نموذج نزيف نقل الوريد الذيل المكرر (TVT) في الفئران المخدرة هو طريقة حساسة في الجسم الحي لتقييم نزيف الهيموفيليا. يستخدم نموذج نزيف TVT المحسن هذا فقدان الدم ووقت النزيف كنقاط نهاية ، مما يؤدي إلى تحسين النماذج الأخرى وتجنب الموت كنقطة نهاية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج نزيف تمزق الوريد الذيل في الهيموفيليا المخدرة بالكامل A الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نماذج نزيف الذيل هي أدوات مهمة في أبحاث الهيموفيليا ، وتحديدا لتقييم آثار التخثر. تم تفضيل نموذج البقاء على قيد الحياة لانتقال الوريد الذيل (TVT) في العديد من الإعدادات بسبب الحساسية للجرعات ذات الصلة سريريا من الثامن ، في حين أن النماذج الأخرى المعمول بها ، مثل نموذج مشبك الذيل ، تتطلب مستويات أعلى من مركبات التخثر. لتجنب استخدام البقاء على قيد الحياة كنقطة نهاية ، قمنا بتطوير نموذج TVT يحدد فقدان الدم ووقت النزيف كنقاط نهاية وتخدير كامل خلال التجربة بأكملها. باختصار ، يتم وضع الفئران المخدرة مع الذيل المغمور في محلول ملحي معتدل (37 درجة مئوية) وجرعات مع مركب الاختبار في الوريد الجانبي الأيمن للذيل. بعد 5 دقائق ، يتم نقل وريد الذيل الجانبي الأيسر باستخدام دليل قالب ، ويتم إرجاع الذيل إلى محلول ملحي ، ويتم مراقبة جميع نوبات النزيف وتسجيلها لمدة 40 دقيقة أثناء جمع الدم. إذا لم يحدث أي نزيف في 10 دقائق أو 20 دقيقة أو 30 دقيقة بعد الإصابة ، يتم تحدي الجلطة بلطف عن طريق مسح القطع مرتين باستخدام قطعة شاش مبللة. بعد 40 دقيقة ، يتم قياس فقدان الدم كميا بكمية الهيموغلوبين التي تنزف في المياه المالحة. ينتج عن هذا الإجراء السريع والبسيط نسبيا نزيف ثابت وقابل للتكرار. بالمقارنة مع نموذج البقاء على قيد الحياة TVT ، فإنه يستخدم إجراء أكثر إنسانية دون المساس بالحساسية للتدخل الدوائي. علاوة على ذلك ، من الممكن استخدام كلا الجنسين ، مما يقلل من العدد الإجمالي للحيوانات التي تحتاج إلى تربية ، وفقا لمبادئ 3R. أحد القيود المحتملة في نماذج النزيف هو الطبيعة العشوائية للإرقاء ، والتي يمكن أن تقلل من قابلية تكرار النموذج. ولمواجهة ذلك، يضمن تعطيل الجلطة اليدوي تحدي الجلطة أثناء المراقبة، مما يمنع الإرقاء الأولي (الصفائح الدموية) من وقف النزيف. توفر هذه الإضافة إلى كتالوج نماذج إصابات النزيف خيارا لتوصيف تأثيرات التخثر بطريقة موحدة وإنسانية.
المقدمة
النماذج الحيوانية ضرورية لفهم التسبب في الهيموفيليا وتطوير واختبار أنظمة العلاج والعلاجات. فأر العامل الثامن بالضربة القاضية (F8-KO) هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيموفيليا A 1,2. تلخص هذه الفئران السمات الرئيسية للمرض وقد استخدمت على نطاق واسع لتطوير العلاجات ، مثل منتجات FVIII المؤتلفة3،4،5 واستراتيجيات العلاج الجيني6،7.
هناك العديد من نماذج إصابات النزيف لتقييم الآثار الدوائية لمركبات مرقئ مختلفة في الجسم الحي. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل هيئة رعاية الحيوان في Novo Nordisk A / S ، ومفتشية التجارب الحيوانية الدنماركية ، ووزارة الأغذية والزراعة ومصايد الأسماك الدنماركية. تتضمن طريقة 40 دقيقة المحسنة التخدير ووقت الجرعات في التصميم (الشكل 1). مطلوب الفئران الهيموفيلي من كلا الجنسين بين 10-16 أسبوعا من العمر لهذا الإجراء.
1. التحضيرات قبل الدراسة
- تحضير محاليل الجرعات بالتركيزات الصحيحة.
- ابدأ الحمام المائي وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية. املأ أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل لجمع الدم بالمحلول الملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم).
- ضع الأنابيب المالحة سعة 15 مل في ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتقييم قابلية تطبيق النموذج الأمثل ، أجريت دراسة على الفئران F8-KO (الخلفية الجينية C57BL) التي تدار باستخدام العلاج البديل المؤتلف للعامل الثامن المتاح تجاريا (rFVIII) ؛ تم اختبار أربع جرعات مختلفة: 1 وحدة دولية / كجم ، 5 وحدة دولية / كجم ، 10 وحدة دولية / كجم ، و 20 وحدة دولية / كجم. علاوة على ذلك، اختبرنا التحكم المقابل في المركبات (السلبية) في الفئران F8-KO ومجموعة النوع البري (WT) باستخدام الفئران C57BL كمجموعة تحكم إيجابية لتقييم نطاق الاستجابة في النموذج.
بعد البروتوكول الأمثل ، كان هنا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذه الطريقة المحسنة لنقل الوريد الذيل (TVT) لها العديد من المزايا مقارنة بطريقة البقاء على قيد الحياة TVT. يتم تخدير الحيوانات بالكامل طوال مدة الدراسة ، مما يجعل التعامل مع الفئران أسهل ويزيد من رفاهية الحيوان. علاوة على ذلك ، على عكس نموذج البقاء على قيد الحياة TVT ، فإن المراقبة بين عشية وضحاها ليست مطلوبة ، ويوفر هذا النموذج الأمثل إمكانية قياس فقدان الدم ومراقبة وقت النزيف الدقيق أكثر من 40 دقيقة. أيضا ، يمكن أن تسبب فترات أطول من النزيف في الحيوانات الواعية الموت عن طريق الطرد ، مما يؤدي إلى الألم والضيق في الحيوان.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون هم أو كانوا موظفين و / أو مساهمين في Novo Nordisk A / S في وقت إجراء هذا البحث.
شكر وتقدير
تم الاعتراف بإستر بلوم وتوماس نيغارد لدعمهما في قياسات FVIII في البلازما. يتم التعرف على بو ألستيد لرسم وتصنيع القالب وقطع الكتل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 11 شفرة مشرط | Swann-Morton | 503 | |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي | Greiner Bio-One ، النمسا | 188271 | |
| 30 G إبر متصلة ب 300 & micro ؛ محاقن L دقيقة (الأنسولين) لجرعات | حقنة الأنسولين BD Micro-Fine + U-100 | 320830 | |
| Advate | Takeda ، اليابان | العلاج باستبدال العامل الثامن المؤتلف (rFVIII) | |
| ضمادات كحول 70٪ إيثانول | هارتمان ، Soft-Zellin | 999 979 | |
| طرد مركزي | Omnifuge 2.0 RS ، قالب قطع Heraus Sepatech | ||
| (الفولاذ المقاوم للصدأ) | أنتجت ذاتيا ، نرحب بك للاتصال بالمؤلفين للحصول على الرسومات | الشكل التكميلي 2: مواصفات الحجم: 20 مم × 40 مم × 10 مم (الطول × الارتفاع × الارتفاع). الأخدود: عمق 3 مم وعرض 3 مم ؛ نصف قطر 1.5 مم | |
| محلول تحلل كريات الدم الحمراء (RBC) | Lysebio ، ABX Diagnostics | 906012 | |
| محلل | |||
| أمراض الدم | Sysmex | CT-2000iv | |
| مصباح تسخين على حامل | وسادة تسخين فيليبس | IR250 | |
| مع ترموستات | CMA | موديل 150 | |
| معايير وضوابط الهيموجلوبين - 8.81 مليمول / لتر تعتمد على دفعة | HemoCue ، | معاير HemoCue الدنماركي ، 707037 | المعايير وأدوات التحكم مصنوعة من 2 زجاج مختلف من معاير HemoCue. يتم تحديد القيمة مقابل الطريقة المرجعية الدولية للهيموجلوبين (ICSH). |
| نظام التخدير المتزو فلوران مكتمل بأنابيب وأقنعة وصندوق تحريض | سيجما دلتا داميكا | ||
| إيزوفلوران | باكستر | 26675-46-7 | |
| مكبر مع أضواء | قياس Eschenbach | ||
| (الألومنيوم) | منتج ذاتيا ، نرحب بك للاتصال بالمؤلفين للحصول على الرسومات | الدقيقةالشكل التكميلي 1: مواصفات الحجم: 20 مم × 40 مم × 10 مم (الطول × الارتفاع × الارتفاع). الأخدود: عمق 2.5 مم وعرض 2.5 مم ؛ نصف قطر 1.25 مم | |
| ماصات دقيقة + نصائح | Finnpipette | ||
| مقياس ضوئي | للأجهزة الجزيئية Corporation ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية | SpectraMax 340 مقياس | |
| Prism Software | GraphPad ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | الإصدار 9.0.1 | |
| محلول ملحي 0.9٪ NaCl | Fresenius Kabi ، السويد | 883264 | |
| كتلة علامة الذيل الخاصة لقطع | ذيل TVT | ||
| حامل | |||
| شفط سائل فراغ | IBS | ||
| وترموستات | TYP 3/8 Julabo |
المراجع
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice cr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
