التحديد التحليلي لوظيفة الميتوكوندريا من المتجانسات الورم الصلب المقتطع

ترتبط جميع الخلايا ارتباطا وثيقا بحاجتها إلى إنتاج واستهلاك الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)، عملة الطاقة الجزيئية. كما الطفرات الخلوية تؤدي إلى تشكيل الأورام, الميتوكوندريا ضمان البقاء على قيد الحياة من خلال تنويع إنتاج الطاقة التي غالبا ما تكون مميزة بشكل غير عادي من الأنسجة غير السرطانية^1,2,3. على هذا النحو، هناك حاجة ماسة إلى التنميط السريع والعميق لوظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا من أجل تسهيل تصنيف نوع الورم، وبدء السرطان، والتقدم، والاستجابة للعلاج.

لا يمكن تقييم الوظائف التنفسية لعينات الأنسجة المقتطعة سليمة لأن الركائز الأساسية لOXPHOS ليست نفاذية الخلية. للتغلب على هذا القيد، يمكن إعداد الميتوكوندريا إما عن طريق العزلة، والبيرميلات الكيميائية، أو التجانس الميكانيكي. تعتبر عزلة الميتوكوندريا منذ فترة طويلة معيارا ذهبيا لتقييم وظيفة الجهاز التنفسي. ومع ذلك، فإنه يتطلب كميات كبيرة من الأنسجة، وتستغرق وقتا طويلا، ومنخفضة الغلة مع التحيز الاختيار ممكن لكسور معينة من الميتوكوندريا⁴. Permeabilization يتكون من الفصل الميكانيكي والتعرض لأقسام الأنسجة أو حزم الألياف إلى المنظفات الخفيفة التي تتحلل بشكل انتقائي غشاء البلازما⁵. وكثيرا ما تستخدم Permeabilization في الأنسجة المخططة مثل الهيكل العظمي والعضلات القلبية وحزم الألياف الفردية يمكن أن يكون مثار بعيدا. بالمقارنة مع العزلة، permeabilization تسفر عن المزيد من الميتوكوندريا في بيئتهم الخلوية الأصلية والشكل المادي⁵. وقد تم تطبيق Permeabilization بنجاح في أنسجة أخرى مثل الورم^6و7 و المشيمة⁸; ومع ذلك، يمكن أن يكون من الصعب استنساخ المستحضرات الألياف permeabilized بسبب اتساق تشريح ومتطلبات الأكسجين للتغلب على القيود انتشار⁹. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون الألياف permeabilized غير مناسبة في أنواع معينة من الأورام التي هي كثيفة الخلوية والألياف الليفية للغاية. يتم إنشاء تجانسات الأنسجة من خلال التعطيل الميكانيكي لغشاء البلازما وتشبه الألياف permeabilized من حيث العائد الميتوكوندريا والسلامة¹⁰. تجانس الأنسجة أيضا تقليل القيود المفروضة على نشر الأكسجين ويمكن استخدامها بسهولة عبر أنواع الأنسجة من خلال تحسين القوة الميكانيكية^11،12.

هنا، نحدد طريقة بسيطة وسريعة لتحديد معدلات الفوسفور التأكسدي (OXPHOS) وقدرة نقل الإلكترون (ET) في متجانسات الأورام الصلبة الطازجة. تم تصميم البروتوكول على النحو الأمثل لتقييم الأنسجة الطازجة باستخدام مقياس التنفس عالي الدقة Oxygraph-2k (O2k) ، والذي يتطلب معرفة مسبقة بالإعداد والمعايرة الآلية ولكن يمكن تكييفه بالمثل باستخدام أي قطب كهربائي من نوع كلارك أو محلل Seahorse أو قارئ لوحة. يمكن تطبيق البروتوكول بشكل مستنسخ عبر أنواع الأنواع والأورام وكذلك تكييفه لتقييم تنوع مسارات ET الميتوكوندريا.

تمت الموافقة على جميع التجارب والإجراءات التي تشمل الحيوانات من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في مركز بنينجتون للبحوث الطبية الحيوية.

1. إعداد الكاشف.

1. إعداد وسائل الإعلام نمو الخلايا EO771 مع 10 MM HEPES، 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 1٪ البنسلين-الستربتوميسين (100 U/mL)، و 0.2٪ أمفوتريسين B.
2. إعداد 1 لتر من محلول الحفاظ على الخزعة (BIOPS) في كوب زجاجي سعة 1000 مل.
   1. إضافة 3.180 غرام من NA₂ATP (5.77 mM التركيز النهائي).
   2. إضافة 1.334 غرام من MgCL₂· 6H₂O (6.56 mM التركيز النهائي).
   3. إضافة 2.502 غرام من تورين (20 mM التركيز النهائي).
   4. إضافة 3.827 غرام من_{Na 2}فوسفوكرياتين (15 mM التركيز النهائي).
   5. إضافة 1.362 غرام من إيميدازول (20 mM التركيز النهائي).
   6. إضافة 0.077 غرام من ديثيوثيريتول (.5 متر التركيز النهائي).
   7. أضف 9.76 غرام من هيدرات MES (تركيز نهائي 50 mM).
   8. أضف 800 مل من H₂O واخلط المكونات باستخدام ستيرر مغناطيسي عند 30 درجة مئوية.
   9. إضافة 72.3 مل من 100 mM K₂EGTA (7.23 mM التركيز النهائي).
      1. حل 7.608 غرام من EGTA و 2.3 غرام من KOH في 100 مل من H₂O.
      2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع 5 M KOH وبذلك يصل حجم إلى 200 مل مع H₂O.
   10. إضافة 27.7 مل من 100 mM كاك₂EGTA (2.77 mM التركيز النهائي).
       1. حل 7.608 غرام من EGTA في 200 مل من H₂O والحرارة إلى 80 درجة مئوية (100 متر تركيز النهائي).
       2. حل 2.002 غرام من كاكو₃ في 200 مل من الساخنة 100 م EGTA الحل.
       3. أثناء التحريك المستمر، أضف 2.3 غرام من KOH وضبط درجة الحموضة إلى 7.0.
   11. ضبط درجة الحموضة إلى 6.75 في 23 درجة مئوية (درجة الحموضة 7.1 في 0 درجة مئوية) مع 5 M KOH. رفع مستوى الصوت إلى 980 مل مع H₂O، ومزج الحل. تحقق من درجة الحموضة مرة أخرى، وضبط إذا لزم الأمر، وتقديم حجم النهائي يصل إلى 1000 مل مع الماء.
   12. Aliquot BIOPS في أنابيب مخروطية (15 مل أو 50 مل) وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. إذابة مرة واحدة فقط، قبل الاستخدام مباشرة.
3. إعداد 1 لتر من المتوسطة التنفس الميتوكوندريا (MiR05) في كوب زجاجي 1000 مل.
   1. إضافة 0.190 غرام من EGTA (0.5 mM التركيز النهائي).
   2. إضافة 0.610 غرام من MgCL₂· 6H₂O (3 mM التركيز النهائي).
   3. إضافة 2.502 غرام من تورين (20 mM التركيز النهائي).
   4. إضافة 1.361 غرام من KH₂PO₄ (10 mM التركيز النهائي).
   5. إضافة 4.77 غرام من HEPES (20 mM التركيز النهائي).
   6. إضافة 37.65 غرام من D-السكروز (110 mM التركيز النهائي).
   7. أضف 800 مل من H₂O واخلط المكونات باستخدام ستيرر مغناطيسي عند 30 درجة مئوية.
   8. إضافة 120 مل من حمض اللاكتوبيون 0.5 M (60 mM التركيز النهائي).
      1. حل 35.83 غرام من حمض اللاكتوبيون في 100 مل من H₂O.
      2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع 5 M KOH وبذلك يصل حجم الصوت إلى 200 مل مع H₂O.
   9. امزج المحلول واضبط درجة الحموضة إلى 7.1 مع 5 M KOH.
   10. وزن 1 غرام من جيش تحرير سرايا، أساسا خالية من الأحماض الدهنية (1 غرام / لتر التركيز النهائي)، في أنبوب مخروطي 50 مل. أضف 40 مل من محلول pH 7.1 من الخطوة 9 إلى الأنبوب ، وعكس بلطف لخلط ، وتجنب الرغوة. نقل BSA المذاب إلى الحل المتبقية 7.1 الحموضة من الخطوة 9 ويحرك بلطف ومستمر. تحقق من درجة الحموضة مرة أخرى، وضبط إذا لزم الأمر، وجلب حجم النهائي تصل إلى 1000 مل مع H₂O.
   11. Aliquot المتوسطة MiR05 إلى أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. إذابة مرة واحدة فقط، قبل الاستخدام مباشرة.
4. إعداد الركائز، uncouplers، ومثبطات.
   1. إعداد 0.8 M Malate: حل 536.4 ملغ من حمض L-ماليك في 4 مل من H₂O. Neutralize مع 5 M KOH إلى درجة الحموضة 7 وبذلك يصل حجم الصوت إلى 5 مل مع H₂O. تقسيم إلى aliquots ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   2. إعداد 1 M بيروفات: حل 550 ملغ من ملح الصوديوم حمض بيروفيك في 4 مل من H₂O. تحييد مع 5 M KOH إلى درجة الحموضة 7 وبذلك يصل حجم تصل إلى 5 مل مع H₂O. تقسيم إلى aliquots ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   3. إعداد 0.5 M ADP (أدينوزين 5′-diphosphate): حل 1.068 غرام من ملح الصوديوم ADP في 4 مل من H₂O. تحييد مع 5 M KOH إلى درجة الحموضة 7 وبذلك يصل حجم يصل إلى 5 مل مع H₂O. تقسيم إلى aliquots ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   4. إعداد 2 M الغلوتامات: حل 3.7426 غرام من حمض L-الجلوتاميك monohydrate في 8 مل من H₂O. تحييد مع 5 M KOH إلى درجة الحموضة 7 وبذلك يصل حجم يصل إلى 10 مل مع H₂O. تقسيم إلى aliquots ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   5. إعداد 4 م Cytochrome ج: حل 50 ملغ من Cytochrome ج في 1 مل من H₂O. تقسيم إلى aliquots ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   6. إعداد 1 M Succinate: حل 2.701 غرام من سكرينات سداسي هيدروهيدرات ملح الصوديوم في 8 مل من H₂O. Neutralize مع 1 N HCl إلى درجة الحموضة 7 وبذلك يصل حجم الصوت إلى 10 مل مع H₂O. تقسيم إلى aliquots ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   7. إعداد 1 mM FCCP (سيانيد الكربونيل-4-(ثلاثي فلوريوميثوكسي)فينيلهيدرازون): حل 2.54 ملغ من FCCP في 10 مل من الإيثانول النقي. تقسيم إلى aliquots ثم تخزين في -20 درجة مئوية.
   8. إعداد 150 ميكرومتر روتينون: حل 3.94 ملغ من Rotenone في 10 مل من الإيثانول النقي لإعداد مخزون 1 مللي متر، دوامة حتى يذوب تماما. تمييع 225 ميكرولتر من تركيز مخزون 1 mM Rotenone مع 1.275 مل من الإيثانول النقي لجعل 1.5 مل من 150 ميكرومتر روتينون. حماية من الضوء، وتقسيمها إلى aliquots، ومن ثم تخزين في -20 درجة مئوية.
   9. إعداد 125 ميكرومتر أنتيميسين A: حل 11 ملغ من أنتيميسين A في 4 مل من الإيثانول النقي لإعداد تركيز 5 MM مخزون أنتيميسين A. تمييع 25 ميكرولتر من 5 مللي متر أنتيميسين تركيز الأسهم مع 975 ميكرولتر من الإيثانول النقي لجعل 1 مل من 0.125 mM Antimycin A. تقسيم إلى aliquots ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   10. إعداد 0.8 M Ascorbate: حل 1.584 غرام من ملح الصوديوم أسكوربات في 8 مل من H₂O. ضبط درجة الحموضة مع حمض الأسكوربيك إلى درجة الحموضة 6 وبذلك يصل حجم إلى 10 مل مع H₂O. حماية من الضوء، وتقسيمها إلى aliquots، ومن ثم تخزينها في -20 درجة مئوية.
   11. إعداد 0.2 M TMPD (رباعي ميثيل ف فينيلينيديامين): حل 32.85 ملغ من TMPD في 987.5 ميكرولتر من DMSO. إضافة 12.5 ميكرولتر من 0.8 م أسكوربات (10 م التركيز النهائي من الأسكوربات). حماية من الضوء، وتقسيمها إلى aliquots، ومن ثم تخزين في -20 درجة مئوية.
   12. إعداد 4 M الصوديوم azide: حل 2.6 غرام من الصوديوم أزيد في 10 مل من H₂O. تقسيم إلى aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. نمو الورم

1. تنمو خلايا EO771 في وسائل الإعلام نمو RPMI 1640 والحفاظ على الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع 5٪ CO₂.
2. منزل واحد أربعة أسابيع من العمر أنثى C57BL/6J الفئران، والحفاظ عليها في 21-22 درجة مئوية على ضوء 12 ساعة: دورة مظلمة. توفير الفئران الإعلانية libitum الوصول إلى الغذاء والماء.
3. بمجرد أن تصل الفئران إلى 10 أسابيع من العمر ، قم بإعداد الخلايا والفئران لزرع الخلايا السرطانية.
   1. جرب الخلايا، وأبطل تنشيط التريبسين مع وسائط النمو، وخلايا الطرد المركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant وإعادة الإنفاق والجمع بين الكريات الخلية (حسب الحاجة) في وسائل الإعلام. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام الأزرق تريبان وإعداد تخفيف الخلية من 1 × 10⁶ خلايا في حجم إجمالي قدره 60 ميكرولتر مع 1:1:1 وسائل الإعلام / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء / PBS الحل. بمجرد إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي، اخلطيها جيدا والحفاظ على تعليق الخلية على الجليد. ملء المحاقن مع 60 ميكرولتر من تعليق الخلية ووضعها على الجليد. العمل بكفاءة وحقن الخلايا في الفئران في غضون 1.5 ساعة من التحضير.
   2. تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (3٪ -5٪ للتحريض و 1٪ -3٪ للصيانة). حلق بين الحق⁴ و 5^الغدد الثديية الإربي. حقن الفئران المخدرة بشكل متعامد بتعليق خلية EO771.
4. استخدم الفرجار الإلكترونية لمراقبة وقياس نمو الورم مرتين في الأسبوع لمدة 4 أسابيع. في التشريح، والمكوس، ووزن، ومن ثم وضع الورم (أو ما لا يقل عن 60 ملغ قسم الورم) على الفور في 10 مل من BIOPS الجليد الباردة. إبقاء أنبوب على الجليد الرطب.

3. إعداد الصك والمعايرة

1. قم بتدفئة وسيط MiR05 في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. بدوره على نظام O2K Oroboros، فتح برنامج DATLAB، أدخل أو حدد المستخدم. انقر على الاتصال O2k. تحقق من تكوين O2k وتأكد من أن يتم تسمية الأداة الصحيحة ل Power-O2k وكل غرفة تتوافق مع مستشعر الأكسجين الصحيح؛ انقر فوق موافق. بمجرد فتح نافذة التحكم O2k، تحت علامة التبويب الأنظمة، قم بتعيين درجة حرارة الكتلة إلى 37 درجة مئوية، وسرعة Stirrer إلى 750 دورة في الدقيقة لكلا الغرفتين، وND الفاصل الزمني لتسجيل البيانات إلى 2.0 ثانية. تحقق من كل من ستيرر باور والإضاءة في صناديق الغرفة. في الأكسجين، O2 التبويب، تعيين كسب للاستشعار إلى 1 V / μA (قد تحتاج إلى تعديل كسب لنماذج الصك القديم)، والجهد الاستقطاب إلى 800 mV، ومن ثم انقر على الاتصال O2K. بمجرد فتح ملف تجربة جديد، قم بتسمية الملف وانقر على حفظ. بمجرد أن تكون التجربة نشطة، سيتم فتح إطار تحديد بروتوكول; انقر على إلغاء لتشغيل SUIT مخصص (Substrate إلغاء التكويد مثبط المعايرة).
3. بعد تحديد البروتوكول، ستفتح نافذة عينة لملء التعليمات البرمجية التجريبية ونوع العينة والفئة ورمز العينة ورقم العينة ورقم النوع الفرعي حسب الاقتضاء. تعيين وحدة ملغ وأدخل تركيز الورم متجانسة لكل مل (المبلغ لكل غرفة سوف لصناعة السيارات في ملء). تأكد من أن المتوسط المشار إليه هو MiR05 وحجم الغرفة هو 2.00 مل. إضافة تعليقات حسب الحاجة في المربع السفلي وانقر على موافق.
4. إزالة سدادات و يستنشق الإيثانول 70٪ من الغرف. لا تنشق أبدا بالقرب من الغشاء الذي يتعرض داخل الغرفة. شطف أربع مرات بالماء النقي وملء الغرفة مع 2.25 مل من MiR05.
5. اختبار الاستشعار: انقر على F9 لإيقاف العربات لمدة 30 s. بمجرد تشغيل شريط stirrer مرة أخرى ، تأكد من أن منحدر O₂ يزيد بسرعة بشكل أحادي في كل غرفة. إذا فشلت الغرفة في اختبار الاستشعار، تحقق من التوصيلات الكهربائية وتنظيف إذا تراكمت الأملاح. كرر الاختبار. إذا استمر جهاز الاستشعار في فشل الاختبار، قم بإزالة موصل مستشعر الأكسجين القطبي (POS) لفحص الغشاء. إذا لوحظ ضرر مرئي للغشاء ، لوحظ أكسدة ثقيلة ، أو تراكم فقاعة كبيرة ، ووقف الإجراءات التجريبية ، والمضي قدما في خدمة الصك.
6. معايرة الأكسجين: إجراء معايرة الأكسجين للحصول على قياسات التنفس الدقيقة.
   1. مع حركة التواء، أدخل سدادات ببطء إلى موقفهم حجم معايرة. سيفون قبالة المتوسطة الزائدة التي قذفت من خلال الشعرية الحقن الذي يجمع في بئر سدادة. مع حركة التواء، رفع سدادات فقط بما فيه الكفاية لتناسب بإحكام أداة سدادة فاصل ترك حجم الغاز فوق المرحلة السائلة لتوازن الهواء النهائي (30-45 دقيقة).
   2. استخدم الحالة الثابتة التي تحققت خلال هذه الفترة لمعايرة مستشعر الأكسجين للحصول على قياسات دقيقة للتنفس. وO₂ المنحدر neg. (المنحدر السلبي للأوكسجين) هو 0 ± 2 pmol / s·mL. إذا كانت القيمة أعلى من 2 pmol/s·mL، قم بتنظيف الغرفة وتجديدها ب MiR05 المذاب حديثا. إذا كان المنحدر غير مستقر، انتقل إلى خدمة الأجهزة.
   3. بعد تحقيق حالة ثابتة، حدد منحنى التركيز O₂ وتسليط الضوء على المنطقة الثابتة من المنحنى عن طريق الضغط باستمرار على مفتاح التحول وزر الماوس الأيسر. بمجرد تحديد المنطقة، انقر على F5،حدد علامة لمعايرة الهواء مع السهم المنسدل وانقر على معايرة ونسخ إلى الحافظة.
7. معايرة خلفية مفيدة (اختياري)
   1. بعد معايرة الهواء، تأكد من عدم وجود حجم غاز فوق المرحلة السائلة لتوازن خلفية التدفق (~ 15 دقيقة) وإغلاق الغرف بالكامل.
      ملاحظة: يمثل معدل الحالة الثابتة الذي تم تحقيقه خلال هذه الفترة خلفية مفيدة ويمكن طرحه من البيانات الناتجة عن الدقة التحليلية المحسنة. فإن O 2 المنحدر neg. زيادة طفيفة في_{البداية} والهضبة بين ± 2 إلى 4 pmol / s· مل.
   2. إذا كانت القيمة عالية (>6 pmol/s·mL)، فهناك تلوث بيولوجي محتمل. في هذه الحالة، تنظيف الغرفة وتجديده مع MiR05 المذاب حديثا. بمجرد تحقيق حالة ثابتة، حدد منحنى O₂ المنحدر neg. وتسليط الضوء على المنطقة الثابتة من المنحنى عن طريق الضغط باستمرار على مفتاح Shift وزر الماوس الأيسر.
   3. بعد تحديد المنطقة، انقر على F5، وحدد مربع تصحيح الأساس وعلامة الأساس مع السهم المنسدل ، وانقر فوق موافق.

4. إعداد الورم المتجانس

1. ضع متجانس زجاجي يحتوي على 1 مل من MiR05 وحشرات زجاجية مناسبة بإحكام على الجليد الرطب.
2. في وقت الدراسة ، ضع الأنسجة في 1 مل من BIOPS في طبق بيتري بارد الجليد.
3. تنظيف الأنسجة وتشريحها لزيادة المواد القابلة للذوبان، وتجنب المناطق النخرية، وإزالة أنسجة الورم الهامشية. باستخدام مجهر تشريح، مشرط، وملاقط الجراحية، وإزالة أي الشعر والأنسجة النخرية، الضام المحيطي والأنسجة الوعائية، والدهون المجاورة، حسب الاقتضاء. الحرص على إبقاء الورم في BIOPS الجليد الباردة أثناء تشريح.
4. قطع الورم إلى قطع صغيرة (~ 5-10 ملغ لكل منهما) ووضع قطع الورم المتبقية مرة أخرى إلى 10 مل من BIOPS أبقى على الجليد. استخدم هذا النسيج لاحقا لإجراء تحضيرات إضافية إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية بسرعة لتقليل مقدار الوقت العينة غير مغمورة بالكامل في BIOPS. بمجرد وضع العينة في MiR05 ، يكون الوقت جوهريا. تحرك بعناية التجانس المعدة في غرفة معايرة في أقرب وقت ممكن.
5. لطخة أقسام الأنسجة بعناية على ورقة تصفية، ووضعها على قارب وزن بلاستيكي صغير ملطخ، وتسجيل الوزن الرطب الأولي. ضع القطع غير المستخدمة مرة أخرى في أنبوب مخروطي 10 مل من BIOPS للحفاظ عليها باستمرار.
6. غمر أقسام الأنسجة في متجانس الجليد الباردة التي تحتوي على MiR05 وتسجيل الوزن المتبقي على قارب الوزن، إذا كان ذلك ممكنا.
7. باستخدام حشرات زجاجية (نطاق إزالة 0.09-0.16 ملم) ، يعطل بلطف نسيج الورم عن طريق إكمال 5-7 ضربات لأسفل ومتابعة. لكل السكتة الدماغية، تدوير الحشرات في حركة عقارب الساعة من الحكمة عكس اتجاه عقارب الساعة 3 مرات في حين دفع الحشرات إلى أسفل و 3 مرات إضافية في حين سحب الحشرات مرة أخرى. تأكد من السماح للأنسجة بالاستقرار في الجزء السفلي من المتجانس بين السكتات الدماغية ولكن تجنب جلب الحشرات فوق حجم السائل بشكل كامل لمنع الرغوة.
   ملاحظة: يجب أن تظهر المتجانسة الناتجة غائمة مع بقايا الأنسجة الصلبة الحد الأدنى.
8. صب المتجانسة في أنبوب مخروطي 15 مل ووضعه على الجليد.
9. ماصة 1-3 مل من MiR05 الطازجة على الحشرات وإلى المتجانس لغسل أي تجانس الأنسجة المتبقية. صب غسل MiR05 في أنبوب مخروطي يحتوي على متجانسة. كرر غسل الحشرات والتجانس 2-3 مرات لضمان النقل الكامل للمتجانس. نضع في اعتبارنا التركيز المستهدف وحجم المطلوبة لعدم تخفيف العينة خلال خطوات الغسيل.
10. لحساب تركيز الأنسجة المتجانس بدقة، قم بفحص المتجانس والتجانس بعناية للمواد غير المتجانسة المتبقية (أي النسيج الضام).
    1. لإزالة المواد غير المتجانسة من المتجانس التي لا يمكن الوصول إليها مع ملاقط، إضافة MiR05 إلى المتجانس، يستنشق حجم (بما في ذلك الأنسجة) مع ماصة ونقل محتويات إلى طبق بيتري.
    2. لإزالة المواد غير المتجانسة من المتجانسة (استقر في قطع كبيرة في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي)، يستنشق القطع الكبيرة مع ماصة ووضعها على غطاء الأنسجة من الأنبوب المخروطي.
    3. إزالة الأنسجة من طبق بتري أو غطاء أنبوب مخروطي مع ملاقط ولطخة على ورق التصفية. إضافة المتجانس المتبقية من غطاء أنبوب مخروطي مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي، وغطاء ذلك، ومن ثم عكس لخلط.
    4. إعادة فحص التجانس والتجانس لأي مواد إضافية غير متجانسة، وكرر الخطوات 4.10.1-4.10.3 لإزالة المواد حسب الحاجة.
11. وزن وتسجيل كتلة المواد غير المتجانسة التي تم استردادها من المتجانس. فحص إعداد متجانسة لأي الأنسجة سليمة بشكل صارخ نقل. إزالة القطع غير متجانسة وتزن حسب الضرورة.
12. طرح وزن الأنسجة المستردة من قارب الوزن، والتجانس، ومتجانسة (إذا لزم الأمر) من الوزن الرطب الأولي لحساب وزن العينة النهائية.
13. باستخدام وزن العينة النهائي، أضف MiR05 إضافية لتحقيق التجانس إلى التركيز المطلوب (انظر الخطوة 5 للحصول على تفاصيل حول تجارب التحسين).
14. بمجرد وزن المتجانس وإعداده ، انتقل إلى الفحص في أقرب وقت ممكن. احتفظ بالعينة المخزنة على الثلج الرطب حتى يتم نقلها إلى الجهاز.

5. الركيزة، فك الارتباط، بروتوكول المعايرة المثبطة (SUIT)

1. بمجرد معايرة الجهاز ، وإعداد العينة ، قم بإزالة سدادات الحركة الملتوية وتوبيخ MiR05 من الغرف (تجنب الغشاء المكشوف داخل الغرفة). خلط جيدا متجانسة وإضافة 2.25 مل من التجانس إلى الغرفة. إذا إضافة واحدة متجانسة لغرف متعددة، ماصة 1 مل في وقت واحد في كل غرفة في حين خلط المتجانسة لضمان توزيع الأنسجة على قدم المساواة. انقر على F4 لتسمية الحدث وختمه الزمني ثم انقر فوق موافق.
2. ملء حقنة 50 مل مع الأكسجين من خزان الأكسجين مع المنظم وأنابيب الغاز باستخدام إبرة حادة 18 G. Hyperoxygenate الغرف إلى ~ 500 ميكرومتر الأكسجين. لهذا، حقن الأكسجين مباشرة في الغرف. أدخل سدادات فضفاضة وانتظر لإغلاق حتى يصل الأكسجين ~ 480 ميكرومتر. مع حركة التواء، وإغلاق الغرفة ببطء والسماح للتنفس إلى التوازن (~ 15-20 دقيقة). ملء سدادة الشعيرات الدموية المركزية مع MiR05 إذا لزم الأمر.
3. التحديد التحليلي لقدرة OXPHOS و ET (حالة نقل الإلكترون) للنشاط المرتبط ب N والمرتبط ب NS وCIV (المجمع الرابع): استخدم الدوائر الدقيقة المخصصة لحقن الركائز وفك الارتباطات والمثبطات في غرف مغلقة تماما. انقر على F4 مع كل حقنة لتسمية الطابع الزمني للأحداث لكل غرفة في الوقت الحقيقي. طوال الدراسة، حدد F6 لضبط تركيز O₂ و O₂ المنحدر neg. المقاييس حسب الحاجة. بعد كل حقنة، اغسل المحاقن 3 مرات في الماء (للمركبات القابلة للذوبان في الماء) أو الإيثانول بنسبة 70٪ (للمركبات المذابة في الإيثانول أو DMSO).
   ملاحظة: N-مرتبط: تدفق O₂ معتمدة بواسطة مجموعات الركيزة توليد NADH المعرفة، NS-المرتبطة: تدفق O₂ معتمدة من التقارب بين تركيبات الركيزة NADH-توليد المعرفة و succinate.
   1. إضافة 5 ميكرولتر من 0.8 M مالات (2 mM التركيز النهائي) والمضي قدما على الفور إلى الحقن المقبل. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الماء.
   2. إضافة فورا 5 ميكرولتر من 1 م بيروفات (2.5 mM التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الماء.
   3. أضف 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (تركيز نهائي 2.5 mM) وانتظر استجابة ADP لتحقيق الاستقرار. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الماء.
      ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى شرطة أبوظبي إضافية (2.5-10 م) لضمان أن تركيزات الأدينيلات لا يقتصر على التدفقات التنفسية.
   4. أضف 5 ميكرولتر من 2 M الغلوتامات (5 م التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الماء.
   5. إضافة 5 ميكرولتر من 4 م Cytochrome ج (10 μM التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الماء.
   6. إضافة 20 ميكرولتر من 1 M Succinate (10 mM التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الماء.
   7. Titrate 0.5-1 ميكرولتر زيادات من 1 mM FCCP (2-20 ميكرومتر التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة، وتستمر حتى لا تكون هناك زيادة إضافية في التنفس. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الإيثانول 70٪.
   8. إضافة 2 ميكرولتر من 150 ميكرومتر روتينون (150 nM-2 μM التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. إضافة 1 ميكرولتر أخرى من Rotenone لضمان عدم وجود مزيد من تثبيط. إذا كان هناك انخفاض في التنفس، والاستمرار مع حقن إضافية حتى لا يكون هناك انخفاض في التنفس. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الإيثانول 70٪.
   9. إضافة 2 ميكرولتر من 125 ميكرومتر أنتيميسين A (125 nM-5 ميكرومتر التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار. إضافة 1 ميكرولتر أخرى من Antimycin A لضمان عدم وجود تثبيط آخر. إذا كان هناك انخفاض في التنفس، والاستمرار مع حقن إضافية حتى لا يكون هناك انخفاض في التنفس. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الإيثانول 70٪.
   10. تحقق من تركيز الأكسجين في الغرفة. إذا كان التركيز أقل من 125 ميكرومتر، reoxygenate إلى هواء الغرفة أو hyperoxygenate أقل ما يقال لضمان أن الأكسجين لا يحد من تدفق الجهاز التنفسي. إضافة 5 ميكرولتر من 0.8 م أسكوربات (2 متر تركيز نهائي). غسل حقنة الحقن 3 مرات في الإيثانول 70٪.
   11. إضافة فورا 10 ميكرولتر من 0.2 M TMPD (1 mM التركيز النهائي) الانتظار لزيادة في التنفس بطيئة. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الإيثانول 70٪.
   12. إضافة 25 ميكرولتر من 4 M الصوديوم Azide (50 mM التركيز النهائي) على الفور عندما تدفق الجهاز التنفسي من الهضاب Ascorbate / TMPD. غسل حقنة الحقن 3 مرات في الإيثانول 70٪.
   13. إنهاء الدراسة - انقر على ملف، حفظ وقطع الاتصال. استمر في غسل الغرفة والمحاقن باتباع الخطوات 9.2-9.3.

6. بروتوكول حساسية ADP

1. بمجرد معايرة الجهاز وإعداد العينة ، قم بإزالة سدادات الحركة الملتوية وتوبيخ MiR05 من الغرف (تجنب الغشاء المكشوف داخل الغرفة). خلط جيدا متجانسة وإضافة 2.25 مل من التجانس إلى الغرفة. لنفترض إضافة واحدة متجانسة لغرف متعددة، ماصة 1 مل في وقت واحد في كل غرفة في حين خلط متجانسة لضمان توزيع الأنسجة على قدم المساواة. انقر على F4 لتسمية الحدث وختمه الزمني وانقر على موافق.
2. إدراج سدادات، ومع حركة التواء، وإغلاق الغرفة ببطء والسماح للتنفس إلى التوازن (~ 15-20 دقيقة). ملء سدادة الشعيرات الدموية المركزية مع MiR05 إذا لزم الأمر.
3. التحديد التحليلي لحساسية الميتوكوندريا المرتبطة بالسجينات: انقر على F4 مع كل حقنة لتسمية الأحداث وختمها الزمني لكل غرفة في الوقت الفعلي. طوال الدراسة، حدد F6 لضبط تركيز O₂ و O₂ المنحدر neg. المقاييس حسب الحاجة.
   1. إضافة 2 ميكرولتر من 150 ميكرومتر روتينون (150 nM التركيز النهائي).
   2. إضافة فورا 20 ميكرولتر من 1 M Succinate (10 mM التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار.
   3. 2- إعادة صياغة شرطة أبوظبي بإضافة تركيزات التشبع الفرعية تدريجيا حتى بلوغ معدل الاستجابة القصوى (V_MAX؛ التركيز النهائي 2.5-10 م م).
      ملاحظة: قد هضبة معدل بعد الحقن بسبب تغير طفيف في تركيز ADP, وبالتالي زيادة تركيز الحقن بعد كل هضبة والاستمرار في المعايرة حتى لا يكون هناك زيادة أخرى في التنفس حتى مع زيادة أضعاف في تركيز حقن ADP.

7. الموصى بها تجارب التحسين

1. تحديد التجانس الأمثل وتركيز الأكسجين للبروتوكول.
   1. تنفيذ بروتوكول SUIT (الخطوات 5.1-5.3) بتركيزات أنسجة متعددة (على سبيل المثال، 30 ملغم/مل، 20 ملغم/مل، 10 ملغم/مل، 5 ملغم/مل، 2.5 ملغم/مل، 1 ملغم/مل، و/أو 0.5 ملغم/مل).
   2. حدد التركيز الذي يزيد من تدفق الجهاز التنفسي مع الحد من تكرار reoxygenations (لا يزيد عن 1-2). إذا كانت هناك حاجة إلى إعادة تأجينات أكثر تواترا، تقليل تركيز المتجانسة.
2. تحديد العدد الأمثل من السكتات الدماغية مع المتجانس.
   1. تنفيذ بروتوكول SUIT (الخطوات 5.1-5.3) على مستويات متعددة من التجانس (على سبيل المثال، 5 ضربات، 10 ضربات، 15 السكتات الدماغية، 20 السكتات الدماغية).
   2. نظرا لعدم وجود بيانات كافية في الأدبيات لتحديد عتبة الزيادة المئوية للسيتوكروم ج مع إعداد الورم المتجانس ، اختر التحضير مع استجابة محدودة للسيتوكروم ج ولكن التنفس الكافي النشط من قبل الركيزة (الركيزات) ذات الاهتمام.
3. تحديد الركيزة المثلى، ADP، فك الارتباط، وتركيزات المثبطات المطلوبة للتدفقات التنفسية الكمية والتكرار.
   1. تنفيذ بروتوكول SUIT (الخطوات 5.1-5.3.9) في تركيز الأنسجة المختارة (الخطوة 7.1). يتجدد كل ركيزة، فك الارتباط، المثبط، وشرطة أبوظبي حتى لا يلاحظ أي استجابة أخرى. يبرئ التثبيط بأزايد الصوديوم في تجارب منفصلة.
      1. إضافة 5 ميكرولتر من 0.8 M مالات (2 mM التركيز النهائي) والمضي قدما على الفور إلى الحقن المقبل.
      2. Titrate 1 ميكرولتر زيادات 1 M بيروفات وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة, تستمر حتى لا يكون هناك زيادة إضافية في التنفس.
      3. Titrate 2 ميكرولتر زيادات 0.5 M ADP وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة, تستمر حتى لا يكون هناك زيادة إضافية في التنفس.
      4. Titrate 1 ميكرولتر زيادات من 2 M الغلوتامات وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة, تستمر حتى لا يكون هناك زيادة إضافية في التنفس.
      5. إضافة 5 ميكرولتر من 4 م Cytochrome ج (10 μM التركيز النهائي) وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار.
      6. Titrate 5 μL زيادات من 1 M Succinate وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة, تستمر حتى لا يكون هناك زيادة إضافية في التنفس.
      7. Titrate 5 ميكرولتر زيادات 0.5 M ADP وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة, تستمر حتى لا يكون هناك زيادة إضافية في التنفس.
      8. Titrate 0.5 μL زيادات من 1 MM FCCP وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة، وتستمر حتى لا يكون هناك زيادة إضافية في التنفس.
      9. Titrate 1 ميكرولتر زيادات من 150 ميكرومتر Rotenone وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة، وتستمر حتى لا يكون هناك انخفاض في زيادة التنفس.
      10. Titrate 1 ميكرولتر زيادات من 125 ميكرومتر Antimycin A وانتظر التنفس لتحقيق الاستقرار بعد كل حقنة، وتستمر حتى لا يكون هناك انخفاض إضافي في التنفس.
      11. إضافة 5 ميكرولتر من 0.8 م أسكوربات (2 متر تركيز نهائي).
      12. إضافة فورا 5 ميكرولتر من 0.2 M TMPD (.5 mM التركيز النهائي) الانتظار لزيادة في التنفس بطيئة. في تجربة منفصلة، أضف 10 ميكرولتر من 0.2 M TMPD (تركيز نهائي 1 mM).
      13. في تجارب منفصلة إضافة، 10 ميكرولتر، 25 ميكرولتر، 50 ميكرولتر، و 100 ميكرولتر من 4 م الصوديوم Azide (20 mM، 50 mM، 100 mM، 200 mM التركيز النهائي، على التوالي) على الفور عندما تدفق الجهاز التنفسي من الهضاب Ascorbate / TMPD.
   2. اختر تركيزات الركيزة والمثبطات التي تشبع داخل الحقنة الأولى لتحسين توقيت التجربة. استخدم ADP في تركيزات التشبع أو التشبع الفرعية للجمع بين تقييمات حساسية ADP وبروتوكولات SUIT التقليدية.
   3. استخدام تركيزات فك الارتباط دون الحد الأقصى لإثبات استجابة الجرعة دون تثبيط تدفق التنفس.

8. تحليل البيانات

1. تحليل SUIT
   1. حدد معدلات الحالة الثابتة أو الذروة من كل عملية تحديد وصادرة من أجل التخفيض التحليلي.
   2. التعبير عن البيانات كما pmol O₂ في الثانية الواحدة لكل ملغ من الأنسجة (pmol / s / ملغ).
   3. تحقيق التخفيض التحليلي من PM-L، PM-P، PMG-P، PMGS-P، وPMGS-E عن طريق طرح antimycin A معدل غير حساس من المعدل المعني (أي، معدل ثابت الدولة التي تم الحصول عليها بعد إضافة ADP).
      ملاحظة: PM: بيروفات + مالات; PMG: بيروفات + مالات + الغلوتامات; PMGS: بيروفات + مالات + الغلوتامات + سوشينات; -L:حالة تسرب; -P: حالة الفوسفور التأكسدي، -E: حالة نقل الإلكترون.
   4. تحقيق التخفيض التحليلي للCIV-E عن طريق طرح معدل azide الصوديوم غير حساسة من ذروة ascorbate / TMPD معدل.
   5. تحقيق التخفيض التحليلي PMG-E عن طريق طرح معدل rotenone غير حساسة من معدل PMGS-E.
   6. تحقيق الحد التحليلي من S-E عن طريق طرح antimycin معدل غير حساس من معدل rotenone غير حساسة.
   7. تحقيق الحد التحليلي من كفاءة التحكم سي السيتوكروم ج، علامة على سلامة الغشاء الخارجي، من خلال المعادلة التالية:
      ج ج = ((J_CHNOc - J_CHNO)/J_CHNO) x 100
      في المعادلة،_ج ج هو ٪ زيادة عند إضافة السيتوكروم ج،J_CHNOc هو تدفق الأكسجين بعد إضافة السيتوكروم ج،وJ_CHNO هو تدفق الأكسجين قبل إضافة السيتوكروم ج.
2. تحليل حساسية شرطة أبوظبي
   1. تحليلي تحديد الحركية لحساسية ADP بالنسبة لمعدل تسرب من succinate + rotenone (وليس معدل تجانس الأنسجة).
   2. رسم تدفق O₂ (المحور ص) مقابل تركيز ADP النسبي (المحور X). تحديد السرعة القصوى للجهاز التنفسي_{(الحد الأقصى}الخامس) كما تحقق معدل الذروة على المعايرة ADP.
   3. تحديد الحركية Michaelis-Menten باستخدام برنامج تركيب منحنى (PRISM، الإصدار 10.1) للكشف عن تركيز ADP الذي يتحقق 1/2 V_MAX (الظاهر K_M).

9. مراقبة الجودة الآلية

1. أداء مفيدة O₂ الخلفية على مدى تركيز الأكسجين المطلوب (0-600 ميكرومتر) ومعايرة صفر.
   1. إكمال الخطوتين 3.1 و 3.2
   2. إزالة سدادات و يستنشق الإيثانول 70٪ من الغرف (تجنب الغشاء المكشوفة في داخل الغرفة). شطف 4 مرات مع المقطر المزدوج H₂O، وملء الغرفة مع 2.25 مل من MiR05
   3. Hyperoxygenate الغرف إلى الأكسجين ~ 600 ميكرومتر.
   4. أدخل سدادات ببطء إلى موقفهم مغلقة تماما. سيفون قبالة المتوسطة الزائدة قذف من خلال الشعيرات الدموية الحقن وجمعها في بئر سدادة والسماح للإشارة الأكسجين لتحقيق الاستقرار (30-45 دقيقة).
   5. لإجراء معايرة الأكسجين، حدد المنطقة التي يكون فيها تركيز الأكسجين والمنحدر مستقرين، وافتح نافذة المعايرة للغرفة المعنية، وحدد علامة R1.
   6. إعداد محلول ثنائي الديثيونيت عن طريق حل 20 ملغ من هيدروسولفيت الصوديوم في 0.5 مل من الماء. الحد من التعرض للهواء كما يتأكسد ثنائي الديثيونيت مع مرور الوقت مع التعرض للأوكسجين.
   7. بمجرد استقرار إشارة الأكسجين، قم بحقن 1 ميكرولتر ولاحظ انخفاض تركيز الأكسجين. ضبط قوة الحل ثنائي الديثيونيت حسب الحاجة.
   8. حقن محلول ثنائي الديثيونيت الكافي لخفض تركيز الأكسجين إلى 450 ميكرومتر، 300 ميكرومتر، 225 ميكرومتر، 150 ميكرومتر، 75 ميكرومتر، و0 ميكرومتر، على التوالي. في كل حقنة، اسمح للأوكسجين بالاستقرار وحدد علامة للمنحدر الثابت. بمجرد أن يكون تركيز الأكسجين ~ 0 ميكرومتر ، ضع علامة على تركيز الأكسجين.
   9. لإجراء تصحيح خلفية O₂ ، حدد نافذة التدفق / المنحدر للغرفة المعنية ، وحدد O₂ Background Calibration، وانقر على Calibrate للحصول على علامات الاهتمام.
   10. لإجراء المعايرة الصفرية، افتح نافذة المعايرة للغرفة المعنية، وحدد علامة R0 التي تم تحقيقها بعد المعايرة ثنائية الليثيوم.
2. تنظيف الأجهزة
   1. شطف بسرعة كل غرفة بالماء النقي ثلاث مرات. للغسيل الأول، يستنشق المتجانسة، وملء الغرفة بالكامل بالماء، ومن ثم يستنشق الماء. للغسيل الثاني، وملء غرفة 3/4 كامل من الماء، وإدراج سدادات لإجبار المياه من خلال الشعيرات الدموية الحقن، يستنشق بعض الماء من خلال الشعيرات الدموية الحقن ومن ثم إزالة سدادات لاستبخاء غسل تماما.
   2. غسل الغرف مع الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق.
   3. على بالوعة أو كوب، تنظيف سدادات بالماء النقي، 70٪ الإيثانول، والإيثانول 100٪، مما اضطر السوائل من خلال الشعيرات الدموية الحقن باستخدام زجاجة غسيل.
   4. شطف بسرعة كل غرفة بالماء النقي مرتين.
   5. احتضان الغرف مع 2 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على ~ 2 ملغ من الميتوكوندريا المجمدة، lysate الخلية، أو الخلايا الليفية الحية لمدة 15 دقيقة.
   6. غسل الغرف بالماء النقي لمدة 5 دقائق مرتين.
   7. غسل الغرف مع الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق مرتين.
   8. غسل الغرف مع الإيثانول 100٪ لمدة 10 دقيقة.
   9. ملء الغرف مع الإيثانول 70٪.
      1. إذا كان تشغيل تجربة متتالية، وترك الغرف في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق ومن ثم الاستمرار في الخطوة 3.3.
      2. إذا اكتملت التجارب، ضع الأغطية على سدادات وإيقاف تشغيل الجهاز.
3. بعد كل استخدام، تنظيف المحاقن الحقن بشكل صحيح والحفاظ على المحاقن مخصصة للاستخدام مركب معين لمنع ترحيل.
   1. أدخل الحقنة في سائل الغسيل واغمر إبرة الحقن بالكامل.
   2. وضع السائل غسل في المحقنة إلى أقصى حجم.
   3. إزالة الحقنة من وعاء الغسيل، وإخراج السائل غسل في كوب ومن ثم لطخة الحقنة على منشفة ورقية.
   4. كرر الخطوات 9.3.1-9.3.3 ثلاث مرات في أقرب وقت ممكن بعد كل استخدام.

كشفت الدراسات الأولية أن أورام EO771 كانت مؤاكسة منخفضة وبالتالي تتطلب تركيزات عالية التجانس لتقييم تدفق O2 الكافي. وأجريت تجارب التحسين لتحديد نطاق تركيز الأنسجة المتجانس الأمثل للدراسة. تم إعداد تجانسات الورم في البداية في 40 ملغ / مل ثم مخففة خطيا. كان تدفق O2 الذي تم تطبيعه إلى كتلة الأنسجة متسقا عبر التركيزات(الأرقام 1A-D). ولوحظ أن 40 ملغم/مل أدت إلى استنفاد الأكسجين بسرعة ولم تكن مناسبة للتجارب(الشكل 1 ألف). تباطأ استهلاك الأكسجين بشكل كبير مع 30 ملغم / مل و 20 ملغم / مل ولكن لا يزال انخفض بسرعة في وقت قصير في غياب الركائز أو ADP (الشكل 1B، C). أدى تركيز 10 ملغم / مل إلى معدل استهلاك الأكسجين الأمثل(الشكل 1D)الذي من شأنه أن يدعم بروتوكول SUIT أطول و90 دقيقة.

تم استخدام بروتوكول SUIT لتقييم NADH- وS succinate المرتبطة OXPHOS وET، فضلا عن نشاط CIV(الشكل 2A). تمت إضافة بيروفات وماليت إلى تجانس الأنسجة في غياب ADP لدفع التسرب (L) من خلال NADH. ثم تمت إضافة تشبع ADP لدفع OXPHOS المرتبطة NADH القصوى (P)، تليها إضافة الغلوتامات. ثم تمت إضافة السيتوكروم ج لضمان سلامة الغشاء الخارجي. وكانت الزيادة في معدل التنفس أقل من 20٪ في جميع العينات(الشكل 2B). ونظرا للاستجابة منخفضة جدا لركائز المرتبطة NADH، كما تم تقييم إطلاق سراح سيتوكروم ج في وجود succinate وروتينون ولاحظ الحد الأدنى لتحفيز السيتوكروم ج (الشكل 2B). ومن المثير للاهتمام أن أوكسفوس المرتبطة NADH كان لا يكاد يذكر في أورام EO771 (الشكل 2C). ثم أضيفت Succinate في وجود بيروفاتي، مالات، والغلوتامات لتحفيز تدفق الإلكترون من خلال ديهيدروجيناز succinate. ثم تم ثدي FCCP لدفع تدفق الإلكترون الأقصى (E) ، والذي كشف أنه في أورام EO771 ، كان الفوسفور بدلا من الأكسدة يقتصر على التنفس(الشكل 2C). تم بعد ذلك تم تبليك الروتينون وأنتيميسين A لمنع معقدة I والثالث معقدة، على التوالي. ثم تمت إضافة أسكوربات و TMPD لدفع تدفق الإلكترون الأقصى من خلال CIV ، والذي يتم تثبيطه بعد ذلك بواسطة أزيد الصوديوم. يوضح الجدول 1 معادلات التخفيض التحليلي للبيانات الأولية(الجدول 2)لكمية المعلمات التنفسية المرسومة في الشكل 2C. بشكل عام ، فإن ملامح الجهاز التنفسي المتجانسة للورم(الشكل 2C)مماثلة لتلك الموجودة في خلايا EO771 غير المزروعة digitonin-permeabilized(الشكل 2D)باستثناء نقل الإلكترون الأقصى المنقوص المدعوم من الركائز المرتبطة ب N و S في الورم.

وبما أن التنفس المرتبط ب NADH كان ضئيلا ، فقد تم تقييم الحركية التنفسية للسجينات عن طريق المعايرة التدريجية ل ADP الفرعية التشبع حتى تحقق المعدل الأقصى (VMAX)(الشكل 3A، 3B). وكان تركيز نصف الحد الأقصى (KM)من ADP في وجود succinate + rotenone 37.5 ميكرومتر، في حين كانماكس V ~ 10.5 pmol / ثانية / ملغ (الشكل 3C). وهكذا، وعلى الرغم من معدلات الأكسدة الضعيفة نسبيا، كانت أورام EO771 حساسة للغاية ل ADP وتوليف ATP المستمر بتركيزات منخفضة نسبيا في ADP.

إن اختيار المناطق المناسبة من البيانات الأولية لاستخراجها أمر بالغ الأهمية لإعادة إنتاج التجارب والتحديد الكمي الدقيق. بالنسبة للسيتوكروم ج، يجب اختيار العلامة في الحالة الثابتة مباشرة قبل الحقن(الشكل 4A، علامة 1). غالبا ما يكون هناك قطعة أثرية حقن الأولية التي يمكن أن تليها فترة من الزمن (حوالي 5-10 دقيقة) حيث تدفق O2 ليست ثابتة. يتم تقييم كفاءة السيتوكروم ج عن طريق إجراء اختيار إضافي بمجرد استقرار تدفق O2 (الشكل 4A، علامة 2). الاختيارات بعد إضافة الركائز، ADP، أو معظم مثبطات مصنوعة أيضا بعد حقن القطع الأثرية وبمجرد أن استقر تدفق O2 (الشكل 4B). يتم الاختيار المستخدم لتحديد التنفس الأقصى غير المتجزيء في ذروة الزيادة التي تحققت أثناء المعايرة من FCCP ، والتي غالبا ما لا تكون الحقنة الأخيرة(الشكل 4C). يتم اختيار TMPD بعد إضافة كل من الأسكوربات و TMPD وعند زيادة الذروة في التنفس(الشكل 4D، علامة 1). فقط بعد هذه الذروة، يتم إضافة المثبط، azide الصوديوم، الذي يقلل بسرعة التنفس ولكن أيضا في كثير من الأحيان لديه حقنة قطعة أثرية أقل من معدل التنفس المثبطة(الشكل 4D). يتم إجراء علامة المانع مباشرة بعد حقن قطعة أثرية (الشكل 4D، علامة 2). تدفق O2 عادة لن تستقر وتستمر في الانخفاض.

الجدول 1: التحبط التنفسي واشتقاق التحليل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: خصائص العينة والجهاز التنفسي للورم الثديي Luminal B متجانسات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الشكل 1:تحسين تركيز الورم المتجانس. O2 تدفق (أحمر) وO2 تركيز (الأزرق) في تجانسات الورم الثديي أعدت في (أ) 40 ملغ / مل, (ب) 30 ملغ / مل, (C) 20 ملغ / مل, و (D) 10 ملغ / مل. ثوم: التنفس المتجانس للأنسجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2:تقييم طاقة OXPHOS و ET من خلال قياس التنفس عالي الدقة في متجانسات الورم المقتطعة حديثا. (A)مؤامرة تمثيلية لاستهلاك الأكسجين (الأحمر) والتركيزات (الزرقاء) على مدار الركيزة ، المثبط ، بروتوكول فك الارتباط. PM: بيروفات + مالات، D: ADP، G: الغلوتامات، ج: Cytochrome ج،S: Succinate، F: FCCP، تعفن: روتينون، أما: أنتيميسين A، Asc/TMPD: أسكوربات/تتراميتيل-ف-فينيلينيديامين. (ب) زيادة في المئة في تدفق O2 عند إضافة السيتوكروم ج. (C-D) التنفس بدعم من مالات، بيروفاتي، الغلوتامات، وsusinate في وجود ADP، FCCP، و ascorbate / TMPD في (C) EO771 المشتقة من الورم متجانسات و (D) غير المزروعة EO771 digitonin-permeabilized الخلايا. ثوم: التنفس الأنسجة متجانسة; رئيس الوزراء: بيروفات + مالات; PMG: بيروفات + مالات + الغلوتامات; PMGS: بيروفات + مالات + الغلوتامات + سوشينات; CIV: مجمع الرابع; -L: حالة تسرب; -P: حالة الفوسفور التأكسدي، -E: حالة نقل الإلكترون. N-مرتبط: تدفق O2 مدعوم بمجموعات ركيزة محددة مولدة ل NADH؛ NS المرتبطة: تدفق O2 بدعم من التقارب بين مجموعات الركيزة NADH-توليد محددة و succinate. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: EO771 الأورام الثديية عرض عالية ADP (أدينوسين 5′-diphosphate) حساسية. (أ) قطعة تمثيلية لاستهلاك الأكسجين (الأحمر) والتركيزات (الزرقاء) في جميع أنحاء بروتوكول المعايرة ADP المرتبطة S. ثوم: التنفس الأنسجة متجانسة; S/Rot: سوشينات/روتينون; دال: شرطة أبوظبي. (ب) التنفس بدعم من succinate في وجود rotenone وزيادة تركيزات ADP (0 ميكرومتر ADP = S / روت -L). (ج) معدل الحد الأقصى (VMAX)وتركيز نصف الحد الأقصى (KM)من ADP في وجود succinate + rotenone. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: ممثل تتبع يوضح اختيار علامة الخام O2 التدفقات لاستخراج البيانات. (أ) Cytochrome ج الاختيار: اختيار رقم 1 قبل الحقن Cytochrome ج واختيار عدد 2 بعد الحقن عندما استقر تدفق O2. ج السيتوكروم ج. (ب) الركيزة، ADP، واختيار المانع: اختيار رقم 1 بعد الحقن (succinate في هذه المؤامرة التمثيلية) حيث استقر تدفق O2. س: سوجينات. (ج) اختيار Uncoupler: اختيار رقم 1 في ذروة الزيادة في التنفس أثناء المعايرة uncoupler. في هذه المؤامرة المعايرة FCCP ممثل، والحقن الثالث يقلل قليلا التنفس وبالتالي لا يستخدم للاختيار. واو: الح ش ص. (D) اختيار TMPD: اختيار رقم 1 في ذروة زيادة التنفس بعد الحقن الأسكوربات و TMPD. اختيار آزيد الصوديوم: اختيار رقم 2 بعد حقن القطع الأثرية الحادة عندما ينخفض التنفس في البداية. As/Tm: أسكوربات/TMPD; آزد: أزيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.