نحن نصف بروتوكولا للحث على الانتقال المرحلي للبروتين الرابط للحمض النووي TAR 43 (TDP-43) عن طريق الضوء في الخلايا العصبية الحركية الشوكية باستخدام سمك الحمار الوحشي كنموذج.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
انتقال المرحلة البصرية من TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية ليرقات حمار وحشي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تجميع البروتين غير طبيعي وضعف الخلايا العصبية الانتقائية هما السمتان الرئيسيتان للأمراض العصبية التنكسية. ويمكن استجواب العلاقات السببية بين هذه الميزات من خلال التحكم في مرحلة انتقال البروتين المرتبط بالمرض في نوع الخلية الضعيفة، على الرغم من أن هذا النهج التجريبي كان محدودا حتى الآن. هنا، ونحن نصف بروتوكول للحث على مرحلة الانتقال من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي ملزمة البروتين TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية من يرقات حمار وحشي لنمذجة تجميع السيتوبلازمية من TDP-43 التي تحدث في الخلايا العصبية الحركية المنحطة في التصلب الجانبي الضموري (ALS). نحن نصف طريقة وراثية بكتيرية للكروموسوم الاصطناعي (BAC) لتقديم متغير TDP-43 البصري بشكل انتقائي إلى الخلايا العصبية الحركية الشوكية لسمك الحمار الوحشي. تسمح الشفافية العالية ليرقات حمار وحشي بالانتقال المرحلي ل TDP-43 البصري في الخلايا العصبية الحركية الشوكية عن طريق إضاءة خارجية بسيطة باستخدام ثنائي الباعث للضوء (LED) ضد الأسماك غير المقيدة. كما نقدم سير عمل أساسي للتصوير الحي للخلايا العصبية الحركية الشوكية حمار وحشي وتحليل الصور مع برامج فيجي / ImageJ المتاحة بحرية لتوصيف استجابات TDP-43 optogenetic للضوء. يمكن هذا البروتوكول من توصيف مرحلة انتقال TDP-43 والتكوين الكلي في بيئة خلوية ضعيفة من ALS ، مما يسهل التحقيق في عواقبه الخلوية والسلوكية.
المقدمة
تتحكم حبيبات ريبونوكليوبروتين (RNP) في عدد لا يحصى من الأنشطة الخلوية في النواة والسيتوبلازم من خلال تجميع أقسام خالية من الأغشية عبر فصل المرحلة السائلة السائلة (LLPS) ، وهي ظاهرة يتحول فيها السائل المتجانس إلى مرحلتين سائلتين متميزتين1،2. وLPS dysregulated من البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة التي تعمل عادة كمكونات حبيبات RNP تعزيز مرحلة الانتقال غير طبيعي، مما يؤدي إلى تجميع البروتين. وقد تورطت هذه العملية في الأمراض العصبية النمائية والعصبية3,4,5. التقييم الدقيق للعلاقة السببية بين LLPS الشاذة من البروتينات الر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع أعمال الأسماك وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر التابع للجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (رقم الموافقة 24-2) للمعهد الوطني لعلم الوراثة (اليابان)، الذي لديه ضمان لرعاية الحيوان في الملف (رقم الضمان A5561-01) في مكتب الرعاية الحيوانية المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH، الولايات المتحدة الأمريكية).
1. بناء BACs للتعبير عن الجين TDP-43 optogenetic من المروج mnr2b
- إعداد البكالوريا
- شراء استنساخ BAC حمار وحشي يحتوي على جراد mnr2b حمار وحشي (CH211-172N16، BACPAC الجينوم). تنقية الحمض النووي BAC من ثقافة LB 5 مل بين عشية وضحاها من DH10B Escherichia القولونية (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
التصوير الحي للبروتينات TDP-43 البصرية وغير البصرية في الخلايا العصبية الحركية الشوكية mnr2b+ ليرقات حمار وحشي
للحث على الانتقال المرحلة TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية في حمار وحشي، تم بناء TDP-43h الإنسان التي يتم وضع علامة مع mRFP1 و CRY2olig22 في N- و C-termini، على التوالي، وعينت على أنها opTDP-43h14 (الشكل 1A). تم إدخال جزء الجينات opTDP-43h في BAC يحتوي على موضع
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التعبير mnr2b-BAC بوساطة opTDP-43h وEGFP-TDP-43z في حمار وحشي يوفر فرصة فريدة للتصوير الحي للانتقال المرحلة TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية. الشفافية البصرية لأنسجة الجسم من يرقات حمار وحشي يسمح لتحفيز optogenetic بسيطة وغير الباضعة من opTDP-43h. أظهرت المقارنات بين الخلايا العصبية الحركية الشوكية المفردة بمرور الوقت أن قلة القلة المعتمدة على الضوء من opTDP-43h تسبب تجمعها السيتوبلازمي ، والذي يذكرنا بأمراض ALS.
واحدة من المعلمات الحرجة التي تحدد سلوك المرحلة من البروتين الم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
كا وKK هما مخترعا الملكية الفكرية الموصوفة في هذه المخطوطة وقد تم تقديم براءات اختراع مؤقتة من قبل المعهد الوطني لعلم الوراثة.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق سيريكا (KA) وأرقام منحة KAKENHI JP19K06933 (KA) وJP20H05345 (KA).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجهر متحد البؤر | أوليمبوس | FV1200 | |
| مجهر التألق | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| مجهر مجسم مضان | Leica | MZ16FA | |
| طبق قاعدة زجاجي | IWAKI | 3910-035 | |
| حاضنة | MEE | CN-25C | |
| لوحة LED | Nanoleaf Limited | مجموعة Nanoleaf AURORA أكثر ذكاء | |
| مقياس الطاقة الضوئية | HIOKI | 3664 | |
| مستشعر بصري | HIOKI | 9742-10 | |
| محلول أحمر الفينول 0.5٪ | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA بوليميراز | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | |
| طبق | FALCON | 353046 | |
| مسبار مطياف BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| إبرة حقنة | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| استنساخ أسماك الزرد BAC CH211-172N16 | BACPAC الجينوم | CH211-172N16 |
المراجع
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biol....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
