Method Article

تطوير نموذج الزراعة المشتركة للخلايا لمحاكاة نقص تروية القلب / التروية في المختبر

DOI:

10.3791/62913

⸱

October 13th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المسافة المكانية هي معلمة رئيسية في تقييم إصابة نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين في نموذج الزراعة المشتركة لطبقات الخلايا البطانية وخلايا عضلة القلب المنفصلة ، مما يشير ، لأول مرة ، إلى أن تحسين البيئة المكانية للزراعة المشتركة ضروري لتوفير نموذج موات في المختبر لاختبار دور الخلايا البطانية في حماية الخلايا العضلية القلبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض القلب الإقفاري هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. يسبب التروية إصابة إضافية تتجاوز نقص التروية. يمكن للخلايا البطانية (ECs) حماية الخلايا العضلية القلبية (CMs) من إصابة التروية من خلال التفاعلات بين الخلايا الخلوية. يمكن أن تساعد الثقافات المشتركة في التحقيق في دور التفاعلات بين الخلايا والخلايا. الزراعة المشتركة المختلطة هي أبسط نهج ولكنها محدودة لأن العلاجات المعزولة والتحليلات النهائية لأنواع الخلايا المفردة غير ممكنة. للتحقق مما إذا كان بإمكان ECs تخفيف تلف خلايا CM اعتمادا على الجرعة وما إذا كان يمكن تحسين هذه الحماية بشكل أكبر عن طريق تغيير مسافة الاتصال بين خطي الخلايا ، استخدمنا الخلايا البطانية للشريان التاجي الأولي للماوس والخلايا العضلية القلبية للفأر البالغ لاختبار ثلاثة أنواع من إدخالات زراعة الخلايا التي تختلف في مسافة الطبقة بين الخلايا عند 0.5 ، 1.0 ، و 2.0 مم ، على التوالي. في CMs فقط ، زادت الإصابة الخلوية كما تم تقييمها بواسطة إطلاق نازعة هيدروجيناز اللاكتات (LDH) بشكل كبير أثناء نقص الأكسجة وعند إعادة الأكسجين عندما كانت المسافة 2.0 مم مقارنة ب 0.5 و 1.0 مم. عندما كانت ECs و CMs على اتصال مباشر تقريبا (0.5 مم) ، لم يكن هناك سوى تخفيف خفيف لإصابة إعادة الأكسجين ل CMs بعد نقص الأكسجة. مع مسافة 2.0 مم ، خففت ECs إصابة CM أثناء كل من نقص الأكسجة ونقص الأكسجة / إعادة الأكسجين ، مما يشير إلى أن التباعد الثقافي الكافي ضروري ل ECs للتحدث مع CMs ، بحيث يمكن لجزيئات الإشارة المفرزة أن تدور وتحفز المسارات الوقائية بالكامل. تشير النتائج التي توصلنا إليها ، لأول مرة ، إلى أن تحسين البيئة المكانية للثقافة المشتركة بين EC / CM أمر ضروري لتوفير نموذج موات في المختبر لاختبار دور ECs في حماية CM ضد إصابة نقص التروية / التروية المحاكاة. والهدف من هذا التقرير هو توفير نهج تدريجي للمحققين لاستخدام هذا النموذج الهام لصالحهم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض نقص تروية القلب هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم 1,2. ومع ذلك ، فإن عملية علاج التروية يمكن أن تسبب في حد ذاتها وفاة الخلايا العضلية القلبية ، والمعروفة باسم إصابة نقص تروية عضلة القلب / التروية (IR) ، والتي لا يوجد لها حتى الآن علاج فعال3. تم اقتراح الخلايا البطانية (ECs) لحماية الخلايا العضلية القلبية (CMs) من خلال إفراز إشارات paracrine ، وكذلك التفاعلات من خلية إلى خلية4.

وقد استخدمت نماذج الزراعة المشتركة للخلايا على نطاق واسع للتحقيق في دور التفاعلات بين الخلايا الأوتوتيكرين و/أو الباراكرين في وظيفة الخلية ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير التجريبي / الطلاء

  1. الحفاظ على CMs و ECs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. قم بإذابة كلا الخطين الخلويين عند وصولهما من البائعين. طبق في قوارير T25 بعد غسلها بوسائط جديدة. يوصى بشراء كل وسائط زراعة خلايا من نفس البائعين الذين تم شراء الخلايا منهم. في اليوم التالي ، قم بتحديث الخلايا بالوسائط واستخدمها عند الالتقاء.
    2. حافظ على حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 21٪ O2 ، 5٪ CO 2 ، 74٪ N2 واحتفظ بها رطبة.
      ملاحظة: يتم عزل الخلايا البطانية للشريان التاجي الأولي للفأر المستخدمة في هذا البروتوكول من الشرايين التاجية للفئران C57BL/6، ويتم عزل الخلايا العضلية القلبية للفئران البالغة من ق....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع أنواع الإدخالات الثلاثة (A ، B ، C) المستخدمة في هذه التجربة لها نفس حجم المسام البالغ 0.4 ميكرومتر. والفرق الوحيد بينها هو الارتفاع من الإدراج إلى القاعدة، الذي يسمح بأن تكون المسافات بين طبقتي الخلايا المستزرعتين معا 0.5 و 1.0 و 2.0 ملم، على التوالي، (الشكل 3) وأنها من بائعين مختلفين (للاطلاع على التفاصيل، انظر جدول المواد).

لإنشاء نموذج للزراعة المشتركة في المختبر مع طبقات منفصلة من خطين خلويين يخضعان للموارد البشرية لمحاكاة إصابة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
تم استخدام نماذج الزراعة المشتركة للخلايا لدراسة الآليات الخلوية لحماية القلب. وبالتالي ، فإن كيفية إنشاء طبقتين منفصلتين مع مسافة ذات مغزى بينهما أمر بالغ الأهمية لتطوير نموذج مناسب للثقافة المشتركة. التحدي في دراسة محاكاة الأشعة تحت الحمراء ، أي الموارد البشرية ، والإصابة هو أنه ليس فقط نقص التروية (نقص الأكسجة) نفسه ولكن أيضا إعادة التروية (إعادة الأكسجين) يؤدي إلى تفاقم الخلل الوظيفي الخلوي. لذلك ، يجب أن يعكس النموذج الواقعي هذه الخصائص من خلال ، على سبيل المثال ، إظ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية (I01 BX003482) ومن قبل الصناديق المؤسسية ل M.L.R.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

خلايا خزانة غطاء محرك AG الغازات تستخدم شركة لإدراج ثقافة الخلايا المستخدمة في إدراج ثقافة الخلايا تستخدم في أجهزة الطرد المركزي متوسطة كاملة شرائح تقنيات الخلايا البطانية

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
عضلة القلب للفأر البالغ (CMs)Celprogen Inc11041-14معزولة من أنسجة قلب الفأر C57BL / 6J البالغة
عداد الخلايا الآلي الكونتيسة IIInvitrogenA27977عد الخلايا لحساب أعداد الخلايا
السلامة الحيويةNuaireNU425400السيارة المعقم
لثقافة الخلية تجميد الخلايا المتوسطةBiologics Inc6916تستخدم لتجميد الخلايا لتخزين خط الخلية على المدى الطويل
حاضنة ثقافةالخلية NuaireNu-5500لتوفير حالة معيشية طبيعية للخلية (21٪ O 2< / sub> ، 5٪ CO2< / sub> ، 74٪ N2< / sub> ، 37 & deg ؛ ج ، مرطب )
حاضنة ثقافة الخلية خزان الغازالمضغوطةUN1013الغاز اللازم لحاضنة زراعة الخلايا   ؛
إدراج ثقافة الخلية أ (0.5 مم)CorningInc 353095المتبادلة EC-CM
B (1.0 مم)PIHP01250Millicell Milliporeللزراعة المشتركة EC-CM
C (2.0 مم)Greiner Bio-One662640للزراعة المشتركة EC-CM
Anstel Enterprises Inc4235لطلاء وتمرير زراعة الخلايا
قوارير ثقافة الخلايا CMs T25Celprogen IncE11041-14تستخدم للثقافة العادية CMs ، مطلية من قبل الشركة المصنعة
CMs ثقافة الخلية المتوسطة الكاملةCelprogen IncM11041-14SCMs ثقافة
CMs ثقافة خلية متوسطة كاملة خالية من الفينولCelprogen IncM11041-14PNCMs وسط ثقافة بدون فينول أحمر يستخدم أثناء قياس LDH
CMs لوحات زراعة الخلايا 96 بئرCelprogen IncE11041-14-96wellتستخدم لتجارب قياس LDH ، مغلفة من قبل الشركة المصنعة
CMs Hypoxia Cell Culture MediumCelprogen IncM11041-14GFPNCMs ثقافة الخلايا تحت حالة نقص الأكسجين (خالية من الجلوكوز والمصل)
غرفة عد خلايا الكونتيسةInvitrogenC10283شرائح العد المستخدمة في عداد الخلايا
Cyquant LDH Toxicثرمو علمية مجموعة قياس C20301LDH
قوارير ثقافة الخلايا ECs T25Fisher Scientific  FB012935المستخدمة في ECs للثقافة العادية
ECs ثقافة الخلية المتوسطةالخلية الكاملة Biologics IncM1168ECs ثقافة ECs متوسطة كاملة
ECs وسط ثقافة الخلية كاملة خالية من الفينولخلية Biologics IncM1168PFECs وسط ثقافة بدون فينول أحمر يستخدم أثناء قياس
LDH ECs لوحات زراعة الخلايا 96 بئرفيشر Scientific (Costar)3370تستخدم لتجارب LDH قياس
ECs ثقافة محلول الطلاء القائمعلى الجيلاتين Cell Biologics Inc6950تستخدم لطلاء قوارير وألواح ECs
ثقافة الخلايا نقص الأكسجة MediumCell Biologics IncGPF1168ECs في حالة نقص الأكسجين (خالية من الجلوكوز والمصل)
مصل الأبقار الجنينية (FBS)فيشر ScientificMT35011CVFBS-HI USDA - معتمدة لزراعة الخلايا وصيانتها
الخلايا الجذعيةلغرفة نقص الأكسجة27310لخلق حالة نقص الأكسجين مع 0.01٪ O 2< / sub > البيئة
Hypoxia Chamber FlowMeter StemCell Technologies27311للاتصال بخزان الغاز الذي يعاني من نقص الأكسجة للحصول على سرعة تدفق غاز
ثابتة خزان غاز نقص التأكسج (0.01٪ O2< / sub> Cylinder) الغازاتالمضغوطة A-LUN1956تستخدم لغسل الوسط والغرفة الناقصة للأكسجين (0.01٪ O 2< / sub> / 5٪ CO2< / sub> / 94.99N 2< / sub>) المجهر
  ؛نيكونTMSلمراقبة حالة الخلية
للشريان التاجي الأولي للفأر (ECs) CellBiologics IncC57-6093معزولة من الشريان التاجي للفئران C57BL / 6
NUNC 15ML CONICL TubesFisher Scientific12565269لعملية زراعة الخلايا والتجارب وإعداد المحلول وما إلى ذلك.
NUNC 50ML CONICL TubesFisher Scientific12565271لعملية زراعة الخلايا والتجارب وإعداد المحلول وما إلى ذلك.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Sigma-AldrichD8662يستخدم لغسل الخلايا أثناء الثقافة أو التجارب قارئ
اللوحةBioTek Instrument11120533قراءة اللوحة اللونية أو الفلورومترية
تفاعل 96 Well Palte (شفاف بدون غطاء)يستخدم 12565226 فيشر العلميلقراءة لوحة قياس LDH
Trypsin / EDTA ل CMsCelprogen IncT1509-0141 × معقم مفلتر واختبار زراعة الأنسجة
Trypsin / EDTA ل ECsCell Biologics Inc6914/06190.25٪ ، تم اختبار قطع الخلية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Co CultureCardiac IschemiaReperfusion InjuryEndothelial CellsCardiomyocytesHypoxia ReoxygenationLDH ReleaseCell Cell InteractionsIn Vitro ModelCulture Inserts

Related Articles