مقالة منهجية

تقنية تجزئة الأنابيب الدقيقة الكمية لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة والأنابيب الدقيقة المرنة والتوبولين الحر في أنسجة الفئران

3.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63358

⸱

نوفمبر 17, 2023

 , 
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

في هذه المقالة

ملخص

تلعب الأنابيب الدقيقة ، وهي بوليمرات توبولين ، دورا مهما كمكون للهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة ومعروفة بعدم استقرارها الديناميكي. طورت هذه الدراسة طريقة لتجزئة الأنابيب الدقيقة لفصلها إلى أنابيب دقيقة مستقرة ، وأنابيب دقيقة قابلة للتعديل ، وتوبولين حر لتقييم استقرار الأنابيب الدقيقة في أنسجة الفئران المختلفة.

الملخص

الأنابيب الدقيقة ، المكونة من دايمرات α / β-توبولين ، هي عنصر حاسم في الهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. تظهر هذه البوليمرات الشبيهة بالأنبوب عدم استقرار ديناميكي حيث تخضع الوحدات الفرعية غير المتجانسة للتوبولين للبلمرة المتكررة وإزالة البلمرة. يعد التحكم الدقيق في استقرار وديناميكيات الأنابيب الدقيقة ، والذي يتحقق من خلال تعديلات توبولين بعد الترجمة والبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة ، أمرا ضروريا لمختلف الوظائف الخلوية. الاختلالات في الأنابيب الدقيقة متورطة بقوة في التسبب في المرض ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية. تركز الأبحاث الجارية على العوامل العلاجية التي تستهدف الأنابيب الدقيقة التي تعدل الاستقرار ، مما يوفر خيارات علاجية محتملة لهذه الأمراض والسرطانات. وبالتالي ، فإن فهم الحالة الديناميكية للأنابيب الدقيقة أمر بالغ الأهمية لتقييم تطور المرض والآثار العلاجية.

تقليديا ، تم تقييم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في المختبر أو في الخلايا المستزرعة من خلال التجزئة الخشنة أو المقايسة المناعية ، باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف تعديلات ما بعد الترجمة من توبولين. ومع ذلك ، فإن التحليل الدقيق لحالة التوبولين في الأنسجة باستخدام مثل هذه الإجراءات يشكل تحديات. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة تجزئة الأنابيب الدقيقة البسيطة والمبتكرة لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة ، والأنابيب الدقيقة المرنة ، والتوبولين الحر في أنسجة الفئران.

تضمن الإجراء تجانس أنسجة الفئران المشرحة في مخزن مؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة بنسبة حجم 19: 1. ثم تم تجزئة التجانسات من خلال عملية طرد مركزي فائقة من خطوتين بعد الطرد المركزي البطيء الأولي (2400 × جم) لإزالة الحطام. أدت خطوة الطرد المركزي الفائق الأولى (100000 × جم) إلى ترسب الأنابيب الدقيقة المستقرة ، بينما تعرض العنصر الطافي الناتج لخطوة الطرد المركزي الفائقة الثانية (500000 × جم) لتجزئة الأنابيب الدقيقة القابلة للذوبان وثنائيات التوبولين القابلة للذوبان. حددت هذه الطريقة نسب التوبولين التي تشكل أنابيب دقيقة مستقرة أو قابلة للذوبان في دماغ الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت اختلافات الأنسجة المتميزة في استقرار الأنابيب الدقيقة التي ترتبط بالقدرة التكاثرية للخلايا المكونة. تسلط هذه النتائج الضوء على الإمكانات الكبيرة لهذه الطريقة الجديدة لتحليل استقرار الأنابيب الدقيقة في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

المقدمة

الأنابيب الدقيقة (MTs) هي هياكل أنبوبية ممدودة تتكون من خيوط أولية تتكون من وحدات فرعية غير متجانسة α / β-توبولين. تلعب أدوارا أساسية في العمليات الخلوية المختلفة مثل انقسام الخلايا والحركة والحفاظ على الشكل والنقل داخل الخلايا ، مما يجعلها مكونات متكاملة للهيكل الخلوي حقيقي النواة1. الطرف السالب من MTs ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية α-tubulin ، مستقر نسبيا ، في حين أن الطرف الزائد ، حيث تتعرض الوحدة الفرعية β-tubulin ، يخضع لإزالة البلمرة الديناميكيةوالبلمرة 2. هذه الدورة المستمرة من إضافة توبولين ديمر وتفككه في الطرف الزائد ، يشار إليها باسم عدم الاستقرار الديناميكي ، تؤدي إلى عملية متكررة للإنقاذ والكارثة3. تعرض MTs مجالات محورية مع اختلافات محلية في عدم الاستقرار الديناميكي ، بما في ذلك المجالات المستقرة والمرنة4.

يعد التحكم الدقيق في عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs أمرا بالغ الأهمية للعديد من الوظائف الخلوية ، لا سيما في الخلايا العصبية التي تتميز بأشكال معقدة. تلعب القدرة على التكيف والمتانة في MTs دورا حيويا في تطوير الخلايا العصبية5،6،7 وحسن سيرها. تم العثور على عدم الاستقرار الديناميكي ل MTs مرتبطا بالعديد من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) للتوبولين ، مثل الأستلة ، والفسفرة ، وبالميتويل ، وإزالة التيروزين ، ودلتا 2 ، وأكسدة البولي جلوتامين ، و polyglycylation. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل ارتباط البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) كآلية تنظيمية8. تحدث PTMs ، باستثناء الأستيل ، في الغالب في منطقة كربوكسي توبولين الطرفية الواقعة على السطح الخارجي ل MTs. تخلق هذه التعديلات ظروفا سطحية متنوعة على MTs ، مما يؤثر على تفاعلها مع MAPs ويحكم في النهاية استقرار MT9. يدل وجود بقايا التيروزين الكربوكسي الطرفي في α-tubulin على MTs الديناميكي ، والذي يتم استبداله بسرعة بتجمع توبولين مجاني. على العكس من ذلك ، فإن إزالة التيروزين من نهاية الكربوكسي وأستلة Lys40 تدل على MTs مستقرة مع انخفاض عدم الاستقرار الديناميكي 9,10.

تم استخدام PTMs من توبولين على نطاق واسع في التجارب لتقييم ديناميكيات واستقرار MTs5،7،11،12،13،14،15. على سبيل المثال ، في دراسات زراعة الخلايا ، يمكن فصل الأنابيب إلى مجموعتين: تجمع توبولين مجاني وتجمع MT. يتم تحقيق ذلك عن طريق إطلاق توبولين مجاني من خلال نفاذية الخلية قبل تثبيت MTsالمتبقية 15،16،17،18،19. تتضمن الطرق البيوكيميائية استخدام مثبتات MT الكيميائية التي تحمي MTs من الكارثة ، مما يتيح فصل MTs والتوبولين الحر من خلال الطرد المركزي20،21،22. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات لا تفرق بين MTs المستقرة والأقل استقرارا (المتقلبة) ، مما يجعل من المستحيل تحديد MTs أو التوبولين القابل للذوبان في أنسجة مثل الدماغ. وبالتالي ، فقد ثبت أن تقييم استقرار MT في الكائنات الحية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية يمثل تحديا. لمعالجة هذا القيد التجريبي ، قمنا بتطوير تقنية جديدة لفصل MTs والتوبولين الحر بدقة في أنسجة الفئران23.

تتضمن طريقة تجزئة MT الفريدة هذه تجانس الأنسجة في ظل ظروف تحافظ على حالة التوبولين في الأنسجة والطرد المركزي من خطوتين لفصل MTs المستقر و MTs المرن والتوبولين الحر. يمكن تطبيق هذا الإجراء البسيط على دراسات واسعة ، بما في ذلك البحوث الأساسية على MTs و MAPs في الكائنات الحية ، والتحليلات الفسيولوجية والمرضية للصحة والأمراض المرتبطة باستقرار MT ، وتطوير الأدوية والعلاجات الأخرى التي تستهدف MTs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. طريقة تجزئة MT

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة دوشيشا. تم استخدام الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين ، 3-4 أشهر من العمر ، هنا. في هذا البروتوكول ، تم تجانس الأنسجة المقطعة ، على سبيل المثال ، الدماغ أو الكبد أو الغدة الصعترية ، على الفور في محلول تثبيت الأنابيب الدقيقة الباردة (MSB) ، والذي يحتوي على Taxol (مثبت MT) بتركيز لا يمنع فقط إزالة البلمرة ولكن أيضا إعادة بلمرة MT. تم فصل التجانس إلى ثلاثة أجزاء من خلال عملية الطرد المركزي الفائق المكونة من خطوتين (الشكل 1). تم الانتهاء من جميع الخطوات في هذا البروتوكول دون انقطاع في بيئة درجة حرارة باردة ، ولم يتم تجميد الأنسجة والكسور حتى تم إذابتها في محلول عينة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS).

  1. إعداد MSB والأنابيب الدقيقة
    1. لتحضير MSB ، امزج الكواشف التالية: 0.1 M 2- (N- مورفولينو) حمض إيثان سلفونيك (MES) ، درجة الحموضة 6.8 (تحييدها بواسطة KOH) ، 10٪ جلسرين ، 0.1 مللي متر DTT ، 1 مللي متر MgSO 4 ، 1 mM EGTA ، 0.5٪ Triton X-100 ، مثبطات الفوسفاتيز (1 mM NaF ، 1 mM β-glycerophosphate ، 1 mM Na3VO4 ، 0.5 μM حمض okadaic) ، 1x كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، ومثبطات الأنزيم البروتيني (0.1 ملليمتر PMSF ، 0.1 مللي متر DIFP ، 1 ميكروغرام / مل بيبستاتين ، 1 ميكروغرام / مل مضاد للألم ، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين ، 10 ميكروغرام / مل ليوبتين ، 50 ميكروغرام / مل TLCK) (انظر جدول المواد) وتدل على MSB (-).
    2. قبل تشريح الأنسجة مباشرة ، أضف 10 ميكرومتر تاكسول و 2 مللي متر GTP (انظر جدول المواد) إلى MSB (-). يشار إلى هذا المخزن المؤقت باسم MSB (+). تحضير المخزن المؤقت في يوم الاستخدام والاحتفاظ به على الجليد.
    3. تحضير الأنابيب الدقيقة لأخذ العينات. أنبوب دقيق فارغ سعة 2.0 مل لتخزين متجانس ؛ أنبوب دقيق فارغ سعة 1.5 مل لتخزين العينات الطافية 1 (S1) ، وعينة الترسب 2 (P2) ، وتخزين العينات المترسبة 3 (P3) ؛ 1.5 مل microtube مع 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) لتخزين الأنسجة المشرحة ؛ 1.5 مل ميكروتيوب مع 200 ميكرولتر من 2x SDS-عينة عازلة (0.16 م تريس درجة الحموضة 6.8 ؛ 20٪ جليسرول ؛ 2٪ 2-ميركابتوإيثانول ؛ 4٪ SDS) لعينة S1 وتخزين العينات الطافية 3 (S3) ؛ وأنبوب الطرد المركزي الدقيق لدوارات الطرد المركزي TLA55 و TLA120.2 (انظر جدول المواد). قم بتسمية جميع الأنابيب ووضعها على الثلج.
  2. تجانس أنسجة الفأر
    1. تحضير طاولة مبردة لتشريح الأنسجة. أولا ، املأ صندوقا بالثلج المجروش وضع طبقين بتري على الجليد ، أحدهما مع الجانب الداخلي لأعلى والآخر مع الجانب الخارجي. ملء برنامج تلفزيوني بارد الجليد في طبق واحد لغسل عابرة وتخزين الأنسجة تشريح. وضع ورقة الترشيح المبللة مع برنامج تلفزيوني على طبق آخر انقلبت.
    2. للتضحية بالفأر ، قم بإجراء خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق باستخدام مخدر مختلط من بوتورفانول ، ميدازولام ، وميديتوميدين. بعد ذلك ، قم بتشريح الأنسجة على الفور ، على سبيل المثال ، الدماغ أو الكبد أو الغدة الصعترية ، واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني بارد في طبق بتري.
      ملاحظة: يمكن تحليل أي نوع من الأنسجة الرخوة بهذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن حجم الأنسجة محدود بنطاق الحجم الموصى به للخالط المستخدم. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام حجم 2 مل من الخالط ، يوصى باستخدام 50-100 ملغ من الأنسجة.
    3. بعد وزن الأنابيب الدقيقة سعة 1.5 مل المملوءة ب PBS لتخزين الأنسجة المشرحة ، قم بقص الأنسجة وتخزينها داخل الأنابيب الدقيقة ، وأعد وزن كل أنبوب دقيق. يمكن حساب الوزن الرطب لكل نسيج عن طريق طرح وزن الأنبوب قبل وبعد إضافة الأنسجة.
    4. قم بتجانس الأنسجة على الفور في MSB البارد المثلج (+) باستخدام خالط مبرد (انظر جدول المواد). كان حجم MSB (+) 19 مرة (ميكرولتر) الوزن الرطب للأنسجة (ملغ). أداء التجانس مع 20 السكتات الدماغية حتى تختفي قطع الأنسجة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتم استخدام 1900 ميكرولتر من MSB (+) ل 100 ملغ من الأنسجة. نظرا لأنه يجب تعديل حجم MSB (+) المراد إضافته لكل وزن رطب لقطع الأنسجة التي تم تحليلها ، فمن الضروري وزن كل قطعة مناديل بدقة.
  3. الطرد المركزي لمتجانسات أنسجة الفأر
    1. انقل التجانس بالكامل إلى أنبوب دقيق سعة 2 مل مع ماصة باستور وأجهزة طرد مركزي عند 2400 × جم لمدة 3 دقائق عند 2 درجة مئوية لإزالة الحطام عن طريق هطول الأمطار.
    2. انقل المادة الطافية بأكملها (جزء S1) إلى أنبوب دقيق ودوامة جديدة سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، قم بقسمة 200 ميكرولتر من جزء S1 في أنبوب دقيق للطرد المركزي وأجهزة طرد مركزي عند 100000 × جم باستخدام دوار TLA-55 لمدة 20 دقيقة عند 2 درجة مئوية للحصول على بروتينات الوزن الجزيئي الكبيرة نسبيا كراسب (جزء P2).
      ملاحظة: يؤثر حجم العينة الخاضعة لخطوات الطرد المركزي الفائق على نصف قطر الطرد المركزي وكفاءة ترسيب الجزيئات. حافظ على حجم العينة عند 200 ميكرولتر أو أقل بعد هذه الخطوة لمنع التجزئة غير الدقيقة.
    3. مزيد من أجهزة الطرد المركزي جميع المواد الطافية الناتجة (جزء S2) عند 500000 جم × باستخدام دوار TLA-120.2 لمدة 60 دقيقة عند 2 درجة مئوية لفصل معقدات البروتين غير القابلة للذوبان في الراسب (جزء P3) عن البروتينات القابلة للذوبان في المادة الطافية (جزء S3).
    4. أضف 400 ميكرولتر من 1x SDS-sample buffer (0.08 M Tris pH 6.8 ؛ 10٪ جلسرين ؛ 1٪ 2-ميركابتوإيثانول ؛ 2٪ SDS) إلى أنابيب الكسر P2 و P3 وصوتيها لفترة وجيزة لإذابة الراسب. انقل عينات الكسر هذه إلى أنبوب دقيق فارغ سعة 1.5 مل.
    5. قم بإذابة إجمالي جزء S3 في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS 2x.
    6. امزج كسور S1 المتبقية بحجم متساو من المخزن المؤقت لعينة 2x SDS لاستخدامها كمنحنى قياسي للنشاف الغربي.
    7. تغلي كل هذه العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد أن تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
  4. القياس الكمي للبروتينات في كل جزء
    1. تحديد كمية البروتينات في الكسور P2 و P3 و S3 عن طريق النشاف الغربي. أولا ، استخدم 10٪ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) لفصل البروتينات عن الكسور P2 و P3 و S3 المخففة بشكل صحيح ، وعينة S1 المخففة بشكل متسلسل من أي فرد كمنحنى قياسي. بعد ذلك ، قم بمسح العينات كهربائيا على أغشية فلوريد البولي فينيليدين (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: تعتمد نسبة التخفيف لكل جزء على تركيز البروتين الموضوعي وتفاعل الجسم المضاد. (على سبيل المثال ، α-tubulin ، TUBB3 ، β-tub ، والتوبولين التيروزين في أنسجة المخ: S3 = 1/400 ، P3 = 1/2,000 ، P2 = 1/2 ، 000 ، S1 = 1 / 50,000 ، 1/20,000 ، 1 / 10,000 ، 1 / 5,000 ، 1 / 2,000 ؛ توبولين الأسيتيل في أنسجة المخ: S3 = 1/200 ، P3 = 1/400 ، P2 = 1/8000 ، S1 = 1/100000 ، 1/40000 ، 1/20000 ، 1/10000 ، 1/4000 ؛ α-توبولين في الكبد: S3 = 1/20 ، P3 = 1/100 ، P2 = 1/20 ، S1 = 1 / 50000 ، 1 / 20000 ، 1 / 10000 ، 1 / 5000 ، 1 / 2000 ؛ α-توبولين في الغدة الصعترية: S3 = 1/100 ، P3 = 1/400 ، P2 = 1/20 ، S1 = 1 / 50,000 ، 1/20,000 ، 1/10,000 ، 1/5,000 ، 1/2,000 تخفيف تركيز الأنسجة).
    2. سد الغشاء ب 5٪ حليب منزوع الدسم في محلول ملحي مخزن تريس (50 مللي متر Tris-HCl pH 7.6 ؛ 152 مللي متر كلوريد الصوديوم) مع 0.1٪ توين 20 (TBS-T) لأكثر من 30 دقيقة.
    3. اغمر الغشاء في TBS-T الذي يحتوي على جسم مضاد أولي (انظر جدول المواد) لأكثر من 2 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام TBS-T لمدة 3 دقائق (3 مرات).
    4. قم بتسمية الجسم المضاد الأولي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة HRP (انظر جدول المواد) في TBS-T لأكثر من 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام TBS-T لمدة 3 دقائق (3 مرات).
    5. تطوير الأغشية باستخدام كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن. بعد ذلك ، قم بتحليل نطاقات الاهتمام باستخدام محلل الصور المضيئة (انظر جدول المواد).
    6. قم بتحديد شدة نطاق البروتين باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) وإنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم وحدات التخفيف لعينات S1 المخففة المستخدمة للمنحنى القياسي على طول المحور X وشدة النطاق على طول المحور Y.
    7. اقرأ تركيز البروتين (الوحدة) المقابلة لعينات الكسر المخفف. اضرب التركيز المقروء بعامل تخفيف العينة للحصول على وحدة بروتين في كل كسر. قسم الوحدة المقاسة لكل كسر على وحدة البروتين الكلية (P2 + P3 + S3) للحصول على نسبة مئوية.

2. تقييم خصائص توبولين في كل كسر

ملاحظة: توفر هذه الطريقة البيوكيميائية ثلاث مجموعات من معقدات التوبولين المحددة بخصائص الترسيب. هنا ، تم تحديد حالة مجمعات التوبولين التي تم الحصول عليها في هذه الكسور بناء على حجم المجمع و tubulin-PTMs. أكمل جميع الخطوات في هذا البروتوكول دون انقطاع في بيئة ذات درجة حرارة باردة ولكن لا تجمد عينات الكسر حتى يتم إذابتها في المخزن المؤقت لعينة SDS.

  1. فحص مصيدة المرشح
    1. قم بتصفية كسور S2 و S3 (500 ميكرولتر لكل منهما) باستخدام عمود دوران الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون (انظر جدول المواد). إجراء 14000 × غرام من الطرد المركزي عند 2 درجة مئوية حتى يتم ترشيح المادة الطافية بأكملها ، ويتم جمع البروتينات المستخلصة في أنابيب الاستقبال ، وتبقى البروتينات المحاصرة على مرشح أنابيب الخزان.
    2. ترجمة الترشيحات بأكملها (حوالي 500 ميكرولتر) في أنابيب الاستقبال إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 1.5 مل وإذابتها في 500 ميكرولتر من 2x SDS-sample buffer.
    3. إذابة المخلفات على مرشح أنابيب الخزان في 1000 ميكرولتر من 1x SDS-عينة عازلة عن طريق سحب العينات ونقلها إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 مل.
    4. تغلي العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد أن تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
    5. تحليل كميات توبولين عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A (الجسم المضاد للتوبولين α ، انظر جدول المواد).
  2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
    1. تحضير المخزن المؤقت الناقل (0.1 M MES ، الرقم الهيدروجيني 6.8 ؛ 10٪ الجلسرين ؛ 1 mM MgSO4 ؛ 1 mM EGTA ؛ 0.1 mM DTT) المكمل بتركيز 1/10 من مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. ثم قم بتصفية المحلول وتخزينه في بيئة باردة.
    2. قم بإعداد عمود كروماتوغرافيا ترشيح هلامي مجهز بنظام كروماتوغرافيا سائل تحضيري في غرفة كروماتوغرافيا (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية.
    3. قبل حقن العينات على العمود ، قم بتدفق 180 مل من المخزن المؤقت الناقل لغسل العمود. معدل التدفق هو 1 مل / دقيقة لمدة 3 ساعات.
    4. حقن توبولين الخنازير المنقى المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) كعنصر تحكم أو جزء S3 من أدمغة الفئران (500 ميكرولتر لكل منهما) على العمود.
    5. Elute بمعدل تدفق 1.0 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت للحامل. اجمع كسور 1.5 مل لمدة 120 دقيقة. مراقبة البروتينات المستخلصة عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر. حافظ على أقصى ضغط أقل من 0.3 ميجا باسكال.
    6. بعد دوامة الكسور التي تم جمعها ، امزج 50 ميكرولتر منها مع 50 ميكرولتر من 2x SDS-sample buffer في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل. تغلي جميع العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد أن تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
    7. قم بتحليل كميات التوبولين عن طريق النشاف الغربي باستخدام DM1A ، والجسم المضاد ل α-tubulin و KMX-1 ، والجسم المضاد ل β-tubulin (انظر جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

القياس الكمي للتوبولين في الكسور P2 و P3 و S3 من دماغ الفأر بطريقة تجزئة MT
تم فصل التوبولين في أنسجة الفئران إلى كسور P2 و P3 و S3 بواسطة طريقة تجزئة MT وتم قياسها كميا بواسطة النشاف الغربي (الشكل 1 أ). تمثل رواسب MTs التي بقيت في جزء P2 عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100000 × جم لمدة 20 دقيقة 34.86٪ ± 1.68٪ من إجمالي التوبولين في دماغ الفأر. تم طرد المادة الطافية (S2) بشكل أكبر عند 500000 × جم لمدة 60 دقيقة. تم الحصول على راسب (جزء P3) وطاف (جزء S3) ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المهمة الأكثر أهمية عند التحقيق في حالة توبولين في الأنسجة من الكائنات الحية هي منع بلمرة MT العرضية أو إزالة البلمرة أثناء التحضير. يتأثر استقرار MTs في العينات بعوامل مثل تركيز Taxol في MSB ، ونسبة كمية الأنسجة إلى المخزن المؤقت ، ودرجة الحرارة أثناء العملية من إزالة الأنسجة إلى التجانس والطرد المركزي. لذلك ، تم تحسين الظروف في كل خطوة من خطوات البروتوكول لتحليل أنسجة الفئران بحجم 20 ضعفا من التجانس. يمكن أن يؤدي التركيز العالي من Taxol إلى بلمرة MT في المختبر ، حتى في ظل الظروف الباردة25

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JST لإنشاء زمالات جامعية نحو إنشاء ابتكار تكنولوجيا العلوم (A.HT. JPMJFS2145) ، JST SPRING (A.HT. ؛ JPMJSP2129) ، منحة مساعدة لزملاء JSPS (A.HT ؛ 23KJ2078) ، منحة مساعدة للبحث العلمي (B) JSPS KAKENHI (22H02946 ل TM) ، منحة مساعدة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة بعنوان "شيخوخة بروتين الدماغ والتحكم في الخرف" من MEXT (TM ؛ 26117004) ، وزمالة Uehara Research من مؤسسة Uehara Memorial Foundation (TM ؛ 202020027). يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
علبة أنبوبية سعة 1.5 مل من 500بيكمان كولتر357448
1A2سيجما ألدريتشT90281: 5،000 تخفيف
2- (N-مورفولينو) حمض الإيثان سلفونيك (MES)Nacalai Tesque02442-44
300 كيلو دالتون عمود تدور الترشيح الفائقAprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511: 5،000 التخفيف
Ä KTAprime plusCytiva11001313
مضاد للفأر IgGJackson ImmunoResearch115-035-1461: 5,000 التخفيف
المضاد للألممعهد الببتيد Inc.4062
أبروتينينناكالاي تيسك03346-84
كيمي-لومي ون إلناكالاي تيسك07880-54
نظام تصفية الفراغ أعلى زجاجة كورنينجكورنينج4307580.22 ومايكرو ؛ م 33.2 سم & sup2 ؛ غشاء النيتروسليلوز
DIFPسيجما ألدريتش55-91-4   ؛
الخالط الرقمي HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT90261: 5,000 التخفيف
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3.3 متر لفةبال كوربوريشنBSP0161
الجلسرينNacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
جهاز طرد مركزي صغير عالي السرعة مبرد كيتمانتوميKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg عمودCytiva28-9893-35
قياس الصور شركة فوجيفيلوم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن
إيمونوستار LD شركة FUJIFILUM Wako Pure ChemicalCorporation 292-69903
KMX-1MilliporeMAB34081: 5,000 تخفيف
LAS-4000 محلل الصور المضيئةFUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
معهد الببتيد الليوبتينInc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
حمض أوكادايكLC مختبراتO-2220 
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
pepstatinNacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
أنابيب الطرد المركزي المصنوعة من البولي كربونات ل TLA120.2
بيكمان كولتر (cOmplete &# 8482 ؛ ، خالي من EDTA)Roche11873580001
التوبولين المنقى  الهيكل الخلويT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
TaxolLC LaboratoriesP-9600
TLA-120.2 الدواربيكمان كولتر357656
TLA-55 الدواربيكمان كولتر366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45
& بيتا ؛ - جليسيروفوسفاتسيجما ألدريتشG9422
برنامج كوكتيل مثبط للبروتياز 343778

المراجع

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207(2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837(2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9(2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415(2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة