تحديد كمي على المستوى العالمي لتعديلات ما بعد الترجمة Histone في نموذج زراعة الخلايا 3D للأنسجة الكبدية

Summary

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين في حالة شبه فسيولوجية.

Abstract

تعتبر المزارع المسطحة لخلايا الثدييات نهجا يستخدم على نطاق واسع في المختبر لفهم فسيولوجيا الخلية ، ولكن هذا النظام محدود في نمذجة الأنسجة الصلبة بسبب تكاثر الخلايا السريع بشكل غير طبيعي. هذا أمر صعب بشكل خاص عند نمذجة الكروماتين الناضج ، حيث أن الخلايا سريعة التكرار تشارك في كثير من الأحيان في تكرار الحمض النووي ولها مجموعة متعددة الصبغيات غير متجانسة. فيما يلي سير عمل لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين الهادئة باستخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد (3D). باستخدام هذا البروتوكول ، تزرع خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية ككرويات 3D قابلة للتكرار في حاضنة توفر انتشارا نشطا للمغذيات وقوى قص منخفضة. أدى العلاج ببوتيرات الصوديوم وسكسينات الصوديوم إلى زيادة في أسيتيلات الهيستون والسكسينيلات، على التوالي. ترتبط الزيادات في مستويات أسيتيلات الهيستون والسكسينيال بحالة كروماتين أكثر انفتاحا. ثم يتم جمع الكرويات لعزل نوى الخلايا، والتي يتم استخراج بروتينات الهيستون منها لتحليل تعديلاتها بعد الانتقالية. يتم إجراء تحليل Histone عبر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادف عبر الإنترنت ، يليه خط أنابيب حسابي داخلي. وأخيرا ، يتم عرض أمثلة على تمثيل البيانات للتحقيق في تواتر وحدوث علامات الهستون التوافقية.

Introduction

منذ أواخر^القرن 19 ، تم استخدام أنظمة زراعة الخلايا كنموذج لدراسة نمو وتطور الخلايا خارج جسم الإنسان ^1,2. كما تم توسيع استخدامها لدراسة كيفية عمل الأنسجة والأعضاء في كل من السياقات الصحية والمريضة ^1,3. تنمو الخلايا المعلقة (مثل خلايا الدم) في أطباق بتري أو قوارير بسلاسة وتبادل لأنها لا تتجمع في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. يمكن أن تنمو الخلايا المشتقة من الأعضاء الصلبة إما في أنظمة ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) أو 3D. في ثقافة 2D ، تزرع الخلايا في طبقة أحادية تلتصق بسطح مستو ^2,4

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

1. وسائط نمو الخلايا (لخلايا HepG2 / C3A): أضف مصل البقر الجنيني (FBS) (10٪ v / v) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1٪ v / v) ، وملحق L-glutamine (1٪ v / v) والبنسلين / الستربتومايسين (0.5٪ v / v) إلى Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM ، الذي يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز). يتم تخزين وسائط النمو في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 2 أسابيع.
2. محلول بوتيرات الصوديوم (NaBut) 200 mM: لإعداد 10 مل ، أعد تعليق 220.18 ملغ من Nabut في 10 مل من ddH₂O. قم بتخزين 1 مل من الأليكوتات عند -20 درجة مئوية. قبل معالجة الخلايا ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.45 مم وأضف 1 مل من المحلول المصفى إل....

Results

في هذا البروتوكول ، عولجت الكرويات HepG2 / C3A ب 20 mM Nabut و 10 mM NaSuc ، وكلاهما أثر على المستويات العالمية من PTMs الهيستون (الشكل 3A). ثم تم تحديد وقياس هيستون PTMs كميا على مستوى البقايا المفردة عن طريق اقتناء MS / MS (الشكل 3B).

عندما يتم تشغيل العينات في نسخ متماثلة ، يمكن إجراء تحليل إحصائي لتقييم إثراء تغيير الطية ل PTM بين العينات ، وكذلك قابلية تكرار الملاحظة. تظهر البيانات المعروضة أن الببتيدات المعدلة باستخدام .......

Discussion

يختلف تحليل PTMs الهيستون اختلافا جوهريا عن خط أنابيب تحليل البروتينات النموذجي. معظم PTMs هيستون لا يزال لها وظائف بيولوجية غامضة. ونتيجة لذلك، لا تتوفر التعليقات التوضيحية مثل أنطولوجيا الجينات أو قواعد بيانات المسارات. توجد العديد من الموارد التي تربط تعديلات الهيستون بالإنزيم المسؤول عن تحفيزها أو البروتينات التي تحتوي على مجالات تربط هذه PTMs (على سبيل المثال ، HISTome³⁶). كذلك ، من الممكن التكهن بالحالة العامة للكروماتين عندما يتم تنظيم المستويات العالمية من PTMs الهيستون. على سبيل المثال ، .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05٪ محلول التربسين-EDTA	Gibco	25300054
0.5-20 & micro ؛ L نصائح ماصة	العلامة	التجارية 13-889-172 (فيشر العلمية)
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة	Bio-Rad	2239480
10 & micro ؛ L ماصة متعددة القنوات	العلامة	التجارية BR7059000 (Millipore Sigma) 10
مل حقنة	Henke Sass Wolf	14-817-31 (فيشر العلمية)	طرف قفل لور ، متدرج إلى 12 مل
10 و 20 و 200 و 1000 & ماصات L أحادية القناة	Eppendorf	14-285-904 (فيشر العلمية) 1000
& micro ؛ L نصائح ماصة	Rainin	30389164
18 G إبرة حقنة	Air-Tite	14-817-100 (فيشر العلمية)	3 "الطول ، 0.05" القطر
200 & ماصة L متعددة القنوات	Corning	4082
2-200 & micro; L نصائح ماصة	العلامة	التجارية Z740118 (Millipore Sigma)
24 جيدا لوحة دقيقة مرفقة منخفضة	للغاية Corning	07-200-602
75 سم 2< / sup>  ؛ قارورة زراعة الخلايا على شكل حرف U	Corning	461464U	غير معالجة ، مع غطاء تنفيس
96 بئر لوحة	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
الأسيتون	فيشر Scientific	A949-1	الأسيتون بيكربونات
الأمونيوم الباردة (NH4< / sub>HCO3< / sub>)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
هيدروكسيد الأمونيوم الحل	فيشر العلمي	AC423300250
ثقافة الخلية الصف المياه	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	المفاعل الحيوي لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد
ClinoStar	CelVivo	N / A	Clinostat CO2< / sub> حاضنة لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد
وحدة	التحكم CelVivo	N / A	Tablet ل ClinoStar الإعدادات
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم ، بدون L-glutamine والفينول
الأحمر مصل بقري الجنين (FBS)	Corning	35-010-CV
حمض الفورميك	Thermo Scientific	28905
غطاء الدخان	Mott	N / A	موديل 7121000
زجاج ماصة باستور	فيشر Scientific	13-678-8B	9 "، قطن متصل ، زجاج بورسليكات ،
مكمل جلوتاجرو	Corning	25-015-CI	200 ملي L-ananyl-L-glutamine
Hank محلول الملح المتوازن (HBSS)	محلول Corning	21-022-CV	1X بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر
HPLC الصف أسيتونيتريل	فيشر Scientific	A955-4
HPLC درجة المياه	فيشر Scientific	W6-1
حمض الهيدروكلوريك (HCl) فيشر	Scientific	A481-212
Ice	N / A	N / A
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية Corning		25-025-CI	100X محلول
الواحة HLB راتنج	المياه	186007549	راتنج محب للماء والدهون المتوازنة (HLB) مع 30 & ميكرو ؛ م حجم الجسيمات
Orbitrap Fusion Lumos مطياف الكتلة Tribrid	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	مطياف الكتلة عالي الدقة
Oro-Flex I لوحة ترشيح البولي بروبيلين	Orochem	OF1100	96 جيدا من مادة البولي بروبلين ث / 10 & M PE فريت
البنسلين الستربتومايسين	Corning	30-002-CI	100X محلول
ورق الأس الهيدروجيني		Z111848 (سيجما ألدريتش)	0-13 ورقة اختبار الأس الهيدروجيني
مسدس الماصة	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma) الشعيرات
الدموية Polymicro	Molex	50-110-7740 (فيشر العلمية)	شعرية من السيليكا المنصهرة المرنة مع طلاء بوليميد, 75 & micro; معرف M × 363 & micro; M OD
البوليسترين 10 مل ماصات مصلية ، معقمة	فيشر	Scientific 1367549
أنهيدريد بروبيونيك	سيجما ألدريتش	240311-50G
طرد مركزي مبرد	Thermo Scientific	75-217-420
راتنج Reprosil-Pur	MSWIL	R13. AQ.0003	120 & Aring ؛ حجم المسام ، مرحلة C18-AQ ، 3 & micro ؛ حجم حبة
M Rotator	Clay Adams	25477 (تداول المختبرات الأمريكية)	خلاط Nutator 1105
التسلسل المعدل التربسين	Promega	V5111
زبدات الصوديوم	Thermo Scientific	A11079
سكسينات الصوديوم ثنائي القاعدة	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac مكثف فراغ (1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة)	Savant	20249 (تداول المختبرات الأمريكية)
مكثف فراغ SpeedVac (96 بئر)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
غطاء معقم	Thermo Scientific	1375	الفئة الثانية ، النوع A2
حمض الكبريتيك (H2< / sub>SO4< / sub>)	فيشر Scientific	02-004-375	كاشف
بيكر المحلل ACSزراعة الأنسجة المعالجة 100 مم × 20 مم طبق	فيشر ساينتفيك	08-772-23
حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA)	AC421451000 العلمي		الحراري يعلق 100٪ وزن / حجم في حمض ثلاثي
فلورو أسيتيك من درجة HPLC (TFA)	فيشر ساينتفيك	PI28904	درجة
مشعب فراغ 96 بئر	Millipore	MAVM0960R
Vortex	سيجما ألدريتش	Z258415
حمام مائي	فيشر FSGPD10
أطراف ماصة واسعة التجويف 1000 & L	Axygen	14-222-703 (فيشر العلمي)
أطراف ماصة واسعة التجويف 200 & مايكرو ؛ L	Axygen	14-222-730 (فيشر العلمي)