Method Article

التنميط المكاني الرقمي لتوصيف البيئة المكروية في الورم الدبقي المتسلل بشكل منتشر من النوع البالغ

DOI:

10.3791/63620

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 3Department of Neurosurgery, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 4Dartmouth Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب خلل التنظيم البروتيني دورا مهما في انتشار الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر ، لكن العديد من البروتينات ذات الصلة لا تزال مجهولة الهوية. توفر المعالجة المكانية الرقمية (DSP) نهجا فعالا وعالي الإنتاجية لتوصيف التعبير التفاضلي للبروتينات المرشحة التي قد تساهم في غزو وهجرة الأورام الدبقية الارتشاحية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر بارتفاع معدلات المراضة والوفيات بسبب الطبيعة الارتشاحية لانتشار الورم. إنها أورام معقدة شكليا ، مع درجة عالية من التباين البروتيني عبر كل من الورم نفسه وبيئته المكروية غير المتجانسة. يتم تعزيز الإمكانات الخبيثة لهذه الأورام من خلال عدم تنظيم البروتينات المشاركة في العديد من المسارات الرئيسية ، بما في ذلك العمليات التي تحافظ على الاستقرار الخلوي وتحافظ على السلامة الهيكلية للبيئة المكروية. على الرغم من وجود العديد من تحليلات الورم الدبقي السائب وحيد الخلية ، إلا أن هناك ندرة نسبية في التقسيم الطبقي المكاني لهذه البيانات البروتينية. إن فهم الاختلافات في التوزيع المكاني للعوامل السرطانية ومجموعات الخلايا المناعية بين الورم الجوهري والحافة الغازية والبيئة المكروية يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الكامنة وراء تكاثر الورم وانتشاره. يمثل التنميط المكاني الرقمي (DSP) تقنية قوية يمكن أن تشكل الأساس لهذه التحليلات المهمة متعددة الطبقات.

DSP هي طريقة تحدد بكفاءة تعبير البروتين داخل المناطق المكانية المحددة من قبل المستخدم في عينة الأنسجة. يعد DSP مثاليا لدراسة التعبير التفاضلي للبروتينات المتعددة داخل وعبر مناطق التمييز ، مما يتيح مستويات متعددة من التحليل الكمي والنوعي. بروتوكول DSP منهجي وسهل الاستخدام ، مما يسمح بالتحليل المكاني المخصص للبيانات البروتينية. في هذه التجربة ، يتم إنشاء المصفوفات الدقيقة للأنسجة من الخزعات الأساسية للورم الأرومي الدبقي المؤرشفة. بعد ذلك ، يتم اختيار مجموعة من الأجسام المضادة ، تستهدف البروتينات ذات الأهمية داخل العينة. ثم يتم تحضين الأجسام المضادة ، التي يتم اقترانها مسبقا بقليل النيوكليوتيدات DNA القابل للأشعة فوق البنفسجية ، مع عينة الأنسجة طوال الليل. تحت التصور المجهري الفلوري للأجسام المضادة ، يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) التي يمكن من خلالها تحديد تعبير البروتين مع العينات. ثم يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى كل عائد استثمار ، مما يؤدي إلى شق قليل النيوكليوتيدات DNA. يتم استنشاق قليل النوكليوتيدات وحسابها داخل كل عائد استثمار ، مع تحديد البروتين المقابل على أساس مكاني.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر هي النوع الأكثر شيوعا من أورام الدماغ الخبيثة لدى البالغين وهي قاتلة دائما. يمثل ميل خلايا الورم الدبقي إلى الهجرة على نطاق واسع في الدماغ تحديا علاجيا كبيرا. وتنطوي الآلية التي تنتشر بها على الهجرة الموجهة والغزو دون رادع. وقد تبين أن خلايا الورم الدبقي الغازية تظهر الانتحاء والهجرة على طول مساحات المادة البيضاء1 ، مع الأبحاث الحديثة التي تنطوي على إزالة الميالين من هذه المسالك كميزة نشطة ، protumorigenic2. يتم التوسط في الغزو من خلال الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة ، حيث تكتسب خلايا الورم الدبقي خصائص اللحمة المتوسطة عن طريق تقليل التعبير عن الجينات التي تشفر بروتينات المصفوف....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع البروتوكول الموضح أدناه إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في دارتموث-هيتشكوك. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى الذين تم تضمين عينات أنسجتهم في هذه الدراسة. راجع قسم جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الشرائح17

  1. استرجع أو أعد الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين من الأورام الدبقية البشرية من النوع البالغ المتسلل بشكل منتشر.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام كتل خزعات مدمجة بالبارافين من ثلاثة مرضى يعانون من الورم الأرومي الدبقي.
  2. إنشاء كتلة ميكروأري الأنس....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 4 النتائج التمثيلية من تجربة DSP التي أجريت على عينات من الورم الأرومي الدبقي. يتم تقديم خريطة حرارية توضح إحدى الطرق التي يمكن من خلالها التقاط البيانات بصريا باستخدام برنامج DSP. تمثل الصفوف أهداف البروتين ، ويتوافق كل عمود مع منطقة الاهتمام. يشير نطاق الألوان من الأزرق إلى الأحمر إلى تعبير منخفض إلى مرتفع ، على التوالي. يعكس تباين اللون داخل الصف عدم تجانس البروتين الإقليمي ويشير إلى ارتباط مكاني محتمل مع تعبير البروتين التفاضلي. على سبيل المثال ، في التجربة الحالية ، S100 و CD.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لتنوع البروتينات التي يمكن أن تؤثر على عدوانية الأورام الدبقية وفكرة أن العديد من هذه البروتينات لا تزال غير مكتشفة ، فإن طريقة قياس كمية البروتين عالية الإنتاجية هي نهج تكنولوجي مثالي. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن البيانات المكانية في عينات الأورام غالبا ما ترتبط بالتعبير التفاضلي18 ، فإن دمج التنميط المكاني في نهج تحديد كمية البروتين يسمح بإجراء تحليل أكثر فعالية.

يتيح النهج عالي الإنتاجية ل DSP أيضا استخدامه في نهج يشبه البندقية ، وهو مثالي لاكتشاف المؤشرات .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بدعم مختبر علم الجينوم السريري والتكنولوجيا المتقدمة في قسم علم الأمراض والطب المخبري في نظام دارتموث هيتشكوك الصحي. يقر المؤلفون أيضا بالمورد المشترك لعلم الأمراض في مركز دارتموث للسرطان مع منحة دعم مركز السرطان NCI 5P30 CA023108-37.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نظام الكشف عن أبحاث BONDLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانياDS9455نظام الكشف المفتوح الذي يحتوي على حاويات مفتوحة في صينية كاشف
BOND WashLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانياAR95010X محلول عازل مركز لغسل الأنسجة
الثابتة Buffer WNanoString ، سياتل ، واشنطناتصل بشركةحظر
كاشف Cy3 مجموعة الاقترانAbcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدةAB188287مجموعة اقتران الأجسام المضادة الفلورية Cy3
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)NanoString ، سياتل ، واشنطن، شركة الاتصالبنظام لتصوير وتوصيف البروتين وأهداف الحمض النووي الريبي
GeoMx DSP Instrument BufferKitNanoString ، سياتل ، واشنطن100471مجموعة Buffer ل GeoMX DSP (بما في ذلك المخازن المؤقتة لمعالجة العينات وتحضيرها)
GeoMx Hyb Code Pack_ProteinNanoString ، سياتل ، واشنطن121300401عناصر التحكم لتشغيل GeoMX DSP experiemtns
لوحة الخلايا المناعية GeoMx (Imm Cell Pro_Hs) NanoString، سياتل ، واشنطن121300101وحدة البروتين مع أهداف للخلايا المناعية البشرية والأهداف المناعية للأورام
المناعية GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)NanoString ، سياتل ، واشنطن121300105وحدة البروتين مع أهداف لأنواع الأورام البشرية المتعددة وعلامات الانتقال الظهاري الوسيط
GeoMx Protein Slide Prep FFPENanoString ، سياتل ، واشنطن121300308كواشف تحضير العينة لتحليل البروتين GeoMX DSP
LEICA Bond RXLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانيااتصل بشركةمجموعة أدوات تلطيخ IHC المؤتمتة
بالكامل - 12 تفاعلاNanoString ، سياتل ، واشنطن100052المواد والكواشف للاستخدام مع نظام تحليل
nCounter نظام تحليلnCounter NanoString ، سياتل ، واشنطنشركة الاتصالبالنظام الآلي لقياس كمية التعبير المستهدف المتعدد (لاستخدامه مع GeoMx DSP)
TMA Master II3DHistech Ltd. ، بودابست ، المجرلإنشاء كتلة المصفوفة الدقيقة للأنسجة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
  2. Wang, J., et al. Invasion of white ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Digital Spatial ProfilingGlioma MicroenvironmentProtein Expression ProfilingTissue MicroarrayFluorescence MicroscopyRegion Of InterestTumor HeterogeneityImmune Cell ProfilingAntibody Oligonucleotide ConjugatesSpatial Proteomics

Related Articles