مقالة منهجية

Kinetx: إطار عمل برمجي لفحص وتحليل التدفق الخلوي المشترك لقياس وتصنيف تنشيط الصفائح الدموية كميا في الوقت الفعلي.

DOI:

10.3791/62947

⸱

أكتوبر 7, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1ICMR, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Institute of Cardiovascular Sciences, University of Birmingham

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتفاعل الصفائح الدموية بسرعة مع مجموعة من المحفزات. تصف هذه الورقة مقايسة وظيفة الصفائح الدموية القائمة على قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي وبرنامج مفتوح المصدر مطور حديثا (Kinetx) لتمكين القياسات الحركية الكمية لإطلاق حبيبات الصفائح الدموية ، وربط الفيبرينوجين ، وتدفق الكالسيوم داخل الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتفاعل الصفائح الدموية بسرعة مع إصابة الأوعية الدموية وتخضع للتنشيط استجابة لمجموعة من المحفزات للحد من فقدان الدم. تقيس العديد من اختبارات وظائف الصفائح الدموية استجابات نقطة النهاية بعد فترة زمنية محددة وليس معدل تنشيط الصفائح الدموية. ومع ذلك ، فإن المعدل الذي تحول به الصفائح الدموية المحفزات خارج الخلية إلى استجابة وظيفية هو عامل أساسي في تحديد مدى كفاءة استجابتها للإصابة ، والارتباط بالجلطة المكونة ، والإشارة إلى تجنيد الصفائح الدموية الأخرى. تصف هذه الورقة مقايسة وظيفة الصفائح الدموية القائمة على قياس التدفق الخلوي والتي تتيح الحصول على البيانات وتحفيز العينة في وقت واحد وتستخدم برنامجا مفتوح المصدر مطور حديثا (Kinetx) لتمكين القياسات الحركية الكمية لإطلاق حبيبات الصفائح الدموية ، وربط الفيبرينوجين ، وتدفق الكالسيوم داخل الخلايا. تم تطوير Kinetix بحيث يمكن للمستخدمين تغيير المعلمات مثل درجة التنعيم أو تحديد نقاط البيانات النائية أو المقاييس الزمنية. لمساعدة المستخدمين غير المألوفين على بيئة R ، يمكن إجراء تحليل Kinetix للبيانات بواسطة أمر واحد. يسمح هذا معا بقياس وتصنيف مقاييس تنشيط الصفائح الدموية في الوقت الفعلي ، مثل المعدل ، والتسارع ، والوقت اللازم لمعدل الذروة ، والوقت اللازم لذروة الكالسيوم ، وتغييرات الشكل النوعية. تعطي القياسات الحركية لتنشيط الصفائح الدموية نظرة ثاقبة فريدة لسلوك الصفائح الدموية خلال المراحل الأولى من التنشيط وقد توفر طريقة للتنبؤ بتجنيد الصفائح الدموية في الجلطة المكونة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الصفائح الدموية دورا مركزيا في الإرقاء وتولد استجابة سريعة ومتعددة الأوجه لإصابة الأوعيةالدموية 1،2. تقيس اختبارات وظائف الصفائح الدموية الحالية جوانب مختلفة من تفاعل الصفائح الدموية ، والتي تمثل أفعالها المرقئة في الجسم الحي. تقليديا ، تم تقييم وظيفة الصفائح الدموية باستخدام فحوصات نقطة النهاية التي تقيس ارتباط الفيبرينوجين أو إطلاق الحبيبات أو تراكم الصفائح الدموية في الصفائح الدموية المحفزة لفترة كافية لتحقيق أقصى تنشيط3،4. لا تأخذ هذه الاختبارات في الاعتبار الوقت الذي تستغرقه الصفائح الدموية لتحويل المحفزات خارج الخلية إلى إشارات داخل الخلايا وتدفق الكالسيوم وبالتالي تحبيب وترتبط بالجلطة المتنامية. يتدفق الدم بمعدل قص يصل إلى 20 داين/سم3 في الأوردة و 80 داين/سم3 في الشرايين الكبيرة5، مما يؤكد على الحاجة إلى الصفائح الدموية لمواجهة هذا المعدل السريع من التدفق عن طريق الكشف عن المحفزات خارج الخلية ومعالجتها والاستجابة لها بسرعة للارتباط بالجلطة المكونة ودعم نموها المستمر.

يمكن أن يختلف معدل تنشيط الصفائح الدموية بشكل مستقل عن الحد الأقصى لتنشيط الصفائح الدموية. كيناز مرتبط بالإنتجرين (ILK) هو بروتين يشارك في تنظيم الإنتجرينات β1 و β3 في الصفائح الدموية6،7. أظهر التثبيط أو الحذف المحدد ل ILK في الجسم الحي أن المعدل ، ولكن ليس المدى الأقصى لتنشيط الصفائح الدموية ، قد تأثر في غياب ILK8 الوظيفي. تم تحديد الاختلافات بين معدل التجميع والحد الأقصى لمستوى التجميع أيضا في الفئران التي تعاني من نقص في CALDAG GEFI9،10 ، وهو جزيء إشارات يشارك في تنظيم الإشارات من الداخل إلى الخارج عبر RAP111.

توضح هذه النتائج أن معدل الصفائح الدموية ومستويات التنشيط القصوى يمكن أن يكونا مستقلين وأن قياسات التنشيط الأقصى قد لا تكون وصفية لسلوك الصفائح الدموية حتى هذه النقطة. قد تؤثر هذه الاختلافات في الوقت المستغرق لتنشيط الصفائح الدموية بشكل عميق على ارتباطها الأولي بالجلطة المتنامية ، مما يؤثر على الهندسة المعمارية والحجم الكلي للجلطة. تسلط هذه الاختلافات بين معدل الصفائح الدموية والتنشيط الأقصى الضوء على الحاجة إلى اختبار لقياس معدل تنشيط الصفائح الدموية بدقة ويمكن استخدامها لاكتشاف الفروق داخل السكان.

تصف هذه الورقة طريقة تقيس بدقة تنشيط الصفائح الدموية وتدفق الكالسيوم في الوقت الفعلي وتحسب مجموعة من المقاييس ، بما في ذلك معدل تنشيط الصفائح الدموية والوقت المستغرق للصفائح الدموية للوصول إلى الحد الأقصى لمعدل التنشيط والحد الأقصى لتدفق الكالسيوم. تعطي هذه القياسات الحركية لتنشيط الصفائح الدموية نظرة أفضل على سلوك الصفائح الدموية خلال المراحل الأولى من تكوين الجلطة وتوفر طريقة للتنبؤ بمدى سرعة تجنيد الصفائح الدموية في الجلطة المكونة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدم هذا البروتوكول الدم البشري الكامل والصفائح الدموية من متبرعين أصحاء ليس لديهم حالات صحية أساسية ولا يتناولون أي دواء معروف أنه يتداخل مع وظيفة الصفائح الدموية بعد موافقة خطية مستنيرة وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث جامعة ريدينج.

1. جمع الدم وتحضير البلازما الغنية بالصفائح الدموية

  1. اجمع الدم المحيطي في مكنسة كهربائية تحتوي على 3.2٪ سترات الصوديوم
  2. تخلص من أول 3 مل.
  3. دع الدم يرتاح عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الطرد المركزي.
  4. تحضير البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) عن طريق الطرد المركزي عند 140 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة الفحص ، والتي تم الانتهاء منها في غضون 60 دقيقة من الطرد المركزي.

2. إعداد الصك

ملاحظة: يعد نظام السوائل غير المضغوطة ضروريا لقياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي حيث يتم تحفيز الصفائح الدموية في وقت واحد حيث يسجل مقياس التدفق الخلوي الأحداث.

  1. استخدم مقياس التدفق الخلوي غير المضغوط لإجراء قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي.
  2. لإجراء الفحص عند 37 درجة مئوية ، قم بتوصيل حصيرة تشريح الماوس بالمسرح لوضع اللوحة المكونة من 96 بئرا. سخني السجادة إلى 37 درجة مئوية طوال مدة الفحص.
  3. ضع لوحا بسعة 96 بئرا فوق السجادة الساخنة للسماح بالحضانة المستمرة عند 37 درجة مئوية (الشكل 1)

3. إعداد الفحص

  1. ربط الفيبرينوجين وتعبير P-selectin
    1. قم بتغطية صفيحة ميكروتيتر من مادة البولي بروبيلين 96 بئر مستديرة القاع وغير المعالجة ب 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) في محلول ملحي من Hepes (HBS ؛ 10 ملي مولار Hepes pH 7.4 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي ملي مجم4 · 7 ساعات20) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    2. تحضير مزيج الأجسام المضادة في HBS الذي يحتوي على 5 ملي مولار من الجلوكوز (HBS-G). أضف الأجسام المضادة المضادة للفيبرينوجين المسماة بالفلوريسين (FITC) (FITC-FGN ؛ التخفيف 1: 37.5 (v / v)) ومضاد للسيليكتين المضاد للسيليكتين (APC-CD62P ؛ التخفيف 1: 37.5 (حجم / حجم)) إلى HBS-G (الحجم النهائي: 225 ميكرولتر) واحتضانه في صفيحة 96 بئرا عند 37 درجة مئوية.
    3. مباشرة قبل جمع الأحداث ، أضف PRP إلى مزيج الأجسام المضادة HBS-G عند تخفيف 1: 600 (حجم / حجم).
      ملاحظة: مطلوب حجم منخفض من PRP لضمان عدم تجاوز حد الحدث وتقليل تراكم الصفائح الدموية في العينة. تم فحص تخفيف الصفائح الدموية في الدراسات التجريبية ولا يؤثر على معدل التنشيط.
    4. احتضان مزيج التنشيط الذي يحتوي على FITC-FGN ، (التخفيف 1: 37.5 (حجم / حجم)) و APC-CD62P (التخفيف 1: 37.5 (حجم / حجم)) وناهض عند 37 درجة مئوية. تشمل ناهضات الثرومبين (thr ؛ 0.0012-1 U / mL) في وجود ببتيد Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP ؛ 1.18 ملي مولار) ، الببتيد المرتبط بالكولاجين المتشابك (CRP-XL ؛ 0.004-10 ميكروغرام / مل) ، ثنائي فوسفات الأدينوزين (ADP ؛ 0.04-4 ميكرومتر) ، الأدرينالين (epi ؛ 20-200 ميكرومتر) ، 9،11-Dideoxy-11α ، 9α-epoxymethanoprostaglandin F2α (U46619 ؛ 0.02-5 ميكرومتر) ، وببتيد منشط مستقبلات الثرومبين 6 (TRAP-6 ؛ 0.04-10 ميكرومتر).
  2. تدفق الكالسيوم
    ملاحظة: تم إجراء هذا الاختبار باستخدام مجموعة أدوات فحص الكالسيوم التجارية (جدول المواد)
    1. قم بتغطية صفيحة ميكروتيتر مستديرة القاع غير المعالجة من مادة البولي بروبيلين ذات القاع المستدير وغير المعالجة بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن من Hepes طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. لتحضير صبغة فحص الكالسيوم ، أضف 100 مل من محلول فحص الكالسيوم و 2 مل من محلول مخزون البروبينسيد (250 مل) إلى زجاجة واحدة من كاشف الكالسيوم للحصول على محلول تحميل كاشف الكالسيوم 2x.
    3. لتحضير Fluo-4 / HBS-G ، قم بتخفيف صبغة فحص الكالسيوم باستخدام HBS-G بنسبة 1: 1 ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. أضف 225 ميكرولتر من Fluo-4 / HBS-G إلى الآبار المناسبة لصفيحة 96 بئرا عند 37 درجة مئوية.
    4. احتضان PRP عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند تخفيف 1: 1 باستخدام Fluo-4 / HBS-G.
    5. تحضير مزيج التنشيط في Fluo-4 / HBS-G واحتضانه عند 37 درجة مئوية. تشمل ناهضات الثرومبين (1 وحدة / مل) في وجود GPRP و CRP-XL (0.5 ميكروغرام / مل) ADP (1 ميكرومتر) و أدرينالين (20 ميكرومتر) و U46619 (1 ميكرومتر) و TRAP-6 (1 ميكرومتر).
    6. قبل جمع الأحداث مباشرة ، أضف PRP / Fluo-4 / HBS-G إلى 225 ميكرولتر من مزيج Fluo-4 / HBS-G في تخفيف نهائي من PRP (بعد إضافة ناهض) من 1: 600 (حجم / حجم ؛ 0.5 مل في 300 مل من الحجم النهائي).

4. إجراء الفحص وجمع البيانات

  1. اضبط مقياس التدفق الخلوي على معدل تدفق على "بطيء" بمتوسط عدد 1000 حدث في الثانية (eps) وبحد أقصى 3000 حلقة في الثانية. اضبط العتبة على 20000 لتجنب تسجيل حطام الخلية.
  2. قم ببوابة مجموعة الصفائح الدموية باستخدام مخططات التشتت الأمامي (FSC) والمبعثر الجانبي (SSC). لجمع البيانات ، ارسم FSC-A مقابل SSC-A لبوابة مجموعة الصفائح الدموية بدقة و FL1 أو FL4 مقابل الوقت لتسجيل أحداث الفلورسنت بمرور الوقت.
  3. يستغرق مقياس التدفق الخلوي 14 ثانية لبدء تسجيل الأحداث. بعد ذلك ، دع الجهاز يسجل الأحداث في كل بئر لمدة 5 ثوان أخرى قبل إضافة 75 ميكرولتر من مزيج التنشيط بسرعة باستخدام طرف تحميل الهلام لضمان الخلط التلقائي (الشكل 1).
  4. اجمع الأحداث لمدة 5 دقائق وقم بإعداد المخططات لتسجيل قناة 488 (FL1 ؛ 533/30 - FITC-fibrinogen / FLUO-4) مقابل الوقت وقناة 633 (FL4 ؛ 675/25 - APC-P-selectin) مقابل الوقت.
  5. احفظ بيانات المؤامرة للقنوات 488 و 633 من كل منها بالإضافة إلى ملفات CSV.

5. تحليل البيانات

  1. قم بتنزيل أحدث إصدار من Kinetx12.
    ملاحظة: يتضمن التنزيل جميع التعليمات البرمجية المطلوبة لتحليل البيانات التي تم إنشاؤها من الفحص ويرافقه مجموعة اختبار من البيانات التجريبية من عشرة مانحين ومخرجات تم إنشاؤها من تحليلهم (يمكن إعادة إنشاء هذه النتائج والتحقق من صحتها عبر الإجراءات التالية) (الشكل 2).
  2. إعداد بيئة R
    1. استخدم لغة البرمجة R عبر بيئة RStudio. قم بتثبيت R13 و RStudio14 والحزم التالية: ggplot2 و dplyr و plotrix و minpack.lm و tidyverse و psych. تأكد من تثبيت جميع الحزم المطلوبة مسبقا بنجاح.
    2. إنشاء بيانات وصفية: ضع ملفا نصيا (يسمى wellData.txt) داخل الدليل نفسه مثل البيانات. يصف ناهضات ، وتركيزاتها ، وأي أجسام مضادة ، والمقايسة (الوظيفة أو الكالسيوم) المستخدمة لإنشاء كل ملف CSV.
    3. ضع ملفا نصيا ثانيا ('IsotypeData.txt') في نفس الدليل وحدد الأنماط المتماثلة. يمكن أن تعمل الملفات المتوفرة في التنزيل ("البيانات / wellData.txt" و "البيانات / IsotypeData.txt") كقالب ، ويمكن تكييفها بسهولة مع الناهضات والمثبطات والتركيزات البديلة.
    4. تحليل البيانات: تتكون Kinetx من ثلاث وظائف كما هو محدد في الخطوات 5.2.5-5.2.7.
    5. kinetxProcess.R: تعالج هذه الوظيفة بيانات قياس التدفق الخلوي الوظيفي الخام. لتشغيل اكتب kinetxProcess('موقع البيانات','أين يجب وضع المخرجات','FL1' (ل FITC-anti-fibrinogen, أو 'FL4' (ل APC-CD62P)
    6. kinetxProcessCalcium.R: تقوم هذه الوظيفة بتحليل وتصنيف بيانات تدفق الكالسيوم. لتشغيل اكتب kinetxProcessCalcium('موقع البيانات','أين تضع المخرجات','FL1')
    7. kinetxSummary.R: تلخص هذه الوظيفة البيانات. لتشغيل اكتب kinetxSummary('موقع البيانات','أين تضع المخرجات','FL1').
    8. لتشغيل جميع الوظائف المذكورة أعلاه (5.2.5-5.2.7) على بيانات الاختبار ، استخدم البرنامج النصي (test. R).
      ملاحظة: تنتج الوظيفتان الأوليان أرقاما لكل متبرع تظهر البيانات الأولية بالإضافة إلى المنحنيات المجهزة. يتم وضع جميع المخرجات وجدول البيانات الذي يلخص البيانات في موقع الإخراج.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكشف تحليل قياس التدفق الخلوي الوظيفي في الوقت الفعلي عن اختلافات في شكل منحنيات التنشيط بين ناهضات وبين المتبرعين
يزيل تحليل البيانات للبيانات الوظيفية (التعرض P-selectin وربط الفيبرينوجين) باستخدام Kinetx نقاط البيانات التي تقع خارج النطاقات المعقولة (>200000 أو <1) و <2.80 ثانية (عدم ضبط الوقت على هذه النقطة) ، وتطبيع البيانات إلى متوسط الأنماط المتماثلة ويناسب منحنى متوسط متحرك سلس (عبر لوث الوظيفة). تقوم Kinetx أيضا بتعيين المقاييس والفئات التي تستند إلى شكل الخط الممهد الملائم والقيم المطلقة ومعدلات التغيير على النحو التالي: (1) RoC - متوسط الارتفاع في الخط الممهد خلال أول 120 ثانية ؛ (2) التسمية - يصنف الاستجابات على أنها سريعة أو متوسطة أو بطيئة يتم تعيينها وفقا للقطعات 40 و 80 ل FL1 و 5 و 10 ل FL4 ؛ (3) EarlyRoC - متوسط الارتفاع في الخط السلس خلال أول 20 ثانية ؛ (4) الشكل - المستجيبون المنخفضون ، المتزايدون ، الخطيون أو المتناقصون (الشكل 3 أ) - يتم تحديد المستجيبين المنخفضين على أنهم FL1 < 4000 أو FL4 < 1000 ، ويتم تحديد الملصقات المتزايدة والخطية والمتناقصة بناء على: shapeMetric - RoC (120 ثانية) / EarlyRoC ، حيث زيادة الشكل المتري >2 ، الشكل الخطي المتري بين 0.9-2 وانخفاض الشكل المتري <0.9 ؛ (5) ينتج جدول بيانات يلخص البيانات من خلال توفير مستوى ومعدل التغيير عند 0 ثانية ، 10 ثانية ، 20 ثانية ، 30 ثانية ، 40 ثانية ، 60 ثانية ، 90 ثانية ، 120 ثانية ، 180 ثانية ، متوسط النمط المتساوي ، الحد الأقصى والحد الأدنى لمعدلات التغيير والتسارع وجميع التسميات والفئات.

تم تحليل ارتباط الفيبرينوجين للصفائح الدموية والتعرض ل P-selectin على مدى 5 دقائق بعد التنشيط استجابة لتركيز واحد من ناهضات ADP و TRAP-6 و CRP-XL و epinephrine و U46617 في 30 متبرعا. تظهر مقاييس ربط الفيبرينوجين والتعرض ل P-selectin استجابة لناهضات مختلفة تباينا كبيرا في شكل الاستجابة (الشكل 3). أظهرت الصفائح الدموية المحفزة باستخدام TRAP-6 و ADP تسارعا أسرع في ارتباط الفيبرينوجين ، والذي تباطأ بالنسبة للعديد من المتبرعين في نقاط زمنية لاحقة (الشكل 3 ب). كان ارتباط الفيبرينوجين استجابة ل CRP-XL والثرومبين والإبينفرين أكثر عرضة لإظهار معدل استجابة متزايد أو خطي. أظهر العديد من المتبرعين فترة تأخير طويلة نسبيا ل CRP-XL قبل أن يتسارع معدل ارتباط الفيبرينوجين بسرعة. غالبا ما تم تصنيف الاستجابة ل U46619 على أنها منخفضة. في المقابل ، كان التعرض ل P-selectin أكثر عرضة لإظهار معدل استجابة خطي أو متزايد لجميع ناهضات باستثناء U46619 الذي أظهر مرة أخرى مستويات استجابة منخفضة (الشكل 3C).

يمكن قياس تدفق الكالسيوم داخل الخلايا أثناء تنشيط الصفائح الدموية بدقة باستخدام قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي
يزيل تحليل البيانات لمقايسة تدفق الكالسيوم نقاط البيانات التي تقع خارج النطاقات المعقولة (< 2.80 ثانية من وقت الصفر الذي يتم ضبطه على هذه النقطة) ثم يناسب منحنى متوسط متحرك سلس (عبر الوظيفة). تقوم Kinetx بتعيين المقاييس ، ويتم تعيين الفئات بناء على شكل الخطوط الملساء الملائمة والقيم المطلقة ومعدلات التغيير على النحو التالي: (1) الفئة - التي تصف شكل استجابة الكالسيوم بناء على الارتفاع المبكر ، والحد الأقصى ، والانخفاض النهائي من الحد الأقصى ، الموصوفة بأنها خطية أو ذروة أو مستدامة (الشكل 4 أ) ؛ (2) المعدل - الذي يصف معدل التغيير في 30 ثانية سريعة ويتم تعريفه على أنه عدم وجود تغيير ، بطيء أو متوسط أو سريع (مع قطع عند 10 و 40 و 80). تنتج Kinetx أيضا جدول بيانات يلخص البيانات من خلال توفير مستوى ومعدل التغيير عند 0 ثانية ، 10 ثانية ، 20 ثانية ، 30 ثانية ، 40 ثانية ، 60 ثانية ، 90 ثانية ، 120 ثانية ، 180 ثانية ، الحد الأقصى والأدنى لمعدلات التغيير والتسارع وجميع الملصقات والفئات ، بالإضافة إلى إنتاج رقم للبيانات لكل متبرع. أظهرت أمثلة تدفق الكالسيوم المقاس بهذه الطريقة في 30 فردا مرة أخرى أنماطا مختلفة من التنشيط بين الأفراد وناهضات (الشكل 4 ب). أعطى CRP-XL استجابة مستدامة في الغالب للكالسيوم ، في حين أن الاستجابة ل TRAP-6 أظهرت في أغلب الأحيان استجابة ذروتها. ولدت جميع ناهضات أخرى استجابة خطية في الغالب.

يحدد قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي الاختلافات في المستويات القصوى للتنشيط استجابة لناهضات وتركيزات مختلفة
توضح النتائج أن مقايسة قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي لديها القدرة على اكتشاف الاختلافات في المستويات القصوى لارتباط الفيبرينوجين (الشكل 5 أ) والتعرض ل P-selectin (الشكل 5 د) ، استجابة للتحفيز عبر مستقبلات مختلفة (10 ميكروغرام / مل CRP-XL مقابل 3 U / مل الثرومبين P < 0.001 ؛ 10 ميكروغرام / مل CRP-XL مقابل 1 U / مل الثرومبين P < كما أظهروا أن الفحص حساس للاختلافات في تركيز ناهض الناهض ، حيث تزداد مستويات الحد الأقصى لارتباط الفيبرينوجين والتعرض ل P-selectin استجابة لتركيزات ناهضة أكبر (ارتباط الفيبرينوجين - CRP-XL - 0.004 ميكروغرام / مل مقابل 0.4 ، 5 ، 10 ميكروغرام / مل ، P < 0.01 ؛ الثرومبين - 0.0012 وحدة / مل مقابل 1 و 3 وحدة / مل ، P < 0.01; ADP - 0.04 ميكروغرام / مل مقابل 1 و 4 ميكرومتر ، P < 0.05).

يعد اختبار قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي حساسا بدرجة كافية للكشف عن التباين بين المتبرعين في معدل تنشيط الصفائح الدموية
تم تحديد الحد الأقصى لمعدل تنشيط الصفائح الدموية عن طريق تركيب متوسط متحرك سلس (اللس) على بيانات التألق ثم استخدامه لحساب الحد الأقصى لمعدل ارتباط الفيبرينوجين والتعرض ل P-selectin (الشكل 5 ب ، ه). تظهر البيانات تباينا كبيرا بين المتبرعين الفرديين ، ومقايسة قياس التدفق الخلوي حساسة بما يكفي لاكتشاف هذا الاختلاف. تشير النتائج إلى أن زيادة تركيز ناهض لها تأثير ضئيل على الحد الأقصى لمعدل ارتباط الفيبرينوجين (الشكل 5 ب). في المقابل ، يزداد الحد الأقصى لمعدل التعرض ل P-selectin مع زيادة تركيز الثرومبين و CRP-XL ، ولكن ليس مع زيادة تركيزات ADP (الشكل 5E).

يمكن اكتشاف الاختلافات في وقت تأخر تنشيط الصفائح الدموية باستخدام قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي
تم تحديد الوقت إلى الحد الأقصى لمعدل تنشيط الصفائح الدموية عن طريق حساب النقاط الزمنية التي تم فيها الوصول إلى الحد الأقصى لمعدل ارتباط الفيبرينوجين والتعرض ل P-selectin (الشكل 5C ، F). يختلف الحد الأقصى لمعدل ارتباط الفيبرينوجين والتعرض لسيكتين الفوسفور بين المتبرعين، لا سيما عند تركيزات ناهضة أقل. يظهر تحفيز الصفائح الدموية بتركيزات متزايدة من CRP-XL أن التركيزات الناهضة الأعلى تستغرق وقتا أقل للوصول إلى الحد الأقصى لمعدل ارتباط الفيبرينوجين مع تباين أقل بين المتبرعين. ومع ذلك ، لا يظهر هذا الاتجاه مع تحفيز الثرومبين أو ADP (الشكل 5 ج). يوضح الاختبار أنه في بعض الظروف ، تؤدي زيادة تركيز ناهض إلى تقليل الوقت المستغرق لبدء تنشيط الصفائح الدموية (وقت التأخر) دون تغيير الحد الأقصى لمعدل تنشيط الصفائح الدموية وأنه يمكن تقييم هذين المقياسين باستخدام هذا المقايس.

figure-results-1
الشكل 1: قياس التدفق الخلوي في الوقت الحقيقي في المختبر الرطب. (أ) تم الطرد المركزي للدم الكامل المضاد للتخثر (ب) للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP). (ج) تم وضع البلازما الغنية بالصفائح الدموية المخففة التي تحتوي على أجسام مضادة مناسبة أو أصباغ مؤشر الكالسيوم في صفيحة من 96 بئرا ، وتحميلها على مقياس التدفق الخلوي غير المضغوط ، وتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية باستخدام حصيرة التشريح. تم تحفيز العينات أثناء الاستحواذ بمزيج تنشيط يحتوي على أجسام مضادة أو صبغة الكالسيوم وناهض ، تمت إضافتها بسرعة إلى البئر باستخدام طرف تحميل الهلام لضمان الخلط التلقائي. (د) تم جمع الأحداث لمدة 5 دقائق ، وتم حفظ ملفات CSV للبيانات الخاصة بكل بئر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تخطيطي لتحليل البيانات. (أ) تم تكوين بيئة R ، وتم إنشاء بيانات التعريف. (ب) تمت إزالة البيانات النائية ، وتم تركيب منحنى متوسط متحرك سلس (اللس). (ج) تم تحديد نوع الاستجابة وشكل الاستجابة (د). (ه) تم حساب المقاييس وتصديرها وإنشاء أرقام لكل جهة مانحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الناتج التمثيلي لتحليل Kinetx لربط الفيبرينوجين الصفائح الدموية في الوقت الفعلي وتعبير P-selectin. (أ) بالإضافة إلى توفير مقاييس مثل الحد الأقصى لمعدل التغيير (RoC) و RoC في نقاط زمنية مختلفة ، يصنف Kinetx أيضا شكل المنحنى لتوفير معلومات إضافية حول تنشيط الصفائح الدموية التي يصعب التقاطها في مقياس واحد. تظهر البيانات التمثيلية ل 30 فردا التباين النموذجي الذي شوهد في ارتباط الصفائح الدموية في الوقت الفعلي (B) و (C) تعبير P-selectin استجابة لناهضات ADP و TRAP-6 و CRL-XL و epinephrine و U46617. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: الإخراج التمثيلي لتحليل Kinetx لتدفق الكالسيوم في الوقت الفعلي. (أ) بالإضافة إلى توفير مقاييس مثل الحد الأقصى لمعدل التغيير (RoC) و RoC في نقاط زمنية مختلفة ، يصنف Kinetx أيضا شكل منحنى تدفق الكالسيوم لتوفير معلومات إضافية حول تنشيط الصفائح الدموية التي يصعب التقاطها في مقياس واحد. تظهر البيانات التمثيلية ل 30 فردا التباين النموذجي الذي شوهد في تدفق الكالسيوم في الوقت الفعلي (B) استجابة لناهضات ADP و TRAP-6 و CRL-XL و epinephrine و U46617. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: يحدد تركيز ناهض الحد الأقصى لتنشيط الصفائح الدموية ولكن ليس معدل تنشيط الصفائح الدموية. تم تغيير الحد الأقصى لتنشيط الصفائح الدموية - ربط الفيبرينوجين (A) أو التعرض ل P-selectin (D) - بشكل إيجابي بشكل إيجابي بسبب تركيز ناهض (CRP-XL أو الثرومبين أو ADP). أظهر معدل تنشيط الصفائح الدموية (B و E) والوقت الأقصى لمعدل تنشيط الصفائح الدموية (C و F) عدم وجود علاقة أو علاقة أضعف مع تغير تركيز ناهض. تظهر قيم P الأهمية على نطاق التركيز بأكمله (اختبار Kruskal-Wallis) ، وتشير العلامات النجمية إلى اختلاف كبير (اختبار المقارنة المتعددة) في القيم الفردية من أدنى تركيز. * P < 0.05 ، ** P < 0.01. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد يكون معدل اكتشاف الصفائح الدموية ومعالجتها والاستجابة لها محمزه أساسيا لتكوين الجلطة. وجدت الدراسات السابقة أن تثبيط عناصر الإشارات التي تؤثر على المعدل ، ولكن ليس المدى النهائي لتنشيط الصفائح الدموية ، يؤدي إلى تكوين جلطة غيرمستقرة 8. تقيس العديد من فحوصات وظائف الصفائح الدموية مدى تنشيط الصفائح الدموية وتجميعها استجابة للظروف والعلاجات المختلفة. ومع ذلك ، فإن هذه لا تأخذ في الاعتبار معدل تنشيط الصفائح الدموية والوقت المستغرق لحدوث هذه العملية المعقدة3،4. تراقب المقايسات المبتكرة القائمة على قياس التدفق الخلوي التي تم تطويرها هنا بشكل متكرر تنشيط الصفائح الدموية بمرور الوقت وتترجم ذلك إلى مجموعة من المقاييس لحساب الحد الأقصى لمعدل تنشيط الصفائح الدموية والوقت المستغرق حتى تصل الصفائح الدموية إلى هذا المعدل الأقصى وتنشيطها بالكامل.

تسلط البيانات المقدمة الضوء على قدرة الفحص في الوقت الفعلي على تحديد الاختلافات بين الاستجابات المختلفة لنوع ناهض وتركيزه وبين الأفراد. أظهرت العديد من التقارير السابقة أن تفاعل الصفائح الدموية متغير للغاية بين الأفراد العاديين15،16 ، مما يشير إلى أن معدل تنشيط الصفائح الدموية قد يختلف أيضا بشكل كبير بين السكان. توضح البيانات من هذه الدراسة أن معدل التحلل وارتباط الفيبرينوجين بالصفائح الدموية يبدو أكثر تنوعا من المستويات القصوى لتنشيط الصفائح الدموية. هذا يدل على أنه يمكن أيضا استخدام قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي كأداة قيمة وموثوقة لتحديد الفروق في معدل الصفائح الدموية في السكان واكتشاف تأثيرات العوامل المثبطة أو المؤيدة للتنشيط المختلفة على معدل الصفائح الدموية كوسيلة إضافية لقياس وظيفة الصفائح الدموية.

عندما يتم قياس وظيفة الصفائح الدموية باستخدام فحوصات نقطة النهاية ، يمكن إجراء مقارنات حول مدى ارتباط الفيبرينوجين أو إطلاق الحبيبات بين الناهضات المختلفة. توضح منحنيات اللوس التي تقارن ارتباط الفيبرينوجين خلال أول 5 دقائق من تنشيط الصفائح الدموية قدرة الاختبار في الوقت الفعلي على استخلاص المزيد من التفاصيل في الاختلافات في حركية تنشيط الصفائح الدموية التي لا تستطيع فحوصات نقطة النهاية الفردية قياسها.

توضح البيانات التي تم جمعها من الفحص في الوقت الفعلي أن السرعة التي يرتبط بها الفيبرينوجين بالصفائح الدموية تتبع نمطا مختلفا قليلا ، اعتمادا على مسار التنشيط (الشكل 3). من أجل تقييم حركية تنشيط الصفائح الدموية بدقة ، من الضروري استخدام مقياس التدفق الخلوي غير المضغوط الذي يتيح الحصول على البيانات وتحفيز العينة في وقت واحد. من الضروري أيضا إضافة الناهضات بسرعة لضمان خلط شبه فوري وكامل للناهض والصفائح الدموية. ينتج عن التحفيز باستخدام الثرومبين ADP والإبينفرين منحنى مماثل يمثل بدء سريعا للإشارات استجابة لحساسية المستقبلات مما يؤدي إلى ارتباط الفيبرينوجين بالصفائح الدموية بمعدل سريع وثابت. في المقابل ، تكون الصفائح الدموية المحفزة بواسطة CRP-XL في البداية بطيئة جدا في ربط الفيبرينوجين بعد التحسس الأولي للمستقبلات. ومع ذلك ، فإن معدل ارتباط الفيبرينوجين يزداد بسرعة بعد هذا التأخير الأولي. يؤدي تحفيز الصفائح الدموية باستخدام U46619 ، وهو محاكي ل TXA2 ، إلى معدل أولي سريع لارتباط الفيبرينوجين ، والذي ينخفض بسرعة إلى معدل بطيء جدا مما يؤدي إلى زيادة طفيفة ومطردة فقط في ارتباط الفيبرينوجين بمرور الوقت.

تم تصميم Kinetx ليكون مفتوح المصدر وقابل للتكرار وسهل التنفيذ من أجل التغلب على المشكلات المتعلقة بالبرامج الاحتكارية ، مثل التكلفة وعدم المرونة. على هذا النحو ، يجب تطويره باستخدام برنامج غير لائق. تم اختيار R لأنه يستخدم على نطاق واسع من قبل علماء الأحياء ، وسهل التركيب ، ومجاني ، ومفتوح المصدر. تتيح هذه البيئة مفتوحة المصدر للمستخدمين البارعين في R تغيير المعلمات مثل درجة التنعيم أو تحديد نقاط البيانات النائية أو المقاييس الزمنية. ومع ذلك ، لمساعدة الباحثين الذين ليسوا على دراية ب R ، تم تطوير Kinetix أيضا بحيث يمكن إجراء التحليل عبر أمر واحد (إما kinetxProcess أو kinetxProcessCalcium ، اعتمادا على البيانات التي يتم تحليلها). يمكن لبرنامج Kinetix الموضح هنا حساب مجموعة من المقاييس ، بما في ذلك قيم المستويات القصوى والمعدل والتسارع لربط الفيبرينوجين أو التعرض ل P-selectin والنقاط الزمنية التي تحدث فيها هذه الحدود القصوى. يمكن مقارنة حركية تنشيط الصفائح الدموية استجابة لمسارات التحفيز المختلفة بشكل أكثر دقة باستخدام هذه الأرقام.

تعد المقارنات بين التحفيز الناهض المختلفة في المستويات القصوى لارتباط الفيبرينوجين ومعدلات ارتباط الفيبرينوجين بالصفائح الدموية أمثلة جيدة على المكان الذي يمكن أن يختلف فيه معدل تنشيط الصفائح الدموية بشكل مستقل عن الحد الأقصى للارتباط. بمقارنة الحد الأقصى لارتباط الفيبرينوجين بعد 5 دقائق من التحفيز مع 0.04 ميكرومتر ADP (3.85 LogFU) و 0.04 ميكروغرام / مل CRP-XL (3.70 LogFU) ، أدى كلا الناهضين إلى كمية مماثلة من الفيبرينوجين المرتبط (الشكل 5 أ). تظهر المعدلات القصوى لربط الفيبرينوجين اختلافا طفيفا أكثر (0.04 ميكرومتر ADP - 0.0050 LogFU / دقيقة ؛ 0.04 ميكروغرام / مل لتر CRP-XL - 0.0054 LogFU / دقيقة) ، مما يشير إلى أن المعدل الإجمالي لارتباط الفيبرينوجين مشابه بين هذين التحفيزين (الشكل 5 ب). ومع ذلك ، عند مقارنة وقت تأخر تنشيط الصفائح الدموية ، هناك فرق واضح يظهر تسارع CRP-XL (117 ثانية إلى الحد الأقصى) بمعدل أبطأ بكثير من ADP (47 ثانية إلى الحد الأقصى) (الشكل 5 ج). وبالتالي ، يصبح من الواضح أن تحفيز ADP ينتج عنه استجابة أولية أسرع بكثير (P < 0.001) عند مقارنته ب CRP-XL. عند ملاحظتها معا ، تصف هذه القياسات لحركية الصفائح الدموية استجابة لناهضين مختلفين استجابة أولية سريعة لتحفيز ADP الذي يتسارع ببطء ويبقى بمعدل ثابت. في المقابل ، ينتج عن تحفيز CRP-XL معدل بطيء من التنشيط ، والذي يتسارع بسرعة في وقت لاحق ، مما يؤدي في النهاية إلى معدل إجمالي ومستويات مماثلة من ارتباط الفيبرينوجين مثل ADP. توضح هذه الاختلافات بين المستويات القصوى ومعدل وتسارع ارتباط الفيبرينوجين أن عددا من المعلمات تشارك في قياس مدى سرعة تنشيط الصفائح الدموية. يمكن للمقايسة في الوقت الفعلي وتحليل Kinetx قياس هذه المعلمات ومقارنتها ، ووصف الوقت المستغرق من حساسية المستقبلات إلى استجابة الصفائح الدموية ، ومقارنة ذلك بين مسارات الإشارات المختلفة.

زيادة تركيز ناهض ليس له تأثير كبير على معدل ارتباط الفيبرينوجين بالصفائح الدموية. ومع ذلك ، فإن الوقت المستغرق للوصول إلى الحد الأقصى لمعدل ارتباط الفيبرينوجين ينخفض مع زيادة تركيز ناهض ، مما يشير إلى أن الصفائح الدموية تربط الفيبرينوجين بمعدل ثابت وأن تشبع المستقبلات يلعب دورا أكثر بروزا في مدى سرعة ارتباط الصفائح الدموية بالفيبرينوجين.

يعد فحص وتحليل تدفق الكالسيوم الموصوف مقايسة سريعة وسهلة للكالسيوم يمكن دمجها كعينات إضافية في الفحص في الوقت الفعلي مما يسمح بتحليل ارتباط الفيبرينوجين بالكالسيوم والصفائح الدموية و P-selectin في نفس مجموعة العينات. توفر حزمة التحليل المخصصة تقييما متعمقا لحركية تدفق الكالسيوم ، بما في ذلك شكل الاستجابة والاستجابة القصوى والوقت اللازم لتحقيق أقصى استجابة. يمكن بعد ذلك مقارنة هذه المعلمات من حيث التباين بين المتبرعين واستجابة لمختلف العوامل الصيدلانية. تمت دراسة تدفق الكالسيوم في الصفائح الدموية سابقا في الصفائح الدموية باستخدام مجموعة متنوعة من المقايسات القائمة على قياس التدفقالخلوي 17،18،19. Aliotta et al.14 ، يصف فحصا أنيقا قادرا على تحليل حركية الأيونات داخل الخلايا المتعددة. يعتمد اختبار الكالسيوم المقدم هنا على هذه المقايسات المنشورة سابقا من خلال تضمين حزمة التحليل التي تتيح قدرا أكبر من المرونة ، واستكشافا أكثر تعمقا للبيانات مع الاستفادة من التحليل عالي الإنتاجية للعديد من المانحين في إطار زمني قصير.

أظهرت الدراسات السابقة أن تثبيط أو عدم وجود جزيئات إشارات معينة يؤدي إلى تغير معدل تنشيط الصفائح الدموية ، والذي يترجم مباشرة إلى تكوين الجلطة8،9. في الماضي ، كان من الممكن قياس حركية تنشيط الصفائح الدموية عن طريق قياس التدفق الخلوي على عدد من النقاط الزمنية الثابتة والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لحساب ومقارنة ، على سبيل المثال ، معدل GPIIbIIIa الخارجي استجابة لناهضات مختلفة20. يوفر الفحص في الوقت الفعلي وتحليل Kinetx الموصوف في هذه الورقة طريقة بسيطة ومتاحة مجانا ودقيقة لقياس كل من معدل ونقطة نهاية تنشيط الصفائح الدموية من الصفائح الدموية المريحة. من المحتمل أن يكون هذا مهما في تحديد الاختلافات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في وظيفة الصفائح الدموية والتي قد يتم تفويتها عند قياس قراءات نقطة النهاية فقط.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا المشروع من قبل مؤسسة القلب البريطانية (PG/16/36/31967 وRG/20/7/34866 وRG/15/2/31224).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
9،11-Dideoxy-11 & alpha ؛ 9 & alpha ؛ -epoxymethanoprostaglandin F2 & alpha - U46619Sigma-Aldrich ، Poole ، المملكة المتحدةD8174-1MG
التدفق الخلوي Accuri C6 مع BD Csamplerبيكتون ديكنسون ، المملكة المتحدة660517 + 660519
أدينوزين ثنائي فوسفاتسيجما ألدريتش ، بول ، المملكة المتحدةA2754-1G
APC المضاد للسيليكتين (CD62p) BDBiosciences ، المملكة المتحدة550888
ميكروتيتر من مادة البولي بروبيلين Corning 96 بئر مستديرة القاع وغير المعالجةSigma-Aldrich ، Poole ، المملكة المتحدةCLS3879-50EA
الببتيد المرتبط بالكولاجين المتقاطع (CRP-XL)CambCol ، المملكة المتحدة
EpinephrineSigma-Aldrich ، Poole ، المملكة المتحدةE4375-1G
الأجسام المضادة للفيبرينوجين التي تحمل علامة FITCDako ، Agilent Technologies ، المملكة المتحدةF011102-2
Fluo-4 صبغة مباشرةThermo-Fisher ScientificF10472
نصائح تحميل هلامStarlab ، المملكة المتحدةI1022-0600
Gly-Pro-Arg-Pro الببتيدSigma-Aldrich ، Poole ، المملكة المتحدةG1895-5MG
ThrombinSigma-Aldrich ، Poole ، المملكة المتحدةSRE0003-10KU
منشط مستقبلات الثرومبين الببتيد 6 (TRAP-6)Bachem ، سانت هيلينز ، المملكة المتحدةH-2936.0005
Vacuette 9NC تخثر 3.2٪ سترات ثلاثي الصوديوم (0.109 مول / لتر)Greiner Bio-one LTD ، ستونهاوس ، المملكة المتحدة454327
مقياس لوحة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bye, A. P., Unsworth, A. J., Gibbins, J. M. Platelet signaling: a complex interplay between inhibitory and activatory networks. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 14 (5), 918-930 (2016).
  2. Jones, C. I., Barrett, N. E., Moraes, L. A., Gibbins, J. M., Jackson, D. E. Endogenous inhibitory mechanisms and the regulation of platelet function. Methods in Molecular Biology. 788, 341-366 (2012).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: a comparative review. Vascular Health and Risk Management. 11, 133-148 (2015).
  4. Saboor, M., Moinuddin, M., Ilyas, S. New horizons in platelets flow cytometry. The Malaysian Journal of Medical Sciences : MJMS. 20 (2), 62-66 (2013).
  5. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, 1525-1541 (1996).
  6. Pasquet, J. M., Noury, M., Nurden, A. T. Evidence that the platelet integrin alphaIIb beta3 is regulated by the integrin-linked kinase, ILK, in a PI3-kinase dependent pathway. Thrombosis and Haemostasis. 88 (1), 115-122 (2002).
  7. Stevens, J. M., Jordan, P. A., Sage, T., Gibbins, J. M. The regulation of integrin-linked kinase in human platelets: evidence for involvement in the regulation of integrin alpha 2 beta 1. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 2 (8), 1443-1452 (2004).
  8. Jones, C. I., et al. Integrin-linked kinase regulates the rate of platelet activation and is essential for the formation of stable thrombi. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 12 (8), 1342-1352 (2014).
  9. Cifuni, S. M., Wagner, D. D., Bergmeier, W. CalDAG-GEFI and protein kinase C represent alternative pathways leading to activation of integrin alphaIIbbeta3 in platelets. Blood. 112 (5), 1696-1703 (2008).
  10. Stolla, M., et al. The kinetics of alphaIIbbeta3 activation determines the size and stability of thrombi in mice: implications for antiplatelet therapy. Blood. 117 (3), 1005-1013 (2011).
  11. Kawasaki, H., et al. A Rap guanine nucleotide exchange factor enriched highly in the basal ganglia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13278-13283 (1998).
  12. Kinetx. , Available from: http://github.com/cardiomaths/Kinetx (2021).
  13. R. , Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
  14. R Studio. , Available from: https://rstudio.com/products/rstudio/download/ (2021).
  15. Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
  16. Panzer, S., Hocker, L., Koren, D. Agonists-induced platelet activation varies considerably in healthy male individuals: studies by flow cytometry. Annals of Hematology. 85 (2), 121-125 (2006).
  17. Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Alberio, L. Flow cytometric monitoring of dynamic cytosolic calcium, sodium, and potassium fluxes following platelet activation. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 97 (9), 933-944 (2020).
  18. do Ceu Monteiro, M., Sansonetty, F., Goncalves, M. J., O'Connor, J. E. Flow cytometric kinetic assay of calcium mobilization in whole blood platelets using Fluo-3 and CD41. Cytometry. 35 (4), 302-310 (1999).
  19. Vines, A., McBean, G. J., Blanco-Fernandez, A. A flow-cytometric method for continuous measurement of intracellular Ca(2+) concentration. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1091-1097 (2010).
  20. Weber, A. A., Schror, K. Differential inhibition of adenosine diphosphate- versus thrombin receptor-activating peptide-stimulated platelet fibrinogen binding by abciximab due to different glycoprotein IIb/IIIa activation kinetics. Blood. 98 (5), 1619-1621 (2001).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Platelet Function AssayKinetic MeasurementsFibrinogen BindingGranule ReleaseCalcium FluxReal Time AnalysisOpen Source SoftwareThrombus Formation
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة