Method Article

تحديد كمي على المستوى العالمي لتعديلات ما بعد الترجمة Histone في نموذج زراعة الخلايا 3D للأنسجة الكبدية

DOI:

10.3791/63606

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين في حالة شبه فسيولوجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر المزارع المسطحة لخلايا الثدييات نهجا يستخدم على نطاق واسع في المختبر لفهم فسيولوجيا الخلية ، ولكن هذا النظام محدود في نمذجة الأنسجة الصلبة بسبب تكاثر الخلايا السريع بشكل غير طبيعي. هذا أمر صعب بشكل خاص عند نمذجة الكروماتين الناضج ، حيث أن الخلايا سريعة التكرار تشارك في كثير من الأحيان في تكرار الحمض النووي ولها مجموعة متعددة الصبغيات غير متجانسة. فيما يلي سير عمل لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين الهادئة باستخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد (3D). باستخدام هذا البروتوكول ، تزرع خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية ككرويات 3D قابلة للتكرار في حاضنة توفر انتشارا نشطا للمغذيات وقوى قص منخفضة. أدى العلاج ببوتيرات الصوديوم وسكسينات الصوديوم إلى زيادة في أسيتيلات الهيستون والسكسينيلات، على التوالي. ترتبط الزيادات في مستويات أسيتيلات الهيستون والسكسينيال بحالة كروماتين أكثر انفتاحا. ثم يتم جمع الكرويات لعزل نوى الخلايا، والتي يتم استخراج بروتينات الهيستون منها لتحليل تعديلاتها بعد الانتقالية. يتم إجراء تحليل Histone عبر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادف عبر الإنترنت ، يليه خط أنابيب حسابي داخلي. وأخيرا ، يتم عرض أمثلة على تمثيل البيانات للتحقيق في تواتر وحدوث علامات الهستون التوافقية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ أواخرالقرن 19 ، تم استخدام أنظمة زراعة الخلايا كنموذج لدراسة نمو وتطور الخلايا خارج جسم الإنسان 1,2. كما تم توسيع استخدامها لدراسة كيفية عمل الأنسجة والأعضاء في كل من السياقات الصحية والمريضة 1,3. تنمو الخلايا المعلقة (مثل خلايا الدم) في أطباق بتري أو قوارير بسلاسة وتبادل لأنها لا تتجمع في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. يمكن أن تنمو الخلايا المشتقة من الأعضاء الصلبة إما في أنظمة ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) أو 3D. في ثقافة 2D ، تزرع الخلايا في طبقة أحادية تلتصق بسطح مستو 2,4. تتميز أنظمة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد بالنمو الأسي ووقت المضاعفة السريع ، وعادة ما يكون 24 ساعة إلى بضعة أيام5. تنمو الخلايا في أنظمة 3D لتشكيل تفاعلات معقدة بين الخلايا الخلوية ونمذجة التكتلات الشبيهة بالأنسجة بشكل أوثق ، وتتميز بقدرتها على الوصول إلى توازن ديناميكي حيث يمكن أن يصل وقت مضاعفتها إلى 1 شهر أو أكثر5.

تقدم في هذه الورقة منهجية مبتكرة لزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد في أنظمة زراعة الخلايا الدوارة التي تحاكي انخفاض الجاذبية6. هذا هو مشتق مبسط من نظام زراعة الخلايا التي قدمتها ناسا في 1990s7. يقلل هذا النهج من قوى القص ، التي تحدث في الطرق الحالية مثل قوارير الغزل ، ويزيد من قابلية التكاثر الكروي6. بالإضافة إلى ذلك ، يزيد المفاعل الحيوي الدوار من انتشار المغذيات النشط ، مما يقلل من تكوين الميت الذي يحدث في أنظمة مثل زراعة الخلايا المتساقطة المعلقة حيث يكون تبادل الوسائط غير عملي6. بهذه الطريقة ، تنمو الخلايا في الغالب دون عائق ، مما يسمح بتكوين الخصائص الهيكلية والفسيولوجية المرتبطة بالخلايا التي تنمو في الأنسجة. خلايا الكبد C3A (HepG2 / C3A) المستزرعة بهذه الطريقة لم يكن لديها عضيات فوق هيكلية فحسب ، بل أنتجت أيضا كميات من ATP و adenylate kinase و urea و cholesterol مماثلة للمستويات التي لوحظت في الجسم الحي 1,2. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الخلايا المزروعة في أنظمة زراعة الخلايا 2D مقابل .3D أنماط مختلفة للتعبير الجيني8. أظهر تحليل التعبير الجيني لخلايا الكبد C3A المزروعة على شكل كرويات ثلاثية الأبعاد أن هذه الخلايا عبرت عن مجموعة واسعة من البروتينات الخاصة بالكبد ، بالإضافة إلى الجينات المشاركة في المسارات الرئيسية التي تنظم وظائف الكبد8. أظهرت المنشورات السابقة الاختلافات بين بروتينات الخلايا التي تنمو بشكل كبير في ثقافة 2D مقابل الخلايا في التوازن الديناميكي في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد5. وتشمل هذه الاختلافات التمثيل الغذائي الخلوي ، والذي بدوره يؤثر على بنية ووظيفة وفسيولوجيا الخلية5. كان بروتين الخلايا المزروعة في ثقافة 2D أكثر ثراء في البروتينات المشاركة في تكرار الخلايا ، في حين أن بروتينات الكرويات ثلاثية الأبعاد كانت أكثر ثراء في وظائف الكبد5.

معدل النسخ المتماثل الأبطأ للخلايا المزروعة ككرويات 3D نماذج أكثر دقة لظواهر محددة مرتبطة بحالة الكروماتين والتعديلات (على سبيل المثال قص هيستون9). قص هيستون هو تعديل هيستون ما بعد الترجمة (PTM) لا رجعة فيه يسبب انقساما بروتينيا لجزء من ذيل هيستون N-terminal. في حين أن وظيفته البيولوجية لا تزال قيد المناقشة10،11،12،13 ، فمن الواضح أن وجوده في الخلايا الأولية وأنسجة الكبد تم تصميمه بواسطة خلايا HepG2 / C3A التي تنمو كروية ، ولكن ليس كخلايا مسطحة9. هذا أمر بالغ الأهمية ، حيث أن حالة الكروماتين والتعديلات تنظم قراءة الحمض النووي في الغالب عن طريق تعديل إمكانية الوصول إلى الجينات وبالتالي التعبير عنها14. تؤثر PTMs الهيستون إما على حالة الكروماتين بشكل مباشر من خلال التأثير على الشحنة الصافية للنيوكليوسومات حيث يتم تجميع الهيستونات ، أو بشكل غير مباشر عن طريق تجنيد كتاب الكروماتين والقراء والممحاة14. تم تحديد المئات من PTMs هيستون حتى الآن15 ، مما يعزز الفرضية القائلة بأن الكروماتين يستضيف "رمز هيستون" تستخدمه الخلية لتفسير الحمض النووي16. ومع ذلك ، فإن تحديد عدد لا يحصى من مجموعات PTM15 ، واكتشاف أن مجموعات من PTMs هيستون غالبا ما يكون لها وظائف بيولوجية مختلفة عن PTMs الموجودة في عزلة (مثل Fischle ، et al.17) ، يسلط الضوء على أن هناك حاجة إلى مزيد من العمل لفك تشفير "شفرة هيستون".

في الوقت الحالي ، يعتمد تحليل PTM للهيستون إما على تقنيات تستخدم الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، البقع الغربية ، أو التألق المناعي ، أو الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل [ChIP-seq]) أو قياس الطيف الكتلي (MS). تتمتع التقنيات القائمة على الأجسام المضادة بحساسية عالية ويمكن أن توفر معلومات مفصلة حول توطين علامات الهستون على نطاق الجينوم ولكنها غالبا ما تكون محدودة في دراسة PTMs النادرة أو PTMs الموجودة في مجموعات18،19،20. التصلب المتعدد هو أكثر ملاءمة لتحديد وقياس تعديلات البروتين المفردة والمتعايشة ذات الإنتاجية العالية وغير المتحيزة ، وخاصة بروتينات الهيستون18،19،20. لهذه الأسباب ، قام هذا المختبرات والعديد من المختبرات الأخرى بتحسين خط أنابيب MS لتحليل ببتيدات الهيستون (MS من أسفل إلى أعلى) ، وذيول الهيستون السليمة (MS من منتصف إلى أسفل) ، وبروتينات الهيستون كاملة الطول (MS من أعلى إلى أسفل) 21،22،23.

فيما يلي سير عمل لزراعة الكرويات HepG2 / C3A وإعدادها لتحليل ببتيد الهيستون (MS من أسفل إلى أعلى) عبر كروماتوغرافيا نانو سائلة ، مقترنة عبر الإنترنت بقياس الطيف الكتلي الترادف (NLC-MS / MS). نمت زراعة خلايا ثنائية الأبعاد وتم حصاد الخلايا ونقلها إلى مفاعل حيوي حيث ستبدأ في تكوين كرويات (الشكل 1). بعد 18 يوما في الثقافة، عولجت الكرويات ببوتيرات الصوديوم أو سكسينات الصوديوم لزيادة الوفرة النسبية لأسيتيلات الهيستون والسكسينيلات. والجدير بالذكر أن الثقافات 3D يمكن معالجتها بالمركبات السامة للوراثة تماما وكذلك نظيراتها من الثقافة المسطحة. في الواقع ، تسلط المنشورات الحديثة الضوء على أن استجابة علم السموم للخلايا في ثقافة 3D تشبه الأنسجة الأولية أكثر من تلك الموجودة في الثقافة المسطحة ثنائية الأبعاد24,25. ثم تم جمع الخلايا في نقاط زمنية محددة وتم إجراء العزل النووي. ثم تم استخراج الهيستونات واشتقاقها بأنهيدريد البروبيونيك قبل وبعد هضم التربسين وفقا لبروتوكول طوره غارسيا وآخرون لأول مرة.26. يولد هذا الإجراء ببتيدات ذات حجم مناسب للفصل عبر الإنترنت باستخدام كروماتوغرافيا الطور المعكوس (C18) والكشف عنها باستخدام MS. وأخيرا، تم تحديد ببتيدات الهيستون وتحديدها كميا، وتم تمثيل البيانات التي تم إنشاؤها بطرق متعددة من أجل تفسير بيولوجي أكثر اكتمالا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. وسائط نمو الخلايا (لخلايا HepG2 / C3A): أضف مصل البقر الجنيني (FBS) (10٪ v / v) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1٪ v / v) ، وملحق L-glutamine (1٪ v / v) والبنسلين / الستربتومايسين (0.5٪ v / v) إلى Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM ، الذي يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز). يتم تخزين وسائط النمو في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 2 أسابيع.
  2. محلول بوتيرات الصوديوم (NaBut) 200 mM: لإعداد 10 مل ، أعد تعليق 220.18 ملغ من Nabut في 10 مل من ddH2O. قم بتخزين 1 مل من الأليكوتات عند -20 درجة مئوية. قبل معالجة الخلايا ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.45 مم وأضف 1 مل من المحلول المصفى إلى 9 مل من وسائط نمو الخلايا للحصول على تركيز عمل يبلغ 20 ملليمتر.
  3. محلول سكسينات الصوديوم 100 mM (NaSuc): لإعداد 10 مل ، أعد تعليق 162.05 ملغ من NaSuc في 10 مل من ddH2O. قم بتخزين 1 مل من الأليكوتات عند -20 درجة مئوية. قبل معالجة الخلايا ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.45 مم وأضف 1 مل من المحلول المصفى إلى 9 مل من وسائط نمو الخلايا للحصول على تركيز عمل يبلغ 10 ملليمتر.
  4. بارد 0.2 م H 2 SO4: لتحضير 1 لتر ، أضف 10 مل من H2SO المركز4 إلى 990 مل من الماء HPLC الصف. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  5. الأسيتون البارد + 0.1٪ حمض الهيدروكلوريك (HCl): أضف HCl المركز (0.1٪ v / v) إلى الأسيتون. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  6. محلول 100 mM NH 4HCO 3 ، الرقم الهيدروجيني 8.0: لإعداد 1 لتر ، أعد تعليق 7.91 جم من NH4HCO3 في 1 لتر من الماء HPLC الصف. تخزين 50 مل من الأليكوت في -20 درجة مئوية.
  7. محلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) بنسبة 0.1٪: أضف TFA المركز (0.1٪ v / v) إلى الماء HPLC الصف. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  8. 60٪ الأسيتونيتريل / 0.1٪ حل TFA: أضف الأسيتونيتريل من الدرجة HPLC (60٪ v / v) إلى الماء HPLC الصف. ثم أضف TFA مركزا (0.1٪ v / v) إلى هذا الحل. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  9. 2٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك: أضف الأسيتونيتريل من الدرجة HPLC (2٪ v / v) إلى الماء HPLC-grade. ثم أضف حمض الفورميك المركز (0.1٪ v / v) إلى هذا المحلول.
  10. 80٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك: أضف الأسيتونيتريل من الدرجة HPLC (80٪ v / v) إلى الماء HPLC-grade. ثم أضف حمض الفورميك المركز (0.1٪ v / v) إلى هذا المحلول.

2. إعداد نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: الخلايا المختلفة، الأولية أو الخالدة، لها خصائص استزراع مختلفة، لذلك قد يختلف تكوين الكرويات بين أنواع الخلايا. تم إنشاء هذا البروتوكول لتشكيل كروية HepG2 / C3A باستخدام المفاعلات الحيوية ونظام مبتكر لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.

  1. باستخدام وسائط النمو القياسية ، تنمو الخلايا كطبقة أحادية حتى تلتقي بنسبة 80٪.
  2. اغسل الخلايا باستخدام HBSS (5 مل لقارورة 75 سم 2) واحتضن الخلايا ب 5 مل من 0.05٪ من التربسين-EDTA المخفف في HBSS (تخفيف 1: 2) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئويةمع 5٪ CO2.
  3. تحقق من انفصال الخلايا تحت المجهر وقم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 3 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) أو وسائط النمو (التي تحتوي على 5٪ -10٪ FBS).
  4. عد عدد الخلايا وقم بتخفيف تعليق الخلية للحصول على 1 × 106 خلايا في حجم أقصى يبلغ 1.5 مل.
  5. قم بموازنة لوحة سفلية مستديرة ذات 24 بئرا منخفضة للغاية (تحتوي على آبار صغيرة متعددة لكل بئر) عن طريق غسل الآبار ب 0.5 مل من وسائط النمو. قم بطرد مركزي للصفيحة لمدة 5 دقائق عند 3000 × g لإزالة فقاعات الهواء من سطح البئر.
  6. انقل تعليق الخلية إلى اللوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 120 × جم.
  7. احتضن اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجةمئوية مع 5٪ CO2 لتشكيل كروية. وفي الوقت نفسه ، قم بموازنة المفاعل الحيوي عن طريق ملء غرفة الرطوبة ب 25 مل من الماء المعقم وغرفة الخلية ب 9 مل من وسائط النمو.
  8. احتضان المفاعل الحيوي ، بالتناوب في حاضنة clinostat ، لمدة 24 ساعة عند 37 درجةمئوية مع 5٪ CO2.

3. نمو الكرويات في المفاعلات الحيوية

ملاحظة: للحفاظ على بنية الكرويات ، يتم استخدام نصائح تجويف واسعة للتعامل مع هياكل 3D.

  1. افصل الكرويات عن لوحة المرفقات المنخفضة للغاية عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام أطراف تجويف عريضة 1 مل ونقلها إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة.
  2. اغسل الطبق ب 0.5 مل من وسائط النمو المسخنة مسبقا وانقلها إلى نفس الطبق.
  3. تقييم جودة الكرويات عن طريق الفحص المجهري واختيار الكرويات المشكلة بما فيه الكفاية. الكرويات ذات النوعية الجيدة لها حجم موحد ، والاكتناز ، والاستدارة.
  4. نقل الكرويات إلى مفاعلات حيوية متوازنة مليئة ب 5 مل من وسائط النمو الجديدة. بعد نقل الكرويات ، املأ المفاعل الحيوي بالكامل بوسائط نمو جديدة.
  5. ضع المفاعل الحيوي في حاضنة الكلينوستات واضبط سرعة الدوران إلى 10-11 دورة في الدقيقة.
  6. تبادل وسائط النمو كل 2-3 أيام عن طريق إزالة 10 مل من الوسائط القديمة واستبدالها ب 10 مل من الوسائط الجديدة.
  7. اضبط سرعة الدوران وفقا للنمو الكروي ، ويزداد مع نمو الكرويات في الحجم والعدد.
  8. بعد 18 يوما في الثقافة ، تكون الكرويات جاهزة للعلاج و / أو الجمع

4. العلاج الكروي وجمع

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم التعامل مع الكرويات HepG2 / C3A مع بوتيرات الصوديوم (NaBut) وسكسينات الصوديوم (NaSuc) لتقييم مستويات علامات الهيستون التي تحتوي على الأسيتيلات والسكسينيلات، على التوالي.

  1. قم بإعداد وسائط النمو بتركيز العمل المناسب للمركب (على سبيل المثال ، 20 mM من Nabut أو 10 mM NaSuc). تبادل الوسائط في المفاعل الحيوي مع الوسائط المعالجة.
    ملاحظة: لإنشاء حالة ضابطة، إما جمع ما يكفي من الكرويات للتجارب قبل إضافة العلاج أو تعيين مفاعل حيوي للكرويات غير المعالجة.
  2. جمع الكرويات للتحليل البروتيني بعد وقت العلاج الكافي (على سبيل المثال ، 48 ساعة إلى 1 أسبوع لعلاج NaSuc أو 48-72 ساعة لعلاج Nabut).
    ملاحظة: لاستخراج الهستون باستخدام هذا البروتوكول ، تم جمع ستة إلى ثمانية كرويات تحتوي على ما يقرب من 1 × 106 خلايا.
    1. قم بإزالة 3-5 مل من الوسائط من المفاعل الحيوي من خلال المنفذ العلوي.
    2. افتح المنفذ الأمامي واستخدم طرف تجويف عريض 1 مل لإزالة الكرويات ووضعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
    3. الطرد المركزي للكرويات في 100 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل الوسائط.
      ملاحظة: يمكن تغيير الوسائط الموجودة في المفاعل الحيوي ويمكن إعادة المفاعل الحيوي إلى الحاضنة للحصول على وقت إضافي للعلاج أو التعافي.
    4. اغسل الكرويات ب 200 ميكرولتر من HBSS لإزالة FBS. جهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة السوبرناتانت.
      ملاحظة: يمكن تخزين الكرويات عند -80 درجةمئوية حتى المعالجة.

5. استخراج هيستون

ملاحظة: تسمح العديد من بقايا الأحماض الأمينية الأساسية الموجودة في الهيستونات بالتفاعل عن كثب مع الحمض النووي ، الذي يحتوي على العمود الفقري لحمض الفوسفوريك. نظرا لأن الهيستونات هي بعض البروتينات الأساسية في النواة ، عندما يتم استخراجها باستخدام حمض الكبريتيك البارد (0.2 M H2SO4) ، يكون هناك الحد الأدنى من التلوث. سوف تترسب البروتينات غير الهيستون في حمض قوي. يستخدم حمض ثلاثي كلورو أسيتيك عالي التركيز (TCA) المخفف إلى تركيز نهائي بنسبة 33٪ بعد ذلك لتعجيل الهيستونات من حمض الكبريتيك. احتفظ بجميع العينات والأنابيب والكواشف على الجليد لاستخراج الهستون بالكامل.

  1. أضف خمسة مجلدات (~ 100 ميكرولتر) من البرد 0.2 M H2SO4 إلى حبيبات الخلية (~ 10-20 ميكرولتر) ، وماصة لأعلى ولأسفل لتعطيل الكريات وإطلاق هيستونات.
  2. أنابيب حضانة لمدة تصل إلى 4 ساعات عند الدوران المستمر أو الاهتزاز عند 4 درجاتمئوية.
    ملاحظة: بالنسبة للعينات المعاد تعليقها التي يزيد حجمها عن 500 ميكرولتر، تكون حضانة 2 ساعة كافية لاستخراج الهيستونات (قد تؤدي الحضانة الأطول إلى استخراج بروتينات نووية أساسية أخرى). بالنسبة للعينات المعاد تعليقها بحجم أقل من 200 ميكرولتر ، يلزم حضانة لمدة 4 ساعات للحصول على عائد أفضل.
  3. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع supernatant في أنبوب جديد والتخلص من بيليه في وقت لاحق.
  4. أضف TCA المركز البارد بحيث يشكل 25٪ -33٪ v/v النهائي (على سبيل المثال ، 40-60 ميكرولتر من TCA البارد: 120 ميكرولتر من supernatant) واخلطه عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.
  5. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة على الأقل عند الدوران المستمر أو الاهتزاز عند 4 درجاتمئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لأحجام حبيبات البدء الأصغر حجما ، يوصى بحضانة بين عشية وضحاها.
  6. جهاز طرد مركزي عند 3400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجاتمئوية. شفط supernatant بعناية. لا تلمس جوانب الأنبوب أو الكرية.
    ملاحظة: ترسب Histones على جانبي وأسفل الأنبوب. تحتوي الكريات البيضاء غير القابلة للذوبان التي تشكلت في الجزء السفلي من الأنبوب على بروتينات غير هيستون وجزيئات حيوية أخرى في الغالب.
  7. اغسل الأنبوب (الجدران والحبيبات) بالأسيتون البارد + 0.1٪ HCl باستخدام ماصة باستور زجاجية (~ 500 ميكرولتر / أنبوب).
  8. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجاتمئوية.
  9. اغسل الأنبوب (الجدران والكريات) باستخدام الأسيتون البارد بنسبة 100٪ باستخدام ماصة باستور زجاجية (~ 500 ميكرولتر / أنبوب). جهاز طرد مركزي عند 3,400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجاتمئوية.
  10. تخلص من supernatant عن طريق قلب الأنبوب وماصة من الأسيتون المتبقي. افتح الغطاء وجفف العينة على المقعد في الهواء لمدة 20 دقيقة تقريبا.
  11. انتقل إلى البروبيونيل أو تخزين العينات في -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

6. الجولة الأولى من الاشتقاق

ملاحظة: يؤدي استخدام التربسين لهضم بروتينات الهيستون إلى ببتيدات صغيرة للغاية يصعب تحديدها باستخدام إعدادات البروتينات التقليدية. لهذا السبب ، يستخدم أنهيدريد البروبيونيك لاشتقاق المجموعات الأمينية ɛ كيميائيا من بقايا ليسين غير المعدلة والأحادية الميثيل. هذا يقيد انحلال البروتيوسين التربسين إلى بقايا أرجينين C-terminal. وبالنسبة للعينات الموجودة في ألواح البئر ال 96، يوصى باستخدام ماصات وخزانات متعددة القنوات لالتقاط الكواشف (الشكل 2 ألف). يتم إجراء الاشتقاق أيضا بعد الهضم لتسمية N-termini الحر للببتيدات مما يزيد من كره الببتيد للماء وبالتالي الاحتفاظ الكروماتوغرافي في الطور المعكوس.

  1. إعادة تعليق العينات في 20 ميكرولتر من 15٪ -20٪ الأسيتونيتريل في 100 مللي متر بيكربونات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 8.0). دوامة لمدة 15 ثانية ، ثم تدور لأسفل عند 1000 × g لمدة 30 ثانية.
  2. إذا كانت هناك ثماني عينات أو أكثر، فانقل كل عينة معاد تعليقها إلى صفيحة من 96 بئرا.
    ملاحظة: إذا لم يتم نقل العينات إلى صفيحة 96 بئرا، يمكن استخدام ماصة أحادية القناة في الخطوات 6.3-6.7 و7.1-7.5 و8.1-8.5.
  3. تحت غطاء المحرك ، أضف 2 ميكرولتر من أنهيدريد البروبيونيك باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
  4. أضف بسرعة 10 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
    ملاحظة: حمض البروبيونيك هو نتاج التفاعل بين أنهيدريد البروبيونيك والأمينات الحرة من الببتيدات ويمكن أن يقلل من درجة الحموضة في العينة. يمكن إعادة تحديد الرقم الهيدروجيني 8 عن طريق إضافة هيدروكسيد الأمونيوم إلى العينة بنسبة 1:5 (v / v).
  5. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 8 باستخدام ورقة اختبار الرقم الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني > 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من الفورميك أو حمض الخليك. عندما > الرقم الهيدروجيني 10 ، يمكن وضع علامات على بقايا الأحماض الأمينية الأخرى مع pKa أعلى.
  6. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  7. كرر الخطوات 6.3-6.6. تضمن الجولة المزدوجة من بروبيونيل الهيستون كفاءة تفاعل كاملة تقريبا.
  8. جفف اللوحة في فراغ السرعة حتى تجف جميع الآبار تماما (~ 9 ساعات).
  9. انتقل إلى هضم التربسين أو تخزين العينات عند -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

7. هضم هيستون

ملاحظة: يتم هضم الهيستون إلى ببتيدات باستخدام التربسين ، الذي يقطع جانب الكربوكسيل من بقايا الأرجينين والليسين. ومع ذلك ، نظرا لأن البروبيونيل يعدل بقايا الليسين ، فإن بقايا الأرجينين فقط هي المشقوقة (الشكل 2B).

  1. تحضير محلول التربسين (25 نانوغرام / ميكرولتر في 50 mM NH4HCO3 ، الرقم الهيدروجيني 8.0). أضف 20 ميكرولتر من التربسين (500 نانوغرام) إلى كل عينة.
    1. لإعداد محلول 50 mM NH 4 HCO 3 ، قم بتخفيف محلول 100 mM NH4HCO3 1: 1 v / v بماء HPLC الصف.
  2. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 8 باستخدام ورقة اختبار الأس الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني > 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من حمض الفورميك أو حمض الخليك.
  3. هضم في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو احتضان في 37 درجةمئوية لمدة 6-8 ساعات.
  4. إذا كان ذلك ممكنا ، تحقق من درجة الحموضة بعد ~ 3 ساعات من الهضم ، لأنها قد تكون انخفضت. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم.
  5. أضف 5 ميكرولتر إضافية من محلول التربسين 50 نانوغرام / ميكرولتر (250 نانوغرام) واستمر في الهضم.
  6. انتقل إلى الجولة الثانية من البروبيونيل أو قم بتخزين العينات عند -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

8. اشتقاق الببتيد N-termini

ملاحظة: يحسن البروبيونيل لببتيدات الهيستون في المحطة N الاحتفاظ بأقصر الببتيدات عن طريق كروماتوغرافيا سائلة معكوسة الطور (على سبيل المثال ، الأحماض الأمينية 3-8 من هيستون H3) ، حيث تزيد مجموعة البروبيونيل من كره الببتيد للماء.

  1. تحت غطاء المحرك ، أضف 2 ميكرولتر من أنهيدريد البروبيونيك باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
  2. أضف بسرعة 10 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
    ملاحظة: حمض البروبيونيك هو نتاج التفاعل بين أنهيدريد البروبيونيك والأمينات الحرة من الببتيدات ، ويمكن أن يقلل من درجة الحموضة في العينة. يمكن إعادة تحديد الرقم الهيدروجيني 8 عن طريق إضافة هيدروكسيد الأمونيوم إلى العينة بنسبة 1:5 (v / v).
  3. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 8 باستخدام ورقة اختبار الرقم الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني > 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من الفورميك أو حمض الخليك. عندما > الرقم الهيدروجيني 10 ، يمكن وضع علامات على بقايا الأحماض الأمينية الأخرى مع pKa أعلى.
  4. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. كرر الخطوات 8.1-8.4. تضمن الجولة المزدوجة من بروبيونيل الهيستون كفاءة تفاعل كاملة تقريبا.
  6. جفف اللوحة في فراغ السرعة حتى تجف جميع الآبار تماما (~ 9 ساعات).
  7. انتقل إلى خطوة تحلية المياه أو قم بتخزين العينات عند -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

9. تحلية المياه وتنظيف العينات

ملاحظة: تتداخل الأملاح الموجودة في العينة مع تحليل مطياف الكتلة. كما يتم تأين الأملاح أثناء الرش الكهربائي ويمكن أن تمنع الإشارات من الببتيدات. يمكن أن تشكل الأملاح قنوات أيونية على الببتيدات ، مما يتسبب في أن يكون للببتيد المقرب كتلة مختلفة. هذا يقلل من كثافة إشارة الببتيد ويمنع التحديد السليم والكمية. ويوضح الشكل 2 جيم الإعداد لتحلية المياه.

  1. ابدأ في خلط راتنج HLB (50 مجم / مل في 100٪ acetonitrile) على لوحة تحريك مغناطيسية.
  2. تأكد من وجود لوحة تجميع 96 بئرا موضوعة أسفل لوحة مرشح البولي بروبيلين المكونة من 96 بئرا لجمع التدفق.
  3. أضف 70 ميكرولتر من تعليق HLB لكل بئر إلى لوحة المرشح. قم بتشغيل الفراغ برفق لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  4. اغسل الراتنج ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بتشغيل الفراغ برفق لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  5. أعد تعليق كل عينة في 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. تحقق من درجة الحموضة. يجب أن يكون ~ 2-3.
  6. قم بتحميل كل عينة في كل بئر. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية بلطف لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  7. يغسل مع 100 ميكرولتر 0.1٪ TFA. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية بلطف لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  8. استبدل لوحة التجميع بلوحة تجميع جديدة بسعة 96 بئرا.
  9. أضف 60 ميكرولتر من 60٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ TFA لكل بئر. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية بلطف لمنع الرش. جمع التدفق من خلال وتجف في فراغ السرعة.
  10. انتقل إلى LC-MS / MS أو قم بتخزينالعينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

10. تحليل الببتيد هيستون عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي

  1. قم بإعداد المراحل المتنقلة لتشغيلها على الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). المرحلة المتنقلة A (MPA): 2٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك. المرحلة المتنقلة B (MPB): 80٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك.
  2. برمجة طريقة HPLC على النحو التالي: (1) 4٪ -34٪ MPB على مدى 30 دقيقة. (2) 34٪ -90٪ MPB أكثر من 5 دقائق ؛ و (3) متساوي الأيزوقراط 90٪ MPB لمدة 5 دقائق. استخدم خصائص العمود الموصى بها التالية: C18 3 ميكرومتر مواد التعبئة ، 75 ميكرومتر القطر الداخلي ، 20-25 سم طول. اضبط معدل التدفق على 250-300 nL / min لأعمدة nano ذات القطر الداخلي 75 ميكرومتر.
    1. في حالة عدم برمجة HPLC لأتمتة توازن العمود قبل تحميل العينة ، قم بتضمين (4) 90٪ -4٪ MPB على مدى دقيقة واحدة و (5) متساوي الأيزوقراطي 4٪ MPB على مدى 10 دقائق.
  3. برمجة طريقة اكتساب MS.
    1. تأكد من أن الجهاز يقوم بإجراء فحص كامل واحد للتصلب المتعدد في بداية كل دورة عمل. يوصى باستخدام أجهزة عالية الدقة (مثل أجهزة تحليل المدار أو وقت الطيران) ، نظرا لدقة الكتلة التي يمكن استخدامها أثناء استخراج الإشارة. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام الأجهزة منخفضة الدقة كما هو موضح سابقا27,28.
    2. تأكد من أن فحص MS الكامل يتبعه 16 حدثا لفحص MS/MS، لكل منها عرض عزل يبلغ 50 m/z، ويمتد نطاق m/z من 300 إلى 1100. على سبيل المثال ، يجب أن يعزل الفحص الأول الإشارات عند 300-350 m / z ، والثاني عند 350-400 m / z ، إلخ. إذا كان ذلك ممكنا ، احصل على فحوصات MS / MS بدقة عالية أيضا ، ولكن الدقة المنخفضة مقارنة بفحص MS الكامل كافية (بسبب الكتل الأصغر من أيونات الشظايا مقارنة بالأيونات السليمة).
    3. ستقوم طريقة HPLC بإنشاء إشارات كروماتوغرافية بعرض ذروة يبلغ ~ 3-40 ثانية ؛ لضمان التحديد الكمي السليم للإشارة، تأكد من أن مقياس الطيف الكتلي يؤدي ما لا يقل عن 10 دورات عمل لكل ذروة كروماتوغرافية (أي دورة عمل مدتها 3 ثوان أو أسرع).
    4. في حالة استخدام محلل كتلة على غرار الملائمة (orbitrap ، مصيدة الأيونات) ، تأكد من تعيين الحد الزمني لحقن الأيونات على <200 مللي ثانية ؛ بالنسبة لأجهزة التحليل الأخرى (رباعية ، وقت الطيران) ، هذه ليست مشكلة بسبب وقت المسح الضوئي الأسرع. قد تكون هناك حاجة إلى اختبار أولي.
      ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول طرق MS لتحليل ببتيد الهيستون في المراجع التالية 27،28،29.
  4. إعادة تعليق العينة في 10 ميكرولتر من MPA ، والتي تتوافق مع ~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر من عينة هيستون المهضومة. كمية التحميل الدقيقة ليست حرجة (أيضا ليست تافهة للتقييم) إذا تم تحميل جميع العينات في الدفعة باستخدام تخفيفات وأحجام مماثلة.
  5. قم بتحميل 1 ميكرولتر من العينة على عمود HPLC.
  6. قم بتشغيل أسلوب LC-MS/MS المبرمج في الخطوات من 10.1 إلى 10.3.

11. تحليل البيانات

  1. استيراد ملفات البيانات الخام MS إلى برنامج مصمم لتنفيذ تكامل منطقة الذروة.
    ملاحظة: يستخدم EpiProfile 30,31 في الدراسة الحالية ويوصى به بشكل عام ، حيث تم تحسينه لاستخراج منطقة الذروة الموثوقة من ببتيدات هيستون المعروفة. ومع ذلك ، فإن البرامج الأخرى المتاحة مجانا لكروماتوغرافيا الأيونات المستخرجة مثل Skyline32,33 مناسبة.
  2. احسب الوفرة النسبية لببتيد معين (غير معدل) كمساحة ببتيد واحد مقسوما على المساحة الكلية للببتيد بجميع أشكاله المعدلة. تحتوي برامج مثل EpiProfile30,31 بالفعل على مكتبات من الببتيدات لاستخراج الإشارة. خلاف ذلك ، قم بإنشاء مكتبة من الببتيدات ذات الأهمية إما يدويا أو عن طريق تحديد الببتيد باستخدام خطوط أنابيب البروتينات الروتينية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، عولجت الكرويات HepG2 / C3A ب 20 mM Nabut و 10 mM NaSuc ، وكلاهما أثر على المستويات العالمية من PTMs الهيستون (الشكل 3A). ثم تم تحديد وقياس هيستون PTMs كميا على مستوى البقايا المفردة عن طريق اقتناء MS / MS (الشكل 3B).

عندما يتم تشغيل العينات في نسخ متماثلة ، يمكن إجراء تحليل إحصائي لتقييم إثراء تغيير الطية ل PTM بين العينات ، وكذلك قابلية تكرار الملاحظة. تظهر البيانات المعروضة أن الببتيدات المعدلة باستخدام ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يختلف تحليل PTMs الهيستون اختلافا جوهريا عن خط أنابيب تحليل البروتينات النموذجي. معظم PTMs هيستون لا يزال لها وظائف بيولوجية غامضة. ونتيجة لذلك، لا تتوفر التعليقات التوضيحية مثل أنطولوجيا الجينات أو قواعد بيانات المسارات. توجد العديد من الموارد التي تربط تعديلات الهيستون بالإنزيم المسؤول عن تحفيزها أو البروتينات التي تحتوي على مجالات تربط هذه PTMs (على سبيل المثال ، HISTome36). كذلك ، من الممكن التكهن بالحالة العامة للكروماتين عندما يتم تنظيم المستويات العالمية من PTMs الهيستون. على سبيل المثال ، ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف مختبر Sidoli بامتنان بمؤسسة أبحاث سرطان الدم (منحة Hollis Brownstein New Investigator Research Grant) ، و AFAR (جائزة Sagol Network GerOmics) ، و Deerfield (جائزة Xseed ) ، و Relay Therapeutics ، و Merck ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (1S10OD030286-01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05٪ محلول التربسين-EDTAGibco25300054
0.5-20 & micro ؛ L نصائح ماصةالعلامةالتجارية 13-889-172 (فيشر العلمية)
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةBio-Rad2239480
10 & micro ؛ L ماصة متعددة القنواتالعلامةالتجارية BR7059000 (Millipore Sigma) 10
مل حقنةHenke Sass Wolf14-817-31 (فيشر العلمية)طرف قفل لور ، متدرج إلى 12 مل
10 و 20 و 200 و 1000 & ماصات L أحادية القناةEppendorf14-285-904 (فيشر العلمية) 1000
& micro ؛ L نصائح ماصةRainin30389164
18 G إبرة حقنةAir-Tite14-817-100 (فيشر العلمية)3 "الطول ، 0.05" القطر
200 & ماصة L متعددة القنواتCorning4082
2-200 & micro; L نصائح ماصةالعلامةالتجارية Z740118 (Millipore Sigma)
24 جيدا لوحة دقيقة مرفقة منخفضةللغاية Corning07-200-602
75 سم 2< / sup>  ؛ قارورة زراعة الخلايا على شكل حرف UCorning461464Uغير معالجة ، مع غطاء تنفيس
96 بئر لوحةAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
الأسيتونفيشر ScientificA949-1الأسيتون بيكربونات
الأمونيوم الباردة (NH4< / sub>HCO3< / sub>)Sigma-AldrichA6141-25G
هيدروكسيد الأمونيوم الحلفيشر العلميAC423300250
ثقافة الخلية الصف المياهCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12المفاعل الحيوي لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد
ClinoStarCelVivoN / AClinostat CO2< / sub> حاضنة لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد
وحدةالتحكم CelVivoN / ATablet ل ClinoStar الإعدادات
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم ، بدون L-glutamine والفينول
الأحمر مصل بقري الجنين (FBS)Corning35-010-CV
حمض الفورميكThermo Scientific28905
غطاء الدخانMottN / Aموديل 7121000
زجاج ماصة باستورفيشر Scientific13-678-8B9 "، قطن متصل ، زجاج بورسليكات ،
مكمل جلوتاجروCorning25-015-CI200 ملي L-ananyl-L-glutamine
Hank محلول الملح المتوازن (HBSS)محلول Corning21-022-CV1X بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر
HPLC الصف أسيتونيتريلفيشر ScientificA955-4
HPLC درجة المياهفيشر ScientificW6-1
حمض الهيدروكلوريك (HCl) فيشرScientificA481-212
IceN / AN / A
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية Corning25-025-CI100X محلول
الواحة HLB راتنجالمياه186007549راتنج محب للماء والدهون المتوازنة (HLB) مع 30 & ميكرو ؛ م حجم الجسيمات
Orbitrap Fusion Lumos مطياف الكتلة TribridThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQمطياف الكتلة عالي الدقة
Oro-Flex I لوحة ترشيح البولي بروبيلينOrochemOF110096 جيدا من مادة البولي بروبلين ث / 10 & M PE فريت
البنسلين الستربتومايسينCorning30-002-CI100X محلول
ورق الأس الهيدروجينيZ111848 (سيجما ألدريتش)0-13 ورقة اختبار الأس الهيدروجيني
مسدس الماصةEppendorfZ666467 (Millipore Sigma) الشعيرات
الدموية PolymicroMolex50-110-7740 (فيشر العلمية)شعرية من السيليكا المنصهرة المرنة مع طلاء بوليميد, 75 & micro; معرف M × 363 & micro; M OD
البوليسترين 10 مل ماصات مصلية ، معقمةفيشرScientific 1367549
أنهيدريد بروبيونيكسيجما ألدريتش240311-50G
طرد مركزي مبردThermo Scientific75-217-420
راتنج Reprosil-PurMSWILR13. AQ.0003120 & Aring ؛ حجم المسام ، مرحلة C18-AQ ، 3 & micro ؛ حجم حبة
M RotatorClay Adams25477 (تداول المختبرات الأمريكية)خلاط Nutator 1105
التسلسل المعدل التربسينPromegaV5111
زبدات الصوديومThermo ScientificA11079
سكسينات الصوديوم ثنائي القاعدةSigma-Aldrich14160-100G
SpeedVac مكثف فراغ (1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة)Savant20249 (تداول المختبرات الأمريكية)
مكثف فراغ SpeedVac (96 بئر)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
غطاء معقمThermo Scientific1375الفئة الثانية ، النوع A2
حمض الكبريتيك (H2< / sub>SO4< / sub>)فيشر Scientific02-004-375كاشف
بيكر المحلل ACSزراعة الأنسجة المعالجة 100 مم × 20 مم طبقفيشر ساينتفيك08-772-23
حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA)AC421451000 العلميالحراري يعلق 100٪ وزن / حجم في حمض ثلاثي
فلورو أسيتيك من درجة HPLC (TFA)فيشر ساينتفيكPI28904درجة
مشعب فراغ 96 بئرMilliporeMAVM0960R
Vortexسيجما ألدريتشZ258415
حمام مائيفيشر FSGPD10
أطراف ماصة واسعة التجويف 1000 & LAxygen14-222-703 (فيشر العلمي)
أطراف ماصة واسعة التجويف 200 & مايكرو ؛ LAxygen14-222-730 (فيشر العلمي)
يجب استخدام محلول غير معقم أنابيب جهاز درجة تسلسل علمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  3. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973(2014).
  6. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).
  7. Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
  8. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
  10. Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
  11. Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
  12. Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).
  13. Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
  14. Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
  15. Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
  16. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  17. Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
  18. Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
  19. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  20. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  21. Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  22. Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
  23. Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
  24. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).
  25. Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
  26. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  27. Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
  28. Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
  29. Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
  30. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  31. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  32. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  33. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  34. Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
  35. Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
  36. Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).
  37. Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
  38. Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
  39. Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
  40. Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
  41. Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
  42. Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  43. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  44. Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
  45. Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).
  46. Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationsPost Translational Modifications3D Cell CultureHepatic SpheroidsChromatin StateLiquid Chromatography Mass SpectrometryHistone AcetylationHistone SuccinylationSpheroid FormationNuclei Isolation

Related Articles