بروتوكولات أخذ عينات العظام المحسنة لاسترجاع الحمض النووي القديم من البقايا الأثرية

Cody E. Parker; Kirsten I. Bos; Wolfgang Haak; Johannes Krause

doi:10.3791/63250

Method Article

بروتوكولات أخذ عينات العظام المحسنة لاسترجاع الحمض النووي القديم من البقايا الأثرية

DOI:

10.3791/63250

⸱

November 30th, 2021

Cody E. Parker¹^,² , Kirsten I. Bos¹^,³ , Wolfgang Haak¹^,³ , Johannes Krause¹^,³

¹Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for the Science of Human History, ²School of Human Evolution and Social Change, Arizona State University, ³Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم البروتوكول سلسلة من بروتوكولات أفضل الممارسات لجمع مسحوق العظام من ثمانية مواقع أخذ عينات تشريحية موصى بها (مواقع محددة على عنصر هيكلي معين) عبر خمسة عناصر هيكلية مختلفة من أفراد العصور الوسطى (الكربون المشع يرجع تاريخه إلى فترة حوالي 1040-1400 م ، معايرة نطاق 2 سيجما).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسعى الطرق المقدمة هنا إلى تعظيم فرص استعادة الحمض النووي البشري من البقايا الأثرية القديمة مع الحد من مواد عينة الإدخال. تم ذلك عن طريق استهداف مواقع أخذ العينات التشريحية التي تم تحديدها مسبقا لإنتاج أعلى كميات من الحمض النووي القديم (aDNA) في تحليل مقارن لاستعادة الحمض النووي عبر الهيكل العظمي. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن هذه البروتوكولات تزيد من فرص التعافي الناجح للحمض النووي البشري القديم والممرض من البقايا الأثرية. تم تقييم غلة الحمض النووي سابقا بواسطة Parker et al. 2020 في مسح واسع للحفاظ على الحمض النووي عبر عناصر هيكلية متعددة من 11 فردا تم استردادهم من مقبرة العصور الوسطى (الكربون المشع مؤرخة في فترة حوالي (حوالي 1040-1400 م ، معايرة نطاق 2 سيجما) في كراكور بيرج ، وهي مستوطنة مهجورة من العصور الوسطى بالقرب من Peißen ألمانيا. نجحت نقاط أخذ العينات الثمانية هذه ، والتي تمتد على خمسة عناصر هيكلية (pars petrosa ، والأضراس الدائمة ، والفقرة الصدرية ، والكتائب البعيدة ، والكاحل) في إنتاج الحمض النووي البشري القديم عالي الجودة ، حيث كانت الغلة أكبر بكثير من المتوسط العام عبر جميع العناصر والأفراد. كانت الغلة كافية للاستخدام في معظم التحليلات الجينية الشائعة للسكان في المصب. تدعم نتائجنا الاستخدام التفضيلي لمواقع أخذ العينات التشريحية هذه لمعظم الدراسات التي تتضمن تحليلات الحمض النووي البشري القديم من البقايا الأثرية. سيساعد تنفيذ هذه الأساليب على تقليل تدمير العينات الأثرية الثمينة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن أخذ عينات من الرفات البشرية القديمة لأغراض استعادة الحمض النووي وتحليله مدمر بطبيعته¹،²،³^،⁴. العينات نفسها هي عينات ثمينة ويجب الحفاظ على الحفظ المورفولوجي حيثما أمكن ذلك. وعلى هذا النحو، من الضروري تحسين ممارسات أخذ العينات لتجنب التدمير غير الضروري للمواد التي لا يمكن تعويضها ولزيادة احتمال النجاح إلى أقصى حد. تستند تقنيات أفضل الممارسات الحالية إلى مجموعة صغيرة من الدراسات التي تقتصر إما على مسوحات الطب الشرعي⁵،⁶ ، أو دراسات العينات القديمة حيث لا يكون تطوير أخذ العينات الأمثل هو الهدف المباشر للدراسة⁷ ، أو الدراسات المخصصة التي تستخدم إما بقايا غير بشرية⁸ أو تستهدف مجموعة صغيرة جدا من مواقع أخذ العينات التشريحية (تستخدم هنا للدلالة على منطقة معينة من عنصر الهيكل العظمي الذي مسحوق العظام منه ^، للاستخدام في تحليلات الحمض النووي النهائية ، تم إنشاؤه)^9,10. تم تحسين بروتوكولات أخذ العينات المعروضة هنا في أول دراسة منهجية واسعة النطاق لحفظ الحمض النووي عبر عناصر هيكلية متعددة من أفراد^{متعددين 11}. جميع العينات ناتجة عن عناصر هيكلية تم استردادها من 11 فردا تم التنقيب عنهم من مقبرة الكنيسة في مستوطنة كراكور بيرغ المهجورة التي تعود إلى العصور الوسطى بالقرب من بيسن ، ساكسونيا أنهالت ، ألمانيا (انظر الجدول 1 للحصول على التركيبة السكانية التفصيلية للعينات) ، وعلى هذا النحو ، قد تحتاج إلى تعديل لاستخدامها مع عينات خارج هذا النطاق الجغرافي / الزمني.

فرد	جنس	العمر المقدر عند الوفاة	¹⁴ تواريخ C (CE ، Cal 2-sigma)
كرا 001	ذكر	25-35	1058-1219
كرا 002	أنثى	20-22	1227-1283
كرا003	ذكر	25	1059-1223
كرا004	ذكر	15	1284-1392
كرا 005	ذكر	10-12	1170-1258
كرا 006	أنثى	30-40	1218-1266
كرا 007	أنثى	25-30	1167-1251
كرا008	ذكر	20	1301-1402
كرا 009	ذكر	مجهول	1158-1254
كرا 010	ذكر	25	1276-1383
كرا 011	أنثى	30-45	1040-1159

الجدول 1: الجنس المحدد وراثيا ، والعمر المقدر المحدد أثريا عند الوفاة ، والتأريخ بالكربون المشع (¹⁴C Cal 2-sigma) لجميع الأفراد ال 11 الذين تم أخذ عينات منهم. تم تكييف هذا الجدول من Parker، C. et al. 2020¹¹.

تسمح هذه البروتوكولات بتوليد مسحوق العظام بشكل مباشر وفعال نسبيا من ثمانية مواقع لأخذ العينات التشريحية عبر خمسة عناصر هيكلية (بما في ذلك pars petrosa) مع تلوث محدود للحمض النووي الناجم عن المختبر. من بين هذه العناصر الهيكلية الخمسة ، تم تحديد سبعة مواقع لأخذ العينات التشريحية الموجودة على أربعة عناصر هيكلية لتكون بدائل قابلة للتطبيق لأخذ العينات المدمرة للهرم الصخري^11,12. وتشمل هذه الملاط ، العاج ، وغرفة اللب من الأضراس الدائمة. العظم القشري الذي تم جمعه من الشق الفقري العلوي وكذلك من جسم الفقرات الصدرية ؛ العظم القشري النابع من السطح السفلي للخصل القمي وعمود الكتائب البعيدة ؛ والعظم القشري الكثيف على طول الجزء الخارجي من تالي. في حين أن هناك العديد من الطرق المطبقة على نطاق واسع لأخذ عينات من pars petrosa⁴،12،13،14 ، العاج ، وغرفة لب الأسنان¹،²،15 ^، فإن الطرق المنشورة تصف الجيل الناجح لمسحوق العظام من الملاط ¹⁶ ، والجسم الفقري ، والشق الفقري السفلي ، والكاحل قد يكون من الصعب الحصول عليها. على هذا النحو ، نوضح هنا بروتوكولات أخذ العينات المحسنة للهرم الصخري (الخطوة 3.1) ؛ الملاط (الخطوة 3.2.1) ، العاج (الخطوة 3.2.2) ، ولب الأسنان (الخطوة 3.2.3) من الأضراس البالغة ؛ العظم القشري للجسم الفقري (الخطوة 3.3.1) والقوس الفقري العلوي (الخطوة 3.3.2) ؛ الكتائب البعيدة (الخطوة 3.4) ؛ والكاحل (الخطوة 3.5) من أجل جعل الاستخدام الفعال لهذه العناصر الهيكلية لكل من الحمض النووي وأبحاث الطب الشرعي متاحا على نطاق أوسع.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الأبحاث المقدمة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها معهد ماكس بلانك لعلوم التاريخ البشري ، يينا ، ألمانيا للعمل مع الرفات البشرية القديمة. قبل تنفيذ أي خطوات من هذا البروتوكول ، تأكد من الالتزام بجميع المتطلبات الأخلاقية المحلية / الحكومية / الفيدرالية المتعلقة بكل من الحصول على إذن للدراسة العلمية واستخدام الرفات البشرية لأخذ العينات المدمرة في منطقتك. يجب تنفيذ جميع الإجراءات / تخزين المواد الكيميائية وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية الفردية.

1. اعتبارات قبل معالجة العينة

تعامل مع العينات بعناية لأن البقايا القديمة مورد محدود وغير قابل للتكرار (على سبيل المثال ، يجب أن يكون أخذ العينات بأقل قدر ممكن من الإسراف ، وأن تعاد جميع الرفات إلى مقدميها المعنيين والشرعيين إن أمكن).
قم بتنفيذ جميع الخطوات في بيئة غرفة نظيفة ، ويفضل أن يكون ذلك في منشأة DNA قديمة مخصصة¹⁷،¹⁸^،¹⁹. استخدم معدات الحماية الشخصية (PPE) التي تتكون من معاطف معقمة صغيرة يسهل اختراقها مع غطاء محرك السيارة ، وقفازات معقمة (زوجان) ، وقناع جراحي ، ونظارات واقية ، وأحذية معقمة أو أحذية غير قابلة للانزلاق بأغطية معقمة (انظر جدول المواد). قم بتغيير القفازات بشكل متكرر ، خاصة بين العينات.
قم بتنظيف وتطهير جميع المعدات والأسطح جيدا باستخدام محلول التبييض / إزالة تلوث الحمض النووي / الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 254 نانومتر) حيثما أمكن (على سبيل المثال ، لقم الحفر ، المثاقب ، الأقنعة / المشابك ، إلخ). أخيرا ، يوصى بشدة بأخذ فترات راحة مريحة منتظمة (كل 2-3 ساعات إن أمكن) لتجنب الإفراط في الإرهاق بسبب بيئة الغرفة النظيفة.
ملاحظة: يجب توثيق جميع بقايا الهيكل العظمي بشكل مناسب (على سبيل المثال ، تصويرها ووزنها ، وإذا أمكن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، وتصوير 3D ، وما إلى ذلك) قبل أخذ العينات (لا تغطي هذه المخطوطة بروتوكولات التوثيق المناسب). يمكن إيقاف جميع بروتوكولات أخذ العينات مؤقتا بين تكرارات أخذ العينات ويمكن تخزين العينات إلى أجل غير مسمى في بيئة جافة ومعقومة يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية).

2. المعالجة المسبقة

تطهير جميع مواقع أخذ العينات التشريحية قبل توليد مسحوق العظام لتقليل مخاطر التلوث¹⁸.
ملاحظة: لا تزال فعالية التبييض و / أو إزالة السطح (انظر الملاحظة في الخطوة 3.3.2 لخطوات إزالة السطح) لإزالة تلوث العينات موضع نقاش بين باحثي الحمض النووي⁸،¹⁹،^20،21،^22،23،24^،²⁵ حيث قد يؤثر كلاهما على إجمالي غلة الحمض النووي ^، خاصة في العينات شديدة التدهور. على هذا النحو ، تعتبر الخطوات التالية اختيارية ويتم تضمينها هنا حيث تم استخدامها في جميع العينات لتوليد النتائج التمثيلية المقدمة في هذه الورقة. يوصى بتحديد استخدام بروتوكولات ما قبل المعالجة هذه على أساس كل حالة على حدة بناء على التطبيق الجزيئي والعمر والندرة ومستوى التدهور المورفولوجي لكل مجموعة عينة.
1. قم بإجراء جميع عمليات أخذ العينات في غرفة نظيفة مخصصة تحت غطاء محرك أقراص تفاعل البوليميراز المتسلسل المجهز بالأشعة فوق البنفسجية (PCR) أو خزانة السلامة الحيوية مع إيقاف تشغيل تدفق الهواء. انشر ورق الألمنيوم المعقم عبر سطح الطاولة لالتقاط أي مسحوق / شظايا عظام طائشة.
2. تأكد من استعادة جميع شظايا العظام (للعودة إلى الوطن) قبل التخلص من الرقاقة. تغيير احباط بين علاج كل عنصر هيكلي. تخلص من ورق القصدير المستخدم في كيس / وعاء خطر بيولوجي قابل للتعقيم.
3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأوساخ / المخلفات السائبة من مواقع أخذ العينات التشريحية عن طريق مسح المنطقة برفق بمنديل معقم جاف خال من النسالة (انظر جدول المواد). تخلص من المناديل في أكياس أو أوعية بيولوجية قابلة للتعقيم.
4. قم بإزالة التلوث من السطح النظيف عن طريق المسح بمنديل معقم مبلل بالمبيض التجاري المخفف (~ 0.01٪ v / v ، مخفف بماء خال من DNase / RNase عالي النقاء) واتركه للحضانة لمدة 5 دقائق. تخلص من المناديل في أكياس أو أوعية بيولوجية قابلة للتعقيم.
  تنبيه: المبيض مادة كيميائية شديدة التآكل ومتفاعلة. ومن ثم يجب اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة قبل استخدامه.
5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المبيض المتبقي من موقع أخذ العينات التشريحية بمنديل معقم مبلل بماء خال من DNase / RNase عالي النقاء. تخلص من المناديل في أكياس أو أوعية بيولوجية قابلة للتعقيم.
6. قم بتعريض جميع مواقع أخذ العينات التشريحية النظيفة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة (الطول الموجي: 254 نانومتر) ، ثم اتركها تجف تماما في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن مواقع أخذ العينات التشريحية جافة تماما قبل الشروع في أخذ العينات أو العودة إلى التخزين ليس فقط لتسهيل توليد مسحوق العظام ولكن أيضا لمنع المزيد من تدهور العينة (على سبيل المثال ، العفن).
  تنبيه: التعرض للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون ضارا للعينين.
7. انتقل فورا إلى أخذ العينات أو تخزين العناصر الهيكلية في بيئة معقمة جافة يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية).

3. توليد مسحوق العظام

ملاحظة: البروتوكولات التالية مخصصة للاستخدام في استخراج الحمض النووي باتباع بروتوكول Dabney et al. 2019²⁶.

أخذ عينات من pars petrosa
ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من الإجراءات الموضحة في Pinhasi et al. 2019⁴ ويتم تقديمه هنا لسهولة الاستخدام. لا يمثل هذا البروتوكول الطريقة الحالية الأقل تدميرا لأخذ عينات pars petrosa. على هذا النحو ، يوصى باستخدام البروتوكول الذي وصفه Sirak et al. 2017¹³ أو أورفانو وآخرون 2020¹⁴ للعينات التي يكون فيها الحفظ المورفولوجي ذا أهمية قصوى.
1. قم بإجراء جميع عمليات أخذ العينات في غرفة نظيفة مخصصة تحت غطاء PCR مجهز بضوء الأشعة فوق البنفسجية أو خزانة السلامة الحيوية (الطول الموجي: 254 نانومتر) مع إيقاف تدفق الهواء. انشر ورق الألمنيوم المعقم عبر سطح الطاولة لالتقاط أي مسحوق / شظايا عظام طائشة.
2. تأكد من استعادة جميع شظايا العظام وأكبر قدر ممكن من المسحوق (للعودة إلى الوطن) قبل التخلص من ورق القصدير. قم بتغيير الرقاقة بين كل عينة. تخلص من الرقاقة المستخدمة في كيس / وعاء خطر بيولوجي قابل للتعقيم.
3. قم بتأمين العنصر الجاف والمطهر باستخدام مشبك أو ملزمة معقمة.
4. اقطع pars petrosa إلى نصفين على طول التلم الصخري العلوي (انظر الشكل 1) باستخدام منشار صائغ قياسي مزود بشفرة 0.6 مم (انظر جدول المواد) بسرعة متوسطة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة (انظر الملاحظة أدناه الخطوة 3.1.6).
  تنبيه: البارس البتروسي كثيف للغاية ، وبالتالي قد يكون من الصعب قطعه. احرص على إبقاء العنصر مثبتا بإحكام لتجنب الإصابة. تخلص من أي شفرات منشار مكسورة في وعاء الأدوات الحادة المناسب.
5. قم بإزالة الأجزاء الصخرية من المشبك. استعادة وحفظ أي مواد فضفاضة / زائدة.
6. ضع ورق الوزن في قارب وزن معقم
7. أمسك الجزء الصخري فوق ورق الوزن ، مع إمالة الجانب المقطوع نحو درج الوزن. حفر في العظم القشري الكثيف بين قناة الوجه وغار الخشاء (يبدو أكثر لمعانا من المواد المحيطة ، انظر الشكل 1) باستخدام مثقاب الأسنان المجهز بقطعة قياس صغيرة (انظر جدول المواد) واضبطه على سرعة متوسطة وعزم دوران متوسط لإنتاج مسحوق العظام.
  ملاحظة: يجب أن يتم الحفر / القطع على دفعات قصيرة بسرعات منخفضة إلى متوسطة لتجنب ارتفاع درجة حرارة العظام واحتمال تدمير / إتلاف الحمض النووي. من الناحية القصصية ، عندما يبدأ الجزء الكثيف من الصخري في ارتفاع درجة الحرارة ، يمكن ملاحظة رائحة توصف بأنها طهي لحم الخنزير المقدد. توقف عن الحفر / النشر على الفور واترك العظم يرتاح حتى يبرد بدرجة كافية قبل الاستئناف.
8. كرر الحفر حتى يتم جمع ما يقرب من 50-100 مجم من المسحوق في ورق الوزن، كما تم قياسه باستخدام ميزان مغلق بدقة لا تقل عن 0.01 مجم (انظر جدول المواد).
  ملاحظة: حيثما أمكن ، يقترح جمع 100 مجم من مسحوق العظام للسماح باستخراج الحمض النووي مرتين مكررتين من 50 مجم لكل منهما. ومع ذلك ، قد لا يكون هذا ممكنا دائما بناء على تحديد مواقع أخذ العينات التشريحية نفسها (على سبيل المثال ، السلامية البعيدة ، حجرة لب الأسنان) أو الحاجة إلى الحفظ المورفولوجي. بالنسبة للمواقع الأخرى ، مثل الملاط ، قد يتوفر أقل بكثير من 50 مجم من المادة. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الملاط وغرفة لب الأسنان والكتائب البعيدة تنتج حمضا نوويا داخليا كبيرا¹¹،²⁷،²⁸ ^، على الرغم من انخفاض المدخلات الأولية لمسحوق العظام من عملية الاستخراج.
9. انقل المسحوق من ورق الوزن إلى أنبوب آمن منخفض الربط عيار 2 مل لاستخراجه أو تخزينه. قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية ، إلى أجل غير مسمى.
10. قم بتخزين العظام / المسحوق الزائد المتبقي في بيئة معقمة جافة يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية) حتى يمكن إكمال العودة / الإعادة إلى الوطن.
11. تخلص من جميع النفايات في أكياس أو أوعية خطرة بيولوجية قابلة للتعقيم. تعقيم / تطهير جميع المعدات القابلة لإعادة الاستخدام (على سبيل المثال ، المشابك ، لقم الحفر ، المثاقب ، المناشير ، إلخ) باستخدام محلول التبييض / إزالة التلوث من الحمض النووي / الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 254 نانومتر) التعرض ، حسب الاقتضاء ، بين كل عينة.

figure-protocol-1
الشكل 1: العظم الصدغي بما في ذلك بارس بتروسا. (أ) عينة مسبقة القطع توضح مواقع الهرم الصخري والتلم البتروسي. (ب) جزء صخري بعد القطع يسلط الضوء على المناطق الكثيفة المراد حفرها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أخذ عينات من الأضراس الدائمة
ملاحظة: لأخذ عينات من الأضراس الدائمة، حدد مسبقا in situ الأضراس ذات الجذور المنصهرة وخالية بشكل مثالي من التسوس أو الشقوق في المينا أو التآكل المفرط للحصول على أفضل النتائج. قم بإزالة أي عينات من حساب التفاضل والتكامل السني وتخزينها عند -20 درجة مئوية لإجراء تحليلات مستقبلية محتملة للميكروبيوم الفموي (الإجراء غير مشمول هنا).
1. أخذ عينات من الملاط
  1. قم بإجراء جميع عمليات أخذ العينات في غرفة نظيفة مخصصة تحت غطاء PCR مجهز بضوء الأشعة فوق البنفسجية أو خزانة السلامة الحيوية (الطول الموجي: 254 نانومتر) مع إيقاف تدفق الهواء. انشر ورق الألمنيوم المعقم عبر سطح الطاولة لالتقاط أي مسحوق / شظايا عظام طائشة.
  2. تأكد من استعادة جميع شظايا العظام وأكبر قدر ممكن من المسحوق (للعودة إلى الوطن) قبل التخلص من ورق القصدير. قم بتغيير الرقاقة بين كل عينة. تخلص من ورق القصدير المستخدم في كيس / وعاء خطر بيولوجي قابل للتعقيم.
  3. ضع ورقة وزن في صينية وزن معقمة.
  4. امسك/ثبت الضرس الذي تم تطهيره من المطلي بالمينا، والجذر لأسفل، فوق صينية وزن باستخدام مشبك محمول باليد مثل مفتاح ربط قابل للتعديل (انظر جدول المواد).
  5. جهز مثقاب الأسنان بعجلة قطع دائرية ذات حواف ماسية. مع ضبط المثقاب على إعداد متوسط السرعة / عزم الدوران ، المس حافة اللقمة برفق إلى الجذر بزاوية -20 درجة تقريبا.
  6. اكشط لأسفل في الدرج لإزالة / جمع المواد الصفراء الخارجية من الجذر (الملاط). توقف عن التجميع عندما تصبح المادة الأخف (البيضاء) للعاج مرئية.
    ملاحظة: من المهم مطابقة اتجاه دوران لقمة القطع فيما يتعلق بدرج التجميع لتجنب أن يصبح المسحوق رذاذا ويحتمل أن يهدر العينة عن طريق فقدان الدرج تماما. الملاط غني بشكل خاص بالحمض النووي. ومع ذلك ، فإن الغلة النموذجية للمواد أصغر بكثير من مواقع أخذ العينات التشريحية الأخرى (~ 7-20 مجم) ¹¹،²⁷^،²⁸.
  7. سجل كتلة المسحوق التي تم جمعها في ورق وزن باستخدام ميزان مغلق بدقة لا تقل عن 0.01 مجم (انظر جدول المواد).
  8. انقل المسحوق من ورق الوزن إلى أنبوب قفل آمن منخفض الربط سعة 2 مل لاستخراجه. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
2. أخذ عينات من غرفة اللب
  1. بعد جمع الملاط (إذا رغبت في ذلك) ، قسم الضرس على طول تقاطع الأسمنت والمينا باستخدام منشار صائغ لإزالة التاج (انظر الشكل 2).
  2. ضع ورقة وزن جديدة في درج وزن جديد.
  3. ثبت قسم التاج في مشبك أو ملزمة محمولة باليد فوق درج الوزن. امسك جانب القطع مائلا لأسفل وقم بحفر / كشط المواد كأول ممر باستخدام مثقاب أسنان مجهز بمثقاب ثقب صغير (انظر جدول المواد) على طول حواف حجرة اللب داخل جزء التاج (انظر الشكل 2).
    ملاحظة: يجب فقط جمع الممر الأول من داخل حجرة اللب وتصنيفه على أنه مادة لب (5-15 مجم عائد نموذجي) ، أي شيء أعمق في السن يعتبر عاجا.
  4. اقلب السن بحيث يكون الجزء السفلي متجها لأسفل ، واضغط على المشبك بمطرقة ، واجمع المسحوق المحرر على ورق الوزن.
  5. سجل وزن المسحوق الذي تم جمعه في ورق الوزن باستخدام ميزان مغلق بدقة لا تقل عن 0.01 مجم (انظر جدول المواد).
  6. انقل المسحوق من ورق الوزن إلى أنبوب آمن منخفض الربط سعة 2 مل لاستخراجه. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
3. أخذ عينات من العاج
  1. ضع ورقة وزن جديدة في درج وزن جديد.
  2. أمسك قسم التاج فوق صينية الوزن (وفقا للخطوة 3.2.2.3) ، وقم بالحفر وجمع المزيد من 50-100 مجم من العاج كما تم قياسه باستخدام ميزان مغلق بدقة 0.01 مجم (انظر جدول المواد) من داخل حجرة اللب بنفس الطريقة لمزيد من أخذ عينات العاج (انظر الشكل 2).
  3. انقل مسحوق العظام من ورق الوزن إلى أنبوب آمن منخفض الربط سعة 2 مل لاستخراجه. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
  4. قم بتخزين قطع الأسنان المتبقية / المسحوق الزائد في بيئة معقمة جافة يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية) حتى يمكن إكمال العودة / الإعادة إلى الوطن.
  5. تخلص من جميع النفايات في أكياس أو أوعية خطرة بيولوجية قابلة للتعقيم. تعقيم / تطهير جميع المعدات القابلة لإعادة الاستخدام (على سبيل المثال ، المشابك ، لقم الحفر ، المثاقب ، المناشير ، إلخ) باستخدام محلول التبييض / إزالة تلوث الحمض النووي / الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 254 نانومتر) التعرض حسب الاقتضاء ، بين كل عينة.

figure-protocol-2
الشكل 2: أخذ العينات قبل الضرس الدائم . (أ) الضرس المعالج مسبقا قبل أخذ العينات ، ويظهر التاج ، والملاط (الطبقة الصفراء من الجذر) ، وموقع القطع عند تقاطع الأسمنت والمينا. (ب) نفس المجموعة المولية بعد الملاط ، توضح موقع القطع عند تقاطع الأسمنت والمينا. (ج) الضرس بعد القطع وأخذ العينات يوضح مواقع أخذ العينات التشريحية لحجرة لب الأسنان والعاج داخل التاج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أخذ عينات من الفقرات الصدرية
1. أخذ عينات من الجسم الفقري
  1. قم بإجراء جميع عمليات أخذ العينات في غرفة نظيفة مخصصة تحت غطاء PCR مجهز بضوء الأشعة فوق البنفسجية أو خزانة السلامة الحيوية (الطول الموجي: 254 نانومتر) مع إيقاف تدفق الهواء. انشر ورق الألمنيوم المعقم عبر سطح الطاولة لالتقاط أي مسحوق / شظايا عظام طائشة.
  2. تأكد من استعادة جميع شظايا العظام وأكبر قدر ممكن من المسحوق (للعودة إلى الوطن) قبل التخلص من ورق القصدير. قم بتغيير الرقاقة بين كل عينة. تخلص من ورق القصدير المستخدم في كيس / وعاء خطر بيولوجي قابل للتعقيم.
  3. ضع ورقة صغيرة من ورق الوزن في درج وزن قياسي.
  4. تأمين الفقرات مع المشبك أو ملزمة اليد ، مع الجسم الفقري للخارج.
  5. أمسك الفقرات فوق صينية الوزن مع إمالة الجسم الفقري لأسفل. باستخدام مثقاب أسنان مجهز بمثقاب قياس صغير (انظر جدول المواد) مضبوط على عزم دوران عالي السرعة منخفض السرعة ، قم بالحفر على طول الحافة الخارجية (السفلية والعليا) للعظم القشري المحيط بالأنسجة الداخلية الملغاة للجسم الفقري (انظر الشكل 3).
  6. اكشط اللقمة على الطبقة القشرية فوق صينية ترجيح قياسية حتى يتم جمع 50-100 مجم من المادة ، كما تم قياسها باستخدام ميزان مغلق بدقة 0.01 مجم (انظر جدول المواد).
  7. انقل مسحوق العظام من ورق الوزن إلى أنبوب قفل آمن منخفض الربط سعة 2 مل لاستخراجه. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
2. أخذ عينات من القوس الفقري العلوي
  ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. قم بإزالة وتجاهل الطبقة الخارجية من العظم القشري للقوس الفقري العلوي باستخدام مثقاب أسنان مجهز بمثقاب صغير (انظر جدول المواد) عن طريق كشطه على طول السطح¹⁹. لا يقترح أخذ عينات من الجسم الفقري ، حيث أن طبقة العظم القشري رقيقة جدا بشكل عام ومن المحتمل أن تستنفد تماما من خلال هذه العملية (انظر الملاحظة في القسم 2).
  1. ضع ورقة صغيرة من ورق الوزن في درج وزن قياسي.
  2. قم بتأمين الفقرات في مشبك / ملزمة يدوية مع عملية العمود الفقري للخارج ، والجانب العلوي لأسفل.
  3. أثناء إمساك الفقرات ، الجانب العلوي لأسفل ، فوق صينية وزن ، قم بالحفر لأعلى في مركز الشق على شكل حرف V الذي يتكون من اندماج العملية الشائكة مع الصفائح (انظر الشكل 3) باستخدام مثقاب أسنان مع بت مقياس صغير (انظر جدول المواد) مضبوط على سرعة منخفضة وعزم دوران عالي.
  4. توقف عن الحفر عندما يكون هناك انخفاض ملحوظ في المقاومة. قم بتغيير موضع الحفر قليلا وكرر حتى يتم جمع 50-100 مجم من مسحوق العظام ، كما تم قياسه باستخدام ميزان مغلق بدقة 0.01 مجم (انظر جدول المواد).
  5. انقل مسحوق العظام من ورق الوزن إلى أنبوب منخفض الربط سعة 2 مل لاستخراجه. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
  6. قم بتخزين العظام / المسحوق الزائد المتبقي في بيئة معقمة جافة يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية) حتى العودة / الإعادة إلى الوطن.
  7. تخلص من جميع النفايات في أكياس أو أوعية خطرة بيولوجية قابلة للتعقيم. تعقيم / تطهير جميع المعدات القابلة لإعادة الاستخدام (على سبيل المثال ، المشابك ، لقم الحفر ، المثاقب ، المناشير ، إلخ) باستخدام محلول التبييض / إزالة التلوث من الحمض النووي / الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 254 نانومتر) التعرض ، حسب الاقتضاء ، بين كل عينة.

figure-protocol-3
الشكل 3: الجسم الفقري ومواقع أخذ العينات التشريحية للعظم القشري العلوي للفقرة الصدرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أخذ عينات من الكتائب البعيدة
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. قم بإزالة وتجاهل الطبقة الخارجية من العظم القشري للعمود و / أو الخصلة القمية باستخدام مثقاب أسنان مجهز بمثقاب صغير عن طريق كشطه على طول السطح¹⁹. قد لا يكون هذا ممكنا للعينات ذات العظام القشرية الرقيقة للغاية أو بقايا الأحداث (انظر الملاحظة في القسم 2).
1. قم بإجراء جميع عمليات أخذ العينات في غرفة نظيفة مخصصة ، تحت غطاء PCR مجهز بضوء الأشعة فوق البنفسجية أو خزانة السلامة الحيوية (الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية: 254 نانومتر) مع إيقاف تدفق الهواء. انشر ورق الألمنيوم المعقم عبر سطح الطاولة لالتقاط أي مسحوق / شظايا عظام طائشة.
2. تأكد من استعادة جميع شظايا العظام وأكبر قدر ممكن من المسحوق (للعودة إلى الوطن) قبل التخلص من ورق القصدير. قم بتغيير الرقاقة بين كل عينة. تخلص من ورق القصدير المستخدم في كيس / وعاء خطر بيولوجي قابل للتعقيم.
3. ضع ورقة صغيرة من ورق الوزن في درج وزن قياسي.
4. قم بتأمين العينة في المشبك / الملزمة المحمولة ، الجانب العلوي لأعلى.
5. امسك العينة فوق صينية الوزن ، واجمع مسحوق العظام من العظم القشري من الجانب السفلي من الخصلة القمية والعمود عن طريق الحفر عبر الطبقات الخارجية الكثيفة (انظر الشكل 4) باستخدام مثقاب أسنان مجهز بمثقاب قياس صغير (انظر جدول المواد).
6. توقف عن الحفر عندما يكون هناك انخفاض ملحوظ في المقاومة ، لأن هذا يدل على مادة أخف وزنا وقابلة للإلغاء. كرر هذه العملية ، مشعا للخارج من الحفر الأولي حتى يتم جمع ما لا يقل عن 50-100 مجم من مسحوق العظام ، كما تم قياسه باستخدام ميزان مغلق دقيق إلى 0.01 مجم (انظر جدول المواد).
7. انقل مسحوق العظام من ورق الوزن إلى أنبوب آمن منخفض الربط سعة 2 مل لاستخراجه. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
8. قم بتخزين العظم / المسحوق الزائد المتبقي في بيئة معقمة جافة يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية) حتى العودة / الإعادة إلى الوطن.
9. تخلص من جميع النفايات في أكياس أو أوعية خطرة بيولوجية قابلة للتعقيم. تعقيم / تطهير جميع المعدات القابلة لإعادة الاستخدام (على سبيل المثال ، المشابك ، لقم الحفر ، المثاقب ، المناشير ، إلخ) باستخدام محلول التبييض / إزالة تلوث الحمض النووي / الإيثانول والتعرض للأشعة فوق البنفسجية ، حسب الاقتضاء ، بين كل عينة.
  ملاحظة: بالنسبة للعينات الأصغر (على سبيل المثال ، عينات الأحداث) قد يكون هناك أقل بكثير من 50-100 ملغ من العظام القشرية المقترحة المتاحة للعينة. ومع ذلك ، حتى بكميات قليلة ، فقد ثبت أن موقع أخذ العينات التشريحي هذا غني بشكل خاص بالحمض النووي¹¹.

figure-protocol-4
الشكل 4: السلامية البعيدة توضح مواقع العظم القشري الكثيف على طول العمود والجانب السفلي من الخصلة القمية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أخذ عينات من الكالوس
1. قم بإجراء جميع عمليات أخذ العينات في غرفة نظيفة مخصصة تحت غطاء PCR مجهز بضوء الأشعة فوق البنفسجية أو خزانة السلامة الحيوية (الطول الموجي: 254 نانومتر) مع إيقاف تدفق الهواء. انشر ورق الألمنيوم المعقم عبر سطح الطاولة لالتقاط أي مسحوق / شظايا عظام طائشة.
2. تأكد من استعادة جميع شظايا العظام وأكبر قدر ممكن من المسحوق (للعودة إلى الوطن) قبل التخلص من ورق القصدير. قم بتغيير الرقاقة بين كل عينة. تخلص من ورق القصدير المستخدم في كيس / وعاء خطر بيولوجي قابل للتعقيم.
3. ضع ورقة صغيرة من ورق الوزن في درج وزن قياسي.
4. قم بتأمين العينة في المشبك / الملزمة المحمولة ، القبة لأعلى.
5. امسك الكاحل، والقبة لأعلى، والسطح الإنسي باتجاه المجمع، فوق صينية الوزن. كشط العظم القشري من عنق الكاحل إلى عمق ~ 1 مم (انظر الشكل 5) باستخدام مثقاب أسنان مع بت مقياس منخفض (انظر جدول المواد) مضبوط على سرعة منخفضة وعزم دوران عالي.
6. قم بتغيير موضع الحفر قليلا وكرر حتى يتم جمع ما يقرب من 50-100 مجم من مسحوق العظام ، كما تم قياسه باستخدام ميزان مغلق بدقة 0.01 مجم (انظر جدول المواد).
7. انقل مسحوق العظام من ورق الوزن إلى أنبوب منخفض الربط سعة 2 مل لاستخراجه. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
8. قم بتخزين العظم / المسحوق الزائد المتبقي في بيئة معقمة جافة يتم التحكم في درجة حرارتها (25 درجة مئوية) حتى تكتمل العودة / الإعادة إلى الوطن.
9. تخلص من جميع النفايات في أكياس أو أوعية خطرة بيولوجية قابلة للتعقيم. تعقيم / تطهير جميع المعدات القابلة لإعادة الاستخدام (على سبيل المثال ، المشابك ، لقم الحفر ، المثاقب ، المناشير ، إلخ) باستخدام محلول التبييض / إزالة التلوث من الحمض النووي / الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 254 نانومتر) التعرض ، حسب الاقتضاء ، بين كل عينة.

figure-protocol-5
الشكل 5: منطقة أخذ العينات من الكاحل لاستعادة العظم القشري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملاحظة: يحتوي الكاحل على القليل جدا من العظم القشري (طبقة خارجية رقيقة). لا ينبغي جمع المادة من السطح فحسب ، بل يجب أيضا جمع الطبقة الكثيفة الأساسية من العظم الإلغائي.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دراسة منفصلة 11 ، تم استخراج الحمض النووي من مسحوق العظام المتولد من كل موقع أخذ عينات تشريحي في¹¹ فردا ، باستخدام بروتوكول استخراج الحمض النووي القياسي الأمثل للشظايا القصيرة من الأنسجة المتكلسة². ثم تم إنتاج مكتبات مفردة تقطعت بها السبل 28 وتسلسلها على HiSeq 4000 (75 نقطة أساس نهاية مزدوجة) إلى عمق ~²⁰،000،000 قراءة لكل عينة. ثم تم تقييم بيانات التسلسل الناتجة لمحتوى الحمض النووي البشري الداخلي باستخدام خط أنابيب EAGER²⁹ (إعدادات BWA: طول البذور 32 ، عقوبة عدم تطابق 0.1 ، مرشح جودة رسم الخرائط 37). يتم الإبلاغ عن جميع النتائج التمثيلية باستخدام نفس المقاييس مثل Parker et al. 2020¹¹ من أجل الاتساق. أنتجت المكتبات من الأجزاء المسحوقة من pars petrosa ، في المتوسط ، حمضا نوويا داخليا أعلى من أي من مواقع أخذ العينات التشريحية ال 23 الأخرى التي تم مسحها (الشكل 6A-B). أنتجت مواقع أخذ العينات التشريحية السبعة الإضافية المعروضة في هذا البروتوكول (الملاط ، الممر الأول لغرفة لب الأسنان ، وعاج الأضراس الدائمة ؛ العظم القشري من الجسم الفقري والقوس الفقري العلوي للفقرة الصدرية ؛ العظم القشري من الخصلة القمية للسلامية البعيدة ؛ والعظم القشري من عنق الكاحل) أعلى غلة تالية (مع عدم وجود دلالة إحصائية بين مواقع أخذ العينات التشريحية هذه. الشكل 6 أ - ب ؛ الملف التكميلي 1: EndoogenousDNAPreCap). أنتجت جميع هذه المواقع البديلة باستمرار غلة الحمض النووي الكافية لتحليلات علم الوراثة السكانية القياسية مثل تحليلات الميتوكوندريا وتحليلات تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP). وكانت معدلات الازدواجية في المكتبات الناجمة عن جميع مواقع أخذ العينات التشريحية منخفضة (العوامل العنقودية < 1.2 في المتوسط، محسوبة كنسبة جميع قراءات رسم الخرائط إلى قراءات رسم الخرائط الفريدة، الجدول 2؛ والجدول 2). الملف التكميلي 1: ClusterFactor) ، مما يشير إلى أن جميع المكتبات التي تم فحصها كانت ذات تعقيد كبير جدا. وبالمثل ، كان متوسط تقديرات تلوث الحمض النووي البشري الخارجي منخفضا ، حيث بلغ متوسطه 2٪ < (تلوث كروموسوم X في الذكور ، n = 7 ، كما ورد في خط أنابيب ANGSD³⁰) في جميع مواقع أخذ العينات التشريحية باستثناء القوس الفقري العلوي (متوسط التلوث المقدر: 2.11٪ ، مع إزالة عينة واحدة كقيمة شاذة. KRA005: 19.52٪ ، انظر الجدول 2 ؛ الملف التكميلي 1: Xpollution). كان متوسط طول الشظية (بعد الترشيح لإزالة جميع القراءات < 30 نقطة أساس) هو الأدنى في المادة التي تم جمعها من حجرة لب الأسنان والعاج ، مع عدم وجود اختلاف كبير بين مواقع أخذ العينات التشريحية الأخرى (55.14 نقطة أساس و 60.22 نقطة أساس ، على التوالي مقارنة بمتوسط 62.87 ، قيم p الزوجية < 0.019 ، الجدول 2 ؛ الملف التكميلي 1: AvgFragLength). بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي كل من الأسنان والفقرات الصدرية على مواقع متعددة لأخذ العينات التشريحية حيث لوحظ ارتفاع استعادة الحمض النووي الداخلي ، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص كبدائل ل pars petrosa.

figure-results-1
الشكل 6: محتوى الحمض النووي البشري لجميع العينات التي تم فحصها. تمثل الخطوط السوداء المتوسط العام ، بينما تمثل الخطوط الحمراء الوسيط (صلب: نسبة الحمض النووي البشري ، متقطعة: قراءات بشرية معينة لكل مليون قراءة تم إنشاؤها). مواقع أخذ العينات التشريحية الفردية مع متوسط نسبة الحمض النووي البشري أعلى من المتوسط العام (8.16٪) ملونة في جميع التحليلات. (أ) نسبة القراءات إلى الجينوم المرجعي hg19. يمثل الخط المتقطع الأزرق الحد الأقصى النظري بالنظر إلى معلمات رسم الخرائط لخط الأنابيب (التي تم إنشاؤها باستخدام Gargammel³¹ لمحاكاة التوزيع العشوائي ل 5,000,000 قراءة من الجينوم المرجعي hg19 مع تلف محاكاة). يتم الإبلاغ عن الوسائل الفردية (X السوداء) والمتوسطات (الدائرة الحمراء) لتلك العينات ذات متوسط نسبة الحمض النووي البشري أعلى من المتوسط العام. تشير فترات الثقة إلى الحدود العليا والدنيا باستثناء القيم الإحصائية المتطرفة. (ب) عدد القراءات الفريدة التي يتم تعيينها للجينوم المرجعي hg19 لكل مليون قراءة لجهد التسلسل (75 نقطة أساس نهاية مزدوجة). تشير فترات الثقة إلى الحدود العليا والدنيا باستثناء القيم الإحصائية المتطرفة. تم تكييف هذا الرقم من Parker، C. et al. 2020¹¹. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 2: متوسط مستويات الازدواجية (قراءات رسم الخرائط/القراءات الفريدة)، ومتوسط ومتوسط أطوال الشظايا، وتقديرات التلوث بالكروموسوم X لجميع مواقع أخذ العينات التشريحية. تم الإبلاغ عن الخطأ على أنه الخطأ القياسي للمتوسط. تم تكييف هذا الجدول من Parker، C. et al. 2020¹¹.

موقع أخذ العينات	متوسط عامل الازدواجية (# القراءات المعينة /# القراءات المعينة الفريدة)	متوسط طول الشظية بالحصان	متوسط النسبة المقدرة لتلوث الكروموسوم X
الهرم الصخري	1.188 ± 0.006	65.40 ± 1.36	0.000 ± 0.003
ملاط	1.197 ± 0.028	67.28 ± 1.76	0.011 ± 0.003
العاج	1.188 ± 0.061	60.22 ± 2.37	0.002 ± 0.007
لب	1.179 ± 0.024	55.14 ± 2.90	0.013 ± 0.006
الكتائب البعيدة	1.191 ± 0.049	65.95 ± 1.08	0.013 ± 0.005
الجسم الفقري	1.194 ± 0.037	66.14 ± 1.03	0.008 ± 0.003
القوس الفقري العلوي	1.19 ± 0.017	63.02 ± 1.23	0.021 ± 0.009*
تالوس	1.198 ± 0.010	68.20 ± 1.24	0.011 ± 0.003
* تمت إزالة عينة KRA005 كقيمة شاذة عند 0.1952

توفر الرمز
جميع برامج التحليلات ووحدات R المستخدمة في تحليلات هذه المخطوطة متاحة مجانا من مؤلفيها. كل رمز R المخصص متاح حسب الطلب.

توافر البيانات
جميع البيانات الأولية المستخدمة في حساب النتائج التمثيلية متاحة مجانا في مستودع بيانات ENA لأرشيف النوكليوتيدات الأوروبي (رقم الانضمام PRJ-EB36983) أو المواد التكميلية ل Parker، C. et ^al.11.

الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الممارسة الحالية في علم الوراثة البشرية القديمة هي أخذ عينات تفضيلية من pars petrosa (الخطوة 2.1) كلما أمكن ذلك. ومع ذلك ، يمكن أن يكون pars petrosa عينة يصعب الحصول عليها ، حيث أنها ذات قيمة عالية لعدد لا يحصى من تقييمات الهيكل العظمي (على سبيل المثال ، تاريخ السكان³² ، وتقدير عمر الجنين عند الوفاة 33 ، وتحديد الجنس³⁴) ، وتاريخيا ، يمكن أن يكون أخذ عينات من pars petrosa لتحليل الحمض النووي مدمرا للغاية ^3,4 (بما في ذلك البروتوكول المقدم هنا ، على الرغم من أن البروتوكولات الجديدة طفيفة التوغل^13,14 قد تم اعتمادها الآن على نطاق واسع للتخفيف من هذا القلق). ويضاف إلى ذلك حقيقة أنه حتى وقت قريب جدا ، لم تتم محاولة إجراء دراسة منهجية واسعة النطاق لاستعادة الحمض النووي البشري عبر الهيكل العظمي¹¹ ، مما يجعل العثور على استراتيجية مناسبة لأخذ العينات عندما يكون الهرم الصخري غير متاح أمرا صعبا.

تساعد البروتوكولات المقدمة هنا على التخفيف من هذا التحدي من خلال توفير مجموعة من الإجراءات المثلى لأخذ عينات الحمض النووي من بقايا الهيكل العظمي الأثري / الشرعي بما في ذلك pars petrosa بالإضافة إلى سبعة مواقع بديلة لأخذ العينات التشريحية عبر أربعة عناصر هيكلية إضافية. وتهدف جميع الخطوات الحاسمة المدرجة إلى التقليل إلى أدنى حد من احتمال فقدان/تلف الحمض النووي إما بسبب عدم كفاءة أخذ العينات (الخطوتان 2-1-6 و3-2-1-3) أو ارتفاع درجة حرارة العينات أثناء الحفر/القطع (الخطوة 3-1-6). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ في جميع أنحاء البروتوكول أنه قد يكون من الضروري تعديل / حذف خطوات ما قبل المعالجة لضمان أفضل أداء في العينات شديدة التدهور. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه حتى من بين العناصر المختارة المعروضة هنا ، لا تزال هناك العديد من تقنيات أخذ العينات البديلة الممكنة (خاصة بالنسبة ل pars petrosa^13,14) ، بالإضافة إلى مجال واسع لمزيد من تحسين مواقع أخذ العينات التشريحية غير المستغلة المعروضة هنا (أي talus: الخطوة 2.5 والفقرات: الخطوة 2.3).

من المهم أيضا أن نضع في اعتبارنا أن هذه البروتوكولات قد تم تصميمها واختبارها باستخدام بقايا قديمة من الأحداث البالغين ذات جودة عالية (حفظ مورفولوجي جيد) لأغراض تحليلات الحمض النووي البشري الداخلي. قد لا تمتد النتائج المقدمة إلى المواد المتدهورة للغاية ، أو سياقات الحفظ الأخرى ، أو رفات الرضع ، أو الرفات غير البشرية ، أو دراسات مسببات الأمراض أو الميكروبيوم ، حيث لا تزال هناك حاجة إلى استكشاف أكبر لاستخدام هذه البروتوكولات في سياقات إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب تعيين العناصر الهيكلية البديلة المعروضة هنا (الأسنان والفقرات والكتائب البعيدة والتالي) لفرد واحد بين البقايا المختلطة ، مما يستلزم أخذ عينات من عناصر متعددة لضمان أصل واحد. على الرغم من هذه القيود ، فإن إتاحة هذه البروتوكولات على نطاق واسع يمكن أن يساعد في التخفيف من بعض عدم التجانس المحيط باختيار العينات ومعالجتها من خلال توفير إطار عام ومحسن كميا للاستخدام في مجموعة واسعة من دراسات الحمض النووي / الطب الشرعي المستقبلية على الرفات البشرية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا موظفي المختبر في معهد ماكس بلانك لعلوم التاريخ البشري على مساعدتهم في تطوير وتنفيذ هذه البروتوكولات. لم يكن هذا العمل ممكنا بدون المدخلات والعمل الجاد للدكتور جويدو براندت والدكتورة إليزابيث نيلسون وأنتجي ويسيغوت وفرانزيسكا آرون. تم تمويل هذه الدراسة من قبل جمعية ماكس بلانك ، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقيات المنح رقم 771234 - PALEoRIDER (WH، ABR) ومنحة البدء رقم 805268 CoDisEASe (إلى KIB).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
# 16 مثقاب الأسنان	NTI	H1-016-HP	مثال مثقاب
0.6 مم شفرة المنشار التمرير	شفرة فيشر Scientific	50-949-097	شفرة للمجوهرات المنشار
22 مم عجلة القطع الماسية	Kahla	SKU 806 104 358 514 220	مرفق قطع Dremel
التبييض التجاري	شركة فيشر العلمية
Ultra-Clean رقائق الألومنيوم العليا	فيشر Scientific	15-078-29X
أنابيب DNA LoBind (2 مل)	Eppendorf	22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment	Dremel	225-01	Dremel تمديد مرن
Dremel 4300 أداة دوارة	Dremel	4300	مثال على الحفر
Dremel collet ومجموعة الجوز	Dremel		محولات لمختلف مرفقات / بتات أداة Dremel
Eagle 33 جالون كيس نفايات Biohazard أحمر	فيشر Scientific	17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق	فيشر Scientific	13-698-792
الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية)	Millipore Sigma	1.08543
وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية المستوى 2 قناع جراحي	فيشر Scientific	50-206-0397	معدات الوقاية الشخصية
فيشربراند كومفورت نتريل قفازات	فيشر ساینتفيك	19-041-171X	معدات الوقاية الشخصية
نظارات السلامة فيشر	العلمية	19-130-208X	معدات الوقاية الشخصية
جرانجر الملزمة الثابتة	فيشر NC1336173 العلمية		ملزمة منضدة
Invitrogen UltraPure خالية من DNase / Rnase	فيشر ساينتفيك	10-977-023
المجوهرات منشار	فيشر العلمي	50-949-231
Kimwipes	Sigma-Aldritch	Z188956
Labconco جهاز تنقية منطق خزانة السلامة الحيوية	فيشر Scientific	30-368-1101
LookOut DNA Erase	Millipore Sigma	L9042-1L
قارب متوسط الوزن	هيثرو Scientific	HS120223
MSC 10 قطعة مجموعة ذو طيات / مشبك	فيشر العلمي	50-129-5352	متفرقات المشابك / مقابض الملزمة لحمل العينات بشكل آمن أثناء الحفر / القطع
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance	Fisher Scientific	14-560-019
معاطف Tyvek المغلقة مع غطاء محرك	السيارة فيشر Scientific	01-361-7X	PPE
وزن ورق	هيثرو العلمي	HS120116

للتحكم NC1818018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).
Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).
Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains. Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).
Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis. Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).
Latham, K. E., Miller, J. J. DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts. Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).
Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management. Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).
Gamba, C., et al. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
Alberti, F., et al. Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans. Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).
Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).
Sirak, K., et al. Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA. Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).
Parker, C., et al. A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons. Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).
Pinhasi, R., et al. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).
Sirak, K. A., et al. A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis. BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).
Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w (2020).
Damgaard, P. B., et al. Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth. Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).
Harney, É, et al. A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth. Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).
Cooper, A., Poinar, H. N. Ancient DNA: Do it right or not at all. Science. 289 (5482), 1139(2000).
Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
Boessenkool, S., et al. Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones. Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).
García-Garcerà, M., et al. Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics. PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).
Malmström, H., et al. More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA. Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).
Basler, N., et al. Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone. BMC Research Notes. 10, 754(2017).
Kemp, B. M., Smith, D. G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).
Korlević, P., et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth. BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).
Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).
Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).
Gansauge, M. -T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).
Peltzer, A., et al. EAGER: efficient ancient genome reconstruction. Genome Biology. 17 (1), 60(2016).
Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. ANGSD: analysis of next generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).
Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA. Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).
Ponce de León, M. S., et al. Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).
Nagaoka, T., Kawakubo, Y. Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death. Forensic Science International. 248, 188(2015).
Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone. American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

بروتوكولات أخذ عينات العظام المحسنة لاسترجاع الحمض النووي القديم من البقايا الأثرية

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles