تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

Cara E. Moravec; Gabriella C. Voit; Francisco Pelegri

doi:10.3791/63177

مقالة منهجية

تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

DOI:

10.3791/63177

⸱

ديسمبر 21, 2021

Cara E. Moravec¹ , Gabriella C. Voit¹ , Francisco Pelegri¹

¹Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد التطور المبكر على المنتجات الموروثة من الأم ، ودور العديد من هذه المنتجات غير معروف حاليا. في هذا الصدد، وصفنا بروتوكولا يستخدم تقنية كريسبر-كاس9 لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في جيل واحد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد التطور المبكر على مجموعة من العوامل الأمومية المدمجة في البويضة الناضجة أثناء تكوين البويضات والتي تؤدي جميع الوظائف الخلوية اللازمة للتنمية حتى تنشيط الجينوم الوجنتي. وعادة ما يتطلب الاستهداف الجيني لهذه العوامل الأمومية جيلا إضافيا لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي، مما يعوق القدرة على تحديد دور الجينات المعبر عنها من قبل الأم أثناء النمو. وقد سمح اكتشاف قدرات التحرير ثنائي الأليليك ل CRISPR-Cas9 بفحص الأنماط الظاهرية الجنينية في الأنسجة الجسدية للأجنة المحقونة أو "المقرمشة"، مما زاد من فهم الدور الذي تلعبه الجينات المعبر عنها وzygotic في البرامج التنموية. توضح هذه المقالة بروتوكولا يعد امتدادا للطريقة المقرمشة. في هذه الطريقة ، يسمح التحرير الثنائي للخلايا الجرثومية بعزل النمط الظاهري للأمهات في جيل واحد ، أو "المقرمشات الأمومية ". يعزز الحمض النووي الريبي الموجه متعدد الإرسال إلى هدف واحد الإنتاج الفعال للهشطات النفاسية للأمهات ، في حين يوفر تحليل تسلسل الحوافر المقرمشة للأمهات طريقة بسيطة لتأكيد الآفات الوراثية التي تنتج نمطا ظاهريا للأمهات. ويدعم استخدام المقرمشات النفاسية للأمهات التحديد السريع للجينات الأساسية المعبر عنها من قبل الأم، مما يسهل فهم التطور المبكر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجموعة من المنتجات المودعة من الأم (على سبيل المثال ، الحمض النووي الريبي والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى) ضرورية لجميع العمليات الخلوية المبكرة حتى يتم تنشيط الجينوم الوجني للجنين¹. عادة ما يكون النضوب المبكر لهذه المنتجات من البويضة قاتلا جنينيا. على الرغم من أهمية هذه الجينات في التطور ، فإن دور العديد من الجينات المعبر عنها من قبل الأم غير معروف حاليا. يتيح التقدم في تكنولوجيا تحرير الجينات في أسماك الزرد ، مثل CRISPR-Cas9 ، استهداف الجينات المعبر عنها من الأم²،³^،⁴. ومع ذلك ، فإن تحديد النمط الظاهري للتأثير الأمومي يتطلب جيلا إضافيا عند مقارنته بالنمط الظاهري الوجني ، مما يتطلب المزيد من الموارد. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام قدرة التحرير ثنائي الأليليك ل CRISPR-Cas9 لفحص الأنماط الظاهرية الجنينية في الأنسجة الجسدية للأجنة المحقونة (F0) ، والمعروفة باسم "المقرمشات"⁵،⁶،⁷^،⁸،⁹^،¹⁰. تسمح تقنية الهش بإجراء فحص فعال للموارد للجينات المرشحة في الخلايا الجسدية ، مما يسهل فهم جوانب محددة في التنمية. يسمح البروتوكول الموصوف في هذه الورقة بتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي ، أو "المقرمشات الأمومية "، في جيل واحد¹¹. يمكن تحقيق هذا المخطط عن طريق توجيه الحمض النووي الريبي المتعدد إلى جين واحد وتعزيز أحداث التحرير ثنائي الأليل في الخط الجرثومي. يمكن تحديد هذه الأجنة المقرمشة للأمهات بواسطة الأنماط الظاهرية المورفولوجية الإجمالية وتخضع للتوصيف الأولي ، مثل وضع العلامات على حدود الخلايا ونمط الحمض النووي¹¹. يسمح التحليل المشترك للنمط الظاهري الذي يمكن ملاحظته والتوصيف الجزيئي الأساسي ل INDELs المستحثة بالتنبؤ بدور الجين المستهدف في التطور المبكر.

في أسماك الزرد ، خلال أول 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ، تتطور مجموعة صغيرة من الخلايا إلى الخلايا الجرثومية البدائية ، وهي مقدمة للخط الجرثومي¹²،¹³^،¹⁴^،¹⁵. في البراثن التي وضعتها إناث F0 ، تعتمد نسبة الأجنة المقرمشة للأمهات التي تم استردادها على عدد الخلايا الجرثومية التي تحتوي على حدث تحرير ثنائي الأليليك في الجين المستهدف. بشكل عام ، كلما حدث التحرير في وقت مبكر في الجنين ، زاد احتمال ملاحظة طفرات CRISPR-Cas9 في الخط الجرثومي. في معظم الحالات ، تأتي الأنماط الظاهرية للأجنة المقرمشة للأمهات من فقدان الوظيفة في أليلين أموميين موجودين في البويضة النامية. عندما تنتهي البويضة من الانقسام الاختزالي ، يتم بثق أحد أليلات الأم من الجنين عبر الجسم القطبي ، بينما يتم دمج الأليل الآخر في نواة الأم. سيمثل تسلسل العديد من الفرديات المقرمشة للأمهات خليطا من الطفرات (عمليات الإدراج و / أو الحذف (INDELs)) الموجودة في الخط الجرثومي التي تساهم في النمط الظاهري¹¹.

يصف البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لإنشاء طفرات CRISPR-Cas9 في جينات تأثير الأم وتحديد النمط الظاهري المقابل باستخدام نهج هش للأمهات (الشكل 1). سيشرح القسم الأول كيفية تصميم وإنشاء الحمض النووي الريبي الإرشادي بشكل فعال ، في حين يحتوي القسمان الثاني والثالث على خطوات حاسمة لإنشاء مقرمشات الأمهات عن طريق الحقن المجهري. بعد حقن خليط CRISPR-Cas9 ، يتم فحص الأجنة المحقونة للتعديلات الجسدية عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (القسم الرابع). بمجرد أن تتطور أجنة F0 المحقونة وتصل إلى مرحلة النضج الجنسي ، يتم عبور إناث F0 إلى ذكور من النوع البري ، ويتم فحص ذريتهم بحثا عن الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي (القسم الخامس). يتضمن القسم السادس تعليمات حول صنع المفردات المقرمشة للأمهات التي يمكن دمجها مع تسلسل Sanger لتحديد INDELs التي يسببها CRISPR-Cas9. وبالإضافة إلى ذلك، تتضمن المناقشة تعديلات يمكن إدخالها على البروتوكول لزيادة حساسية هذه الطريقة وقوتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الدراسات التي أدت إلى تطوير هذا البروتوكول ، تمت الموافقة على جميع مساكن أسماك الزرد والتجارب من قبل لجنة جامعة ويسكونسن ماديسون المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC-M005268-R2).

1. توليف الحمض النووي الريبي الإرشادي

ملاحظة: تم إنشاء مقرمشات zygotic باستخدام الحمض النووي الريبي دليل واحد أو تعدد إرسال الحمض النووي الريبي دليل متعدد إلى هدف واحد⁵،⁶^،⁷،⁸،⁹^،¹⁰. يزيد تعدد إرسال الحمض النووي الريبي الإرشادي من النسبة المئوية للأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا مقرمشا وموجوتا¹⁰. بسبب هذا التردد المتزايد للأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا ، يتم إنشاء المقرمشات الأمومية عن طريق تعدد الإرسال أربعة RNAs موجهة إلى جين واحد. يمكن العثور على بروتوكول أكثر تفصيلا حول استخدام CHOPCHOP لتصميم الحمض النووي الريبي الموجه وطريقة التلدين لتوليف الحمض النووي الريبي الإرشادي لأسماك الزرد في مكان آخر¹⁶،¹⁷،¹⁸،¹⁹^،²⁰.

لتحديد جين معبر عنه من الأم لاستهدافه ، تأكد من مستويات نسخ mRNA أثناء التطوير عبر قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي التي توفر معلومات النسخ من الزيجوت إلى 5 أيام²¹. بشكل عام ، يتم التعبير عن الجينات الخاصة بالأم بشكل كبير في الجنين المبكر وتتحلل بعد تنشيط الجينوم الوجني²².
بمجرد تحديد الجين المستهدف الذي تم التعبير عنه من قبل الأم ، حدد أول مجال بروتين متوقع باستخدام قسم "المجالات والميزات" المتاح على متصفح جينوم Ensembl²³. استخدم هذا المجال كمنطقة مستهدفة للحمض النووي الريبي الإرشادي الأربعة.
استخدم برنامج اختيار الحمض النووي الريبي CHOPCHOP لتحديد أربعة مواقع مستهدفة للحمض النووي الريبي في أول مجال نشط. تصميم أوليغونوكليوتيدات خاصة بالجينات، كما هو موضح أدناه لكل موقع مستهدف. في oligonucleotide الخاص بالجين ، يتوافق قسم N²⁰ مع التسلسل المستهدف مطروحا منه موقع PAM (NGG) من CHOPCHOP. رتب هذه الأوليغنوكليوتيدات الخاصة بالجينات وقلة النوكليوتيد الثابتة باستخدام تنقية الملح القياسية (انظر جدول المواد).
قلة النوكليوتيد الخاصة بالجينات:
5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
لإنشاء قالب RNA إرشادي لكل أوليغونوكليوتيد خاص بالجين ، قم بصلبه إلى oligonucleotide الثابت واملأ المعلقات ببوليميراز T4-DNA كما هو موضح سابقا¹⁶. بعد تجميع قوالب الحمض النووي الريبي الإرشادية الأربعة، قم بتنقيتها وتركيزها معا باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي ومجموعة المكثفات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
قم بتوليف خليط sgRNA من قالب الحمض النووي الريبي الإرشادي المجمع باستخدام مجموعة نسخ T7 في المختبر (انظر جدول المواد). قم بإجراء النسخ في المختبر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن أن يؤدي استخدام نصف تفاعلات مجموعة T7 Transcription إلى تقليل التكلفة لكل تفاعل.
بعد تخليق الحمض النووي الريبي ، قم بتنقية المجموعة الناتجة من sgRNAs باستخدام بروتوكول خلات الإيثانول / الأمونيوم كما هو موضح سابقا¹⁶،²⁰^،²⁴. بعد عزل الحمض النووي الريبي، أعد تعليقه في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. إذا تم استخدام نصف تفاعلات مجموعة النسخ T7 لنسخ مجموعة sgRNAs ، فأعد تعليق الحمض النووي الريبي النقي إلى 10-15 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
حدد كمية sgRNAs المجمعة التي تم إنشاؤها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتخفيف تجمع sgRNAs في المياه الخالية من النوكليز إلى تخفيف 1500 نانوغرام / ميكرولتر ± 500 نانوغرام / ميكرولتر.
بعد تحديد تركيز تجمع sgRNAs ، تحقق من سلامة sgRNAs على هلام الأغاروز بنسبة 1٪.
1. يلقي 1٪ من الأغاروز / 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم / جل TBE. بمجرد أن يتصلب الجل ، ضعه في مخزن TBE قيد التشغيل.
2. امزج 1 ميكرولتر من خليط sgRNA و 1 ميكرولتر من مخزن مؤقت لتحميل هلام الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد). قم بتحميل هذه العينة في الجل وقم بتشغيل الجل على 100 فولت لمدة 5 دقائق.
تصور الأشرطة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV). يجب أن تظهر مجموعة sgRNAs كنطاق واحد. إذا لوحظت مسحة ، فمن المحتمل أن يحدث تحلل الحمض النووي الريبي.
قم بتخزين مجموعة sgRNAs في أليكوتس 1 ميكرولتر للاستخدام الواحد في أنابيب شريط PCR خالية من النوكليز في الفريزر -80 درجة مئوية. بالنسبة للكميات الكبيرة من خليط sgRNAs (30 ميكرولتر أو أكثر) ، قم بإدخال نصف الحجم في أنابيب شريط PCR الخالية من النوكليز وتخزين النصف الآخر كحجم أكبر في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النوكلياز. تذوب و aliquot عند الحاجة.
لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، تأكد من أن العينات الموجودة في أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق لا تخضع لأكثر من دورتين للتجميد والذوبان.

2. إعداد الكواشف والمواد اللازمة للحقن المجهري

ملاحظة: في أسماك الزرد ، يمكن أن يؤدي حقن Cas9 mRNA إلى إنشاء مقرمشات وجنتية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات أن بروتين Cas9 أكثر كفاءة في إنشاء INDELs في الأجنة المحقونة^16,25. يستخدم هذا البروتوكول بروتين Cas9 لتوليد المقرمشات النفاسية لأن هذا البروتين لا يعاني من نفس التأخر في النشاط مثل حقن Cas9 mRNA. من الناحية النظرية ، يجب أن يزيد هذا من احتمال حدوث طفرة ثنائية الأليل في وقت مبكر من التطور مما يؤدي إلى زيادة فرصة تأثر جزء أكثر شمولا من الخط الجرثومي. يمكن العثور على بروتوكولات وموارد أخرى توضح بالتفصيل كيفية التحضير للحقن المجهري في مكان آخر^24,26.

شراء أو توليد بروتين Cas9 (انظر جدول المواد). أعد تعليق بروتين Cas9 في الماء الخالي من النوكليز لصنع محلول 2 ملغم / مل و aliquot 1 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيق الخالية من البولي بروبيلين RNase. تخزينها كأنابيب تستخدم لمرة واحدة في -80 درجة مئوية.
في فترة ما بعد الظهر قبل الحقن ، استخدم مجتذب ماصة دقيقة لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية وإنشاء إبرة حقن. قم بتخزين الإبرة غير المنقطعة في حامل إبرة مغلق حتى صباح يوم الحقن المجهري.
لإنشاء طبق حقن ، صب 20 مل من 1.5٪ agarose / معقم H₂O لملء نصف طبق بتري 100 مم × 15 مم وانتظر حتى يتصلب. بمجرد ضبط محلول الأغاروز ، أضف 20 مل من 1.5٪ agarose / H₂O المعقم إلى طبق Petri وضع القالب البلاستيكي (انظر جدول المواد) في الأغاروز السائل واتركه يتصلب.
بعد تصلب الأغاروز ، قم بإزالة القالب البلاستيكي وتخزين لوحة الحقن رأسا على عقب في الثلاجة حتى صباح يوم الحقن. يمكن استخدام صفيحة واحدة للحقن المتعددة طالما أن الآبار تحافظ على سلامتها.

3. الحقن المجهري لكوكتيل CRISPR-Cas9 في جنين الزرد أحادي الخلية لتوليد المقرمشات الأمومية

ملاحظة: يمكن العثور على المزيد من الموارد للحقن المجهري في أجنة أسماك الزرد في أماكن أخرى²⁴،²⁶^،²⁷. إن حقن خليط كريسبر-كاس9 في القرص الأرومي النامي للأجنة ذات الخلية الواحدة قد يزيد من احتمال إنتاج المقرمشات الأمومية . يمكن أيضا حقن الخليط في كيس صفار البيض حتى مرحلة 2 خلية. ومع ذلك، تعتمد المخاليط التي يتم حقنها في صفار البيض على تدفق البوبلازم للوصول إلى القرص الأرومي، لذلك يمكن أن يقلل CRISPR-Cas9 الذي يتم حقنه في صفار البيض من كفاءة قطع CRISPR-Cas9²⁸.

في فترة ما بعد الظهر قبل الحقن المجهري ، قم بإعداد صلبان من النوع البري في صناديق تزاوج أسماك الزرد. احتفظ بكل من الأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ولكن افصلها بفاصل مربع التزاوج أو ضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض.
في صباح يوم التجربة، أخرج 2 ملغم/مل من بروتين كاس9 وأليكوت واحد من مجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الخالي من البولي بروبيلين الخالي من RNase والذي يحتوي على بروتين Cas9 ، قم بتجميع خليط حقن 5 ميكرولتر يتضمن مجموعة من sgRNAs ، و 1 ميكرولتر من محلول أحمر فينول بنسبة 0.5٪ ، ومياه خالية من النوكليز. استهدف تركيزا نهائيا من 400 نانوغرام / ميكرولتر من بروتين Cas9 و 200 نانوغرام / ميكرولتر من sgRNAs المجمعة في الماء الخالي من RNase أو نسبة 2: 1 من بروتين Cas9 إلى sgRNAs في الجنين المحقون. يمكن تخزين خليط الحقن هذا على الجليد لصباح يوم الحقن.
قم بإزالة لوحة الحقن من الثلاجة واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة على الأقل.
بعد تجميع كوكتيل الحقن ، اسمح للذكر والأنثى بالتزاوج ، على سبيل المثال ، عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج أو عن طريق وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى ، حسب الاقتضاء.
بعد وضع الأسماك ولكن قبل جمع الأجنة ، قم بقطع طرف إبرة غير مكسورة باستخدام شفرة حلاقة جديدة أو ملقط ناعم لإنشاء إبرة ذات تجويف صغير بما يكفي لتجنب تلف الجنين ولكنها واسعة بما يكفي بحيث لا تصبح مسدودة بخليط الحقن. بعد قطع الإبرة، قم بتحميل الإبرة بخليط الحقن باستخدام طرف ماصة محمل صغير يتم إدخاله في الطرف الخلفي من الشعيرات الدموية (انظر جداول المواد).
بعد ملء الإبرة ، احتضن الإبرة لمدة 5 دقائق في RT لتجميع مجمعات Cas9-sgRNA.
قم بتشغيل الحاقن الدقيق وأدخل الإبرة في المتلاعب الدقيق. ضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرومتر وقم بمعايرة الإبرة عن طريق ضبط ضغط الحقن حتى تخرج الإبرة بلعة 1 نانولتر في الزيت المعدني.
ملاحظة: عند الحقن في الزيت المعدني ، سيكون قطر البلعة 1 نانولتر حوالي 0.125 مم (أو نصف قطرها 0.062 مم) كما تم قياسه باستخدام شريحة الميكرومتر.
لمزامنة الأجنة ، اجمعها بعد 10 دقائق باستخدام مصفاة بلاستيكية وشطفها في طبق بتري باستخدام وسائط E3 1x (5 mM NaCl ، 0.17 mM KCl ، 0.33 mM CaCl₂ ، 0.33 mM MgSO₄ ، وأضف 20 ميكرولتر من 0.03 M Methylene Blue لكل 1 لتر من 1x E3). قم بإزالة 10-15 جنينا ووضعها في طبق بتري منفصل ليتم الاحتفاظ بها كعناصر تحكم غير محقونة.
نقل بقية الأجنة النامية إلى آبار صفيحة الحقن.
حقن 1 نانولتر من المحلول (ما مجموعه 400 جزء من بروتين Cas9 و 200 جزء من الحمض النووي الريبوزي المرسال) في القرص الأرومي النامي لجنين أحادي الخلية. إذا أصبح طرف الإبرة مسدودا ، فاستخدم الملقط لكسر الطرف الخلفي وإعادة معايرة الإبرة لإخراج بلعة 1 nL. تأكد من حقن جميع الأجنة خلال أول 40 دقيقة من التطور بعد الإخصاب.
بعد اكتمال الحقن ، أعد الأجنة المحقونة إلى طبق بتري المسمى الذي يحتوي على وسائط 1x E3 والسماح لها بالتطور طوال اليوم. قم بإزالة أي أجنة غير مخصبة أو لا تتطور بشكل طبيعي وفقا لسلسلة مراحل الزرد²⁹.

4. فحص INDELs الجسدية في الأجنة المحقونة F0

ملاحظة: يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد INDELs ، مثل اختبار T7 endonuclease I أو تحليل الذوبان عالي الدقة ، عند تحديد ما إذا كانت الأجنة تحتوي على INDELs ³⁰ الجسدية.

في اليوم التالي بعد الحقن ، قم بإزالة الأجنة المعيبة والمحللة من طبق بتري واستبدل وسائط 1x E3 للحفاظ على صحة الجنين.
بعد تنظيف الطبق ، اجمع ستة أجنة محقونة صحية واثنين من أجنة التحكم من الطبق غير المحقون. ضع كل جنين على حدة في بئر واحد من أنبوب شريط PCR وقم بتسمية الجزء العلوي من الأنابيب.
لاستخراج الحمض النووي الجينومي للأجنة الفردية ، قم بإزالة وسائط E3 الزائدة من آبار أنبوب الشريط وإضافة 100 ميكرولتر من 50 mM NaOH لكل بئر.
احتضن الأجنة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتبريد العينات إلى 4 درجات مئوية ، وأضف 10 ميكرولتر من 1 M Tris HCL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، ودوامها لمدة 5 إلى 10 ثوان. يمكن تخزين هذا الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل دون تدهور كبير في الحمض النووي.
صمم اشعال فحص فريد لكل موقع دليل لتضخيم جزء الحمض النووي بقوة 100-110 نقطة أساس يتضمن الموقع المستهدف CRISPR-Cas9. إذا كان ذلك ممكنا ، ضع الموقع المستهدف في منتصف الجزء المضخم ، مما يسمح بتحديد عمليات الحذف الأكبر.
لكل موقع من المواقع الأربعة المستهدفة الإرشادية، قم بإعداد ثمانية تفاعلات PCR سعة 25 ميكرولتر باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي أحادي الجنين المحضر، ومزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل، وأوليات الفحص الخاصة بالدليل لتحديد الطفرات الجسدية في الموقع المستهدف (الجدول 1).
قم بصب 2.5٪ agarose / 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم / هلام TBE باستخدام أمشاط تخلق آبارا بعرض 0.625 سم تقريبا. يسمح هذا المشط العريض بدقة أفضل عند اكتشاف تغيرات الحجم في التسلسل الجينومي. بعد أن يتصلب الجل ، ضعه في غرفة الرحلان الكهربائي التي تحتوي على مخزن مؤقت يعمل ب TBE.
أضف 5 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x إلى منتج PCR وقم بتحميل 25 ميكرولتر من هذا الخليط في الجل. تأكد من تشغيل عينات الحقن والتحكم على نفس الصف من الجل. بعد تحميل جميع العينات ، أضف 5 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم لكل 1 لتر من المخزن المؤقت TBE إلى الطرف الإيجابي لصندوق الهلام.
قم بتشغيل الجل على 120 فولت حتى تزول نطاقات الحمض النووي أو يقترب الحمض النووي من نهاية الحارة. إذا أنشأ Cas9 INDELs في الموقع المستهدف ، فعادة ما يتم ملاحظة مسحة في العينات المحقونة ولكن ليس في عناصر التحكم.
إذا لوحظت مسحات في ما لا يقل عن ثلاثة من أصل أربعة مواقع إرشادية في الأجنة المحقونة بأربعة حمض نووي ريبي مرشد ، فتنمو الأجنة المحقونة الشقيقة.
عندما لا تحتوي العينات المحقونة على مسحات في العدد المطلوب من مواقع التوجيه ، قم بتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي الجديد ليحل محل تلك التي لم تعمل وإنشاء مجموعة جديدة من الحمض النووي الريبي الإرشادي الذي يتضمن تلك التي عملت وتلك المصممة حديثا. حقن واختبار تجمع جديد ل INDELs الجسدية كما هو موضح أعلاه.

5. تحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في أجنة الأمهات المقرمشة

ملاحظة: بمجرد أن تصل إناث F0 المحقونة إلى مرحلة النضج الجنسي، فإن خلاياها الجرثومية لديها القدرة على توليد خليط من الأجنة المقرمشة والبرية للأمهات. على الرغم من أن هذا الخليط يسمح بضوابط داخلية للإخصاب وتوقيت النمو ، إلا أنه لا يزال من المفيد إعداد incross من النوع البري كعنصر تحكم خارجي في حالة وجود قابض من أنثى F0 يحتوي فقط على أجنة هشة للأمهات.

في فترة ما بعد الظهر قبل التجربة ، قم بإعداد الإناث المحقونة F0 ضد الذكور من النوع البري والتحكم في الصلبان من النوع البري في صناديق تزاوج الزرد القياسية. ضع كلا من الأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ولكن افصلها بمقسم صندوق التزاوج أو ضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض.
في صباح يوم التجربة، اسمح للذكر والأنثى بالبدء في التزاوج، على سبيل المثال، عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج أو وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى.
اجمع الأجنة كل 10 دقائق عن طريق تحريك إدراج وضع البيض في قاع خزان تزاوج جديد يحتوي على مياه نظام عذبة وقم بتسمية الخزان بعلامة تحدد أنثى F0 الفردية. خذ خزان التزاوج القديم وصب الماء من خلال مصفاة الشاي لجمع الأجنة من قابض فردي واحد لمدة 10 دقائق.
بمجرد جمع الأجنة من قابض واحد مدته 10 دقائق في المصفاة ، انقلها إلى طبق بتري يحتوي على وسائط 1x E3. ضع علامة على طبق بتري مع وقت الجمع ومعلومات السمك.
تحت مجهر تشريحي مع مصدر ضوء منقول ، راقب الأجنة التي تمر بالتطور كل ساعة لأول 6-8 ساعات ويوميا لمدة 5 أيام القادمة.
تحديد الأجنة المقرمشة المحتملة للأمهات من خلال التغيرات المورفولوجية الإجمالية في نموها مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري المتطابقة زمنيا²⁹.
انقل الأجنة المقرمشة المحتملة للأمهات إلى طبق بتري يحتوي على وسائط 1x E3 وفحص النمط الظاهري المورفولوجي عند 24 hpf وقابلية البقاء (على سبيل المثال ، تضخم المثانة السباحة) في 5 أيام بعد الإخصاب.

6. تسلسل الأليلات في الهابلويدات الهشاشة للأمهات

ملاحظة: تحتوي المفردات المقرمشة للأمهات على أليل واحد في الموضع المستهدف ، مما يسمح بتحديد INDELs في الجين المستهدف عبر تسلسل Sanger. يمكن أيضا تحليل أجنة الهابلويدات المقرمشة للأمهات باستخدام اختبارات تسلسل الجيل التالي. من المتوقع أن تحمل الأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا هشا للأم آفة في واحد على الأقل من المواقع الأربعة المستهدفة (انظر المناقشة).

في فترة ما بعد الظهر قبل التجربة ، قم بإعداد أزواج تزاوج من إناث F0 المعروفة بإنتاج أجنة هشة للأمهات عبرت إلى ذكور من النوع البري. حافظ على فصل الذكور من النوع البري جسديا عن الإناث باستخدام مقسم مربع التزاوج أو ضع الأنثى في إدراج وضع البيض.
في صباح يوم التجربة ، قم بإزالة القسم المادي أو ضع كل من الذكور والإناث داخل إدراج وضع البيض لبدء التزاوج. في أول علامة على وضع البيض ، قاطع التكاثر عن طريق فصل الذكور والإناث F0. احتفظ بكل أنثى F0 منفصلة في صناديق تزاوج فردية.
قم بإعداد محلول الحيوانات المنوية المعالج بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام خصيتين من ذكر واحد من النوع البري لكل 100 ميكرولتر من محلول هانك (الجدول 2) ، وهو ما يكفي لتخصيب البويضات المبثوقة من أنثى واحدة ، كما هو موضح سابقا³¹.
بثق البويضات الناضجة يدويا من إناث F0 المختارة مسبقا وإجراء الإخصاب في المختبر (IVF) باستخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية³¹.
بعد الإخصاب في المختبر ، اسمح للأجنة الفردية بالتطور حتى يتم ملاحظة النمط الظاهري الهش للأم ووضع تلك الأجنة في طبق بتري مختلف.
بمجرد تحديد الأجنة الفردية المقرمشة للأمهات ، اسمح لها بالتطور لمدة 6 ساعات على الأقل بعد الإخصاب.
لاستخراج الحمض النووي الجيني من عشرة أجنة فردية هشة على الأقل للأمهات ، ضع جنينا فرديا واحدا في بئر فردي من أنبوب شريط PCR ، وقم بإزالة وسائط E3 الزائدة من البئر وإضافة 50 ميكرولتر من 50 mM NaOH.
احتضن الأجنة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتبريد العينات إلى 4 درجات مئوية ، وأضف 5 ميكرولتر من 1 M Tris HCL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، والدوامة لمدة 5-10 ثوان. يمكن تخزين الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
لتحديد مواقع الدليل التي تحتوي على INDELs، قم بتصميم الاشعال للتسلسل لتضخيم جزء من الحمض النووي يتضمن جميع المواقع الأربعة المستهدفة CRISPR-Cas9. تسمح هذه الاشعال التسلسلية بتحديد INDELs التي تمتد عبر مواقع إرشادية متعددة.
قم بإعداد تفاعلين PCR 25 ميكرولتر لكل جنين باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي المحضر والاشعال التسلسلي.
بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل، قم بتنقية العينتين وتركيزهما باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي والمكثفات (انظر جدول المواد). ثم أرسل جزء الحمض النووي إلى تسلسل Sanger باستخدام كل من الاشعال للتسلسل الأمامي والخلفي.
بعد تسلسل الجزء الهش الأمومي الفرداني ، قم بمحاذاته مع تسلسل النوع البري وحدد INDELs في المواقع المستهدفة باستخدام برنامج محاذاة التسلسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح النهج التجريبي الموصوف في هذا البروتوكول بتحديد الأنماط الظاهرية لتأثير الأم بطريقة سريعة وفعالة في استخدام الموارد (الشكل 1).

توليد المقرمشات الأمومية :
عند تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي الأربعة لاستهداف جين واحد مرشح للتأثير الأمومي، ينبغي إيلاء اعتبار خاص للمكان الذي سيرتبط فيه الحمض النووي الريبي الإرشادي بالحمض النووي. بشكل عام ، يجب تجميعها جميعا مع الحد الأدنى من المناطق المتداخلة أو معدومة بين الحمض النووي الريبي الموجه في بدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة بتحديد وتوصيف جزيئي أولي للنمط الظاهري للتأثير الأمومي في جيل واحد بدلا من الأجيال المتعددة المطلوبة لكل من التقنيات الجينية الأمامية والعكسية. حاليا ، دور العديد من الجينات المعبر عنها من قبل الأم غير معروف. ويرجع هذا النقص في المعرفة جزئيا إلى الجيل الإضافي المطلوب لتصور النمط الظاهري عند تحديد الجينات ذات التأثير الأمومي. في الماضي ، كان من الممكن تحقيق التحديد السريع للجينات ذات التأثير الأمومي في أسماك الزرد عن طريق حقن أوليغونوكليوتيدات مورفولينو مانعة للترجمة في البويضات المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر موظفي تربية الحيوانات في مختبر Pelegri السابقين والحاليين على رعايتهم للمنشأة المائية. ونحن ممتنون أيضا للتعليقات والبصيرة على المخطوطة التي كتبها ريان تريفينا وديان هانسون. تم توفير التمويل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة إلى F.P. (GM065303)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.4)	Invirogen	15568025	لتفاعل البوليميراز المتسلسل
1.5 مل أنابيب Eppendorf أي	صانع
10 ملي مولار dNTPs	Thermo Fischer 18427013 العلمي		التوليف من gRNA
100 BP سلم	أي صانع		للرحلان الكهربائي للهلام
100٪ RNAse خال من الإيثانول	أي صانع
100٪ RNAse الإيثانول الحر	أي صانع
100 مل دورق	أي صانع		ل IVF
5 M الأمونيوم Acceate	Thermo Fischer العلمي	الموجود في MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synation من gRNA
70٪ تخليق الإيثانول			ل gRNA (70 مل من الإيثانول + 30 مل من الماء الخالي من النوكلياز)
بوروسيل 1.0 مم OD × 0.5 مم معرف	FHC INC	27-30-1	للحقن المجهري
السائبة فارما بيكربونات الصوديوم 35 رطلا	توريد الشعاب المرجانية السائبة	255	مستلزمات الأسماك
CaCl_{2< / sub>}	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein مع NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
الحمض النووي المتكامل قليل النوكليوتيد الثابت	التقنيات (IDT)		AAAAGCACCGGCTCGTCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
لوحة زجاجية للاكتئاب	الحراري Fischer Scientific	13-748B	لتلقيح الأنابيب
ملقط	Dumont	SS	لمقص تشريح التلقيح
	الاصطناعي أدوات العلوم الدقيقة	14091-09	لأطفال الأنابيب
تشريح الستيروسكوب (مع مصدر الضوء المنقول)	أي صانع		للتلقيح
& المكثف -5	Zymo Research	D4014	توليف صبغة
تحميل هلام الحمض النووي gRNA (6x) أي	صانع		للرحلان الكهربائي للهلام
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	لمزيج PCR
مزود الطاقة للفصادة	أي صانع		لمجموعة
			للهلام https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf نصائح Femtotips Microloader ل Femtojet Microinjector	Thermo Fischer	Scientific E5242956003	للحقن المجهري
للإيثانول (200 دليل ، خالي من النوكلياز)	أي صانع
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	للحقن
الدقيق شبكة الأسماك	أي صانع		لوازم الأسماك
محلول ملحي مجمد جمبري	ملحي روبيان مباشر		الإمدادات السمكية
عام لجميع الأغراض Agarose	أي صانع		للهلام الكهربائي الهلام
النوكليوتيد	بالجين (IDT) TAATACGACTCACTATA		- N^{20< / sup> -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG}
قفازات	أي صانع
دلو ثلج	أي صانع
المحيط الفوري	أي صانع		مستلزمات الأسماك
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide ، 10 مجم / مل	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH_{2< / sub>PO_{4< / sub>}}	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & amp أنثى أسماك
MEGAshortscript T7 Transcription	Kit Thermo Fischer Scientific	AM1354	توليف gRNA
الميثيلين الأزرق	الحراري	فيشر AC414240250	العلمي ل E3
MgCl_{2< / sub>}	MiliporeSigma	7791-18-6	لمزيج PCR
MgSO_{2< / sub> & middot ؛ 7H_{2< / sub>O}}	MiliporeSigma	M2773
قالب بلاستيكي الحقن	الدقيق العالمي أدوات الدقة	Z-Moulds	للحقن الدقيق
Micromanipulator	أي صانع		للحقن
الدقيق Micropipeter	أي صانع
مجتذب	ماصة	P-87	للحقن
الدقيقأطراف ماصة دقيقة مع مرشحات (جميع الأحجام)	أي أطراف
بدون مرشحات (جميع الأحجام)	أي ميكروويف صانع
	أي صانع
زيت معدني	MiliporeSigma	m5904-5ml	للحقن
الدقيق MS-222 (Tricaine-D)	أي صانع		معتمد من إدارة الأغذية والعقاقير
Na_{2< / sub> HPO_{4< / sub>}}	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC0_{3< / sub>}	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	أي صانع
NaOH	MiliporeSigma	567530
غير لاصقة ، أنابيب الطرد الدقيق الخالية من RNase ، 1.5 مل		Ambion AM12450	تخليق المياه
الخالية من النوكلياز	أي صانع
منشفة ورقية	أي صانع
ماصات Pastro	أي صانع
أنابيب شريط PCR	أي صانع
ألواح بتري قطرها 100 مم	أي صانع
محلول أحمر الفينول	MiliporeSigma	P0290	للحقن
الدقيق البلاستيك المبلعون	VWR	47747-358	لملعقة بلاستيكية أطفال الأنابيب
	أي صانع		لأطفال الأنابيب
بيض الروبيان المالح	الممتاز الروبيان الملحي الروبيان الملحي شبكة دقيقة
RNA هلام تحميل صبغة		موجودة في MEGAshortscript T7 طقم النسخ	للرحلان الكهربائي للهلام
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
مقياس	أي صانع
Sharpie	أي صانع
ملعقة	أي صانع
معقم H2O	أي صانع		لمزيج PCR
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	توليف شريط gRNA
	أي صانع
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	أي صانع		للهلام
الكهربائي ملطخ الشاي	أمازون	IMU-71133W	مستلزمات الأسماك
مشط Thermo Scientific Owl 12 سنا ، بسمك 1.0 / 1.5 مم ، على الوجهين ل B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	للرحلان الكهربائي للهلام
Thermo Scientific ؛ البومة EasyCast B2 أنظمة الرحلان الكهربائي جل	الصغير Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	للهلام
الكهربائي Thermocycler	أي صانع
Thermocycler	أي صانع
Transilluminator	أي صانع مصباح
الأشعة فوق البنفسجية	UVP	موديل XX-15 (Cat رقم UVP18006201)
لنظارات السلامة بالأشعة فوق البنفسجية	أي صانع		لزجاجة غسيل التلقيح
	الاصطناعي Thermo Fischer Scientific	S39015	مستلزمات الأسماك
صناديق تزاوج أسماك الزرد	Aqua Schwarz	SpawningBox1	مستلزمات الأسماك
1.5 مل أنابيب Eppendorf	فيشر Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
سلم	100 BPThermo Fischer	Scientific 15628019
100٪ RNAse خالية من الإيثانول	أي صانع
5 م أمونيوم أسيتات	حراري فيشر العلمي
70٪ إيثانول			70 مل إيثانول و 30 مل من المياه الخالية من النوكلياز
ملحقات صندوق الجل الأفقي	فيشر Scientific		0.625 مم
Agarose	أي صانع
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2 ، ثنائي هيدرات	سيجما	10035-04-8	E3
أنابيب شعرية	Cole-Parmer	UX-03010-68	لإبر الحقن
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	أي صانع
تشريح يعترض	أي صانع
تشريح المجهر	أي صانع
تشريح مقص	أي صانع
الحمض النووي نظيف & المكثف -5	Zymo Research	D4014
صبغة تحميل هلام الحمض النووي (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 ميكرولتر
الإيثانول (200 دليل ، خالي من النوكلياز)	أي صانع
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	أي صانع		شبكة دقيقة
جمبري محلول ملحي	مجمد LiveAquaria	CD-12018	أغذية الأسماك
مشط جل مشط (0.625 مم)	أي صانع
نظام هلام الفصادة	الكهربائية أي صانع
تقنيات الحمض النووي المتكاملة	قليلة النوكليوتيدات الخاصة بالجينات
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705! gucid = N: N: PS: مدفوع : GGL: CSM-2295: 4P7A1P: 20501 231 & gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc = aw.ds
أطباق زجاجية	أي صانع
قفازات	أي صانع
العمل			امزج 9.9 مل من Hank's Premix مع 0.1 مل HS Stock # 6
Hank's Premix			يجمع بين ما يلي بالترتيب: (1) 10.0 مل HS # 1 ، (2) 1.0 مل HS # 2 ، (3) 1.0 مل HS # 4 ، (4) 86 مل ddH2O ، (5) 1.0 مل HS # 5. قم بتخزين جميع حلول HS في حل Hanks 4C
Hanks Solution
			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution # 1			8.0 جم كلوريد الصوديوم ، 0.4 جم KCl في 100 مل ddH2O
Hank's Stock Solution # 2			0.358 جم Na2HPO4 اللامائي ؛ 0.60 جم K2H2PO4 في 100 مل ddH2O
Hank's Stock Solution # 4			0.72 g CaCl2 in 50 مل ddH2O
Hank's Stock Solution # 5			1.23 g MgSO47H2O في 50 مل ddH20
Hank's Stock Solution # 6			0.35g NaHCO3 في 10.0 مل ddH20 ؛ اجعل يوما جديدا من الاستخدام
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	أي صانع
ملح المحيط الفوري	أي صانع		لمياه السمك
في المختبر النسخ كيت ميجا قصير	نص حراري فيشر العلمي	AM1354
Invitrugen & trade ؛ UltraPure™ DNase / RNase خالية من الماء المقطر	فيشر Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 متوسط
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
ذكر وإناث أسماك
Mega Short Script T7 طقم الترسيب	Thermo Fischer Scientific	AM1354
الميثيلين الأزرق	فيشر العلمي	AC414240250	E3 متوسط
MgSO2-7H2O	سيجما	M2773
Microimicromanipulator
الحقن الدقيق قالب البلاستيك	العالم أدوات الدقة	Z-Moulds
الحاقن
الشريحة	Microneedle
Micropipeter (1-10) مع نصائح	، يحتاج أي صانع		إلى نصائح p10 مصفاة
Micropipetter (20-200) مع نصائح	أي صانع
Micropippetter (100-1000) مع نصائح	، أي صانع
بلاستيكية
ميكروويف	أي صانع
MiliQ Water	أي صانع
الزيوت المعدنية	سيجما ألدريتش	M5904-5 مل
Na2HPO4	سيجما
NaCl	سيجما	S9888
NaHC02	سيجما	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
ضيقة	أي صانع
إبرة مجتذب	Sutter	P-97
منشفة ورقية	أي صانع
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
موقع دليل التمهيدي PCR المرافق	تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT)
بادئات PCR دليل يحيط بموقع قطع الحمض النووي الريبي	تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT)		قياسي محلى
أنابيب شريط PCR	الحرارية فيشر AB0771W
أطباق بتري	FB0875714 فيشر Scientific		10 سم قطر 100 مم × 15 مم
فينول ريد	فيشر ساينس	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
نصائح الماصة	أي صانع		10ul و 200ul و 1000ul
بلاستال بلاستيك	فيشر Scientific	12-141-364
ملعقة بلاستيكية	أي صانع
دليل التمهيدي موقع	تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT)
شفرة الحلاقة	أولين	H-595B
هلام الحمض النووي الريبي تحميل الصبغة	في طقم نصي megashort (في مجموعة الترسيب في المختبر)
RNAse بعيدا	فيشر	21-402-178
RNAse خالية من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبيلين	الحرارية فيشر AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse المياه الخالية	من RNAse فيشر Scientific	10-977-023
مقياس	أي صانع
Sharpie	أي صانع
بيكربونات الصوديوم (خلية تم اختبار الثقافة)	Sigma	S5761	مياه السمك
بروميد الصوديوم Solotion	Sigma	E1510
برنامج لتحليل تسلسل
مقياس الطيف الضوئي
Sterlie H2O	أي علامة تجارية
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
قم بلصق	أي علامة تجارية
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	متوفر في معظم متاجر المطابخ
Thermocycler
نقل الماصة	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher Scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
مصباح الأشعة فوق البنفسجية	نظارات السلامة UVP الأشعة فوق البنفسجية
	أي صانع
زجاجة غسيل	فيشر علمي	S39015
صناديق التزاوج لسمك الزرد	أي صانع
وصفة عازلة	PCRأضف 171.12 مل H20 معقم ؛ 0.393 مل 1 م MgCl2 ؛ 2.616 مل 1 م MgCl2 ؛ 2.618 مل 1 م تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.4) 13.092 مل 1 مليون KCl ؛ 0.262 مل 1٪ جيلاتين. الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة ثم برد السولوشن على الجليد. بعد ذلك ، أضف 3.468 مل 100 مجم / مل BSA ؛ 0.262 مل dATP (100 مل) ، 0.262 مل dCTP (100 مللي متر) ؛ 0.262 مل dGTP (100 ملم); 0.262 مل dTTP (100 مل). Alliquote في أنابيب

لتنظيف الحمض النووي الاصطناعي الكهربائية الرحلان الكهربائي محلول تقنيات الحمض النووي المتكاملة قليلة الخاصة ملح الزرد دقيقة ميكروبيبتر صانع gRNA الصف مباشرة IVF متوسطة (IDT) حل النهائي من هانك الزردالدقيق شريحة دقيقة ملعقة علمية نصائحسانجر eppendorf معقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).
Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).
Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860(2017).
Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).
Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319(2015).
Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).
Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).
Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).
Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9

تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة