مقالة منهجية

المقايسات القائمة على التلألؤ الكيميائي للكشف عن أكسيد النيتريك ومشتقاته من الأتمتة ومركبات النيتروجين

4.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63107

⸱

فبراير 16, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولات للكشف عن أكسيد النيتريك ومشتقاته ذات الصلة بيولوجيا باستخدام الفحوصات القائمة على التلألؤ الكيميائي بحساسية عالية.

الملخص

نشاط أكسيد النيتريك (NO) في الجسم الحي هو النتائج المشتركة لآثاره المباشرة ، وعمل مشتقاته الناتجة عن عدم autoxidation ، وتأثيرات المركبات النيتروجينية. يعد قياس مستقلبات NO ضروريا لدراسة نشاط NO على مستوى الأوعية الدموية وفي الأنسجة الأخرى ، خاصة في الإعدادات التجريبية حيث يتم إعطاء NO الخارجي. تسمح اختبارات التلألؤ الكيميائي القائمة على الأوزون بإجراء قياسات دقيقة للمستقلبات NO و NO في كل من السوائل (بما في ذلك البلازما ، ومتجانسات الأنسجة ، ومزارع الخلايا) ومخاليط الغاز (على سبيل المثال ، التنفس الزفير). لا يتفاعل مع الأوزون لتوليد ثاني أكسيد النيتروجين في حالة مثيرة. يسمح انبعاث الضوء الناتج عن ذلك بالكشف الضوئي وتوليد إشارة كهربائية تعكس محتوى NO للعينة. يمكن استخدام Aliquots من نفس العينة لقياس مستقلبات NO محددة ، مثل النترات والنتريت و S-nitrosothiols ومجمعات الحديد والنيتروزيل. بالإضافة إلى ذلك ، لا يستهلك الهيموغلوبين الخالي من الخلايا أيضا كميا مع تحليل التلألؤ الكيميائي. يتم توفير مثال توضيحي لجميع هذه التقنيات.

المقدمة

منذ أن حدد سلفادور مونكادا والحائزون على جائزة نوبل روبرت فورشغوت ولويس إغنارو وفريد مراد أكسيد النيتريك (NO) باعتباره عامل الاسترخاء المشتق من البطانية المعروف سابقا (EDRF) ، تم تأسيس الدور المركزي ل NO في العديد من الآليات الرئيسية التي تمتد عبر بيولوجيا الأوعية الدموية وعلوم الأعصاب والتمثيل الغذائي واستجابة المضيف1،2،3،4،5،6،7 . أصبح الإعطاء الخارجي للغاز NO علاجا راسخا لفشل الجهاز التنفسي بسبب ارتفاع ضغط الدم الرئوي في حديثي الولادة8. كما تم التحقيق في غاز أكسيد النيتريك لعلاج عدوى الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) ، والملاريا والأمراض المعدية الأخرى ، وإصابة نقص التروية ، وللوقاية من إصابات الكلى الحادة في المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب9،10،11،12. تنشأ الحاجة إلى تقنيات قياس دقيقة لتقييم مستويات NO ، ومستقلباتها ، ومستويات البروتينات والمركبات المستهدفة من كل من الدراسات الميكانيكية والتداخلية.

نظرا لتفاعله العالي ، قد يخضع NO لتفاعلات مختلفة اعتمادا على المصفوفة البيولوجية التي يتم إنتاجها و / أو إطلاقها. في حالة عدم وجود الهيموغلوبين (Hb) أو غيرها من أوكسي هيموبروتينات ، يتأكسد NO بالكامل تقريبا إلى النتريت (NO2-).

2NO + O 2 → 2NO2

رقم 2 + لا → N2O3

N 2 O3 + H 2 O → NO2- + H+

لا يخضع NO أولا للأتمتة مع الأكسجين الجزيئي (O 2) لإنتاج ثاني أكسيد النيتروجين (NO 2) ويتفاعل مع NO 2 نفسه لتوليد ثالث أكسيد ثنائي النيتروجين (N2 O3). يتفاعل جزيء واحد من N 2 O3 مع الماء (H 2 O) لتشكيل جزيئين من NO2- وبروتون (H +)13. داخل الدم الكامل14,15 ، NO و NO 2- يتم تحويلها بسرعة إلى نترات (NO 3-) حيث تتفاعل هذه الجزيئات بحماس مع مجموعات الهيم المؤكسدة من Hb [Hb-Fe2+-O2 أو oxyhemoglobin (oxyHb)] لإنتاج NO 3-. يقترن هذا التفاعل بانتقال مجموعة الهيم إلى الحالة الحديدية [Hb-Fe3+ أو methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

حاجز خلايا الدم الحمراء (RBC) والمساحة المجاورة مباشرة للبطانة هي العوامل الرئيسية التي تحد من هذا التفاعل وتسمح لجزء صغير من NO الذي تطلقه البطانة بالعمل كEDRF16,17. في الواقع ، من المعروف أن Hb الخالي من الخلايا في الدورة الدموية يعطل توسع الأوعية في الإعدادات التجريبية والسريرية17,18. داخل RBC ، اعتمادا على الأوكسجين وتركيز NO 2 ، يتفاعل جزء من NO مع deoxyhemoglobin (Hb-Fe2+) لتشكيل الحديد والنيتروزيل Hb (Hb-Fe2 + -NO أو HbNO):

Hb-Fe2 + + بدون → Hb-Fe2+-NO

في RBC15,17 ، يمكن أن يشكل NO 2- Hb-Fe 3+ عن طريق تقليل Hb-Fe 2+ مما يؤدي إلى إطلاق NO ، والذي بدوره يربط Hb-Fe 2+-O2 (بشكل تفضيلي) أو Hb-Fe 2+.

لا ينبغي اعتبار توليد المشتقات NO-derivatives أحادي الاتجاه بشكل صارم حيث يمكن تجديد NO من NO2 - و NO3 - في الأنسجة المختلفة وبواسطة إنزيمات مختلفة (على سبيل المثال ، بواسطة البكتيريا المعوية أو داخل الميتوكوندريا ، خاصة في ظل ظروف نقص الأكسجين) 19,20.

تؤدي كمية متغيرة من NO المنتجة (أو المدارة) إلى توليد المصب من S-nitrosothiols ، بشكل رئيسي عن طريق نقل الميثيول من N 2 O3 في وجود نوكليوفيل يخلق وسيطا مانحا NO+ (Nuc-NO+-NO2-):

N 2 O3 + RS - → RS-NO + NO2-

هناك احتمال آخر لتوليد S-nitrosothiols وهو نيتروزيل الثيولات المؤكسدة (لا يتفاعل مع الثيول المؤكسد):

RS• + لا يوجد → RS-NO

قد تكون هذه الآلية وأكسدة الثيول المباشرة بواسطة NO2 ممكنة فقط في ظروف محددة للغاية موصوفة في مكان آخر21. تتراوح S-nitrosothiols من جزيئات الضوء مثل S-nitrosoglutathione إلى البروتينات الكبيرة المحتوية على الثيول. يتكون S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) من نيتروز مجموعة ثيول من بقايا السيستين المحفوظة في السلسلة β (β93C)22.

يعد توليد واستقلاب S-nitrosothiols جزءا من الآليات التنظيمية المهمة. ومن الأمثلة على ذلك تنظيم الجلوتاثيون ، كاسباز ، N-methyl-D-Aspartate (NMDA) ، ومستقبلات الريانودين23،24،25،26،27،28. كان يعتبر سابقا وسيطا رئيسيا لبيولوجيا NO في الجسم الحي ، ويبدو أن الألبومين النيتروجيني (S-nitroso-albumin) هو ناقل NO / NO+ دون أي نشاط بيولوجي إضافي محدد29.

عند قياس تركيز NO ومشتقاته من عينة بيولوجية محددة داخل مصفوفة بيولوجية ، من المهم مراعاة خصائص مثل الحموضة والأوكسجين ودرجة الحرارة ووجود الكواشف. ومن الأمثلة على ذلك الجهات المانحة الخارجية التي يتم إعطاؤها ، وفي حالة الالتهاب الحاد ، يتفاعل بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) مع NO2مما يؤدي إلى توليد تركيز خارق للطبيعة من الجذور الحرة مثل البيروكسينتريت (ONOO-)21. بالإضافة إلى الطريقة التحليلية المستخدمة ، فإن مرحلة ما قبل التحليل لإعداد العينات وتخزينها أمر أساسي. يجب التنبؤ بالتفاعلات النهائية التي لا تمثل أي نشاط في الجسم الحي والنظر فيها وحظرها. ومن الأمثلة الصالحة على ذلك عدم استقرار S-NO-Hb ، مما يتطلب علاجا مخصصا لعينات الدم عندما يتم استهدافها للقياس22.

الفحوصات القائمة على التلألؤ الكيميائي هي المعيار الذهبي للكشف عن مستويات NO ومستقلباته الرئيسية [NO2-، NO3-، S-NO ومجمعات الحديد والنيتروزيل (Fe-NO)] في أي سائل بيولوجي ، بما في ذلك تجانس الأنسجة30,31. تعتمد هذه الطرق على كاشف التلألؤ الكيميائي (CLD) ، وهو جهاز يضم تفاعل NO مع الأوزون (O3) ، مما يولد NO 2 في حالة إثارة (NO2•). يؤدي استرخاء NO2 • إلى انبعاث فوتون من الضوء يتم اكتشافه بواسطة أنبوب مضاعف ضوئي ، مما يولد إشارة كهربائية تتناسب طرديا مع محتوى NO لخليط الغاز الذي تم أخذ عينات منه32. يتم تمثيل مخطط مبسط ل CLD.

إعداد التلألؤ الكيميائي: لا + O₃ إلى NO₂ * تفاعل ؛ أنبوب مضاعف ضوئي يعرض الرسم التخطيطي الانبعاث البصري.
الشكل 1: مخطط مبسط لكاشف التلألؤ الكيميائي لغاز أكسيد النيتريك. الكشف القائم على التلألؤ الكيميائي لأكسيد النيتريك (NO) هو توليد stoichiometric لفوتون واحد لكل جزيء غاز NO يتم إدخاله في كاشف التلألؤ الكيميائي (CLD). يتم الحصول على تفاعل التلألؤ الكيميائي في غرفة معينة مزودة بالأوزون (O3) من مولد داخلي ، والذي يتم الاحتفاظ به عند ضغط سلبي عن طريق الاتصال بمضخة خارجية ، مما يسمح بالتدفق المستمر والمستمر لغاز العينة. يتطلب توليد O3 أكسجين ثنائي الذرة (O 2) يتم توفيره بواسطة خزان O2 مخصص متصل ب CLD (توفر الشركات المصنعة الأخرى CLDs تعمل بالهواء المحيط). داخل غرفة التفاعل ، يتفاعل كل جزيء من غاز NO الموجود في الغاز الذي تم أخذ العينات منه مع الأكسجين لإنتاج جزيء واحد من ثاني أكسيد النيتروجين في الحالة المنشطة (NO2 *). بالعودة إلى حالته الأرضية، ينبعث كل جزيء NO2* من فوتون واحد يتم اكتشافه بواسطة أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) يقع بجوار غرفة التفاعل. ينتج PMT مع مكبر الصوت المرتبط به ووحدة المعالجة المركزية إشارة تتناسب مع عدد الفوتون وعدد جزيئات NO في غرفة التفاعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن توصيل مدخل العينة من CLD بنظام الأواني الزجاجية الذي يحتوي على غرفة تفاعل للعينات السائلة. يتم تطهير النظام باستمرار بغاز خامل مثل النيتروجين أو الهيليوم أو الأرجون ، مما ينقل NO من غرفة التفاعل إلى CLD. يتم حقن عينات الطور السائل من خلال غشاء مخصص في وعاء التطهير.

مخطط الجهاز الكيميائي ، يوضح تدفق الغاز في وعاء تطهير بغلاف PTFE ، مصيدة هيدروكسيد الصوديوم.
الشكل 2: هيكل وعاء التطهير للكشف القائم على التلألؤ الكيميائي لغاز أكسيد النيتريك يسمح وعاء التطهير (يمين) بالكشف عن غاز أكسيد النيتريك (NO) أو أي مركب آخر يمكن تحويله بسهولة إلى غاز NO عند إطلاقه من كاشف الطور السائل. يتم توصيل مدخل الغاز الخامل بمصدر (خزان) لغاز خامل مثل الأرجون أو زيون أو النيتروجين ثنائي الذرة (N2). يستخدم صمام الإبرة (يفتح إلى اليسار) للتحكم في الضغط داخل وعاء التطهير ويمكن إزالته بالكامل لتنظيف الوعاء. يتم تغطية منفذ الحقن بغطاء مع حاجز غشائي لحقن العينة. يجب استبدال الغشاء في كثير من الأحيان. تحيط سترة ساخنة بغرفة التفاعل ويتم توصيلها بحمام ماء ساخن لإجراء فحص VCl3 في HCl. يتم توصيل منفذ وعاء التطهير بكاشف التلألؤ الكيميائي (CLD) أو بمصيدة NaOH (المطلوبة ل VCl3 في فحوصات HCl). لتصريف محتوى غرفة التفاعل ، قم أولا بإغلاق السدادات عند مدخل الغاز الخامل ومخرج وعاء التطهير ، وأغلق صمام الإبرة ، وأزل الغطاء في منفذ الحقن ، وأخيرا افتح السدادة في البالوعة. يجب وضع مصيدة NaOH (يسار) في خط مستقيم بين وعاء التطهير و CLD إذا تم إجراء فحص VCl3 في HCl بسبب تآكل HCl. يتطلب الاتصال ب CLD دائما وضع مرشح عازل مكثف للمجال (IFD) بين CLD وإخراج وعاء التطهير (أو مصيدة NaOH ، إذا تم استخدامها). يزيل مرشح IFD الجسيمات المحمولة جوا ويمنع السائل من المرور عبر وعاء التطهير. PTFE = بولي تترافلورو إيثيلين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ونتيجة لذلك ، يمكن اكتشاف أي مركب يمكن تحويله إلى NO من خلال تفاعل كيميائي محدد وخاضع للرقابة بحساسية عالية في أي سائل بيولوجي ونسيج متجانس24. يتم إجراء القياس المباشر للمرحلة الغازية NO من خلال التلألؤ الكيميائي في كل من الإعدادات التجريبية والسريرية. يتم وصف هذه التقنيات على نطاق واسع في أماكن أخرى33،34،35. يمكن إجراء قياس NO2-و S-nitrosothiols و S-nitrosated proteins و Fe-NOs عن طريق إضافة عينات في خليط تفاعل مع ثلاثي يوديد (I3-) ، والذي يطلق غاز NO من جميع هذه المركبات:

I3- → I2 + I-

2NO 2− +2I− +4H+ → 2NO + I 2 +2H 2 O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

بينما أنا 3- لا يتفاعل مع NO 3-15. وتصبح القياسات الدقيقة لكل مركب ممكنة عن طريق المعالجة المسبقة لعينات الأليكوت بالسلفانيلاميد المحمض (AS) مع أو بدون كلوريد الزئبق (HgCl2). على وجه التحديد ، تزيل المعالجة المسبقة باستخدام AS جميع محتويات NO 2. ونتيجة لذلك، فإن محتوى NO الذي تم قياسه بواسطة CLD لا يعكس سوى مجموع تركيز S-NOs و Fe-NOs. يؤدي حقن HgCl 2 في عينة أليكوت قبل حقن AS إلى إطلاق NO2- بواسطة S-NO. يضمن العلاج باستخدام AS (مما يؤدي إلى إزالة NO2) أن محتوى NO المقاس يعكس فقط تركيز Fe-NOs. تسمح سلسلة من عمليات الطرح بين التقييمات بحساب التركيز الدقيق لمشتقات NO الثلاثة22.

مخطط التحليل الكيميائي الحيوي المتسلسل مع خلط الكاشف والحضانة وخطوات القياس المركب.
الشكل 3: خطوات إعداد العينة لفحص التلألؤ الكيميائي I3- في حمض الخليك. يتم توضيح الخطوات المتسلسلة لإعداد اختبار التلألؤ الكيميائي I3- في حمض الخليك. مطلوب استخدام أنابيب الطرد المركزي المحمية من الضوء. الأنابيب 1 و 2 و 3 هي تلك المستخدمة للتحضير للفحص. هناك حاجة إلى عينة أخرى من أليكوت (الأنبوب 4) لفحص VCl 3 في HCl إذا كان قياس النترات (NO3-) مطلوبا. يشار إلى الخطوات بالأرقام باللون الأحمر. الملء المسبق (الخطوة 1) كما هو موضح بمحلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) أو HgCl2 قبل إضافة حجم العينة. أضف حجم العينة (2) كما هو موضح ، دوامة ، واحتضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT). أضف (3) PBS أو السلفانيلاميد المحمض (AS) كما هو موضح ، دوامة ، واحتضن لمدة 3 دقائق في RT. قم بتشغيل الفحص (4). التركيز الذي يقاس بالفحص هو مجموع تركيز المركبات المبلغ عنها تحت كل أنبوب. سيسمح الأنبوب رقم 1 بقياسات النتريت (NO2-) و S-nitrosothiols (S-NO) ومجمعات الحديد والنيتروزيل (Fe-NOs) كإشارة واحدة. لقياس النترات (NO 3-) ، يجب تشغيل العينات باستخدام كل من I 3- في حمض الخليك و VCl 3 في مقايسات HCl ، ويجب طرح القيمة التي تم الحصول عليها من الأنبوب 1 من القيمة التي تم الحصول عليها من الأنبوب 4. * الكميات المقترحة لاستخدامها في تحليل Hb لتحديد الكميات المتبقية NO2-و S-nitrosohemoglobin والحديد-النيتروزيل-الهيموغلوبين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لقياس NO 3 ، يتم استخدام كلوريد الفاناديوم (III) (VCl 3) في حمض الهيدروكلوريك (HCl) لتحويل NO 3- إلى NO في وعاء التطهير من أجل قياس NO 3- stoichiometrically مع CLD:

2 NO 3-+ 3V +3 + 2H 2 O →2NO+ 3VO2+ + 4H+

لتحقيق تحويل سريع بما فيه الكفاية ، يجب إجراء التفاعل عند 90-95 درجة مئوية. يقترن الانخفاض من NO3 - إلى NO 2- بتخفيض NO2 - إلى NO بواسطة HCl. كما يقلل معدن الفاناديوم من S-NOs مما يحرر NO moiety22,36. يعكس التركيز النهائي الذي تم الحصول عليه بواسطة CLD مع VCl 3 في HCl التركيز الكلي ل NO 3-و NO2 والمركبات النيتروجينية الأخرى. يسمح طرح القيمة الأخيرة من التركيز الناتج عن CLD مع I 3- بحساب تركيز NO 3- 36,37 (الشكل 3).

في فحص الاستهلاك NO ، فإن الإطلاق المستمر ل NO في وعاء التطهير من قبل مانحين NO مثل (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) يولد إشارة مستقرة تسمح بتحديد كمية أوكسي Hb الخالي من الخلايا في العينات المحقونة. كمية NO المستهلكة في وعاء التطهير هي في علاقة stoichiometric مع كمية oxyHb في العينة38.

وتوضح بروتوكولات قياس ال NO2-، و NO3-، و S-nitrosothiols، ومجمعات الحديد والنيتروزيل، وعدم استهلاك Hb الخالي من الخلايا في عينات البلازما. تتطلب الدراسات التي أجريت على NO في بيئة RBC معالجة عينة محددة تليها كروماتوغرافيا الاستبعاد لقياس S-NO-Hb و Hb-NO الهشة للغاية إلى جانب تحديد تركيز Hb الكلي15,22. يعد إعداد العينة مفيدا في تصحيح القياس. يمكن أن يؤدي الوجود المسبق ل NO 2- في H 2 O وإطلاق NO2- أثناء الفحص إلى قياس تركيزات أعلى بشكل مصطنع من مشتقات NO مثل S-NO-Hb14,39. كما يتم عرض جوانب مهمة من إعداد العينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الإجراءات المشار إليها في هذا البروتوكول هي وفقا لمجلس مراجعة مستشفى ماساتشوستس العام. تم جمع عينات الدم التي تم استخدامها خلال دراسة سابقة وتم إلغاء تحديدها للغرض الحالي18.

ملاحظة: راجع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على إرشادات محددة بشأن التوصيلات المثلى بين الأنابيب والأواني الزجاجية التي تشكل وعاء التطهير والغسيل والصيانة العامة. يجب أن تكون الاتصالات ثابتة ومصنوعة بعناية حتى لا تتلف الأواني الزجاجية. حدد مكونات وعاء التطهير الزجاجي: خط مدخل الغاز ، وعاء التطهير مع سترة التدفئة والمكثف ، مصيدة فقاعات الغاز هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، خط الاتصال بين وعاء التطهير والفقاعة ، خط غاز مخرج سفينة التطهير (إلى CLD) الموهوب بمرشح عازل مكثف للمجال (IFD). يجب أن يكون خط مرشح IFD بين وعاء التطهير ومدخل العينة من CLD في مكانه في كل مرة يتم فيها قياس أي مستقلبات في شكل سائل (البلازما ، مزارع الخلايا ، متجانسات الأنسجة) (جميع الفحوصات المقدمة في البروتوكول). يعتمد إعداد العينة على السائل أو الأنسجة التي يتم تحليلها وعلى المركبات ذات الاهتمام. ويغطي القسمان 1 و 2 جوانب هامة من مرحلة التحليل المسبق. يتم تضمين خطوات إعداد محددة لفحوصات محددة في الأقسام 3-5. تنطبق الأقسام 6-8 على جميع الفحوصات.

1. إعداد كواشف مخصصة

ملاحظة: لمزيد من التفاصيل، راجع المنشورات السابقة15,22.

  1. تحضير 5٪ (290 ملليمتر) محلول السلفانيلاميد المحمض (AS) لإزالة NO 2 عن طريق إذابة 500 ملغ من سلفانيلاميد إلى 10 مل من 1N HCl. هذا الحل مستقر لعدة أشهر.
  2. تحضير محلول كلوريد الزئبق 50 mM (HgCl 2) لإطلاق NO 2 من S-NOs عن طريق إذابة 67.9 ملغ من HgCl 2 إلى 5 مل من PBS. حماية محلول المخزون من الضوء.
  3. تحضير محلول NO2- الحجب مع 800 mM ferricyanide [K3Fe (CN)6] لأكسدة Hb مع 100 mM N-ethylmaleimide (NEM) لمنع مجموعات الثيول و (اختياري) 10٪ محلول نونيل فينيل - بولي إيثيلين جليكول (Nonidet p-40) لإذابة أغشية الخلايا الحمراء.
    1. أضف K3Fe(CN)6 إلى الماء منزوع الأيونات والمقطر (ddH2O، 263.5 جم من المسحوق لكل لتر) للحصول على تركيز نهائي قدره 800 ملليمتر.
    2. أضف NEM إلى محلول 800 mM K3 Fe(CN)6 في محلول ddH2O (12.5 جم من المسحوق لكل لتر للحصول على تركيز 100 mM) واخلط المحلول لإذابة جميع البلورات.
    3. أضف جزءا واحدا من 10٪ NP-40 إلى تسعة أجزاء من محلول NEM K3 Fe(CN) 6 100 mM NEM 800 mM (111 مل لكل لتر) واخلطه جيدا (خطوة إلزامية لتحليل الدم الكامل).
  4. قم بإعداد محلول تثبيت S-NO-Hb الذي يحتوي على 12 mM K 3 Fe(CN) 6 و 10 mM NEM و 100 μM ثنائي إيثيلينترياميني حمض الخماسيتيك(DTPA ، لاستخلاب المعادن) ، ومنظف Nonidet p-40 بنسبة 1٪ من محاليل المخزون الخاصة بهم.
    1. قم بإعداد محلول NEM 200 mM عن طريق إضافة بلورات NEM إلى PBS (25 mg / mL ، على سبيل المثال ، 250 mg في 10 mL PBS) واخلط المحلول حتى تذوب جميع البلورات (يتم تصنيعها في يوم التجربة).
    2. قم بإعداد محلول 800 mM K 3 Fe(CN)6 بإضافة K3Fe(CN)6 إلى ddH 2 O (263.5 mg / mL على سبيل المثال 1.32 g في 5 mL من ddH2O للحصول على تركيز نهائي من 800 mM)(يتم إجراؤه في يوم التجربة).
    3. قم بإعداد محلول مخزون DTPA 10 mM عن طريق إضافة 786 mg من DTPA إلى 200 مل من ddH2O وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع 5N NaOH لإذابة DTPA بالكامل.
    4. أضف 5 مل من محلول NEM 200 mM ، و 1.5 مل من محلول 800 mM K3Fe (CN) 6 و 1 مل من محلول مخزون DTPA إلى 81.5 مل من PBS عند 7.2 درجة حموضة ، وأخيرا ، أضف 11 مل من 10٪ NP-40 أخيرا للوصول بالحجم النهائي إلى 100 مل.

2. جمع العينات

ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول جمع العينات، راجع الأعمال المنشورة سابقا15،22،40.

  1. جمع الدم الكامل
    1. جمع الدم في أنابيب مغلفة بالهيبارين مفضلة الوريد على الأوعية الشريانية (ما لم يكن ذلك مطلوبا على وجه التحديد) وتفضيل وضع القسطرة على الوخز بالإبر (إن أمكن) باستخدام قسطرة أو تجويف إبرة لا يقل عن 20 جم أو أكبر لتقليل انحلال الدم.
    2. أضف على الفور محلول الحجب NO2 (جزء واحد من المحلول إلى 4 أجزاء من الدم الكامل) ، أو قم بالمعالجة (الأقسام 3 أو 4) ، أو قم بتجميده وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
  2. جمع البلازما وخلايا الدم الحمراء (RBCs)
    1. جمع الدم في أنابيب مغلفة بالهيبارين تفضل الوريد على الدم الشرياني (ما لم يكن مطلوبا على وجه التحديد) وإبر لا تقل عن 20 جم أو أكبر لتقليل انحلال الدم وأجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 5 دقائق عند 4000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    2. امزج المادة الفائقة (البلازما) مع محلول الحجب NO2 (جزء واحد من المحلول إلى 4 أجزاء من السوبرناتانت) في أنبوب جديد وعملية (الأقسام 3 أو 4) ، أو قم بتجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: بالنسبة لفحص عدم الاستهلاك، لا يمكن استخدام حل الحظر NO 2. يمكن إجراء الفحص دون معالجة مسبقة بالبلازما.
    3. أعد تعليق حبيبة RBC من الأسفل إلى أنبوب جديد مملوء مسبقا بمحلول تثبيت S-NO (انظر الخطوة 1.4) (1 مل من الكريات إلى 9 مل من المحلول) واحتضنها لمدة 5 دقائق.
    4. مرر الليزات RBC في عمود تحجيم باستخدام بوليمر G-25 Sephadex الذي تم شطفه مسبقا باستخدام ddH2O لاستبعاد الكروماتوغرافيا
    5. اجمع جزء Hb للمعالجة (القسم 4) ولقياس تركيز Hb باستخدام كاشف Drabkin's (لقياس Hb ، راجع العملالمنشور سابقا 22).
      ملاحظة: لإعداد وأخذ عينات من نسيج / عضو معين ، وتحديد هيلومه ، وعزله جراحيا. شق الوريد ، وثقب الشريان ، وحقن مع محلول ملحي الهيبارين (10 U / mL) عبر الشريان. استئصا الأنسجة عندما تبدأ المياه المالحة في التدفق العكسي عند الشق الوريدي. تجانس الأنسجة باستخدام مجانس ميكانيكي مع إضافة جزء واحد من محلول NO2- المانع إلى 4 أجزاء من الأنسجة المتجانسة.

3. VCl3 في إعداد فحص HCl

ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول VCl3 في إعداد فحص HCl ، راجع الأعمال المنشورة سابقا37,41.

تنبيه: ستتلف CLD إذا لم يكن مصيدة NaOH في مكانها الصحيح عند إجراء هذا الفحص. ويرجع ذلك إلى تآكل حمض الهيدروكلوريك.

  1. إعداد حلول قياسية من NO3- للمنحنى القياسي
    1. قم بإذابة 85 ملغ من NaNO 3 في 10 مل من ddH2O للحصول على 0.1 M NaNO3- (يظل هذا المحلول مستقرا لبضعة أسابيع).
    2. استخدم محلول المخزون لإعداد المعايير عن طريق التخفيف في ddH2O للحصول على تركيزات 5 ميكرومتر ، 10 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر نانو3 من أجل إجراء منحنى معايرة لعينات البلازما أو البول (استخدم تركيزات أقل إذا كنت تعمل مع مزارع الخلايا).
  2. تحضير محلول مشبع VCl 3 (كلوريد الفاناديوم) لتقليل NO 3 في وعاء التطهير
    تنبيه: تفاعل الماء وVCl3 طارد للحرارة. انتبه إلى ارتفاع درجة حرارة الأواني الزجاجية عند إضافة الحمض وعند شطف الأواني الزجاجية في نهاية التجربة.
    1. قم بإذابة 1.6 جم من VCl 3 في 200 مل من 1 M HCl عن طريق إضافة VCl3 أولا في قارورة نظيفة ثم إضافة 200 مل من 1 M HCl.
    2. قم بتصفية المحلول بالتفريغ من خلال ورق الترشيح (مثل ورق الترشيح 11 ميكرومتر ، ولكن يمكن استخدام أي ورق ترشيح).
      ملاحظة: يتحول المحلول المصفى إلى اللون الأزرق الشفاف، في حين أن محلول VCl3 غير المصفى بني اللون بسبب الجسيمات غير الذائبة.
    3. حافظ على المحلول المشبع مغطى إما برقائق الألومنيوم أو شريط البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) لأن المركب حساس للضوء.
  3. تحضير الحمام المائي المتداول
    1. قم بتوصيل جهاز حمام مائي متداول بسترة المياه الخاصة بوعاء التطهير. تأكد من أن الخطوط جافة قبل التحضير.
    2. ابدأ الحمام المائي عند 95 درجة مئوية وتحقق من عدم وجود تسربات على خطوط المياه عن طريق تطبيق مناشف ورقية (غير ملتصقة) حول الخطوط.
  4. إعداد مصيدة فقاعات الغاز
    1. تحقق من أن غلاف PTFE الخاص بالفقاعة في مكانه وأنه غير تالف.
    2. افتح فقاعة الغاز وحقن 15 مل من 1 M NaOH في قاعدة الفقاعة.
    3. أعد وضع فقاعة الغاز وأغلق الاتصال بإحكام عن طريق الضغط على الجزء السفلي نحو الأعلى ولف الجزأين قليلا. تشير استحالة قلب الجزء العلوي من الفقاعة دون تطبيق القوة إلى وجود ختم صحيح.
    4. قم بتوصيل مخرج وعاء التطهير بمدخل مصيدة فقاعات الغاز.

4. I3- في إعداد فحص حمض الخليك

ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول I3- في إعداد فحص حمض الخليك ، راجع الأعمال المنشورة سابقا15،22،38،41،42.

  1. إعداد منحنى قياسي ل NO2-
    1. تحضير محلول مخزون عن طريق إذابة 69 ملغ من نتريت الصوديوم (NaNO 2) في 10 مل من ddH2 O للحصول على محلول 100 mM. هذا الحل مستقر إذا تم تخزينه في حاوية محكمة الإغلاق ومبردة ومحمية من الضوء.
    2. قم بتخفيف محلول المخزون بشكل متسلسل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل مملوء مسبقا ب 900 ميكرولتر من ddH2O: أضف 100 ميكرولتر من محلول المخزون إلى أنبوب الطرد المركزي الأول ، وامزج ، وقم بتسمية واستخدام 100 ميكرولتر من الأنبوب للأنبوب الثاني ، ثم كرر ذلك مما أدى إلى 10 mM ، 1 mM ، ثم 100 μM.
    3. مزيد من التخفيف مع ddH 2 Oللحصول على 50 ميكرومتر و 25 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 1 ميكرومتر و 500 نانومتر NaNO2 أليكوتس لاستخدامها في منحنى المعايرة.
  2. تحضير I3- في حمض الخليك لوعاء التطهير (يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 أسبوع)22
    1. أضف 2 غرام من يوديد البوتاسيوم (KI) و 1.3 غرام من اليود (I 2) إلى 40 مل من ddH2O و 140 مل من حمض الخليك.
    2. اخلطي جيدا عن طريق تحريك الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  3. إعداد العينات للتحديد التفاضلي ل NO2-، S-nitrosothiols (S-NO-Hb، إذا تم جمع Hb) ومجمعات الحديد والنيتروزيل (Hb-NO إذا تم جمع Hb) (الشكل 3)
    1. قسم كل عينة إلى 3 أليكوتات من 270 ميكرولتر (900 ميكرولتر من Hb إذا كان قياس S-NO-Hb و Hb-NO) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحمية من الضوء ، 2 منها مملوءة مسبقا ب 30 ميكرولتر من 1x PBS (100 ميكرولتر إذا كان قياس S-NO-Hb و Hb-NO) والأنبوب الثالث مع 30 ميكرولتر من HgCl2 (100 ميكرولتر إذا كان قياس S-NO-Hb و Hb-NO) ، دوامة وحضانة في RT لمدة 2 دقيقة (الشكل 3).
    2. أضف 30 ميكرولتر من 5٪ AS إلى العينة التي تحتوي على HgCl 2 لقياس Fe-NOs ، (100 ميكرولتر ل Hb-NO) وإلى واحدة مع PBS المضافة لقياس S-NOs و Fe-NOs (100 μL ل S-NO-Hb و Hb-NO) وإضافة 30 ميكرولتر من PBS إلى العينة الثالثة المملوءة مسبقا ب 1x PBS لقياس NO 2 و S-NOs و Fe-NOs (100 μL للبقايا NO 2- من مجموعة Hb ، S-NO و Hb-NO). دوامة وحضانة في RT لمدة 3 دقائق (الشكل 3).

5. لا يوجد استهلاك بواسطة إعداد Hb الخالي من الخلايا

ملاحظة: لمزيد من التفاصيل، راجع العملالمنشور سابقا 38.

  1. تحضير محاليل oxyHb القياسية من محلول Hb منقى مع تركيز معروف
    1. قم بتخفيف محلول المخزون بشكل متسلسل إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل بالإضافة إلى ddH2O للحصول على المحاليل التي سيتم استخدامها لمنحنى المعايرة: 62 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 25 ميكرومتر ، 12.5 ميكرومتر ، 6.25 ميكرومتر ، 3.125 ميكرومتر ، 1.56 ميكرومتر.
  2. تحضير محلول DETA-NONOate
    1. أضف 10 ملغ من DETA-NONOate إلى 610 ميكرولتر من 10 ميكرومتر NaOH في درجة الحموضة 7.4 PBS لتوليد 100 mM من DETA-NONOate وإبقائه على الجليد.

6. بدء كاشف التلألؤ الكيميائي (CLD) وإعداد وعاء التطهير

ملاحظة: لإعداد وعاء التطهير، ارجع إلى العملالمنشور سابقا 43.

  1. التحقق من الاتصالات الرئيسية من وإلى CLD
    1. قم بتوصيل خط الأكسجين ب CLD وافتح خزان الأكسجين عند ضغط يتفق مع الشركة المصنعة ل CLD.
    2. تأكد من توصيل خط مرشح عزل المجال المكثف (IFD) ب CLD ولكن ليس بوعاء التطهير أو مصيدة NaOH
  2. بدء تشغيل CLD
    1. على واجهة CLD ، ابدأ تشغيل برنامج الكشف عن فحوصات الطور السائل.
    2. تحقق من أن إمدادات الأكسجين كافية. إذا كان هذا هو الحال ، فسيبدأ CLD بنجاح في أخذ العينات من مدخله ويشير إلى اكتشافه بواسطة إشارة بالمللي فولت (0-5 mV). خلاف ذلك ، سوف يطالب CLD بإشارة تشخيصية سلبية.
  3. تحضير وعاء التطهير
    1. أغلق وعاء التطهير في جميع الموانئ الثلاثة: قم بتثبيت صمام الإبرة بالكامل على اليمين ، وأغلق مداخل ومخرج التوقف.
    2. قم بإزالة الغطاء من وعاء التطهير وإضافة كمية كافية من الكاشف الخاص بالفحص المخطط له إلى غرفة التفاعل (الجدول 1) بحيث يمكن لإبرة المحقنة المستخدمة في حقن العينات الوصول إلى عمود السائل.
    3. تحقق من وجود خط أساس ثابت مرغوب فيه (الجدول 1).
  4. بدء تدفق غاز التطهير
    1. تأكد من أن خزان الغاز الخامل (على سبيل المثال ، N2) مجهز بمنظم من مرحلتين وقم بتوصيل خزان الغاز الخامل بمدخل الغاز في السفينة.
    2. افتح الغاز بضغط مخرج عند منظم 1-5 رطل لكل بوصة مربعة ، وافتح مدخل وعاء التطهير وافتح ببطء صمام إبرة وعاء التطهير للسماح بتدفق الغاز. تحقق من الفقاعات داخل وعاء التطهير.
  5. ضبط تدفق الغاز
    1. سجل ضغط الخلية الذي تم قياسه بواسطة CLD باستخدام خط مرشح IFD لأخذ عينات من الهواء المحيط.
    2. أعد وضع الغطاء الموجود على وعاء التطهير ، وقم بتوصيل خط مرشح IFD بوعاء التطهير (أو بمصيدة NaOH في VCl3 في فحص HCl) ، وافتح مخرج وعاء التطهير.
    3. استخدم صمام الإبرة للوصول إلى نفس ضغط الخلية عند مستوى CLD المسجل في الهواء المحيط.

7. التجربة

ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول التجربة، راجع العملالمنشور سابقا 43.

  1. بدء برنامج الحصول على إشارة التلألؤ الكيميائي
    1. قم بتوصيل المنفذ التسلسلي ل CLD بالمنفذ التسلسلي للكمبيوتر الذي تم تثبيت برنامج الاكتساب عليه.
    2. قم بتشغيل برنامج التحليل.
    3. انقر فوق اكتساب ، وحدد المجلد لحفظ ملف .data ، واكتب اسم الملف ، وانقر فوق حفظ.
      ملاحظة: لاحظ وقت التشغيل المحدد مسبقا على الشاشة، حيث يتوقف التسجيل تلقائيا عند انقضاء الوقت المحدد مسبقا. إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة وقت التشغيل المحدد مسبقا.
  2. الاستعداد لحقن العينات المتكررة
    1. اضبط مقياس الجهد على الشاشة للتحكم في خط الأساس المستهدف بالنقر فوق الزرين الحد الأدنى و / أو الحد الأقصى ثم إدخال القيمة المطلوبة.
    2. احصل على أنبوب سعة 20 أو 50 مل مملوء ب ddH2O لشطف المحقنة بين العينات.
    3. احصل على صندوق من مناديل المهام الحساسة المتاحة بسهولة.
  3. حقن العينة
    ملاحظة: ابدأ من المحاليل القياسية لمنحنى المعايرة (حقن من العينات الأقل تركيزا إلى العينات الأكثر تركيزا)، ثم انتقل إلى عينات التجربة (فكر في القيام بذلك في عينات مكررة أو ثلاثية).
    1. شطف المحقنة مرتين على الأقل أو أكثر باستخدام ddH2O قبل سحب كل عينة (وبعد كل حقنة) وتحقق في كل مرة من إخراج الماء دون عوائق على مسح المهمة.
    2. أدخل المحقنة في أنبوب العينة أثناء حمل كل من المحقنة والأنبوب على مسافة قريبة ، واسحب المكبس إلى الحجم المطلوب مع ضمان عدم وجود فقاعة هواء و / أو أجزاء صلبة غير متجانسة.
    3. نظف طرف المحقنة باستخدام ممسحة مهمة ، ثم أدخل المحقنة في غطاء الحاجز في منفذ الحقن وحقنها بعد التحقق من أن طرف المحقنة داخل المرحلة السائلة في غرفة التفاعل.
  4. ضع علامة على الحقن في البرنامج وانتظر
    1. تحقق من أن الحقن يسبب تغييرا صعوديا في الإشارة (الشكل التكميلي 1) (لأسفل في عدم استهلاك NO بواسطة فحص Hb الخالي من الخلايا) واكتب اسم العينة بالنقر فوق المربع الرمادي ضمن أسماء العينات ، ثم انقر فوق وضع علامة على الحقن.
      ملاحظة: يشتبه في حدوث انسداد في المحقنة إذا لم يولد حقن العينة إشارة.
    2. انتظر حتى تصل الإشارة الكهربائية إلى خط الأساس مرة أخرى (يستغرق ذلك عادة 3-4 دقائق). يمكن استخدام هذه المرة لتنفيذ الخطوة 7.3.1.
  5. كرر كافة الخطوات المشار إليها في الخطوتين 7.3 و7.4 أثناء وبعد كل حقنة حتى نهاية التجربة. تذكر تشغيل عينة من محلول الحفظ (إذا تم استخدامه)
  6. إيقاف التجربة
    1. انقر فوق STOP لمقاطعة اكتساب الإشارة ، وإيقاف CLD وإيقاف تشغيل الحمام المائي (إذا تم قياس NO3- ).
    2. قاطع تدفق الغاز ، وافتح صمام الإبرة ، وأزل الغطاء من وعاء التطهير ، وضع حاوية نفايات تحت التصريف وافتح سدادة التصريف.
      ملاحظة: إذا كانت التجربة تتطلب الحصول على البيانات لفترة أطول من 60 دقيقة، فمن الضروري إعادة تشغيل عملية الاستحواذ بعد 60 دقيقة من وقت التشغيل (كرر الخطوة 7.1.3) وإنشاء ملف جديد.

8. القياسات والحسابات

ملاحظة: يتم إجراء القياسات والحسابات في وضع عدم الاتصال ويمكن إجراؤها في وقت مختلف.

  1. بدء برنامج اكتساب التلألؤ الكيميائي لتحليل البيانات دون اتصال بالإنترنت
    1. ابدأ تشغيل البرنامج وانقر على معالجة.
    2. حدد ملف التجربة، ثم انقر على فتح.
  2. حساب المساحة تحت المنحنى لكل إدارة
    1. يقوم البرنامج تلقائيا برسم خط الأساس (الشكل التكميلي 2A ، الخط الأصفر الأفقي) ومحور الذروة لكل موجة ناتجة عن كل إدارة عينة (خطوط صفراء رأسية): تحقق من موضعها الصحيح (أو اضبطها بالنقر فوق كل سطر وتحريكه بالماوس أو الأسهم) وانقر فوق عتبة موافق (الشكل التكميلي 2B).
      ملاحظة: في اختبار عدم الاستهلاك بواسطة اختبار قياس Hb الخالي من الخلايا ، لا يتمكن البرنامج عادة من التقاط الشكل الموجي الناتج عن حقن العينة بشكل صحيح. من خلال تكبير كل شكل موجي ، يمكن للمشغل بسهولة مساعدة البرنامج في حساب المنطقة (الشكل التكميلي 2).
    2. يقوم البرنامج تلقائيا برسم البداية (الخط الأخضر الرأسي) والنهاية (الخط الأحمر الرأسي) لكل قمة تسببها كل إدارة عينة: تحقق من موضعها الصحيح (أو اضبطها بالنقر فوق كل سطر وتحريكه بالماوس أو الأسهم) وانقر فوق دمج (الشكل التكميلي 2C).
      ملاحظة: قد يتم تعريف بعض المناطق في التتبع عن طريق الخطأ على أنها حقن في هذه المرحلة، وقد يتم حساب بعض القمم تلقائيا مرتين. يمكن إعادة تحديد كلا الخطأين وإزالتهما خلال الخطوة 8.2.2
    3. يقوم البرنامج تلقائيا بمطابقة كل منطقة إشارة بعد حقن تم وضع علامة عليها أثناء التجربة واسمها المعين: انتقل إلى كل قمة (يشار إليها بخط عمودي أصفر) مع الاسم المعين بالنقر فوق الذروة التالية والذروة السابقة ، ثم انقر فوق الزر All OK للحصول أخيرا على الحساب لجميع المناطق على الشاشة.
    4. من أجل تصحيح جميع أخطاء التسمية أو المطابقة التي يرتكبها المستخدم أو البرنامج ، استخدم حسب الحاجة الأزرار المشار إليها في الملف التكميلي 1.
  3. نقل قيم منحنى المعايرة إلى جدول بيانات وإنشاء معادلة انحدار خطي (الشكل التكميلي 3)
    1. نقل البيانات من برنامج CLD إلى جدول بيانات جديد من خلال النسخ واللصق. رتب العمودين على ورقة البيانات كتركيز العينة والمساحة تحت المنحنى، وأضف قيمة متطابقة تساوي صفرا على كلا العمودين.
    2. حدد العمودين، وانقر على إدراج > مبعثر، ثم ضمن قائمة تصميم المخطط ، حدد إضافة عنصر مخطط > خط الاتجاه > خطي.
    3. انقر بزر الماوس الأيمن على خط الاتجاه الذي تم إنشاؤه ، وانقر فوق تنسيق خط الاتجاه ، ثم انقر فوق الخيارات عرض المعادلات على الرسم البياني وعرض قيمة R المربعة على الرسم البياني في قائمة تنسيق خط الاتجاه للحصول على معادلة معايرة خطية بسيطة.
  4. نقل المساحة المحسوبة لكل عينة لحساب تركيزها (الشكل التكميلي 3)
    1. الإبلاغ عن كل قيمة في جدول البيانات. في العمود التالي، قم بتطبيق المعادلة التي تم الحصول عليها من الخطوة 8.3.3 للحصول على تركيز كل عينة تم حقنها، حيث y هو التركيز (قيمة العمود الجديد) و x هي المساحة تحت المنحنى المقاسة بعد الحقن.
      ملاحظة: تذكر أن تأخذ في الاعتبار التركيز المقاس في محلول الحفظ (إذا تم استخدامه) وطرح القيم وفقا لذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

واستخدم اختبار عدم الاستهلاك بواسطة مقايسة Hb الخالية من الخلايا في عينات تحتوي على تركيزات معروفة من أوكسي Hb الخالي من الخلايا (الشكل 4). نظرا لأن هيم واحد من oxyHb يطلق جزيء NO واحد في الفحص ، يتم استخدام oxyHb الخالي من الخلايا المنقى لبناء منحنى المعايرة للفحص (الشكل التكميلي 3).

يوضح الشكل 5 علاقة الجرعة والاستجابة بين Hb الخالي من الخلايا (الذي تم قياسه باستخدام فحص قياس الألوان) وعدم استهلاك المرضى الذين يخرجو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نظرا للحساسية العالية ، فإن الفحوصات القائمة على التلألؤ الكيميائي لتحديد NO والمركبات ذات الصلة لديها خطر كبير من تلوث NO 2. يجب اختبار كل كاشف (خاصة محلول الحجب NO 2) والمخفف (بما في ذلك ddH 2 O) المستخدم في التجربة لمحتواه NO 2- لتصحيحه لإشارة الخلفية. النتريت هو رد فعل للغاية مع نصف العمر في الدم كله حوالي 10 دقائق ويولد بسرعة NO3-. وبالتالي فإن الوقت الذي ينقضي بين جمع الدم والطرد المركزي ، أو NO2-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يتلقى L.B. دعم الراتب من K23 HL128882 / NHLBI NIH كباحث رئيسي لعمله على انحلال الدم وأكسيد النيتريك. يتلقى LB منحا من "المنح السريعة لأبحاث COVID-19" في مركز ميركاتوس بجامعة جورج ميسون ومن iNO Therapeutics LLC. يتم دعم B.Y. من خلال منح من NHLBI / #R21HL130956 و DOD / The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1 ، Log DM190244). حصلت B.Y. على براءات اختراع في MGH حول التوليد الكهربائي لأكسيد النيتريك.

قدمت L.B. و B.Y. طلب براءة اختراع لعدم التسليم في رقم طلب معاهدة التعاون بشأن البراءات لمرض COVID-19: PCT/US2021/036269 المودع في 7 يونيو 2021. ويتلقى المركز دعما للمرتبات من يونيتيد بوصفه الباحث الرئيسي في تطوير التكنولوجيا الرامية إلى التشخيص اللامركزي لمرض السل لدى الأطفال الموجودين في بيئات منخفضة الموارد.

شكر وتقدير

أصبحت البروتوكولات الواردة في هذه المخطوطة ممكنة بفضل المساهمات المتراكمة للزملاء السابقين في مختبر الدكتور وارن زابول لأبحاث التخدير في الرعاية الحرجة ، قسم التخدير في مستشفى ماساتشوستس العام. ونعرب عن تقديرنا لمساهمة الدكاترة أكيتو ناكاغاوا، وفرانشيسكو زاديك، وإيمانويل فاسينا، وتشونغ لي، وياسوكو ناغاساكا، وإستر سباغنولي، وإيمانويل ريزواغلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الخليكسيجما45754500 مل - سائل
مضاد للرغوة ب مستحلبسيجماA5757250 مل - سائل
DETA NONOateكايمان8212010 مجم
جيبكو DPBS (1x) بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيومThermoFisher14190144500 مل
حمض الهيدروكلوريك 37٪ (1 م)سيجما258148500 مل - سائل
اليودSAFC207772100 جم - كاشف
KimwipesKimtech34155
Mercury (II) كلوريد ACS صلب> 99.5٪سيجما215465100 جم - صلب (يذوب في الماء)
نظام تنقية المياه Mili-QMillipore
موديل 705 RN 50 & mu ؛ حقنة Lهاميلتون80530حقنة ميكرولتر
موديل 802 N 25 & L حقنةهاميلتون84854حقنة ميكرولتر
N-ethylmaleimideSigma426025 جم -
محلل أكسيد النيتريك البلوري + برنامج الحزمة - وعاء التطهيرZysenseNOA 280iكاشف التلألؤ الكيميائي
Nonidet p-40 & nbsp ؛ (NP-40)ThermoFisher8512510٪ - 500 مل
كاشف سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (III) ACS & 99٪سيجما244023100 جم - مسحوق
كاشف يوديد البوتاسيوم ACS> 99٪سيجما221945100 جم -
كريست نتريت البوتاسيوم الصلب. للتحليل EMSURE ACSSupelco105067250 جم - بلوري
PowerGen 125Fisher Scientific14-359-251الخالط الميكانيكي
RV3 مضخة دوارة دوارة على مرحلتينمضخة تفريغ A65201906 إدواردز- مجمعة مع محلل
هيبارين الصوديوم - BD Hemogard CloBD BiosciencesBD36787175 وحدة USP
كاشف ACS اللامائي لهيدروكسيد الصوديوم & جي ؛ 97٪سيجما7954291 كجم - كريات
كاشف نترات الصوديوم ACS & 99٪سيجما221341500 جم - مسحوق
نتريت الصوديوم & جي 99٪سيجماS2252500 جم -
سلفانيلاميد بلوري & 98٪سيجماS9251100 جم - صلب
الفاناديوم (III) كلوريدسيجما11239325 جم - صلب - الحذر (طارد للحرارة)
Whatman 1 ورق الترشيحSigmaWHA10010155

المراجع

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186(1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550(2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550(2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238(2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879(2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

S

مقالات ذات صلة