحركي تسمح بمقارنات الشدة وتوفر أدوات لقياس القمع والتحسينات في الأنماط الظاهرية الحركية. يحدد اختبار الحركة الشعاعية الاختلافات في الحركة الزاحفة (الحركة الجيوب الأنفية على سطح صلب) بين مجموعات الديدان. يستفيد هذا المقايسة من سلوك الاستكشاف الطبيعي غير المحفز C. elegans عن طريق وضع الديدان في موقع واحد على طبق ووضع علامة على موقعها النهائي بعد فترة زمنية ^معينة10. بدلا من ذلك ، السباحة في السائل (سحق) المقايسات عد الانحناءات الجسم من الديدان الفردية على مدى فترة محددة من الزمن. العد اليدوي للانحناءات الجسم بالعين البشرية هو الوقت المكثف وعادة ما يظهر تباين كبير بين المجربين. ويمكن أن يؤدي استخدام التتبع والتحليل الآلي بمساعدة الحاسوب إلى القضاء على الكثير من هذا التباين. بالإضافة إلى توصيف الضعف الحركي الأساسي لنماذج ALS ، يمكن لكل من الحركة الشعاعية ومقاايسات السباحة الكشف عن تعديل الأنماط الظاهرية الحركية المتميزة من التدخلات الجينية أو الصغيرة للجزيء. هذه الأساليب لها فائدة لدراسة نماذج ALS وأي سلالة C. elegans التي تعرض الحركة المتغيرة.

البروتوكول

1. فحص الحركة الشعاعية

1. إعداد 100 مم أو 150 مم قطرها أطباق بيتري حوالي نصف كامل من وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) وبذر مع حديقة موحدة من البكتيريا OP50 لتغطية كامل سطح أجار.
2. الوجه لوحات المقايسة NGM رأسا على عقب وتسمية الجزء السفلي مع معرف لسلالات C. elegans ليتم فحصها، 2 لوحات لكل سلالة (الشكل 1A).
3. جعل نقطة صغيرة مع علامة في وسط لوحة رأسا على عقب (الشكل 1A).
4. أثناء العمل مع مجهر تشريح ، نقل 15-20 نظمت الديدان ^matched11 إلى وسط لوحة المقايسة مباشرة على نقطة المركز (مرئية من خلال NGM) باستخدام اختيار البلاتين سلك (الشكل 1B).
   ملاحظة: حاول نقل كافة worms في نفس الوقت أو بأسرع وقت ممكن.
   1. تعيين جهاز توقيت لمدة 30 دقيقة بعد وضع الديدان في وسط لوحة. وضع الغطاء مرة أخرى على لوحة ووضعها جانبا (الشكل 1C).
5. استمر في نقل الديدان حتى تكون جميع السلالات على لوحات المقايسة المعينة ، مع تدوين ملاحظة حول المدة التي يستغرقها النقل بين اللوحات (الهدف هو ~ 1 دقيقة بين اللوحات). احتفظ بجميع اللوحات بنفس الترتيب الذي تم إعداده به.
6. بعد 30 دقيقة، تبدأ تسجيل أول لوحة.
   1. إزالة الغطاء ووضع وجه لوحة أسفل تحت المجهر تشريح، بحيث وصفت الجزء الخلفي من لوحة تواجه، وأجار NGM هو بين خط الأفق والديدان. لوحة سوف تكون رأسا على عقب من الاستخدام العادي.
   2. ضبط التركيز المجهر حتى الديدان مرئية من خلال أجار.
   3. باستخدام قلم تلميح شعر ملون مختلف من نقطة الوسط ، ضع نقطة صغيرة في موقع كل دودة - اتبع مسارات الدودة عبر العشب البكتيري للعثور على الحيوانات الأكثر ابتعادا.
   4. تحقق من حافة لوحة وبعض الديدان قد ينتهي هناك. أيضا، عد وتسجيل عدد الديدان في نقطة الوسط نقطة (الشكل 1D).
7. استمر في وضع علامة على جميع لوحات الفحص بالترتيب ، بحيث يكون لدى جميع اللوحات 30 دقيقة من وقت النشاط ، مع الحرص على حساب الوقت الذي استغرقه إعداد اللوحة. ثم قم بإجراء قياسات يدوية أو رقمية كما هو موضح في الخطوات 1.8 أو 1.9.
8. قم بإجراء قياسات يدوية باستخدام مسطرة.
   1. استخدم مسطرة لقياس في مم، والمسافة من نقطة الوسط إلى علامات الموقع النهائي لكل دودة وتسجيل المسافة. للمساعدة في تتبع التقدم أثناء التسجيل، قم بتسمية أول نقطة مسجلة بخط وسم صغير.
   2. سجل بيانات الطول لكل نقطة على التوالي عن طريق تدوير اللوحة بطريقة عقارب الساعة (الشكل 1E).
9. إجراء القياس الرقمي باستخدام الماسح الضوئي و ImageJ.
   1. باستخدام ماسح ضوئي مسطح، قم بمسح الجزء الخلفي من لوحة (لوحات) المقايسة بجوار المسطرة (الأرقام التي تواجه سطح المسح الضوئي) (الشكل 2A).
   2. افتح صورة اللوحة الممسوحة ضوئيا في ImageJ أو برنامج مشابه.
      ملاحظة: ImageJ هو برنامج معالجة الصور المجاني القائم على Java الذي تستضيفه المعاهد القومية للصحة.
   3. انقر على أداة الخط المستقيم ثم ارسم خطا يربط بين نقطتي الطول و 2 سم على الصورة الممسوحة ضوئيا للحاكم (الشكل 2B).
      ملاحظة: الضغط على مفتاح الكمبيوتر Shift سوف يفرض الخط إلى أقرب زاوية 45 درجة.
   4. انتقل إلى القائمة تحليل واستخدمه لتعيين المقياس (تحليل | تعيين مقياس) (الشكل 2C).
   5. أدخل المسافة المعروفة (10) ووحدات الطول (مم) في المربعات المناسبة، لا تقم بضبط المسافة في عدد وحدات البكسل. تحقق من Global لتطبيق نفس المقياس على جميع الصور التي يتم تحليلها في كل جلسة ImageJ؛ وإلا، قم بتعيين المقياس لكل صورة عند الفتح (الشكل 2D). انقر فوق موافق.
      ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 1.9.2-1.9.5 لتعيين مقياس القياس. ستقوم قياسات هذه الصورة الآن تلقائيا بربط طول الخطوط بالبكسل المحدد: علاقة الطول. الصور الممسوحة ضوئيا في 300 نقطة في البوصة سيكون لها علاقة تقريبية من 11.8 بكسل لكل ملم.
   6. استخدم أداة الرسام لوضع علامة أعلى النقطة الأولى التي سيتم تسجيلها.
      ملاحظة: هذا مؤشر مرئية الفيروس المتنقل الأول سجل.
   7. استخدم أداة الخط المستقيم لرسم خط من نقطة الوسط إلى نقطة بيانات الفيروس المتنقل الأول.
   8. انقر فوق المفتاح M على لوحة المفاتيح لقياس المسافة. بدلا من ذلك، انتقل إلى القائمة تحليل واختر قياس (تحليل | قياس). وفي كلتا الحالتين، سيظهر القياس في إطار جديد؛ هذه النافذة سوف تجمع كل القياسات لكل صورة.
   9. الحفاظ على نقطة الوسط ثابتة، قم بتحريك نهاية الخط لمس نقطة الدودة الأولى إلى نقطة دودة التالية، تتحرك في اتجاه عقارب الساعة، وانقر فوق المفتاح M لقياس.
   10. استمر في قياس كل نقطة بطريقة عقارب الساعة حتى يتم تسجيل جميع النقاط.
   11. نسخ ولصق بيانات قياس الطول في جدول بيانات لحفظها. ثم كرر العملية لكل صورة لوحة ممسوحة ضوئيا.
       ملاحظة: الخطوات 1.9.6 - 1.9.11 قياس قيم إزاحة الفيروس المتنقل (الشكل 2E-F).
10. إجراء التحليل الإحصائي.
    1. الجمع بين النسخ المتماثلة داخل تجربة واحدة بحيث يكون العدد الإجمالي المسجل بين 30-40 دودة.
    2. إجراء نسخ تجريبية مستقلة في أيام مختلفة ومع مجموعات مستقلة من الديدان في نهاية المطاف مع 3 تكرارات تجريبية مستقلة.
    3. تحليل البيانات باستخدام التحليلات الإحصائية المناسبة مثل اختبار الطالب t لسلالتين أو ANOVA ذات الاتجاه واحد لثلاث سلالات أو أكثر.

2. الكمبيوتر تحليلها السباحة المقايسة

ملاحظة: يحتوي هذا البروتوكول على إرشادات تفصيلية لنظام البرامج والأجهزة WormLab المتوفرة تجاريا (راجع جدول المواد). ومع ذلك، يمكن تطبيق سير العمل على أنظمة الفحص الأخرى التي تم تحليلها بواسطة الكمبيوتر.

1. إعداد وتسجيل مقاطع الفيديو.
2. رفع التدريع على أجهزة التصوير (الشكل 3) والتحقق من أن ارتفاع الكاميرا يتم تعيينه إلى الموقع المتوقع.
   ملاحظة: الارتفاع الأمثل لالتقاط الديدان على لوحة 35 ملم هو من هذا القبيل أن الثالث من أسفل المسمار مترابطة تتحمل مرئية تحت قوس تركيب الكاميرا قابل للتعديل، ولكن لا ينظر إلى ثقب تصاعد إضافية فوق المسمار تتحمل (حوالي 30.5 سم فوق المرحلة) (الشكل 3C). سيؤدي ذلك إلى نسبة التقاط 11.43 ميكرومتر/بكسل. النظر في إضافة مؤشر "الارتفاع الصحيح" بحيث يكون من الأسهل تأكيد ذلك قبل بدء الفحص. راجع البروتوكول الخطوة 2.18 لحساب تسويات الارتفاع.
3. افتح البرنامج المقترن (الشكل التكميلي 1A).
4. انقر فوق رمز التقاط الفيديو (فيلم مع مثلث يشير إلى اليمين في الوسط) لفتح نافذة التقاط فيديو جديدة. ستكون الكاميرا في Live View ، ولكن الشاشة ستكون سوداء (الشكل التكميلي 1B).
5. اضغط لأسفل على مقبض باهتة وتحويلها في اتجاه عقارب الساعة لضبط الضوء.
   ملاحظة: مقبض باهتة على مرحلة نظام التصوير بالقرب من مصدر الضوء حقل مشرق. سيتم تشغيل عرض العرض المباشر للقطة الفيديو من الأسود إلى الإضاءة.
6. مرة أخرى في إطار التقاط الفيديو ، انقر على علامة التبويب إعدادات ، وضبط على النحو التالي: وضع الفيديو: 2456 × 2052_Mono8، معدل الإطار: 14، الإخراج: أحادية اللون، التعرض: 0.00300 ق، كسب: 1 ديسيبل، غاما: 1، تدوير 180 (تحقق على).
7. العودة إلى علامة التبويب التقاط . حدد مجلد التسجيل (الشكل التكميلي 1B).
   ملاحظة: هذا حيث سيتم تخزين كافة التسجيلات وملفات المشروع. إنشاء مجلدات فريدة للتجارب الفردية للحفاظ على تنظيم البيانات.
8. تعيين اسم ملف عن طريق إدخاله في مربع النص بادئة الملف .
   ملاحظة: سيقوم البرنامج تلقائيا بإلحاق رقم تقدمي بنهاية البادئة بالتنسيق "0001". من المستحسن أن يكون لديك نظام تسمية متناسقة للملفات مثل: "YYYYMMDD_treatmentName_rep#_".
9. تعيين إعدادات التقاط أخرى كما يلي: المخزن المؤقت: 128 الإطارات (افتراضي)، المدة (تحقق على): 00 h:01min:00 s. تجاهل الإعدادات الأخرى أو إيقاف تشغيلها في علامة التبويب هذه.
10. ضع لوحة المقايسة، وغطها، على مرحلة الجهاز، وتمركزها في شاشة التقاط الفيديو ؛ إزالة الغطاء.
    ملاحظة: إعداد لوحات المقايسة مسبقا. تتكون كل طبق من طبق بيتري عيار 35 ملم نصفه تقريبا مليء ب NGM غير المصنف (بدون حديقة بكتيرية).
11. استخدام micropipette لغسل المرحلة ^{متزامنة11} الديدان في 1 مل من M9 على لوحة المقايسة - تهدف إلى حوالي 50 الديدان (الشكل 3D). دوامة بلطف لوحة لجلب الحيوانات إلى المركز أو استخدام micropipette لإضافة بضع قطرات من M9 لفصل الحيوانات (الشكل 3E). تعيين جهاز توقيت لمدة 60 ثانية للسماح للديدان للتأقلم مع السباحة.
    ملاحظة: لن تكون اللوحة مرئية 100٪ على الشاشة. لا يتم تتبع الحيوانات بدقة أثناء تداخلها.
12. أثناء العد التنازلي للمؤقت، قم بضبط تركيز الكاميرا يدويا عن طريق تحويل حلقة التركيز على جسم العدسة للكاميرا أثناء مشاهدة الشاشة (الشكل 3F). فمن الممكن لتكبير على الديدان باستخدام الماوس عجلة التمرير مما يسمح للتركيز أكثر دقة.
13. بعد ضبط التركيز، قم بضبط مقبض الضوء بحيث تكون الشاشة مشرقة قدر الإمكان دون التعرض المفرط (تظهر كوحدات بكسل حمراء على الشاشة).
14. بعد 60 s، اضغط على الزر تسجيل .
    ملاحظة: سيتم الانتقال الفيديو من عرض Live إلى تسجيل وسيكون جهاز ضبط وقت مرئية. عند اكتمال الالتقاط، سوف تعود شاشة التقاط الفيديو إلى طريقة العرض المباشرة (الشكل التكميلي 1B).
15. إزالة لوحة بعد تسجيل وإعداد لوحة المقبل. إعادة تسمية البادئة حسب الحاجة. غسل الديدان في لوحة المقايسة، واحتضان لمدة 60 ق، وتسجيل كل علاج.
16. بعد إكمال جميع التسجيلات لتجربة، أغلق أي علامات تبويب فيديو مفتوحة، ثم قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء عن طريق إيقاف تشغيل مقبض الباب الباهت.
17. أغلق نافذة التقاط الفيديو بالنقر فوق الزر x الأحمر في الزاوية اليمنى العليا للنافذة؛ بدلا من ذلك، أغلق حزمة البرامج بأكملها ثم أعد فتح.
18. إعداد مقاطع الفيديو للتتبع.
19. من القائمة الشريط الجانبي سير العمل ، حدد الزر الأول في هذه القائمة، استيراد تسلسل الصورة، والعثور على وانقر نقرا مزدوجا على الفيديو. سيتم فتح الفيديو في النافذة الوسطى (الشكل التكميلي 2A).
    ملاحظة: العرض الافتراضي للبرنامج هو القائمة الشريط الجانبي سير العمل ; يمكن الوصول إلى هذه القائمة أيضا من خلال القائمة المنسدلة العلوية للعرض أسفل عرض [عرض | سير العمل]. تحتوي قائمة سير العمل على عدة خيارات للعرض؛ طريقة عرض المسار مناسبة عند هذه النقطة في البروتوكول. إذا كان الزر تعيين معلومات تسلسل غير مرئية في القائمة، ثم هذا ليس طريقة العرض الصحيحة. أولا، انظر إلى أسفل القائمة وتحقق من أن علامة التبويب سير العمل نشطة، ثم تحقق من أن طريقة عرض المسار نشطة بالنقر على أيقونة المسار . حيث تظهر القوائم في الإطار يعتمد على حجم جهاز العرض وموقع القوائم المفتوحة الأخرى. يمكن نقل القوائم عن طريق السحب والإفلات، والتصغير، والإغلق. يمكن أيضا فتح معظم القوائم من خلال القائمة المنسدلة عرض .
20. من قائمة سير العمل، حدد تعيين معلومات التسلسل (الشكل التكميلي 2B). في إطار القائمة الجديدة، تحقق من نظام التسمية، وأضف ملاحظات، وتحقق من صحة بيانات التعريف.
21. تحقق من تعيين التحجيم بشكل صحيح; مقياس: 11.43 ميكرومتر/بكسل ومقياس سيتم تعبئة السيارات كما 1000 ميكرومتر هو 87 بكسل. إذا تم تعديل ارتفاع الكاميرا بشكل مختلف عن المنصوص عليه هنا، اتبع التعليمات الواردة في هذه القائمة لتحديث المقياس. انقر فوق الزر حفظ .
22. في قائمة سير العمل، حدد ضبط الصورة، وستفتح قائمة منبثقة جديدة تسمى تعديلات الصورة (الشكل التكميلي 2C). حدد الديدان الداكنة على خلفية الضوء (حقل ساطع).
23. ضبط إعدادات إضافية. إعدادات معالجة الصور الموصى بها هي كما يلي: تنعيم الخلفية: 10، تنعيم الغاوسية: 5، ثقوب التعبئة: 2، تصفية كائن صغير: 0، وتخطي تجزئة المشتقة المتكاملة.
24. ضبط مستوى عتبة بحيث تمتلئ تماما الحيوانات مع الأخضر ولكن لا تزال متميزة عن الخلفية. انقر فوق تطبيق.
    ملاحظة: يجوز التقاط بعض الكائنات التي ليست ديدان.
25. من قائمة سير العمل ، حدد الكشف والتعقب (الشكل التكميلي 2D).
    ملاحظة: ستظهر قائمة على جانب الفيديو مع علامات التبويب 3: الكشف عن تعقب وإصلاح. سيبدو المؤشر وكأنه إصبع يشير عند عرض الفيديو. بدلا من ذلك، انقر فوق تحديد الرمز (سهم المؤشر) في قائمة الرمز في أعلى يسار البرنامج.
    1. استخدم أداة تحديد الإصبع لتحديد 3-7 ديدان وانقر فوق الزر الكشف عن الفيروسات المتنقلة في علامة التبويب الكشف .
       ملاحظة: يساعد هذا التحديد البرنامج بدقة تحديد worms الشروط معينة ويجب أن يتم لكل فيديو. بعد بضع ثوان ، سيتم تسليط الضوء على معظم الديدان باللون الأخضر ولها عدد باللون الأصفر. الديدان التي لمس أو كرة لولبية حتى من المرجح أن لا يكون أبرز; ومع ذلك، فإن البرنامج على الأرجح العثور عليها أثناء التتبع. هناك خيار لضبط معلمات الكشف؛ ومع ذلك، الافتراضات تعمل بشكل جيد في معظم الشروط. إذا تم إجراء تعديلات على معلمات الكشف، تأكد من أن تكون متناسقة بين العينات و replicates.
26. لا يزال في إطار الكشف عن وتتبع ، انتقل إلى علامة التبويب تعقب (الشكل التكميلي 2E). في الاختيار تتبع المعلمات استخدام التراجع، قم بإلغاء تحديد المسار المتنقلة على حافة الصورة.
27. تعيين فرضية ماكس تتبع إلى 5. تعيين وضع التتبع إلى السباحة.
    ملاحظة: إعداد فرضية ماكس تعقب يضبط عدد المحتملة الفيروس المتنقل المسارات دودة متعقبة واحدة يسمح أن يكون ويعطي البرنامج بعض فسحة في كيفية بدقة لتعقب دودة واحدة دون فقدان المسار منه. 5 هو إعداد جيد للسباحة.
28. الانتقال إلى قسم الإعدادات المتقدمة وتعيين ما يلي: يمكن أن تلمس الديدان الإطارات الحدود: 50، يمكن أن تتداخل الديدان الإطارات: 500، التسامح الموقف: 0.50، التسامح الشكل: 0.50. احفظ هذه الإعدادات ونشرها لجميع مقاطع الفيديو في تجربة (وما بعدها) عن طريق حفظها كتشكيل.
    ملاحظة: لا ينصح تصفية المسار ويمكن بسهولة القيام به بعد المعالجة، وترك قبالة.
29. انتقل إلى إدارة التكوين (رمز الترس) في قائمة الأيقونة العلوية اليمنى. عند النقر فوق، سيتم فتح القائمة الشريط الجانبي إدارة التكوين . بعد ذلك، انقر فوق رمز حفظ (الترس +) ، وإعطاء هذا التكوين اسما ووصفا ، ثم انقر فوق الزر موافق .
    1. للوصول إلى هذا التكوين في المستقبل، افتح قائمة التكوين ، وحدد التكوين المطلوب، وانقر فوق رمز تحميل (توجيه السهم لأعلى). ثم أضف معلومات التسلسل، وربما ضبط مستوى العتبة، وحدد الفيروسات المتنقلة للكشف عنها. ستكون كافة الإعدادات الأخرى هي نفسها.
30. في القائمة سير العمل ، انقر فوق حفظ المشروع، تحقق من حفظ الموقع وإضافة اسم ملف مشروع (مطابقة اسم ملف المشروع إلى اسم الفيديو يساعد على الاستمرارية). أغلق الفيديو.
    ملاحظة: يتم حفظ هذه المشاريع مع نوع الملف .wpr.
31. تكرار لكافة مقاطع الفيديو: استيراد تسلسل الصور (2.18)، تحميل التكوين المحفوظ (2.28.1)، ضبط العتبة (2.23)، تعيين معلومات التسلسل (2.19)، الكشف عن الديدان (2.24.1)، حفظ المشروع (2.29)، إغلاق الفيديو.
32. تتبع مقاطع الفيديو
    1. لتعقب ملفات المشروع، انتقل إلى قائمة سير العمل وانقر فوق الرمز دفعة (مجلد يحتوي على صفحات الفيروس المتنقل) (الشكل التكميلي 2F).
       ملاحظة: سيتم عرض لوحة معالجة الدفعات (الشكل التكميلي 2G). أحيانا يكون مخفيا ولكن يمكن الوصول إليه في أسفل القائمة سير العمل الدفعي ؛ قد تحتاج النافذة إلى توسيع لرؤيتها.
    2. انقر فوق الزر إضافة ضمن المقطع تحديد ملف من هذه القائمة معالجة الدفعات . انتقل إلى وحدد كافة ملفات المشروع (.wpr) المراد معالجتها، انقر فوق فتح.
       ملاحظة: سيتم تعبئة القائمة معالجة الدفعات مع مسار الملف المحدد مؤشر حالة وشريط تقدم رمادي لكل ملف.
    3. انقر فوق رمز البدء (زر التشغيل). لاحظ مؤشر التقدم الأخضر في الملف الأول. السماح بمعالجة كافة الملفات. عندما تقرأ جميع الملفات كما انتهت (الأخضر)، يمكن إغلاق البرنامج (الشكل التكميلي 2G).
    4. إذا كان ملف مشروع يحصل عالقا، خذ بعين الاعتبار تشغيل ملف المعلقة من تلقاء نفسه، هذا عادة ما يحل المشكلة. إذا لم يعمل هذا على حل المشكلة، افتح ملف المشروع، واحذف الديدان المحددة (القائمة الكشف عن المسار)، ثم أعد التحديد من مجموعة تدريب جديدة. ثم إعادة معالجة ملف المشروع.
33. إصلاح المسارات (مستحسن)
    ملاحظة: إصلاح المسارات يمكن أن تزيد من دقة المسارات. الإصلاحات الشائعة هي الجمع بين المسارات التي تنتمي بوضوح إلى نفس الدودة كما ينظر إليها من قبل العين البشرية كما، وحذف المسارات التي ليست دقيقة أو لا التقاط بيانات دودة حقيقية، وتقسيم المسارات التي يتم تحريف لأن الديدان لمس (إزالة المقطع سيئة والجمع بين المسارات من قبل وبعد القسم الفقراء إذا كان عمليا).
    1. افتح البرنامج وافتح ملف مشروع [ملف | فتح المشروع] من الفائدة. انقر فوق فتح وانقر فوق نعم لاستخدام هذا الملف. انتظر حتى يتم تحميل عامل التصفية الزمني. سيتم عرض الفيديو المعالج على الشاشة؛ وسيتم تسليط الضوء على الديدان باللون الأخضر والمحددة باللون الأصفر. استخدم مشغل الفيديو لتصفح الفيديو أو تشغيله.
    2. من قائمة سير العمل ، حدد الكشف والتعقب (الشكل التكميلي 2D). التبديل إلى علامة التبويب إصلاح . تنشيط المؤشر محدد بالنقر فوق رمز أداة محدد (السهم المؤشر). فرك من خلال الفيديو، وإيجاد واختيار مسار دودة، ومن ثم استخدام قائمة الإصلاح لإنشاء التغيير المطلوب.
       ملاحظة: لإصلاح معظم المشاكل بشكل استراتيجي بسرعة، قم بتكبير اللوحة بحيث يكون حوالي 1/^6th من اللوحة مرئيا، ابدأ بالمنطقة المحيطة بالمسار رقم 1. فرك بسرعة من خلال التحقق من الفيديو للديدان التي تظهر في ظروف غامضة من العدم، والمسارات حيث تتغير الأرقام، أو الديدان تصطدم بعضها البعض، والتحرير كما تنشأ مشاكل. اتبع الديدان في الترتيب العددي من موضع البداية. فرك ذهابا وإيابا لمتابعة كل دودة حسب الضرورة حتى يتم إصلاح لوحة كاملة. إيلاء اهتمام دقيق ل حواف لوحة. في كثير من الأحيان ، تظهر الديدان المزيفة في ظلال حواف اللوحة.
34. تحليل البيانات
    1. من القائمة سير العمل ، حدد تحليل البيانات (الشكل التكميلي 3A).
       ملاحظة: ستظهر نافذة جديدة تسمى تحليل البيانات و رسم (الشكل التكميلي 3B). تحتوي هذه النافذة على طرق عديدة لتقييم وعرض بيانات الحركة الخاصة بمجموعة الفيروسات المتنقلة لملف مشروع محدد. تسمح معظم هذه التحليلات باختيار ديدان محددة أو متعددة أو جميعها من مقطع فيديو معين مما يسمح برسم معلومات المسار بطرق مختلفة.
    2. لتحليل عدد الدرات، انتقل إلى ملخص المسار [الموضع والسرعة | موجز المسار] (الشكل التكميلي 3C). استخدم زر التصدير في أسفل اليمين لتصدير البيانات بتنسيق جدول بيانات قابل للقراءة (.csv)، واختر مسارا إلى الموقع المطلوب لجدول البيانات، بما في ذلك إعادة تسميته إلى شيء لا ينسى. الإعدادات الافتراضية هي خيار جيد (الشكل التكميلي 3D).
    3. الصق هذه البيانات، بالإضافة إلى أي مجموعات بيانات مشروع أخرى ذات صلة في مصنف جدول بيانات موحد (الشكل التكميلي 3E).
    4. استخدم "عدد المنعطفات" و"مدة المسار" لحساب المنعطفات لكل دقيقة لكل مسار باستخدام وظائف جدول البيانات (=المنعطفات/المسار المدة * 60) أو استخدم مقياسا مختلفا كما هو مطلوب (الشكل التكميلي 3F).
       ملاحظة: يقوم المنعطفات في الدقيقة بالتقاط معلومات مشابهة جدا كمقايسة سحق يدوية وهو مقياس مستخدم على نطاق واسع للنشاط في السائل ، ولكن هناك العديد من الخيارات ، ومن الممكن تماما أن يحدد مقياس مختلف بيانات أخرى مثيرة للاهتمام لعلاج معين أو مقارنة.
    5. إذا رغبت في ذلك، شاشة لحجم الفيروس المتنقل، ومدة المسار، و / أو بعض المقاييس الأخرى المختارة باستخدام أدوات التنسيق الشرطي لتسليط الضوء على المسارات لإزالة إذا كانت يحتمل أن تكون محيرة. الحفاظ على معالجة البيانات المتسقة بين العلاجات والتكرار.
    6. تحليل البيانات باستخدام التحليلات الإحصائية المناسبة مثل اختبار الطالب t لسلالتين، أو ANOVA ذات الاتجاه واحد ل 3 سلالات أو أكثر. إجراء نسخ تجريبية مستقلة في أيام مختلفة ومع مجموعات مستقلة من الديدان لما لا يقل عن 3 تكرارات تجريبية مستقلة.

النتائج

توفر كل من الحركة الشعاعية ومقاايسات السباحة كشفا حساسا لضعف الحركة (الشكل 4 والشكل 5). للتحقيق في الآليات الكامنة وراء TDP-43 المرضية في ALS، وقد وضعت نماذج C. elegans التي تعبر عن البرية من نوع أو ALS-متحولة الإنسان TDP-43 عموم الخلايا العصبية. تعرض هذه الحيوانات خصائص جزيئية وخليوية تذكرنا ب ALS ، بما في ذلك الخلل ^{الحركي9}. الأهم من ذلك، أنها تظهر ضعف الحركة المعتدلة مع التعبير عن نوع البرية TDP-43 الإنسان وضعف الحركة أكثر حدة في الحيوانات التي تعبر عن ALS-متحولة TDP-43 باستخدام كل من الحركة الشعاعية ومقاايسات السباحة. بعض الحيوانات المتحولة أو المعدلة وراثيا سيكون لها ضعف أكبر في الزحف من السباحة، أو العكس بالعكس. باستخدام اثنين من المقايسات حركية مختلفة، يتم الحصول على صورة أوضح من الاختلافات الظاهري بين السلالات.

الحركة الشعاعية
عند وضعها على طبق أغار بذر، C. elegans استكشاف محيطهم، بما في ذلك البحث عن حدود مصدر غذائهم. تعتبر فحوصات الحركة الشعاعية إحدى الطرق للاستفادة من هذا السلوك كمقياس للياقة البدنية. من خلال تحليل السلوك الحركي (الزحف على سطح صلب) بطريقة خاضعة للرقابة وقابلة للقياس الكمي ، يقدم المقايسة الحركية الشعاعية أداة بسيطة وفعالة لتقييم شدة العجز الحركي والأنماط الظاهرية الأخرى ذات الصلة بالمحرك. تلتقط مقايسات الحركة الشعاعية الاختلافات في الحركة في الديدان النموذجية ALS المعتدلة أو شديدة التأثر وتقدم خط أساس لمقارنة تعديل الأنماط الظاهرية للحركة أو التغيرات في الحركة مع التقدم في العمر (الشكل 6). يمكن تطبيق هذه الاستراتيجية لتحديد سلوك الزحف لأي سلالة غيرت الحركة من النوع البري (N2) أو السيطرة على الديدان. ومع ذلك، قد لا تكون هذه الطريقة خيارا جيدا لتقييم الحيوانات غير القادرة على الزحف بشكل طبيعي، مثل المسوخ الدوارة أو الحيوانات المصابة بالشلل. وعادة ما تمثل الديدان البرية متوسط نزوح يتراوح بين 200-300 ميكرومتر/دقيقة عند رفعها واختبارها عند 20 درجة مئوية. وتظهر بيانات المثال المعروضة في الشكل 4 النتائج المتوقعة التي تقارن N2، وهما نوعان مختلفان من السلالات المعدلة وراثيا يعبران عن نوع TDP-43 البشري البري النمط الظاهري المعتدل [TDP-43 (WT-mild)، CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43؛ Pmyo-3::GFP])) أو النمط الظاهري الأقوى [TDP-43 (WT-معتدل)، CK410 (bkIs402 [Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]، سلالة معدلة وراثيا تعبر عن TDP-43 البشري المتحول مع النمط الظاهري الشديد [TDP-43 (M337V)، CK423 (bkIs423 [Psnb-1:TDP-43؛ Pmyo-2::GFP])، وسلالة معدلة وراثيا تعبر عن بروتين آخر مرتبط بالأمراض العصبية، تاو الإنسان البري [تاو (WT)، CK144 (bkIs144 [Paex-3::tau(4R1N)؛ Pmyo-2::GFP])]. ولدينا نوعان من السلالات التي تعبر عن TDP-43 البرية درجات مختلفة من الضعف كما تم اكتشافها عن طريق الحركة الشعاعية. TDP-43 (WT-low) لا يختلف كثيرا عن N2، بينما TDP-43 (WT-high) لا تظهر اختلافات واضحة في الحركة. TDP-43 (M337V) وتاو (WT) سلالات لديها ضعف أكثر حدة في الحركة.

فحص السباحة
C. elegans الانخراط في السباحة النمطية (سحق) الحركة عندما مغمورة في السائل. فور الغمر ، تبدأ الديدان في ثني الرأس والذيل بشكل مميز نحو بعضها البعض بزاوية منعطف تبلغ حوالي 45 درجة ، مع كون قمة الزاوية هي نقطة الوسط للدودة. الديدان الانحناء البديل في الاتجاهات البطنية والدر الظهرية. يمثل الضربة الواحدة، كما تقاس بالبرنامج، حركة الانتقال من زاوية منحنى الجسم مباشرة إلى زاوية 20 درجة أو أكثر، بغض النظر عن الاتجاه (يمكن تعديل عتبة الزاوية بعد المعالجة داخل إطار التحليل والتآمر [سير العمل | تحليل | البيانات | شكل الجسم الانحناء زاوية | | منتصف النقطة عتبة السعة: # درجات]. يستخدم فحص السباحة الموصوف هنا التتبع والتحليل الآلي القائم على الكمبيوتر لتوفير تسجيل غير متحيز لنشاط السباحة. ومن المتوقع أن يتراوح متوسط الديدان البرية من النوع (N2) بين 150-200 ثراش في الدقيقة عند رفعها وتسجيلها عند 20 درجة مئوية. وتظهر البيانات الواردة في الشكل 5، على سبيل المثال، النتائج المتوقعة التي تقارن N2، وهما نوعان مختلفان من السلالات المعدلة وراثيا يعبران عن نوع البرية TDP-43 البشرية ذات النمط الظاهري المعتدل [TDP-43 (WT-mild)، CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43؛ Pmyo-3::GFP])) أو النمط الظاهري الأقوى [TDP-43 (WT-معتدل)، CK410 (bkIs402 [Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]، وسلالة معدلة وراثيا تعبر عن بروتين آخر مرتبط بالأمراض العصبية، تاو الإنسان البري [تاو (WT)، CK144 (bkIs144 [Paex-3::tau(4R1N)؛ Pmyo-2::GFP])]. سلالة المعدلة وراثيا التعبير عن ALS-متحولة TDP-43 [TDP-43 (M337V)] لا سحق في السائل، وذلك هو المشار إليها على الرسم البياني كما ND (أي بيانات). يمكن أن يميز هذا المقايسة بين الأنماط الظاهرية المختلفة عن المقايسة الحركية الشعاعية الموضحة في الشكل 4. على سبيل المثال، في المقايسة الحركة شعاعي (الشكل 4)، TDP-43 (WT-low) لم يكن مختلفا بشكل كبير عن N2. ومع ذلك، في الفحص السباحة (الشكل 5)، كل من TDP-43 (WT-low) وTDP-43 (WT-high) تختلف اختلافا كبيرا عن N2، وكذلك تختلف اختلافا كبيرا عن بعضها البعض. أيضا ، على الرغم من كل من TDP - 43 (M337V) وتاو (WT) وجود إعاقات الزحف الشديد عن طريق الحركة الشعاعية (الشكل 4) ، تاو فقط (WT) قادرة على سحق ما يكفي لتعقبها من قبل البرنامج (الشكل 5). الحيوانات TDP-43 (M337V) غير قادرة على سحق، والتحليل القائم على البرمجيات لا يكشف أو تتبع هذه الديدان بدقة. وهكذا، لم يتم جمع البيانات عن هذه الديدان (ND، لا توجد بيانات).

الشكل 1: سير عمل فحص الحركة الشعاعية. لوحات A-E تظهر الخطوات المعممة من المقايسة الحركة الشعاعية. الخطوات هي على النحو التالي: (أ) لوحات NGM، مع OP50 المصنف إلى الحواف، يتم إعدادها عن طريق وضع العلامات ووضع علامات نقطة مركزية، (B) يتم وضع الديدان في وسط أغار كما تميزت النقطة المركزية، (C) يسمح الديدان للتحرك بحرية لفترة محددة من الزمن، (D) لوحة انقلبت أسفل إلى أعلى ويتم وضع علامة على الموقع النهائي لكل دودة في لون مختلف عن النقطة المركزية، (ه) المسافة من النقطة الوسطى إلى كل موقع دودة نهائية تقاس إما باليد أو رقميا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: القياس الرقمي للموقع النهائي باستخدام ImageJ.  يمكن قياس المسافة من قياسات المركز باليد أو رقميا ، لقياس رقميا باستخدام ImageJ (A) مسح المؤخر من لوحة مع مسطرة في الإطار. (ب) رسم طول معروف باستخدام أداة الخط. (ج) استخدم الطول المعروف المرسوم في (ب) لتعيين المقياس [تحليل | تعيين مقياس...]. (D) استخدم أداة الخط لرسم خط من نقطة الوسط إلى علامة الموقع النهائية، كرر لكل علامة. (ه) خط فرشاة الطلاء بمناسبة علامة الأولى قياس الإيدز في التهديف (خط أسود متعرج بالقرب من علامة 1). يتم ترقيم علامات الموقع النهائي باللون الأصفر لتوضيح اتجاه التهديف. (F) يتم تسجيل القياسات في إطار النتائج. حفظ النتائج في مكان آخر للتحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: المواد وتعديلات الأجهزة لاستخدام البرنامج. (أ) المواد المستخدمة في فحص السباحة بمساعدة البرامج. (ب) إعداد عام للبرمجيات والمواد اللازمة، لاحظ أن السكن في وضع مرتفع. (ج) يمكن تعديل ارتفاع قوس تصاعد العدسة. تظهر هذه الصورة المسار القابل للتعديل ومؤشر الشريط الذي يشير إلى الارتفاع المفضل لإجراء فحوصات السباحة. من الضروري ضبط الضوء الساطع وتركيز الكاميرا قبل التسجيل. (د) توضع لوحة مقايسة مقاس 35 ملم على المسرح، وتضاف الحيوانات الموجودة في M9 إلى اللوحة، ويبدأ جهاز توقيت طوله دقيقة واحدة. (ه) من المفيد في بعض الأحيان أن تدور بلطف لوحة لنقل الديدان أقرب إلى المركز - مراقبة الموقع على شاشة التقاط العيش؛ بدلا من ذلك ، يمكن استخدام بضع قطرات من M9 من ماصة لفصل الديدان. (F) ضبط حلقة التركيز على عدسة الكاميرا، ومراقبة الديدان على الشاشة لتحديد التركيز الأمثل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تكشف فحوصات الحركة الشعاعية عن الاختلافات في سرعة الزحف. تم قياس التشتت غير المحفز ليرقات L4 المرحلة تنمويا باستخدام مقايسة الحركة الشعاعية الموصوفة أعلاه والمكتسحة على أنها μm/min مسافرة (A-B). نفس البيانات المرسومة في (أ) و (ب) توضح عرضين رسوميين مختلفين محتملين. في (A)، يتم عرض البيانات كرسم بياني شريطي، مما يجعل الاختلافات النسبية بين السلالات أكثر وضوحا. في (ب)، يتم تبسيط الإزاحة النهائية لكل دودة داخل الرسم البياني، مما يسمح بتصور التباين داخل السكان بشكل أفضل. لتقييم الأهمية بين السلالات التي تم اختبارها، تم استخدام تحليل التباين في اتجاه واحد (ANOVA) مع اختبار المقارنة المتعدد ل Tukey. **p=0.0022, ****p<0.0001, ns=غير مهم. TDP-43 (M337V) وتاو (WT) هي أيضا مختلفة اختلافا كبيرا عن N2, p<0.0001. أشرطة الخطأ في (أ) هي خطأ قياسي في الوسط (SEM) وفي (B) هي الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تكشف فحوصات السباحة عن اختلافات في الضرب في السائل. تم قياس معدلات السباحة (تردد الضرب أو التموج في السائل) باستخدام تسجيل وتحليل غير متحيز بمساعدة الكمبيوتر موضح أعلاه ومكذب كضربات / دقيقة (A-B). نفس البيانات المرسومة في (أ) و (ب). في (A)، يتم رسم البيانات كرسم بياني شريطي، مما يجعل الاختلافات النسبية بين السلالات أسهل في الرؤية. في (ب)، يتم رسم البيانات من كل دودة فردية تم تسجيلها داخل الرسم البياني، مما يسمح بتصور التباين داخل السكان بشكل أفضل. لتقييم الأهمية بين السلالات التي تم اختبارها، تم استخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) مع اختبار المقارنة المتعدد ل Tukey. p<0.0001، ns=غير هام. TDP-43 (WT-معتدل) و tau(WT) هي أيضا مختلفة بشكل كبير عن N2، p<0.0001.Error أشرطة في (A) هي خطأ قياسي من المتوسط (SEM) وفي (ب) الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تنتقل الديدان المتحولة TDP-43 أقل من الديدان البرية. لوحات تبين الفرق التمثيلي في الموقع النهائي لل L4 N2 (من النوع البري) و TDP-43 (M337V) (CK423 (bkIs423 [Psnb-1::TDP-43؛ Pmyo-2::GFP]) ، وهي سلالة تعبر عن TDP-43 البشري المتحول مع ضعف شديد في الوظائف الحركية بعد ساعة واحدة من الزحف غير المحفز في درجة حرارة الغرفة. يتم وضع علامة لوحات مع نقطة حمراء للنقطة الوسطى والنقاط الزرقاء للموقع النهائي للحيوانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تسجيل سلوك السباحة باستخدام برنامج التصوير والتتبع. (أ) سير عمل التتبع وموقع رمز التقاط الفيديو. (ب) يتم عرض نافذة التقاط الفيديو في Live View، ويتم تمييز أهم الجوانب. سيتم تغيير الكلمات الخضراء "عرض مباشر" إلى "تسجيل" أحمر عند تنشيط زر التسجيل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: إعداد وتتبع سلوك السباحة. يظهر هذا الشكل سلسلة من لقطات الشاشة للمساعدة في إعداد تسلسل صور الفيديو للتتبع. البروتوكول العام لإعداد تسلسل الفيديو هو فتح كل قائمة سير العمل في هذا الترتيب: استيراد تسلسل الصور | تعيين | معلومات التسلسل ضبط | الصور الكشف عن | وتتبعها حفظ المشروع. يمكن استخدام إطار تحليل البيانات فقط بعد تعقب ملف مشروع. (أ) يظهر ملف .avi (فيديو) مفتوح بعد استيراد التسلسل إلى البرنامج من داخل سير عمل المسار . (ب) توفر نافذة معلومات التسلسل مجموعة مكانا للملاحظات، وتعيين/ تغيير المقياس، والتحقق من البيانات الوصفية لتسلسل الفيديو. توجد إرشادات لتغيير المقياس في هذه النافذة ويجب اتباعها عند خفض الكاميرا أو رفعها (B). تعرض الصورة (C) إعدادات إطار ضبط الصورة . (D) لقطة شاشة تظهر علامة التبويب الكشف من نافذة الكشف والتعقب . يتم استخدام الكشف عن الديدان لتدريب البرنامج ويجب تعيينها لكل تسلسل فيديو. يمكن تعيين معلمات كشف إضافية هنا إذا رغبت في ذلك. (ه) لقطة شاشة من علامة التبويب تتبع من نافذة الكشف عن وتتبع مع الإعدادات الموصى بها لتتبع سلوك السباحة. هذه هي الخطوة الأخيرة في إعداد تسلسل الفيديو. حفظ التسلسل كمشروع باستخدام إطار حفظ المشروع . كرر هذه الخطوات لكل تسلسل فيديو. يمكن حفظ الإعدادات كتشكيل لتقليل حمل العمل والتأكد من معاملة جميع التسلسلات بنفس الطريقة (غير المعروضة). لتعقب ملفات المشروع للتحليل، انتقل إلى سير العمل الدفعي . (F) يظهر الرمز المستخدم للتنقل إلى سير العمل الدفعي ، و(G) يظهر إطار معالجة الدفعات، ويسلط الضوء على أزرار الإضافة والبدء، ويظهر المظهر المتوقع لملف مشروع تم تعقبه. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: تحليل سلوك السباحة. بعد تعقب ملف مشروع، يمكن فتحه باستخدام [ملف | فتح المشروع]. ستظهر الديدان باللون الأخضر كما هو موضح في (A). تنقية من خلال الفيديو يقدم الاختيار السريع أن الفيديو معالجتها كما هو متوقع، وتسليط الضوء الأخضر سوف تختفي أثناء تنقية. يتم فتح إطار تحليل البيانات ورسمها من العنصر تحليل سير عمل البيانات . (ب) يظهر تحليل البيانات ورسم النافذة مع عرض موقف فتح (الافتراضي) ، يتم تمييز جميع المسارات. أسفل نقاط البيانات يوجد مخطط يعرض المسار المسجل لكل دودة مميزة. يتم استخدام تحليل ملخص المسار للمنعطفات المحسوبة في الدقيقة. (C-D) عرض تقرير موجز المسار وتفاصيل التصدير. (E-F) عرض ملخص المسار في جدول بيانات وكيفية حساب المنعطفات في الدقيقة، والإخراج تقاس في هذا المقايسة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

الحركة الشعاعية:
يتم التحكم بسهولة في دقة هذا المقايسة عن طريق تغيير متغير الوقت. زيادة طول الوقت يجعل من الأسهل لمراقبة الاختلافات بين الحيوانات مع الأنماط الظاهرية الشديدة، وبالتالي تحديد الاختلافات الدقيقة. ومع ذلك ، لأن هذا المقايسة يقيس الإزاحة ، إذا تم تمديد وقت الفحص لفترة طويلة جدا ، فإن الحيوانات ذات الحركة العادية ، مثل N2 ، ستسافر إلى حواف اللوحة ، وسيؤدي سلوك الأعلاف إلى التراجع. وهذا من شأنه أن يقلل بشكل مصطنع قياس المسافة المقطوعة. قد تؤدي الفترات الزمنية الطويلة جدا إلى اختفاء الاختلافات بين السلالات ، خاصة بين الحيوانات ذات الأنماط الظاهرية الحركية الأقل حدة ، حيث تصبح الحيوانات مشتتة بالتساوي عبر اللوحة. تقصير متغير الوقت سيمنع الديدان الأكثر نشاطا من العثور على حواف اللوحة. لا تتبع هذه الطريقة المسافة الإجمالية المقطوعة لكل دودة ولكنها تضغط المسافة المقطوعة لكل دودة إلى مسافة خطية من وسط اللوحة. على هذا النحو ، فهي بطبيعتها أقل قوة من الطريقة التي تسجل طول المسار الإجمالي للديدان الفردية. ومع ذلك، يتطلب فحص الحركة الشعاعية القليل جدا من تدريب الباحثين، ويستخدم الكواشف بأسعار معقولة نسبيا التي تتوفر عادة في معظم مختبرات الديدان، وحساسة بما يكفي لتحقيق نتائج كبيرة وقابلة للاستنساخ. بالنسبة للمختبرات التي تفضل تتبع الفيديو الآلي، تم إنشاء العديد من الطرق مسبقا لتتبع وتحليل حركات ^الزحف12، أو يمكن تغيير معلمات البرامج المستخدمة في فحص السباحة في هذه الورقة للسماح بالكشف عن الزحف وتحليله.

وعادة ما تتم هذه التجربة في تكرارات مستقلة ثلاثية، مع مجموعة من 30-40 دودة لكل تكرار. يتم تقسيم كل تكرار على اثنين من لوحات مختلفة 100 ملم أو 150 ملم، مع 15-20 الديدان لكل لوحة. استخدام الديدان أكثر من الموصى بها لكل لوحة يمكن أن تجعل من الصعب تسجيل كفاءة. عدد إجمالي سجل من 90 + هو مدعوم بما فيه الكفاية لتحديد أهمية خفيفة، معتدلة، أو شديدة ضعف الحركة. أن تكون متسقة مع التوقيت بين السلالات المسجلة أمر ضروري للدقة والتكرار. 30 دقيقة عموما طويلة بما يكفي لتحديد الاختلافات بين الأنماط الظاهرية المعتدلة إلى الشديدة مثل السلالات المعدلة وراثيا التعبير عن TDP-43 متحولة الإنسان مقارنة مع الديدان البرية من نوع (الشكل 4). إذا تم تمديد متغير الوقت، فمن المستحسن أيضا زيادة حجم اللوحة من 100 ملم إلى 150 ملم. يمكن أن تؤثر العوامل البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة على هذا المقايسة ، التي تتم عادة في درجة حرارة الغرفة المحيطة ، لذلك من المهم استخدام عنصر تحكم من النوع البري (N2) دائما عند المقارنة عبر التكرارات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا المقايسة قياس حركية بعض السلالات التي لا تظهر سلوك السباحة العادي في السائل (سحق)، مما يجعلها تكملة مفيدة لمقايسة السباحة.

فحص السباحة:
استخدام نظام التصوير والاستحواذ لأتمتة تتبع وتحليل السباحة دودة يسمح لبيانات صارمة وغير متحيزة. ومع ذلك، هناك عدة عوامل أثناء الإعداد الأولي للتجربة التي تحتاج إلى التحكم بين العينات. وتشمل هذه الوقت للتأقلم مع السائل قبل بدء التسجيل، والظروف المحيطة (أي درجة الحرارة والرطوبة)، وإعدادات الإضاءة والتسجيل المتسقة. على مرحلة التسجيل، هناك العديد من الميزات التي تساعد على تقليل التباين بين اللوحات. وتشمل هذه الكاميرا المتكاملة التي شنت على المسار ومرحلة مشرق الميدان الذي يجعل تسجيل الفيديو متسقة بين لوحات، والتدريع حول المرحلة التي تمنع الانعكاسات، ووهج، وحركات الهواء أثناء التسجيل، وحزمة برامج قوية أن يكشف موثوق الديدان ويسمح لتصحيح يدوي للمسارات في مرحلة ما بعد المعالجة الفيديو. في هذا البروتوكول، يتم تسجيل مقاطع فيديو للوحة 35 مم مع الديدان لمدة دقيقة واحدة ثم معالجتها باستخدام حزمة البرامج. بعد المعالجة، يضمن التصحيح اليدوي للمسارات تسجيل سلوكيات الفيروس المتنقل بدقة دون الخلط بين أخطاء التتبع. يتم استخدام بيانات العد وتتبع المدة لتحديد المنعطفات في الدقيقة كمقروءة نهائية. ولضمان إمكانية إعادة الإنتاج، يتم جمع البيانات على مدى ما لا يقل عن 3 تجارب تكرار مستقلة، سجل كل منها 40-50 حيوانا، لتحقيق العدد النهائي المشترك للحيوانات 120-150. هذا العدد يكفي للتمييز بين الاختلافات الصغيرة في سلوك السباحة من الديدان السيطرة. بعض الديدان لديها عجز في المحركات شديدة جدا بحيث لا يمكن التقاطها من قبل المقايسات السباحة. على سبيل المثال، إذا وضعت الحيوانات في حليقة متوسطة سائلة بدلا من تنفيذ الاستجابة المتوقعة للسحق، فإن هذا الفحص لن يسجل تلك الحركات بدقة، وقد يلتقط فحص حركة آخر، مثل الحركة الشعاعية، تلك العيوب الحركية بشكل أفضل. يستخدم البروتوكول المقدم نظام تصوير متاح تجاريا (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل)، ولكن قد توفر أنظمة تتبع الديدان الأخرى أداة مماثلة، وبعضها مفتوح ^{المصدر12}. تصف الأساليب المنشورة سابقا التسجيل اليدوي لدودة ^thrashing13. في حين أن التحليل الآلي ينتج عددا من المقاييس لكل دودة على حدة ، والكشف عن الانحناءات الجسم الذي يقاس في thrashes في الدقيقة الواحدة ، ويوفر نتائج متسقة بين التجارب والمسارات بشكل جيد مع التهديف التقليدية من الديدان thrashes بالعين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	-	احصل على سلالات الوراثة الخاصة بك حسب الرغبة ، N2 هي سلالة تحكم مفيدة
ماصات باستور يمكن التخلص منها ، زجاج البورسليكات	VWR	14673-010	ماصة زجاجية تستخدم لإنشاء دودة الانتقاء - أمسك ماصة زجاجية في يد واحدة و ~ 1 بوصة من الأسلاك البلاتينية (التي تمسك بها كماشة) في الأخرى فوق اللهب للانضمام.
أطباق بتري يمكن التخلص منها ، 35 × 10 مم	VWR	10799-192	لوحات فحص لنظام التصوير WormLab
أطباق بتري يمكن التخلص منها ، 60 × 15 مم	VWR	25384-090	لوحات مخزون للديدان
أطباق بتري يمكن التخلص منها ، 100 × 15 مم	VWR	25384-302	لوحة فحص الحركة الشعاعية القياسية
أطباق بتري يمكن التخلص منها ، 150 × 15 مم	VWR	25384-326	إطار زمني أطول لوحة فحص الحركة
تشريح المجهر	Leica	M80	نطاق للحفاظ على الديدان وإعداد فحوصات الحركة الشعاعية
علامات ذات رؤوس دقيقة	VWR	52877-810	تحتاج إلى لونين على الأقل لمقايسات الحركة الشعاعية. نصائح دقيقة مطلوبة للدقة.
ماسح ضوئي مسطح	Amazon	Epson Perfection V850	اختياري لمقايسة الحركة الشعاعية. يفترض البروتوكول دقة 300 نقطة في البوصة ، ومعظم الماسحات الضوئية ستعمل بشكل جيد
ImageJ		NIH-Optional	free software مقدمة من NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
M9 buffer	VWR	IC113037012	Medium المستخدمة في فحص السباحة. يمكن صنعه من الصفر ، انظر WormBook: صيانة C. ايليجانس
NGM (وسط نمو الديدان الخيطية)	VWR	76347-412	وسط يستخدم لزراعة C. ايليجانس. يمكن تصنيعها من الصفر ، انظر WormBook: صيانة C. elegans
OP50 & nbsp ؛ البكتيريا	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	مصدر الغذاء الأساسي ل C. elegans
p1000 ماصة	VWR	76207-552	Pipettor ، تستخدم في فحص السباحة
p1000 نصائح	VWR	83007-384	نصائح للماصة ، المستخدمة في فحص السباحة
سلك بلاتيني ، قطر 0.2032 مم	VWR	BT136585-5M	سلك بلاتيني دقيق يستخدم لإنشاء انتقاء دودة - أمسك ماصة زجاجية في يد واحدة و ~ 1 "من الأسلاك البلاتينية (التي تمسك بها كماشة) في الأخرى فوق اللهب للانضمام.
Ruler	VWR	56510-001	تحتاج إلى تسجيل فحوصات الحركة الشعاعية
نظام	MBF Bioscience	WormLab	يشتمل نظام التصوير على أجهزة WormLab (مرحلة المجال الساطع والكاميرا والإسكان) وبرنامج WormLab. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system