مقالة منهجية

مناهج رسم الخرائط الكيميائية لدراسة عدوى المثقبيات

3.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63255

⸱

يناير 21, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, 2Laboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research, University of Oklahoma, Norman, 3Department of Anthropology, University of Oklahoma, Norman, 4Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد لتوزيع الأيض أثناء عدوى المثقبيات ، بما في ذلك جمع العينات ، واستخراج الأيض ، ونظرة عامة على اكتساب بيانات قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل ، وتوليد نموذج 3D ، وأخيرا ، تصور البيانات.

الملخص

تشير المدارية المسببة للأمراض والاستوائية المرضية إلى مواقع الأنسجة المستعمرة أو المتضررة بشكل انتقائي من مسببات الأمراض ، مما يؤدي إلى أعراض المرض الموضعية. تشمل طفيليات المثقبيات البشرية المعدية المثقبيات Trypanosoma cruzi ، العامل المسبب لمرض شاغاس. المثقبيات بروسي ، العامل المسبب لمرض النوم ؛ وأنواع الليشمانيا ، العوامل المسببة لداء الليشمانيات . وهي تؤثر مجتمعة على 20 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. تظهر هذه الطفيليات استوائية محددة: القلب والمريء والقولون ل T. cruzi والأنسجة الدهنية والبنكرياس والجلد والجهاز الدوري والجهاز العصبي المركزي ل T. brucei والجلد لسلالات الليشمانيا الجلدية ، والكبد والطحال ونخاع العظم لسلالات الليشمانيا اللزجة . لذلك فإن المنظور المكاني ضروري لفهم التسبب في مرض المثقبيات السوماتية. رسم الخرائط الكيميائية يولد تصورات 3D من وفرة جزيء صغير ولدت عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي، بالمقارنة مع المعلمات الميكروبيولوجية والمناعية. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن تطبيق رسم الخرائط الكيميائي لدراسة العمليات المسببة للأمراض أثناء عدوى المثقبيات ، بدءا من أخذ عينات الأنسجة المنهجية واستخراج الأيض ، يليه اكتساب بيانات قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائلة ، وينتهي بتوليد خرائط 3D لتوزيع الأيض. يمكن استخدام هذه الطريقة لأسئلة بحثية متعددة ، مثل متطلبات المغذيات لاستعمار الأنسجة بواسطة T. cruzi أو T. brucei أو Leishmania ، والتمثيل الغذائي المناعي في مواقع العدوى ، والعلاقة بين اضطراب التمثيل الغذائي للأنسجة المحلية وأعراض المرض السريري ، مما يؤدي إلى نظرة شاملة على التسبب في مرض المثقبيات الدقيقة.

المقدمة

تتكون طفيليات المثقبيات من أنواع الليشمانيا والمثقبيات الأفريقية (Trypanosoma brucei) والمثقبيات الأمريكية (Trypanosoma cruzi). تسبب الليشمانيا الأولية داء الليشمانيات، والذي يشمل الشفاء الذاتي وداء الليشمانيات الجلدي الموضعي المحدود ذاتيا، وداء الليشمانيات المخاطي الجلدي الذي تتلف فيه الأنسجة المخاطية للفم والأنف والحلق، وداء الليشمانيات الحشوي مع استوائية طفيليات إلى الأعضاء الحشوية التي تسبب الحمى وتضخم الكبد والطحال1،2. T. brucei يسبب داء المثقبيات الأفريقي البشري (HAT) ، المعروف أيضا باسم مرض النوم ، الذي يتم الإبلاغ عنه بشكل رئيسي في البلدان الأفريقية 3. تشمل العلامات والأعراض السريرية تضخم الكبد والطحال والحمى والصداع وآلام العضلات والعظام واعتلالات العقد اللمفاوية وفقر الدم في المرحلة الدموية اللمفاوية عندما تتركز الطفيليات في مجرى الدم والغدد الليمفاوية. ويتبع ذلك مرحلة السحايا والدماغ ، حيث تتركز الطفيليات في الجهاز العصبي المركزي وتسبب اضطرابات النوم والتغيير السلوكي ، وفي نهاية المطاف غيبوبة قاتلة4. T. cruzi يسبب مرض شاغاس ، المتوطن في الأمريكتين. يعاني الأفراد المصابون من مرحلة حادة أولية ، عادة ما تكون بدون أعراض ، مع استوائية طفيليات واسعة. يعاني حوالي 10٪ -30٪ من الأفراد المصابين من أعراض المرحلة المزمنة بعد عقود من العدوى ، والتي تتميز بتضخم المريء وتضخم القولون ومضاعفات القلب والأوعية الدموية5,6.

يدرس الأيض الأنواع الجزيئية الصغيرة (50-1500 Da) ، بما في ذلك المركبات البيولوجية من التمثيل الغذائي الأولي أو الثانوي والمركبات المشتقة من الخارج مثل الأدوية أو الجزيئات المشتقة من الطعام. في سياق التفاعلات بين المضيف والممرض ، يمكن أن تستكشف الأيض تأثير العدوى على بيئات مستقلب المضيف ، وهو أمر بالغ الأهمية في الوصول إلى تأثير العامل الممرض على المضيف. ويمكنه أيضا تقييم تكيفات مسببات الأمراض مع البيئة الغذائية والمناعية المضيفة7،8،9. يعد قياس الطيف الكتلي (MS) والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) من أدوات التمثيل الغذائي الشائعة المستخدمة لتحديد الأيضات وتحديدها كميا وتوصيفها. ويمكن أيضا تطبيق هذا النهج "omics" على اكتشاف المؤشرات الحيوية وتطوير الأدوية10،11.

بالنظر إلى استواء الأنسجة المحدد لطفيليات المثقبيات ، يمكن لتحليلات الأيض المكاني أن تمكن من الحصول على نظرة ثاقبة كبيرة في التسبب في الأمراض التي تسببها. كشف رسم خرائط التوزيع المكاني للمستقلبات عن مستقلبات متأثرة محليا بعدوى المثقبيات الكروزي المزمنة في أنسجة قلب الفأر وعدوى المثقبيات كروزي الحادة والطويلة الأجل في الجهاز الهضمي للفأر6،12،13. على وجه التحديد ، أظهر رسم الخرائط الكيميائي 3D انفصالا بين ثبات الطفيليات والتغيرات الأيضية في أنسجة القلب للفئران المصابة بداء المثقبيات المزمن. كان التمثيل الغذائي أكثر اضطرابا في الأجزاء السفلية والقمية من القلب ، مطابقا لمواقع أعراض مرض شاغاس (تمدد الأوعية الدموية القمي القلبي). تشمل عائلات الأيض التي تزعجها العدوى في مواقع قلبية محددة والمرتبطة بشدة المرض الأسيلكارنيتين والجلسروفوسفوكولينز12،13،14. في الجهاز الهضمي ، اتفقت التغيرات الأيضية المستمرة مع مواقع أعراض مرض شاغاس: المريء والقولون. في المقابل ، يتم إعادة تطبيع عملية التمثيل الغذائي في المواقع غير المرتبطة بأعراض مرض شاغاس ، مثل الأمعاء الدقيقة. تشمل المستقلبات التي تزعجها العدوى محليا في الجهاز الهضمي الأسيلكارنيتين والجلسروفوسفوكولين والكينورينين والتريبتوفان وحمض الكوليك. وبالإضافة إلى ذلك، مكنت هذه التحليلات من تحديد آلية استقلابية جديدة للتسامح مع مرض شاغاس6. كشف تطبيق هذه الطرق على دراسة داء الليشمانيات الجلدي عن اضطرابات استقلابية كبيرة في موقع الآفة ، ولكن أيضا تغيرات استقلابية محددة في الأنسجة السليمة المجاور للآفة ، والمنظارية. على سبيل المثال ، تم استنفاد الجلوتامين في موقع الآفة ، في حين أن الجلسروفوسفوكولين في m / z (نسبة الكتلة إلى الشحنة) 200-299 و 400-499 و 500-599 و 600-699 زادت بشكل كبير في موقع الآفة. ولم يزد الكمبيوتر الشخصي (O-34:1) إلا في المواقع المجاورة للآفات15.

الهدف من هذه المخطوطة هو إظهار الخطوات اللازمة لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد لتوزيع الأيض ("رسم الخرائط الكيميائية") كما هو مطبق على نماذج عدوى طفيليات المثقبيات (الشكل 1). يعتمد هذا النهج على العديد من التطورات الهامة في سياق الأيض ومعالجة بيانات الأيض ، ولا سيما تطوير برنامج 'ili لرسم بيانات الأيض على نماذج ثلاثية الأبعاد بسهولة16.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة من قبل جامعة أوكلاهوما أو لجنة جامعة كاليفورنيا سان دييغو المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. ونفذت جميع الخطوات التي تعالج المواد المعدية داخل خزانة السلامة الأحيائية (الفئة الثانية، النوع A2) ووفقا للوائح المحلية.

1. جمع الأنسجة

  1. إصابة النماذج الحيوانية المناسبة لعدوى المثقبيات ، بشكل عام الفئران أو الهامستر.
    ملاحظة: هناك مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج الفئران لعدوى المثقبيات ، اعتمادا على الأعراض المطلوبة التي سيتم إنتاجها ، وسرعة تطور المرض ، وشدة المرض ، وما إلى ذلك. يمكن للمستخدمين الاختيار في الوقت الذي يناسبهم.
    1. بالنسبة لنماذج عدوى داء الليشمانيات الجلدي، تصيب تحت الجلد في وسادة القدم أو داخل الأدمة في الأذن15.
    2. بالنسبة لنماذج عدوى داء الليشمانيات الحشوي ، تصيب عن طريق الوريد1,17.
    3. بالنسبة لنماذج عدوى مرض شاغاس ومرض النوم ، تصيب داخل الصفاق 6،12،18،19. تحديد جرعة الطفيلي لاستخدامها على أساس سلالة الطفيلي والنقاط الزمنية المخطط لها.
  2. تخطيط مواقف التقسيم.
    1. خطط لإنشاء أقسام بحد أدنى 10 ملغ من الأنسجة لكل قسم. من الأفضل استخدام 30-50 ملغ.
    2. بالنسبة لنماذج عدوى مرض شاغاس ، خطط لجمع شرائح القلب والجهاز الهضمي بشكل منهجي.
    3. بالنسبة لنماذج عدوى داء الليشمانيات الجلدي ، قم بجمع الأنسجة الآفة والعينات المجاورة للآفة.
    4. بالنسبة لنماذج عدوى داء الليشمانيات الحشوي ، خطط لجمع الطحال وفصوص الكبد المتعددة. قد تكون مواقع الأنسجة الإضافية مثل الأنسجة الدهنية ذات أهمية أيضا في الجمع.
      تنبيه: يجب التعامل مع العينات من الحيوانات المصابة بموجب بروتوكول السلامة الأحيائية المناسب والمعتمد مؤسسيا. وسيشمل ذلك عموما متطلبات معدات الحماية الشخصية (PPE) وفتح الأنابيب فقط وجمع العينات داخل خزانة السلامة الأحيائية (الفئة الثانية، النوع A2).
  3. أنابيب التسمية والوزن للتجانس.
    1. استخدم نوع الأنبوب المناسب لنظام التجانس المتاح. بالنسبة ل TissueLyser، استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل.
    2. القتل الرحيم للفئران في النقاط الزمنية المطلوبة للعدوى باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران على النحو المعتمد من قبل IACUC المؤسسية أو وفقا للبروتوكول المعتمد من IACUC.
    3. قسم الأنسجة بشكل منهجي كما هو مخطط له ، مع قسم واحد لكل أنبوب.
    4. تذكر أن تغسل معدات جمع العينات بين العينات باستخدام مذيب الاستخراج (50٪ ميثانول في هذا البروتوكول).
  4. الحفاظ على غطاء الأنبوب مفتوحا ، التقط عينات التجميد على الفور في النيتروجين السائل.
    تنبيه: لا تغلق الأنابيب حتى يتبخر أي نيتروجين سائل يدخل الأنبوب بالكامل لمنع الأنابيب من الانفجار مع توسع النيتروجين. اتخذ خطوات كافية لضمان عدم ملامسة الجلد للنيتروجين السائل (استخدم قفازات التبريد والملقط لتثبيت الأنابيب). ارتد واقيا آمنا للوجه.
  5. قم بتخزين الأنابيب على الثلج الجاف حتى يتم جمع جميع العينات المطلوبة.
  6. نقطة التوقف: تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للقيام بالاستخراج.
  7. أنابيب الوزن لتحديد وزن عينة الأنسجة. سجل في جدول بيانات.
    1. حافظ على تجميد العينات أثناء عملية الوزن: احتفظ بالأنابيب على الثلج الجاف ، ووزنها بسرعة ، ثم أعد إلى الثلج الجاف على الفور. لا تسمح للعينات بالذوبان أثناء الوزن.

2. استخراج الأيض

ملاحظة: يجب استخدام السوائل والكواشف من فئة LC-MS فقط طوال الوقت. تم تكييف هذه الطريقة من المرجع 20.

  1. تحضير جميع مذيبات الاستخراج (LC-MS الصف H2O ، LC-MS الصف الميثانول ، ارتفعت مع 4 ميكرومتر من سلفاكلوربيريدازين ، LC-MS الصف ثنائي كلورو الميثان: الميثانول ارتفع مع 2 ميكرومتر من سلفاكلوربيريدازين) في زجاجات زجاجية 1 لتر ، باستخدام الأواني الزجاجية المخصصة.
    ملاحظة: ينبغي حساب الحجم المراد تحضيره استنادا إلى أوزان العينات، مع مراعاة 500 ميكرولتر من الماء لكل 50 ملغ من العينة، و 500 ميكرولتر من الميثانول مع 4 ميكرومتر من السلفاكلوربيريدازين لكل 50 ملغ من العينة، و 1000 ميكرولتر من ثنائي كلورو الميثان المبرد مسبقا: ارتفع الميثانول مع 2 ميكرومتر من السلفات كلور بيريدازين لكل 50 ملغ من العينة، مما زاد الحجم المحسوب بنسبة 10٪ للسماح بعدم دقة السحب. تخزين مذيب الاستخراج في 4 درجات مئوية على الأقل بين عشية وضحاها لتبريد المسبق.
  2. إجراء التجانس القائم على الماء لعينات الأنسجة وفقا للخطوات المذكورة أدناه.
    1. أضف حبة واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 5 مم (انظر جدول المواد) إلى كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل التي تحتوي على عينات من الأنسجة ، باستخدام موزع خرزة. حافظ على الأنابيب على الجليد.
    2. اصنع أنبوبا فارغا واحدا يحتوي على LC-MS من الدرجة H2O التي ستمر عبر جميع الخطوات وتكون بمثابة استخراج فارغ. استخدم متوسط حجم H2O من عمليات استخراج العينات. أضف درجة LC-MS المبردة H2O إلى عينات الأنسجة المجمدة.
      1. تطبيع حجم الماء إلى وزن الأنسجة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الماء / 50 ملغ من العينة ، باستخدام أوزان العينة المحسوبة في الخطوة 1.7.
        تنبيه: في حالة التعامل مع عينات خطرة بيولوجيا، استمر في اتباع بروتوكول السلامة الأحيائية المناسب والمعتمد من مؤسسيا. وسيشمل ذلك عموما متطلبات معدات الحماية الشخصية (PPE) وفتح الأنابيب فقط داخل خزانة السلامة الأحيائية (الفئة الثانية، النوع A2).
    3. قم بتجانس العينات بسرعة 25 هرتز لمدة 3 دقائق باستخدام مجانس الأنسجة (انظر جدول المواد).
      1. أغلق الأنابيب بإحكام لتجنب انسكاب الكواشف أثناء المعالجة.
    4. جمع حوالي 1/10 من حجم التجانس لاستخراج الحمض النووي ، qPCR ، التحليلات القائمة على البروتين ، أو التحليلات الأخرى (إذا رغبت في ذلك). يخزن في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق أو صفيحة 96 بئرا (اعتمادا على الحجم الذي تم جمعه) لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -80 درجة مئوية ، إذا كان من المقرر إجراء تجارب استخراج الحمض النووي في يوم مختلف. قد تكون فترات التخزين الأطول ممكنة ولكن لم يتم اختبارها.
      1. قم بإجراء عمليات استخراج الحمض النووي باستخدام أي مجموعة تجارية قياسية لاستخراج الحمض النووي للثدييات (انظر جدول المواد) من الأنسجة كما هو موضح في المرجع 13. حدد كميا إنتاجية الحمض النووي وخزن الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية. وقد لوحظت كمية ونوعية الحمض النووي مقبولة ل qPCR حتى بعد 3 سنوات.
        ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة على التجانس المجمد في يوم لاحق من استخراج الأيض.
      2. قم بإجراء qPCR كما هو موضح في المرجع 13 ، باستخدام 180 نانوغرام من الحمض النووي المستخلص.
        ملاحظة: يمكن إجراء ذلك على الحمض النووي الذي تم جمعه في يوم سابق وتجميده عند -20 درجة مئوية.
        1. في حالة الدراسات المتعلقة بعدوى T. cruzi ، استخدم الاشعال التالية: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA و AATTCCTCCAAGCAGCGGATA لتحديد مستويات الطفيليات كميا21 والاشعال التالية لتطبيعها لمستويات الحمض النووي المضيفة: TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA و CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 (انظر جدول المواد).
          ملاحظة: دورات qPCR الموصى بها هي كما يلي: إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أداء 40 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ثم 58 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، وأخيرا 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. قم بإجراء تحليل منحنى الانصهار حسب الاقتضاء لجهاز التدوير الحراري المتاح. معالجة البيانات باستخدام طريقة ΔΔCt23 للحصول على حمل طفيلي نسبي بين مواقع أخذ العينات. يمكن الحصول على القياس الكمي المطلق عن طريق مقارنة قيم ΔΔCt المشتقة من العينات بمنحنى قياسي ناتج عن كميات معروفة من الطفيليات ، ويرتفع إلى عينات أنسجة غير مصابة ، ويستخرج كما في الخطوات 2.2 إلى 2.2.4.1.
      3. إجراء توصيف قائم على البروتين للاستجابات المناعية باستخدام مجموعات السيتوكين متعددة الإرسال أو مجموعات ELISA التجارية القياسية (انظر جدول المواد) كما هو موضح في المرجع 13 على المتجانس المخزن.
    5. حفظ ما لا يقل عن نصف 500 ميكرولتر من حجم التجانس لاستخراج الأيض.
  3. إجراء استخراج الأيض المائي.
    ملاحظة: يمكن تكييف اختيار المذيبات بناء على الخصائص الكيميائية للمستقلبات ذات الاهتمام.
    1. أضف الميثانول LC-MS البارد المثلج مع 4 ميكرومتر من سلفاكلوربيريدازين إلى المتجانس لتحقيق تركيز نهائي من الميثانول بنسبة 50٪ مع 2 ميكرومتر من سلفاكلوربيريدازين في الماء.
      تحذير: الميثانول قابل للاشتعال وخطير. استخدم إجراءات السلامة المناسبة، بما في ذلك المناولة داخل غطاء الدخان أو خزانة السلامة الأحيائية.
    2. تجانس العينات في مجانس الأنسجة بسرعة 25 هرتز لمدة 3 دقائق. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 16000 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. جمع حجم متساو من supernatant في لوحة 96 بئر. حدد الحجم لمطابقة أصغر حجم من الميثانول + الماء مجتمعين عبر جميع العينات. هذا هو الكسر المائي.
      1. ضع جانبا أي مادة مائية متجانسة متبقية عند -80 درجة مئوية كنسخة احتياطية.
    4. احتفظ بالبقايا الصلبة على الجليد أثناء جمع المواد الفائقة.
    5. استخراج مائي جاف supernatant حتى يجف (~ 3 ساعات أو بين عشية وضحاها). استخدم السرعة القصوى وبدون تدفئة.
    6. قم بتجميد طبق 96 بئر المجفف عند -80 درجة مئوية.
  4. إجراء استخراج الأيض العضوي.
    ملاحظة: يمكن تكييف اختيار المذيبات بناء على الخصائص الكيميائية للمستقلبات ذات الاهتمام.
    1. أضف 1000 ميكرولتر لكل 50 ملغ من عينة ثنائي كلورو الميثان المبرد مسبقا: ارتفع الميثانول مع 2 ميكرومتر من سلفاكلوربيريدازين إلى البقايا الصلبة من الخطوة 2.3.4.
      تنبيه: استخدم إجراءات السلامة المناسبة عند التعامل مع المذيبات، بما في ذلك التعامل داخل غطاء الدخان بمعدل تدفق جيد.
    2. قم بتجانس العينات في مجانس الأنسجة بسرعة 25 هرتز لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي للعينات عند 16000 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. جمع حجم متساو من supernatant في لوحة 96 بئر. حدد الحجم لمطابقة أصغر حجم من ثنائي كلورو الميثانول: الميثانول ، عبر جميع العينات. هذا هو الجزء العضوي.
    4. تخزين الكريات في -80 درجة مئوية كنسخة احتياطية. قم بتخزين المستخلص العضوي المتبقي عند -80 درجة مئوية كنسخة احتياطية. جفف المستخلص العضوي في الهواء في غطاء الدخان طوال الليل.
    5. قم بتجميد طبق 96 بئر المجفف عند -80 درجة مئوية.

3. الحصول على بيانات LC-MS

  1. أعد تعليق المستخلصات المائية والعضوية إلى 60 ميكرولتر لكل منها 50٪ ميثانول + 2 ميكرومتر من سلفاديميثوكسين ، وامزجها. سونيكات لمدة 10 دقائق. ثم ، جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق ونقل supernatant إلى 96 بئر نظيفة. قم بالختم بختم لوحة خال من المنطقة ووضع اللوحة في جهاز أخذ العينات التلقائي LC.
    تنبيه: استخدم إجراءات السلامة المناسبة عند التعامل مع المذيبات، بما في ذلك التعامل داخل غطاء الدخان بمعدل تدفق جيد.
  2. قم بتوصيل المراحل المتنقلة المناسبة بنظام LC (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: بالنسبة إلى LC في الطور العكسي للوضع الإيجابي ، يوصي المؤلفون ب LC-MS-grade H2O + 0.1٪ من حمض الفورميك كمرحلة متنقلة A و LC-MS-class acetonitrile + 0.1٪ من حمض الفورميك كمرحلة متنقلة B بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة وتدرج LC لمدة 7.5 دقيقة. خطوات التدرج الموصى بها هي كما هو منشور في المرجع 6: 0-1 دقيقة ، 2٪ B ؛ 1-2.5 دقيقة ، زيادة خطية إلى 98 ٪ B ؛ 2.5-4.5 دقيقة ، عقد في 98 ٪ B ؛ 4.5-5.5 دقيقة ، انخفاض خطي إلى 2٪ B ؛ 5.5-7.5 دقيقة ، عقد في 2 ٪ B.
  3. تأكد من أن الأداة نظيفة. معايرة MS في كل من الوضع الإيجابي والسلبي.
  4. إجراء تقييم أداء MS حسب الاقتضاء للأداة.
  5. إنشاء تسلسل تشغيل MS.
    1. ابدأ بفراغين ، ومعيارين (6 خلطات) ، و 5 عناصر تحكم في الجودة المجمعة (QC) في سلسلة تخفيف ، تبدأ من 2 ميكرولتر من حجم الحقن وتزداد تدريجيا إلى حجم حقن 30 ميكرولتر.
    2. عشوائيا ترتيب العينة.
    3. بعد كل 12 عينة، قم بتشغيل فارغ، ثم مراقبة الجودة المجمعة.
  6. قم بتوصيل عمود C8 LC (حجم الجسيمات 1.7 ميكرومتر ، حجم المسام 100 Å ، طول 50 × 2.1 مم × القطر الداخلي) ومراقبة التسريبات والضغط الخلفي المفرط. إصلاح المشكلات وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للأداة.
  7. بدء تشغيل تسلسل تشغيل MS وجمع بيانات LC-MS/MS المعتمدة على البيانات.
    ملاحظة: بالنسبة لأداة Q-Exactive Plus MS ، استخدم التأين الكهربائي الساخن والحصول على MS2 المعتمد على البيانات (أعلى 5) في الوضع الإيجابي ، ودقة 70000 ل MS1 و 17500 ل MS2 ، وهدف AGC من 1E6 ل MS1 و 2E5 ل MS2 ، والحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات من 100 مللي ثانية لكل من MS1 و MS2 ، ونطاق المسح الضوئي إلى 100-1500 م / z ل MS1 ، ونافذة عزل MS2 من 1 م / ض. اضبط غاز الغمد على 35 ، وغاز aux على 10 وغاز الاجتياح على 0 ، وجهد الرش على 3.8 كيلو فولت ، ودرجة الحرارة الشعرية على 320 درجة مئوية ، ومستوى RF من S-lens على 50 ، ودرجة حرارة غاز aux على 350 درجة مئوية.
    1. التحقق من جودة البيانات: تحقق من الفراغات الأولية (تأكد من عدم وجود قمم رئيسية) ، والمعايير (تأكيد وجود قمم متوقعة وشكل ذروة متماثل) ، ومراقبة الجودة (تأكيد وجود قمم متوقعة ، وشكل الذروة ، وكثافة الذروة المتوقعة).
    2. مراقبة دورية MS تشغيل أثناء تسلسل التشغيل.
  8. بمجرد الانتهاء من التشغيل ، تحقق من البيانات بحثا عن أي حقن مفقودة أو أخطاء أخرى.
  9. قم بتخزين عمود خطاب الاعتماد على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. قم بإزالة العينات وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  10. تحميل البيانات الخام إلى مستودع البيانات.
    ملاحظة: يوصى باستخدام MassIVE (massive.ucsd.edu) لتمكين الارتباط النهائي بالشبكات الجزيئية للتعليقات التوضيحية للمستقلب24,25.

4. معالجة بيانات LC-MS

  1. تحويل الملفات الخام إلى تنسيق مفتوح (.mzXML أو .mzML) باستخدام MSConvert26.
    1. قم بتحميل البيانات الخام وبيانات mzXML أو mzML إلى مستودع البيانات.
  2. إنشاء جدول ميزات. هناك العديد من الأدوات للقيام بذلك (MZmine ، MS-DIAL ، openMS ، XCMS ، إلخ.27،28،29،30).
    ملاحظة: يوصى باستخدام MZmine لأنه مجاني ومفتوح المصدر ويمكنه استيراد ملفات mzXML مباشرة بعد MSconvert، ولديه خيارات واجهة مستخدم رسومية لمعالجة البيانات ومراقبة تأثير اختيار المعلمات، ويمكنه التصدير مباشرة إلى GNPS للشبكات الجزيئية24.
    ملاحظة: اتبع وثائق الأداة واستخدم المعلمات المناسبة للأداة المتاحة. يمكن أيضا العثور على تفاصيل إضافية في Reference31.
    1. تصدير جدول المعالم بتنسيق .csv.

5.3D توليد نموذج

  1. ارسم يدويا نموذج 3D de novo للقياس وفقا للخطوات المذكورة أدناه.
    1. التقط صورة للجهاز محل الاهتمام.
    2. قم بتنفيذ ما يلي في برنامج SketchUp (انظر جدول المواد) كما هو مذكور أدناه.
      1. احذف الصورة الافتراضية لرجل تظهر عند فتح البرنامج.
      2. انقر فوق ملف > استيراد لاستيراد صورة للأجهزة محل الاهتمام.
      3. انقر على أداة الخطوط وحدد خيار Freehand . استخدم أداة القلم الرصاص لتتبع ورسم الخطوط العريضة للأجهزة ذات الاهتمام. تأكد من إغلاق الخط عن طريق الرسم على طول الطريق إلى نقطة البداية. بمجرد إغلاق الخط بنجاح ، ستظهر المنطقة المرسومة مظللة تلقائيا.
      4. حدد أداة الدفع/السحب واسحب المنطقة المظللة لتحويل الرسم من 2D إلى 3D.
      5. حذف صورة الجهاز: حدد زر الممحاة ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة وحدد مسح.
      6. تصدير الملف بتنسيق .dae: > الملفات تصدير > 3D.
    3. تحسين واقعية النموذج وفقا للخطوات المذكورة أدناه.
      1. استيراد النموذج إلى برنامج MeshLab (انظر جدول المواد): افتح MeshLab وحدد شبكة استيراد > الملفات. حدد نموذج .dae الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. ستظهر قائمة خيارات ما قبل الفتح . حدد موافق.
      2. حدد Wireframe في القائمة العلوية. ثم حدد: المرشحات > الربط والتبسيط وإعادة الإعمار > أسطح التقسيم الفرعي: نقطة الوسط. اترك جميع القيم افتراضية وحدد تطبيق مرتين. افحص بصريا عرض الإطار السلكي للنموذج للتأكد من أنه شبكي بدقة. أغلق القائمة المنبثقة.
      3. تصدير النموذج بتنسيق .stl: ملف > تصدير شبكة باسم، ثم حدد تنسيق ملف STL (*.stl) في القائمة المنسدلة ملفات من نوع . انقر على حفظ. حدد موافق في القائمة المنبثقة التالية.
      4. افتح برنامج Meshmixer (انظر جدول المواد). انقر فوق الزر استيراد (+). حدد ملف .stl الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. استخدم فرش > النحت > فرش السحب والنحت > > أدوات التضخيم لسحب أسطح النموذج التي تحتاج إلى تقريبها.
      5. بمجرد أن يكون للنموذج المظهر المطلوب ، احفظه بتنسيق . stl: ملف > تصدير. قم بتسمية الملف حسب الرغبة وحدد تنسيق STL الثنائي (*.stl) في القائمة المنسدلة حفظ بنوع. انقر على حفظ. إذا ظهرت قائمة منبثقة ، فانقر فوق متابعة.

6. إيلي بلوت جيل

  1. الحصول على إحداثيات للمواقع في نموذج 3D التي تتوافق مع مواقع أخذ العينات.
    1. افتح النموذج ثلاثي الأبعاد من الخطوة 5.1.3.5 في برنامج MeshLab : شبكة استيراد > الملفات. حدد النموذج الذي تم إنشاؤه في الخطوة 5.1.3.5. انقر فوق موافق في النافذة المنبثقة معالجة ما بعد الفتح .
    2. للحصول على إحداثيات x و y و z لكل بقعة أخذ عينات: حدد أداة PickPoints ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على فترات متباعدة بانتظام عبر سطح نموذج 3D. بمجرد تحديد جميع الإحداثيات المطلوبة ، انقر فوق الزر "حفظ " العلوي في النافذة المنبثقة " النموذج".
      ملاحظة: سيؤدي هذا إلى تصدير الإحداثيات بتنسيق ملف .pp. يمكن فتح هذا الملف في برنامج جداول البيانات.
    3. في برنامج جداول البيانات: افتح ملف .pp الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.1.2. اضبط عرض البيانات باستخدام > البيانات النص إلى أعمدة > محدد. انقر فوق التالي ، ثم حدد المسافة ، وانقر فوق إنهاء.
    4. أعد التنسيق بحيث تبقى القيم الرقمية فقط في خلايا جدول البيانات عن طريق تحديد الصفحة الرئيسية > البحث عن > استبدال. في المربع البحث عن ماذا، أدخل: y=". اترك المربع استبدال بفارغ. انقر فوق استبدال الكل ، ثم فوق موافق. كرر ل x = " و z = " و " />. القيم جاهزة الآن للخطوة 6.2.
  2. اصنع جدول ميزات 'ili. تم اقتباس هذه الطريقة من المرجع 16.
    1. في برنامج جدول بيانات، أنشئ جدول الميزات. تتوافق الصفوف مع كل موضع والأعمدة مع البيانات.
      ملاحظة: يجب أن تكون الأعمدة الأولى هي اسم الموضع (اسم العينة)، متبوعا بإحداثيات x وy وz لنقاط أخذ العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.1.2 (مع رؤوس الأعمدة x وy وz). يجب أن يكون عنوان العمود الخامس "نصف قطرها".
    2. الصق البيانات الوصفية المناسبة ووفرة ميزة الأيض في أعمدة جدول البيانات اللاحقة.
    3. في العمود "نصف القطر" ، أدخل الحجم المطلوب لبقع أخذ العينات المراد تصورها على النموذج. تحديد قيم نصف القطر تجريبيا: أدخل 1 كافتراضي، ثم قم بتقييم ما إذا كان نصف القطر أو الإحداثيات بحاجة إلى ضبط في الخطوة 6.3. احفظ الملف بتنسيق .csv (ملف > حفظ باسم)، ثم حدد CSV (محدد بفواصل) (*.csv) في القائمة المنسدلة. قم بتسمية الملف حسب الرغبة. انقر على حفظ.
  3. افتح البيانات في 'ili (برنامج تم تطويره بواسطة 16).
    1. افتح موقع 'ili (ili.embl.de). حدد Surface. اسحب وأسقط نموذج 3D الذي تم إنشاؤه في نافذة المتصفح. اسحب جدول الميزات الذي تم إنشاؤه وأفلته في نافذة المتصفح نفسها.
    2. استخدم وسيلة الإيضاح في الزاوية السفلية اليسرى لعرض عمود البيانات المطلوب على نموذج 3D. تأكد من تطابق البقع ونصف القطر المحددين في الخطوة 6.2.1 مع مواقع أخذ العينات. إذا لزم الأمر، اضبط القيم في جدول المعالم، أو اختر إحداثيات إضافية في MeshLab (راجع الخطوة 6.1.2).
      ملاحظة: يمكن أيضا تحسين المرئيات عن طريق تحديد البقع > عتامة الحدود وتعيين شريط التمرير إلى قيمته القصوى.
    3. حدد على التوالي كل عمود بيانات لتقييم توزيع ميزة المستقلب هذه على نموذج 3D.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذا النهج لتصور ميزات مستقلب محددة فقط ذات أهمية ، على سبيل المثال ، تلك التي تحتوي على p < 0.05 أو تغيير معين في الطية بين العينات المصابة وغير المصابة ، كما هو محدد في أدوات التحليل الإحصائي الخارجية. يمكن أيضا اختيار ميزات التصور خارج 'ili من خلال مناهج التعلم الآلي مثل الغابة العشوائية.
  4. قم بإجراء تصور خطي / سجل للبيانات وفقا للخطوات المذكورة أدناه.
    1. باستخدام علامة التبويب تعيين في أعلى يسار الصفحة، حدد خطي أو لوغاريتمي في القائمة المنسدلة مقياس .
    2. قم بتعيين نفس المقياس لجميع المؤامرات في حالة تصور ميزات متعددة.
      ملاحظة: يختار موقع الويب تلقائيا الحد الأدنى والحد الأقصى لكل عمود بيانات لعرضه.
    3. لضبط المقياس يدويا، قم بإلغاء تحديد خيار الحد الأدنى/الأقصى التلقائي وأدخل القياس المطلوب. سيتم الآن عرض جميع البيانات ضمن نفس المقياس.
  5. تغيير مقياس لون البيانات (تدرج رمادي ، أزرق-أبيض-أحمر ، إلخ).
    1. قم بتغيير مقياس اللون إلى نظام الألوان المطلوب في قائمة التعيين باستخدام القائمة المنسدلة خريطة اللون . تأكد من أن نظام الألوان المحدد مناسب لعمى الألوان.
  6. لتغيير لون نموذج 3D أو لون الخلفية، استخدم خيارات اللون والخلفية ضمن القائمة ثلاثية الأبعاد.
  7. إخفاء محاور 3D عن طريق إلغاء تحديد المربع إظهار الأصل ضمن القائمة 3D.
  8. احفظ الصورة عن طريق لقطة الشاشة أو باستخدام أداة القص أو مفتاح الاختصار Crtl + S لنظام التشغيل Windows أو Linux و figure-protocol-1+ S على OS X.

النتائج

يعتمد عدد ميزات الأيض التي تم الحصول عليها على نوع الأنسجة التي تم تحليلها ومعلمات معالجة البيانات. على سبيل المثال ، تم استخدام هذا البروتوكول لتحليل التأثير المكاني لعدوى T. cruzi على أيض الجهاز الهضمي في نموذج فأر لعدوى T. cruzi. في العمل السابق ، تم حقن الذكور C3H / HeJ داخل الصفاق مع 1000 CL + luc T. cruzi parasites32,6. تم قتل الحيوانات الرحيم بعد 12 أو 89 يوما من الإصابة ، وتم إجراء تحليل رسم الخرائط الكيميائي ل 13 جزءا متجاورا من الجهاز الهضمي كما هو موضح في هذا البروتوكول. أدى هذا التحليل إلى جدول ميزات من 5,502 ميزة، والتي تم تصورها بعد ذلك في 3D باستخدام الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول. يتيح هذا النهج تصور ميزات الأيض في الحيوانات الفردية التي تكون عالية في موقع الحمل الطفيلي العالي (كينورينين ، الشكل 2B مقابل حمل الطفيلي ، الشكل 2A) ، من المستقلبات ذات التوزيع التفاضلي عبر مناطق الأنسجة (الجلوتامين ، الشكل 2C) وميزات المستقلب التي توجد عند مستويات مماثلة عبر الأمعاء الدقيقة والغليظة (LPE 16: 0 الشكل 2D) ). تم اختيار Kynurenine للتصور بسبب علاقته المعروفة بالالتهاب والمنشورات السابقة حول قدرة المستقلبات المشتقة من kynurenine على تنظيم T. cruzi load33. وكانت نماذج التعلم الآلي العشوائية القائمة على الغابات قد كشفت في السابق عن وجود ارتباط بين مستويات كينورينين وحالة العدوى6. تم اختيار الجلوتامين للتصور استنادا إلى منشورات سابقة توضح وجود علاقة بين توافر الجلوتامين في المختبر وحساسية T. cruzi للعقاقير34. تم تأكيد التوزيع التفاضلي باستخدام الانحدار اللوجستي ، p < 0.05. تم اختيار LPE 16: 0 بعد الفحص البصري للبيانات لاكتشاف ميزات المستقلب الموجودة على مستويات مماثلة عبر مواقع الأنسجة.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. تم إنشاء الرسم التوضيحي باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل الخرائط الكيميائية. تم حقن ذكور الفئران C3H / HeJ داخل الصفاق مع طفيليات 1000 CL + luc T. cruzi 32. تم قتل الحيوانات الرحيم بعد 12 أو 89 يوما من الإصابة ، وتم جمع الجهاز الهضمي وتقسيمه بشكل منهجي (الخطوة 1)6. تم استخراج المستقلبات كما في الخطوة 2 وتحليلها بواسطة LC-MS / MS .3D تم إجراء إنشاء نموذج باستخدام برنامج SketchUp (الخطوة 5) ، وتم رسم البيانات في 3D كما في الخطوة 6. (أ) توزيع الطفيليات في فأر معين، بعد 12 يوما من الإصابة. (ب) توزيع مستقلب كينونرينين في نفس الماوس، بعد 12 يوما من الإصابة. (ج) متوسط توزيع الجلوتامين عبر الفئران المصابة، بعد 89 يوما من الإصابة. (د) مستويات قابلة للمقارنة من m/z 454.292 وقت الاحتفاظ 2.929 دقيقة، مشروحة على أنها 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (LPE 16:0)، في نفس الفأر كما هو الحال في A و B في الأمعاء الدقيقة والقولون. تم إنشاء عينات وبيانات في6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يعد فهم عدوى المثقبيات الجسدية أمرا ضروريا لتوجيه تطوير الأدوية الجديدة وأساليب العلاج. وهذه الطريقة الكيميائية لرسم الخرائط مهيأة بشكل فريد لتوفير رؤى قابلة للتنفيذ حول العلاقة بين التمثيل الغذائي ومرض المثقبيات السوماتيد، وبالتالي تلبية هذه الحاجة الانتقالية.

يوصى فقط بمذيبات LC-MS أثناء استخراج الأيض وتحليلات MS ، لتقليل تلوث الخلفية. يجب تجنب التلوث البوليمري35 ، المشتق عادة من فيلم البارافين و / أو البلاستيك الآخر 36،37،38 ، حيثما أمكن ذلك. يجب ألا يتم استخدام Parafilm ، على وجه الخصوص ، أبدا. هذه الجوانب حاسمة لأن جودة بيانات LC-MS تعتمد على المواد المستخدمة أثناء إعداد العينات واستخراج الأيض. يجب ضمان جودة البيانات قبل إنشاء مخططات 'ili. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب إنشاء خرائط الأيض المكانية الشاملة هذه جمع جميع عينات الأنسجة المجاورة واستخراج الأيض من جميع العينات التي تم جمعها لتجنب الفجوات في هذه الخرائط. وبالتالي ينبغي النظر في إجراءات الجمع والخدمات اللوجستية لاستخراج الأيض وتحليل LC-MS والتكاليف والتخطيط لها وفقا لذلك.

يمكن تعديل هذا البروتوكول لتلبية احتياجات المستخدم بطرق متعددة. على سبيل المثال، ستؤثر قطبية وقابلية ذوبان المذيبات المستخدمة أثناء استخراج الأيض على المستقلبات المكتشفة39. ولزيادة تنوع خصائص المستقلب المكتشفة لتحليلات رسم الخرائط الكيميائية غير المستهدفة، يوصى بالجمع بين خطوات استخراج متعددة ومذيبات. على سبيل المثال ، تستخدم هذه الطريقة ثنائي كلورو الميثان والميثانول والماء كمذيبات استخراج لأنها تمكن من الكشف الدقيق عن الجزيئات غير القطبية والقطبية20,40. ومع ذلك ، فإن هذه المذيبات ليست مناسبة عالميا لكل تجربة MS ، ويجب على الباحثين اختيار مذيبات الاستخراج بناء على أهداف مشروعهم. وبالمثل ، يمكن استخدام ظروف LC-MS / MS المختلفة ، مثل استبدال كروماتوغرافيا الطور المعكوس بكروماتوغرافيا الطور العادي. يمكن أيضا استخدام أعمدة بديلة لجمع بيانات الطور المعكوس بدلا من كروماتوغرافيا C8 ، على الرغم من أن كروماتوغرافيا C8 تجريبيا أكثر قوة لدهون الأنسجة ولها تردد انسداد أقل. من الناحية المفاهيمية ، يمكن أيضا تطبيق هذه البروتوكولات على طرق قياس الطيف الكتلي الأخرى مثل كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة ، إلخ.

وهناك نهج بديل هو التصوير الطيفي الكتلي. والواقع أنه خلافا لنهج التصوير الطيفي الكتلي، فإن قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل لا يحافظ بطبيعته على المعلومات المكانية10. وتعمل نهج رسم الخرائط الكيميائية على سد هذه الفجوة عن طريق إدراج موقع أخذ العينات في وقت وضع تصور للمشروع، وفي البيانات الوصفية للعينة، وفي خطوات معالجة البيانات. وتتمثل إحدى نقاط قوة نهج رسم الخرائط الكيميائية هذا، على عكس التصوير الطيفي الكتلي، في القدرة على تقديم تعليقات توضيحية واثقة (مبادرة معايير الأيض من المستوى 1 أو المستوى 2 من الثقة في التعليقات التوضيحية41)، على عكس التصوير الطيفي الكتلي حيث يعتمد الجزء الأكبر من التطبيقات على الكتلة الدقيقة فقط للتعليق التوضيحي. سيمكن التصوير الطيفي الكتلي من رسم الخرائط المكانية الدقيقة الحبيبات ، وأحيانا وصولا إلى مستوى الخلية الواحدة ، على سبيل المثال ، 42،43. وعلى النقيض من ذلك، تتيح نهج رسم الخرائط الكيميائية رسم خرائط واسعة النطاق عبر الأعضاء لتوزيع المستقلب دون الحاجة إلى مهارات عالية التخصص في الاستئصال بالتبريد للحيوانات بأكملها. يوفر رسم الخرائط الكيميائية أدلة تكميلية للعديد من مناهج النسخ المكاني التي يجري تطويرها، على سبيل المثال، 44، مع ميزة التركيز على "طبقة omics الأقرب إلى النمط الظاهري"45. وتشمل الطرق البديلة لتحديد كمية حمل الطفيليات قياس التلألؤ الأحيائي في وقت جمع العينات6. ويمكن أيضا جمع الأجزاء الدقيقة لتمكين المجهر البؤري أو الإلكتروني من تقييم عبء الطفيليات الموضعية وتلف الأنسجة. ويمكن أيضا استخدام تجانس الماء، الذي يستخدم لقياس كمية السيتوكين في هذا البروتوكول والمنشورات السابقة13، لتحديد العلامات القائمة على البروتين لتلف الأنسجة.

هناك أيضا طرق متعددة للحصول على نماذج 3D مناسبة لرسم بيانات LC-MS الناتجة. بالإضافة إلى الطريقة المقترحة هنا ، يمكن شراء النماذج مسبقة الصنع من مختلف البائعين عبر الإنترنت. التأكد من تطابق شروط الاستخدام مع الاستخدام المقصود، خاصة فيما يتعلق بالنشر. يمكن إنشاء نماذج للأعضاء الكبيرة de novo باستخدام الماسحات الضوئية 3D وفقا لتعليمات الماسح الضوئي. توجد بدائل مثل MATLAB لتوليد وتصور نماذج ثلاثية الأبعاد لرسم الخرائط الكيميائية46 ، ولكن تم تنفيذها في المقام الأول قبل تطوير 'ili16. MATLAB هي مجموعة أدوات تحليل البيانات والبرمجة التي تقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في العديد من المجالات. ومع ذلك ، فإن MATLAB ليس مجانيا ولا مفتوح المصدر ، ويتطلب الإلمام بواجهات MATLAB ، خاصة بالنظر إلى أن MATLAB لم يتم تطويره لمعالجة بيانات قياس الطيف الكتلي. بدائل هذه الطريقة المقترحة ، وهي SketchUp و Meshlab و 'ili ، يمكن الوصول إليها بحرية وسهلة الاستخدام وتقدم وظائف مماثلة ل MATLAB لأغراض رسم الخرائط الكيميائية.

هذه الطريقة قوية فيما يتعلق بإعداد العينات واستخراج الأيض. غالبا ما يكون استكشاف الأخطاء وإصلاحها ضروريا في خطوة الحصول على بيانات LC-MS. هذا خارج نطاق هذه المقالة. يتم توجيه القراء إلى منشورات ممتازة حول استكشاف أخطاء الحصول على بيانات LC-MS وإصلاحها ، بما في ذلك 20,47. وبالمثل ، فإن تعقيدات التعليق التوضيحي للمستقلب تتجاوز نطاق تركيز هذه الطريقة على توليد نموذج 3D. تشمل المراجع المفيدة حول هذا الموضوع 24,25,48,49.

في حين أن هذه الطريقة تستكشف بشكل فعال التسبب في المرض ، إلا أن هناك قيودا على هذا النهج ، بعضها شائع في أي تجربة استقلاب. ويتمثل أحد هذه القيود في انخفاض معدل التعليقات التوضيحية لميزات LC-MS50، التي تتوقف على توافر المكتبات الطيفية المرجعية وجودتها. وهناك قيد آخر هو أن هذا البروتوكول لا يحافظ على الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب عدم توافق كواشف الحفاظ على الحمض النووي الريبي مثل الحمض النووي الريبي في وقت لاحق مع تحليل LC-MS/MS. ومع ذلك ، فإن جودة البروتين كافية للتحليلات النهائية وبالتالي يمكن أن تحل محل التحليلات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال.

يعكس نهج رسم الخرائط الكيميائية لمسببات العدوى بشكل مباشر كيفية تطور العدوى البكتيرية أو الفيروسية أو الطفيلية في أنظمة الأعضاء وتسبب المرض الموضعي. تحليل هذه العينات الفرعية الإقليمية وتوليد نماذج 3D ينقل في نهاية المطاف كيف تعمل المستقلبات عبر الفضاء ثلاثي الأبعاد ، مما يلقي الضوء على هذه الأبعاد المكانية غير المعترف بها سابقا للبيولوجيا الجزيئية. باستخدام هذا البروتوكول ، على سبيل المثال ، تمت مقارنة توطين الأيض بحمل طفيلي Trypanosoma cruzi. أوضحت النتائج العلاقة بين العامل الممرض والأنسجة المضيفة وأظهرت أيضا ديناميكيات التمثيل الغذائي لتطور أعراض مرض شاغاس6. كما تم تطبيق أساليب رسم الخرائط الكيميائية على مواضيع مختلفة، مثل التفاعل البيئي الذي بناه الإنسان51،52،53، والتركيب الكيميائي لأنظمة الأعضاء مثل جلد الإنسان46 والرئتين54، واستقلاب النبات والتفاعلات البيئية55. يمكن أن تتضمن التطبيقات المستقبلية تقييم تحمل الأمراض المحلية ومرونتها ، أو العلاقة بين مستويات الأيض المحلية ، ومدار مسببات الأمراض ، ومدار المرض في نماذج تتجاوز عدوى المثقبيات الدقيقة. يجب أن يكون لهذا النهج أيضا قابلية تطبيق واسعة لتوسيع بروتوكولات الحرائك الدوائية الحالية ، لتقييم العلاقة بين مستويات أدوية الأنسجة المحلية واستقلاب الدواء مقابل السياق الأيضي العام ، وتلف الأنسجة ، وإزالة مسببات الأمراض. بشكل عام ، يسمح رسم الخرائط الكيميائية باستكشافات فريدة لتوزيعات الأيض في أنواع مختلفة من العينات ، مع تطبيقات تشمل التسبب في الأمراض ، وصحة الإنسان ، والتفاعلات بين الإنسان والبيئة ، والديناميات الميكروبية.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

شكر وتقدير

لورا إيزوبيل ماكول ، دكتوراه ، حاصلة على جائزة المحققين في التسبب في الأمراض المعدية من صندوق بوروز ويلكوم. كما يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من رقم جائزة المعاهد الوطنية للصحة R21AI148886 ، وهي منحة تجريبية من مركز أوكلاهوما للأمراض التنفسية والمعدية (OCRID) تحت رقم جائزة المعاهد الوطنية للصحة P20GM103648 ، وصناديق بدء التشغيل من جامعة أوكلاهوما (إلى LIM). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للممولين. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا مطوري الأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. وقد تم الاستشهاد بجميع المنشورات ذات الصلة، حيثما ينطبق ذلك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب EppendorfNANA أي علامة تجارية ، كما هو متاح
زجاجة 1 لتر ، بيركسNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
1 لتر أسطوانة متدرجة ، بيركسNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
2 مل أنابيب SafeLock EppendorfVWR20901-540تستخدم نموذج الأنبوب المناسب لمخالط
الأنسجة المتاحنموذج ثلاثي الأبعاد (تم إنشاؤه وفقا لخطوات البروتوكول ، أو تم شراؤه)NANA حسب الاقتضاء للنظام قيد التحقيق
حبة 5 مم من الفولاذ المقاومQiagen69989
96 لوحة بئرفيشر3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA التمهيديNANAأي علامة تجارية، حسب المتاحة؛ نشر في بيرون ، م. وآخرون. تطوير اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للكشف عن Trypanosoma cruzi < / i> في عينات الدم. أكتا تروبيكا. 103 (3) ، 195 & - ndash ؛ 200 (2007).
التوازن التحليليNANA أي علامة تجارية, كما هو متاح
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA التمهيديNANAأي علامة تجارية, كما هو متاح; نشرت في Piron, M. et al. تطوير اختبار PCR في الوقت الحقيقي للكشف عن Trypanosoma cruzi < / i> في عينات الدم. أكتا تروبيكا. 103 (3) ، 195 & - ndash ؛ 200 (2007).
جهاز طرد مركزي منضدة مع جهاز طرد مركزي دقيق ، أنبوب صقر وسعة 96 بئرNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
خزانة السلامة الحيويةNANAالفئة الثانية ، النوع A2 ؛ أي علامة تجارية ، كما هو متاح
CAGCAAGCATCTATGACTTAG
ACCCC التمهيدي		NANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح ؛ نشرت في Cummings، K.L.، Tarleton، R.L. التقدير الكمي السريع ل Trypanosoma cruzi < / i> في الأنسجة المضيفة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. علم الطفيليات الجزيئي والكيميائي الحيوي. 129 (1) ، 53 & - - 59 (2003).
الكاميراNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح. كاميرا الهاتف المحمول كافية لهذا البروتوكول
نظام التصوير القادر على الأشعة الكيميائيةNAأي نظام ، كما هو متاح
كراتقطنية NANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
cryoglovesVWR97008-208استبدال بأي علامة تجارية ، كما هو متاح
مقص تشريحNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
الجليد الجافNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
ملقط إضافي الطولNANA أي علامة تجارية ، كما هو متاح
ثلاجة قابلة للاشتعالNANAأي علامة تجارية ، كما
صناديق تخزين الفريزر لأنابيب الطرد المركزيالدقيقة NANA أي علامة تجارية ، كما هو متاح
غطاء الدخانNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
كتلة عالية الدقة مطيافNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح ، مثل ThermoFisher Q-Exactive Plus (رقم الكتالوج 0726030)
دلو الثلجNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
برنامج iliili.embl.deNA
isofluraneCovetrus29405
كبير tupperwareNANA أي علامة تجارية ، كما هو متاح ؛ كبيرة بما يكفي لاحتواء بشكل مريح الماوس ، كرة القطن
LC-MS الصف أسيتونيتريلفيشر أوبتيماA955-4
LC-MS الصف ثنائي كولوروميثانفيشر أوبتيماD151-4
LC-MS درجة حمض الفورميكفيشر أوبتيماA11750
LC-MS الصف الميثانولفيشر أوبتيماA456-4
LC-MS درجة المياهفيشر أوبتيماW64
عمود الكروماتوغرافيا السائلةPhenomenex00B-4499-ANيمكن تغييرها إلى ماركات ونماذج أخرى حسب الاقتضاء للمستقلبات ذات الأهمية
خرطوشة حارس عمود الكروماتوغرافيا السائلةPhenomenexAJ0-8784يمكن تغييرها إلى ماركات ونماذج أخرى حسب الاقتضاء للنواتج الأيضية ذات الأهمية
خرطوشة عمود حارس عمود الكروماتوغرافياالسائلة PhenomenexAJ0-9000يمكن تغييرها إلى ماركات ونماذج أخرى حسب الاقتضاء للمستقلبات ذات الأهمية
النيتروجين السائلNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
لوسيفيرينGoldbioLUCK-1G
برنامج MeshLabhttps://www.meshlab.net/برنامج NA
Meshmixerhttps://www.meshmixer.com/NA
MS calibrantNANAواحد مناسب للأداة المتاحة
MS برامج معالجة البياناتNANAخيارات متعددة المتاحة ؛ يوصي المؤلفون ببرنامج MZmine
MSConverthttp://proteowizard.sourceforge.net/NA
NanodropThermoFisherND-ONE-Wنماذج nanodrop الأخرى مناسبة أيضا
ماصة p1000NANAاستخدم العلامة التجارية المناسبة لتناسب الماصات المتوفرة
P1000 الماصةNANA أي علامة تجارية، كما هو متاح
أطراف ماصات p20تستخدم NANA العلامة التجارية المناسبة لتناسب الماصات المتوفرة
الماصات p20NANA أي علامة تجارية، كما هو متاح
أطراف ماصات p200NAتستخدم العلامة التجارية المناسبة لتناسب الماصات المتوفرة
p200 ماصةNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
معدات الحماية الشخصية (قفازات ، معطف مختبر ، نظارات / نظارات واقية ؛ درع وجه)NANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
Q-Plex Mouse Cytokine - شاشة (16-Plex) يمكناستبدال Quansys biosciences110949MSبمقايسات السيتوكين الأخرى القائمة على البروتين مثل مجموعات السيتوكين التجارية الأخرى
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 إعدادية)ZymoD4069بأي علامة تجارية من مجموعة استخراج الحمض النووي للثدييات ، كما هو متاح
في الوقت الحقيقي thermocyclerNANAأي علامة تجارية ، كما يتوفر
شاكر الملح أو مصفاة الشايNANAأي علامة تجارية ؛ لاحتواء كرة قطنية مبللة بالأيزوفلوران ومنع ملامسة جلد الفأر
برنامج SketchUphttps://www.sketchup.com/
ملقطNANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح
speedvac مع أنبوب الطرد المركزي الدقيق وسعة 96 لوحةبئر NANA أي علامة تجارية ، كما يمكن
استبدال برامج جداول البياناتالمتاحة https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excelNAببرامج إدارة جداول البيانات الأخرى ، كما هو مطبق
سلفاكلوروبيريدازينسيجماS9882-100G
سلفاديميثوكسينسيجماS7007-10G
Sybr مزيج تفاعل qPCR الأخضريمكن أن يستبدل فيشرA25780بمزيج تفاعل qPCR الأخضر Sybr الآخر ، حسب الرغبة
TCCCCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA التمهيدي		NANAأي علامة تجارية ، كما هو متاح ؛ نشرت في Cummings، K.L.، Tarleton، R.L. التقدير الكمي السريع ل المثقبية الكروزية < / i> في الأنسجة المضيفة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. علم الطفيليات الجزيئي والكيميائي الحيوي. 129 (1) ، 53 & - - 59 (2003).
خالط الأنسجةNANAأي علامة تجارية ، حسب التوفر ؛ على سبيل المثال ، Qiagen TissueLyser II ، رقم الكتالوج 85300 ، مع مجموعة محول TissueLyser (2 × 24) ، رقم الكتالوج 69982
عينات الأنسجةNANAمن نموذج العدوى المناسب
موزع حبة واحدة TissueLyserQiagen69965
UHPLCNANAأي علامة تجارية, كما هو متاح, مثل ThermoFisher Vanquish (رقم كتالوج IQLAAAGABHFAPUMBHV)
الفريزر درجة حرارة منخفضة للغاية (-80)NANAأي علامة تجارية, كما هو متاح
حمام بالموجات فوق الصوتيةNANA أي نظام, كما هو متاح
الجليد الرطبNANAأي علامة تجارية, كما هو متاح
منطقة خالية من فيلمالختم VWR& nbsp; 490007-390
للصدأ تتوفر حامل نصائح استبدال عينة NA

المراجع

  1. McCall, L. -I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
  2. McCall, L. -I., Zhang, W. -W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053(2013).
  3. de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079(2021).
  4. Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
  5. Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
  6. Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
  7. Parab, A. R., McCall, L. -I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
  8. Lewis, C. M., McCall, L. -I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
  9. Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
  10. Newsom, S. N., McCall, L. -I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926(2018).
  11. Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, Database issue 521-526 (2007).
  12. Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819(2021).
  13. McCall, L. -I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
  14. Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
  15. Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593(2021).
  16. Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
  17. McCall, L. -I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588(2015).
  18. Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
  19. Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
  20. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
  21. Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
  22. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  25. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  26. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  27. Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
  28. Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163(2008).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395(2010).
  30. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  31. FBMN with MZmine. , Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021).
  32. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  33. Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550(2011).
  34. Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
  35. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  36. Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
  37. Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
  38. Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
  39. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  40. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  41. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  42. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  43. Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
  44. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  45. Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
  46. Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
  47. Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
  48. Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
  49. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  50. Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
  51. Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669(2018).
  52. Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
  53. McCall, L. -I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289(2019).
  54. Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
  55. Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429(2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

توزيع المستقلباتالانتحاء النسيجيالكروماتوغرافيا السائلةمطيافية الكتلةالتصوير ثلاثي الأبعادأخذ عينات الأنسجةاستخلاص المستقلباتإمراض المرض
مناهج رسم الخرائط الكيميائية لدراسة عدوى المثقبيات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.