مقالة منهجية

نهج في المختبر لدراسة خلل الميتوكوندريا: نموذج Cybrid

DOI:

10.3791/63452

⸱

مارس 9, 2022

 ,  ,  , 
1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cybrids المتنقلة هي خلايا هجينة يتم الحصول عليها عن طريق دمج الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) - الخلايا المستنفدة (خلايا rho0 ) مع الخلايا الخلوية (الخلايا المنوحة) المشتقة من المرضى المصابين باضطرابات الميتوكوندريا. فهي تسمح بتحديد الأصل النووي أو الميتوكوندريا للمرض ، وتقييم النشاط الكيميائي الحيوي ، وتأكيد الدور الممرض للمتغيرات المرتبطة ب mtDNA.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقص مجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا التي تنفذ الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) هو العلامة الكيميائية الحيوية لاضطرابات الميتوكوندريا البشرية. من وجهة نظر وراثية ، يمثل OXPHOS مثالا فريدا لأنه ينتج عن استكمال نظامين وراثيين متميزين: الحمض النووي النووي (nDNA) والحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA). لذلك ، يمكن أن تكون عيوب OXPHOS ناتجة عن طفرات تؤثر على الجينات المشفرة النووية والميتوكوندريا.

أظهر العمل الرائد الذي قام به كينغ وأتاردي ، الذي نشر في عام 1989 ، أن خطوط الخلايا البشرية المستنفدة من mtDNA (المسماة rho0) يمكن إعادة توطينها بواسطة الميتوكوندريا الخارجية للحصول على ما يسمى ب "cybrids transmitochondrial". بفضل هذه السيبريدات التي تحتوي على الميتوكوندريا المشتقة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) والنوى من خلايا rho0 ، من الممكن التحقق مما إذا كان العيب مرتبطا ب mtDNA أو nDNA. هذه السايبريدات هي أيضا أداة قوية للتحقق من صحة إمراض الطفرة ودراسة تأثيرها على المستوى الكيميائي الحيوي. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا يصف توليد السايبرد واختياره وتوصيفه.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) هي مجموعة من المتلازمات متعددة الأنظمة الناجمة عن ضعف في وظائف الميتوكوندريا بسبب طفرات في الحمض النووي (nDNA) أو الميتوكوندريا (mtDNA)1. وهي من بين الأمراض الأيضية الموروثة الأكثر شيوعا ، مع انتشار 1: 5000. تتبع الأمراض المرتبطة ب mtDNA قواعد علم الوراثة الميتوكوندريا: وراثة الأم ، وتأثير الغيرية والعتبة ، والفصل الانقسامي2. mtDNA البشري هو دائرة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل من 16.6 كيلو بايت ، والتي تحتوي على منطقة تحكم قصيرة مع تسلسلات اللازمة للتكرار والنسخ ، و 13 جينا ترميز البروتين (جميع الوحدات الفرعية للسلسلة التنفسية) ، و 22 tRNA ، و 2 rRNA الجينات3.

في الأفراد الأصحاء ، هناك نمط وراثي واحد mtDNA (homoplasmy) ، في حين أن أكثر من نمط وراثي واحد يتعايش (heteroplasmy) في الحالات المرضية. يجب أن تتغلب الطفرات غير المتجانسة الضارة على عتبة حرجة لتعطيل OXPHOS والتسبب في أمراض يمكن أن تؤثر على أي عضو في أي عمر4. تملي الوراثة المزدوجة ل OXPHOS الميراث: صبغي جسدي متنحي أو مهيمن ومرتبط ب X لطفرات nDNA ، والأم لطفرات mtDNA ، بالإضافة إلى حالات متفرقة لكل من nDNA و mtDNA.

في بداية عصر طب الميتوكوندريا ، وضعت تجربة تاريخية أجراها كينغ وأتاردي5 الأساس لفهم أصل الطفرة المسؤولة عن MD عن طريق إنشاء خلايا هجينة تحتوي على نوى من خطوط الخلايا السرطانية التي تم فيها استنفاد mtDNA بالكامل (خلايا rho0) والميتوكوندريا من المرضى الذين يعانون من MDs. لم تكن تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) متاحة في ذلك الوقت ، ولم يكن من السهل تحديد ما إذا كانت هناك طفرة موجودة في الجينوم النووي أو الميتوكوندريا. ثم تم استخدام الطريقة ، الموصوفة في عام 1989 ، من قبل العديد من الباحثين العاملين في مجال طب الميتوكوندريا6،7،8،9. تم نشر بروتوكول مفصل مؤخرا10 ، ولكن لم يتم إنشاء أي فيديو حتى الآن. لماذا يجب أن يكون مثل هذا البروتوكول ذا صلة في الوقت الحاضر عندما يمكن ل NGS تحديد مكان وجود الطفرة بدقة وسرعة؟ الجواب هو أن توليد cybrid لا يزال البروتوكول الحديث لفهم الدور الممرض لأي طفرة جديدة في mtDNA ، وربط النسبة المئوية للتباين مع شدة المرض ، وإجراء تحقيق كيميائي حيوي في نظام نووي متجانس تكون فيه مساهمة الخلفية النووية الأصلية للمريض غائبة11 ، 12,13.

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على البلاستيدات الخلوية من الخلايا الليفية المتقاربة المشتقة من المريض والتي تزرع في أطباق بتري 35 ملم. يسمح الطرد المركزي للأطباق في وجود cytochalasin B بعزل الخلايا الخلوية المنوية ، والتي يتم دمجها بعد ذلك مع خلايا rho0 في وجود البولي إيثيلين جلايكول (PEG). ثم تزرع السيبريدات الناتجة في وسط انتقائي حتى تنشأ المستنسخات. يظهر قسم النتائج التمثيلية مثالا على التوصيف الجزيئي للسيبريدات الناتجة لإثبات أن mtDNA مطابق للخلايا الليفية للمرضى المتبرعين وأن nDNA مطابق للحمض النووي لخط خلية rho0 الوراثي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: قد يتطلب استخدام الخلايا الليفية البشرية موافقة أخلاقية. تم اشتقاق الخلايا الليفية المستخدمة في هذه الدراسة من مرضى MD وتخزينها في البنك الحيوي المؤسسي وفقا للمتطلبات الأخلاقية. وقدمت الموافقة المستنيرة على استخدام الخلايا. قم بإجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا تحت خزانة تدفق صفائحي معقمة في درجة حرارة الغرفة (RT ، 22-25 درجة مئوية). استخدم محاليل مفلترة معقمة مناسبة لزراعة الخلايا والمعدات المعقمة. تنمو جميع خطوط الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. يجب إجراء اختبارات الميكوبلازما أسبوعيا لضمان وجود مزارع خالية من الميكوبلازما. يمكن إنشاء خلايا 143BTK- rho0 كما هو موضح سابقا5.

1. زراعة الخلايا

  1. قبل البدء في أي إجراء ، تحقق من وجود طفرة في الخلايا الليفية المشتقة من مريض (مرضا) MD وتحديد النسبة المئوية للبلازما المتغايرة أو المتماثلة عن طريق تقييد تعدد الأشكال طول الشظايا (RFLP) و / أو تحليلات تسلسل mtDNA الكامل14.
  2. الخلايا الليفية البذرية في أربعة أطباق بتري 35 ملم ، يحتوي كل منها على 2 مل من وسط الثقافة الكاملة (الجدول 1). دع الخلايا تنمو حتى تلتقي بنسبة 80٪ (48 ساعة).
  3. تنمو خلايا 143BTK- rho0 في 8 مل من وسط الثقافة المكمل (الجدول 1) في طبق بتري 100 مم.
  4. الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  5. تحقق من عدم وجود mtDNA في خلايا rho0 عن طريق تقنيات التسلسل14.

2. استئصال الخلايا الليفية

  1. قم بتعقيم أربع زجاجات مناسبة لأجهزة الطرد المركزي سعة 250 مل عن طريق تعقيم الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جففها في فرن المختبر أو في RT.
  2. قم بتسخين جهاز الطرد المركزي عند 37 درجة مئوية.
  3. اغسل الأطباق مقاس 35 مم التي تحتوي على الخلايا الليفية مرتين ، باستخدام 2 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون (مع / س) الكالسيوم والمغنيسيوم.
  4. نظف السطح الخارجي للأطباق بنسبة 70٪ من الإيثانول وانتظر حتى يتبخر الكحول.
  5. قم بإزالة الأغطية من الأطباق والأغطية اللولبية من الزجاجات. ضع كل طبق ، بدون غطاء ، رأسا على عقب في الجزء السفلي من كل زجاجة طرد مركزي سعة 250 مل.
  6. أضف ببطء 32 مل من Enucleation Medium إلى كل زجاجة (الجدول 1) ، مما يسمح للوسط بدخول الطبق وملامسة الخلايا. قم بإزالة أي فقاعات من الأطباق باستخدام ماصة باستور الزجاجية الطويلة ، مع تقويس الطرف في لهب بنسن.
    ملاحظة: من المهم إزالة الفقاعات للسماح للوسط بدخول الطبق وملامسته للخلايا.
  7. أغلق كل زجاجة بغطاء المسمار وانقلها إلى جهاز الطرد المركزي.
  8. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 8000 × جم ، أقصى تسارع ، تباطؤ بطيء. انتبه لتحقيق التوازن بين جهاز الطرد المركزي: ثقل موازن كل زجاجة. إذا لزم الأمر ، اضبط الوزن عن طريق إضافة حجم مناسب من Enucleation Medium.
  9. أثناء الطرد المركزي ، استخدم فراغا أو ماصة مصلية سعة 10 مل لشفط والتخلص من الوسط من ألواح زراعة 143BTK- rho0 وغسلها مرتين باستخدام 4 مل من 1x PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم.
  10. أضف 2 مل من التربسين لتغطية الطبقة الأحادية للخلية بالكامل.
  11. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تقريبا.
  12. قم بإزالة الأطباق من الحاضنة ، وراقب انفصال الخلايا باستخدام مجهر مقلوب للخلايا الحية (الأهداف 4x أو 10x) ، وتمنع نشاط الإنزيم بإضافة 2 مل من وسط الثقافة المكملة.
  13. استنشاق 4 مل من تعليق الخلية في الطبق باستخدام ماصة 10 مل ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  14. عد الخلايا باستخدام غرفة مقياس الدم Burker أو عداد آلي.
  15. في نهاية الطرد المركزي (الخطوة 2.8) ، قم بشفط الوسط من الزجاجات وتخلص منه.
  16. قم بإزالة الأطباق عن طريق عكس الزجاجات على شاش معقم تم رشه مسبقا بالإيثانول بنسبة 70٪. نظف السطح الخارجي للأطباق وأغطيتها بالإيثانول بنسبة 70٪. انتظر حتى يتبخر الكحول ، ثم أغلق الأطباق.
  17. قبل المتابعة ، تحقق من تكوين cytoplast (شبح) باستخدام مجهر مقلوب للخلايا الحية (الهدف 4x أو 10x). ابحث عن الخلايا الليفية الممدودة للغاية بسبب بثق نواتها التي يسببها السيتوكالاسين B.
  18. إلى كل طبق 35 مم ، أضف 1 × 106 من 143BTK- rho 0 خلية معاد تعليقها في 2 مل من 143BTK- rho0 وسط ثقافة مكمل بمصل بقري جنيني 5٪ (FBS).
  19. اترك الأطباق لمدة 3 ساعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واترك خلايا 143BTK- rho0 تستقر على الأشباح. لا تزعج الأطباق.

3. اندماج الخلايا الليفية المنوية مع خلايا رو 0

  1. بعد 3 ساعات من الحضانة ، استنشق وتجاهل الوسط من الأطباق.
  2. اغسل الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام 2 مل من مصل Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) عالي الجلوكوز مع مصل / أو مع الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM).
  3. استنشاق وتجاهل الوسيط.
  4. أضف 500 ميكرولتر من محلول PEG (انظر جدول المواد) إلى الخلايا واحتضنها لمدة 1 دقيقة بالضبط.
  5. استنشق حل PEG وتخلص منه.
  6. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 2 مل من DMEM عالي الجلوكوز مع مصل DMEM أو مع MEM.
  7. أضف 2 مل من Fusion Medium (الجدول 1) واحتضنه بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.

4. اختيار Cybrid والتوسع

  1. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة ، وقم بتربسين الخلايا كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.9-2.13) ، وانقل محتوى كل طبق 35 مم إلى طبق 100 مم.
  2. أضف 8 مل من وسط الاختيار (الجدول 1) وضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  3. تغيير الوسط كل 2-3 أيام.
  4. انتظر لمدة 10-15 يوما من التحديد حتى تظهر مستعمرات الخلايا.
  5. قم بتجميد أحد أطباق بتري الأربعة من خلال جمع جميع الحيوانات المستنسخة وتوليد ثقافة "ضخمة" كنسخة احتياطية من السايبرد ، والتي يمكن استنساخها في النهاية واستخدامها لمزيد من التحقيقات.
  6. التربسين الخلايا في أطباق الثقافة المتبقية ، عد ، والبذور في واحد أو أكثر من أطباق بتري في 50-100 خلية / طبق في وسط الثقافة المكمل (الجدول 1) حتى تظهر المستنسخات. دعهم ينموون لبضعة أيام.
  7. قم بتكوير الخلايا المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 1200 × غرام لمدة 3 دقائق في RT وتخلص من السوبرناتانت.
  8. استخراج الحمض النووي من الكريات (انظر جدول المواد).
  9. إجراء التنميط الجيني عن طريق عدد متغير من التحليل المتكرر جنبا إلى جنب (VNTR) كما تم الإبلاغ عنه سابقا15.
  10. التقط الحيوانات المستنسخة من طبق بتري باستخدام أسطوانات استنساخ أو طرف ماصة ، باستخدام مجهر ستيريو لتجنب تجميع الحيوانات المستنسخة المختلفة ، ونقلها إلى طبق من 96 بئرا ، يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المكمل (الجدول 1).
  11. قم بتوسيع كل استنساخ حتى يكون هناك ما يكفي من الخلايا لتجميد واستخراج الحمض النووي.
  12. تحقق من نسبة الطفرة لكل استنساخ بواسطة RFLP أو طرق التسلسل الأخرى. من الناحية المثالية ، حاول الحصول على كل من المستنسخات ذات mtDNA من النوع البري (طفرة 0٪) والمستنسخات ذات نسب الطفرات المختلفة ، وكلاهما يضيف ما يصل إلى mtDNA المتحور المتجانس (طفرة 100٪). انظر الشكل 1 للحصول على رسم تخطيطي لبروتوكول توليد cybrid.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب توليد cybrids 3 أيام من العمل المختبري بالإضافة إلى فترة اختيار (~ 2 أسابيع) و 1-2 أسابيع إضافية لنمو الحيوانات المستنسخة. الخطوات الحاسمة هي جودة cytoplasts وفترة الاختيار. يشبه مورفولوجيا cybrids تلك الموجودة في الخلايا المانحة rho0. تعيين mtDNA الصحيح و nDNA في cybrids إلزامي لتأكيد هوية الخلايا. ويرد مثال على ذلك في الشكل 2. في هذه الحالة ، قمنا بتوليد cybrids بدءا من الخلايا الليفية المشتقة من مريض يحمل m.3243A>G غير المتجانسة ، وهي واحدة من أكثر طفرات mtDNA شيوعا ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي mtDNA على معدل طفرة مرتفع جدا مقارنة ب nDNA بسبب عدم وجود هيستون واقية وموقعه بالقرب من السلسلة التنفسية ، مما يعرض الجزيء لتأثيرات أكسدية ضارة لا تتصدى لها أنظمة الإصلاح بكفاءة16. تم تحديد أول طفرات mtDNA المسببة للأمراض في عام 1988 17,18 ، ومنذ ذلك الحين ، تم وصف عدد كبير من الطفرات. تقنية NGS هي نهج ذي صلة لفحص جينوم الميتوكوندريا بأكمله وتحديد المتغيرات14 بسهولة. ومع ذلك ، فإن تقييم الدور الممرض لطفرة mtDN...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة في مركز دراسة أمراض الميتوكوندريا لدى الأطفال (http://www.mitopedia.org)، بتمويل من مؤسسة مارياني. VT هي عضو في الشبكة المرجعية الأوروبية للأمراض العصبية العضلية النادرة (ERN EURO-NMD).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5-برومو-2'-ديوكسيوريدينسيجما-ألدريتش (ميرك)B5002-500MG
6 ألواح آباركورنينج3516
96 بئر لوحاتCorning3596
استخراج الحمض النووي لثقافة الدموالخلايا QIAGEN13323
أجهزة الطرد المركزيبيكمان كولترأفانتي J-257,200 RCF ، 37 درجة ؛
زجاجات أجهزة الطرد المركزي C ، 250 ملبيكمان كولتر356011
السيتوكالاسين ب من Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
Dialyzed FBSGibco26400-036 100 مل
DMEM عالي الجلوكوز (بدون L-Glutamine W / بيروفات الصوديوم)EuroCloneECB7501L
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco - PBS (مع / o الكالسيوم بدون المغنيسيوم)EuroCloneECB4004L
الإيثانول المطلق اللامائيكارلو إربا414601
FetalClone III (منتج مصل الأبقار)Cytiva - مختبرات HyCloneSH30109.03
ماصات باستور زجاجيةVWRM4150NO250SP4
مجهر بحثي مقلوب للفحص المجهري للخلايا الحيةنيكونكليس TE200
JA-14 دوار الألومنيوم ذو الزاويةالثابتة بيكمان كولتر339247
مختبر الأوتوكلاف Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutamine 200 ملي مولار (100x)EuroCloneECB 3000D
الحد الأدنى من المتوسط الأساسي MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert طقم الكشف عن الميكوبلازماLonzaLT07-318
PEG (محلول البولي إيثيلين جليكول)سيجما ألدريتش (ميرك)P7181-5X5ML
البنسلين الستربتومايسين (محلول 100x)أطباق EuroCloneECB3001D
Primo TC 100 ممأطباق EuroCloneET2100
Primo TC 35 ممEuroCloneET2035
بيروفات الصوديوم 100 ملي مولارEuroCloneECM0542D
مجهر مجسمنيكونSMZ1000
التربسين 2.5٪ في HBSSEuroCloneECB3051D
UridineSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G
مجموعة محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
  2. DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
  3. El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  6. Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
  7. Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
  8. Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
  9. Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).
  10. Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
  11. Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
  12. Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).
  13. Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).
  14. Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
  15. Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
  16. Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061(2020).
  17. Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
  18. Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
  19. Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
  20. Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).
  21. Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
  22. Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
  23. Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
  24. Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591(2020).
  25. Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
  26. Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
  27. Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
  28. Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cybrid Heteroplasmy

مقالات ذات صلة