مقالة منهجية

التنميط المكاني الرقمي لتوصيف البيئة المكروية في الورم الدبقي المتسلل بشكل منتشر من النوع البالغ

DOI:

10.3791/63620

⸱

سبتمبر 13, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 3Department of Neurosurgery, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 4Dartmouth Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب خلل التنظيم البروتيني دورا مهما في انتشار الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر ، لكن العديد من البروتينات ذات الصلة لا تزال مجهولة الهوية. توفر المعالجة المكانية الرقمية (DSP) نهجا فعالا وعالي الإنتاجية لتوصيف التعبير التفاضلي للبروتينات المرشحة التي قد تساهم في غزو وهجرة الأورام الدبقية الارتشاحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر بارتفاع معدلات المراضة والوفيات بسبب الطبيعة الارتشاحية لانتشار الورم. إنها أورام معقدة شكليا ، مع درجة عالية من التباين البروتيني عبر كل من الورم نفسه وبيئته المكروية غير المتجانسة. يتم تعزيز الإمكانات الخبيثة لهذه الأورام من خلال عدم تنظيم البروتينات المشاركة في العديد من المسارات الرئيسية ، بما في ذلك العمليات التي تحافظ على الاستقرار الخلوي وتحافظ على السلامة الهيكلية للبيئة المكروية. على الرغم من وجود العديد من تحليلات الورم الدبقي السائب وحيد الخلية ، إلا أن هناك ندرة نسبية في التقسيم الطبقي المكاني لهذه البيانات البروتينية. إن فهم الاختلافات في التوزيع المكاني للعوامل السرطانية ومجموعات الخلايا المناعية بين الورم الجوهري والحافة الغازية والبيئة المكروية يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الكامنة وراء تكاثر الورم وانتشاره. يمثل التنميط المكاني الرقمي (DSP) تقنية قوية يمكن أن تشكل الأساس لهذه التحليلات المهمة متعددة الطبقات.

DSP هي طريقة تحدد بكفاءة تعبير البروتين داخل المناطق المكانية المحددة من قبل المستخدم في عينة الأنسجة. يعد DSP مثاليا لدراسة التعبير التفاضلي للبروتينات المتعددة داخل وعبر مناطق التمييز ، مما يتيح مستويات متعددة من التحليل الكمي والنوعي. بروتوكول DSP منهجي وسهل الاستخدام ، مما يسمح بالتحليل المكاني المخصص للبيانات البروتينية. في هذه التجربة ، يتم إنشاء المصفوفات الدقيقة للأنسجة من الخزعات الأساسية للورم الأرومي الدبقي المؤرشفة. بعد ذلك ، يتم اختيار مجموعة من الأجسام المضادة ، تستهدف البروتينات ذات الأهمية داخل العينة. ثم يتم تحضين الأجسام المضادة ، التي يتم اقترانها مسبقا بقليل النيوكليوتيدات DNA القابل للأشعة فوق البنفسجية ، مع عينة الأنسجة طوال الليل. تحت التصور المجهري الفلوري للأجسام المضادة ، يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) التي يمكن من خلالها تحديد تعبير البروتين مع العينات. ثم يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى كل عائد استثمار ، مما يؤدي إلى شق قليل النيوكليوتيدات DNA. يتم استنشاق قليل النوكليوتيدات وحسابها داخل كل عائد استثمار ، مع تحديد البروتين المقابل على أساس مكاني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر هي النوع الأكثر شيوعا من أورام الدماغ الخبيثة لدى البالغين وهي قاتلة دائما. يمثل ميل خلايا الورم الدبقي إلى الهجرة على نطاق واسع في الدماغ تحديا علاجيا كبيرا. وتنطوي الآلية التي تنتشر بها على الهجرة الموجهة والغزو دون رادع. وقد تبين أن خلايا الورم الدبقي الغازية تظهر الانتحاء والهجرة على طول مساحات المادة البيضاء1 ، مع الأبحاث الحديثة التي تنطوي على إزالة الميالين من هذه المسالك كميزة نشطة ، protumorigenic2. يتم التوسط في الغزو من خلال الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة ، حيث تكتسب خلايا الورم الدبقي خصائص اللحمة المتوسطة عن طريق تقليل التعبير عن الجينات التي تشفر بروتينات المصفوفة خارج الخلية وجزيئات التصاق الخلايا ، وتضخيم الهجرة وتسهيل الانتشار من خلال البيئة المكروية للورم3،4،5.

على المستوى الجزيئي ، تم إثبات اضطراب العديد من البروتينات التي تمنح الاستقرار الخلوي والتفاعل مع المكونات المناعية6. من المعروف أن الأورام الدبقية الارتشاحية تخضع لقمع البروتينات ذات الخصائص المضادة للموت المبرمج (على سبيل المثال ، PTEN)7. كما أنها تفرط في التعبير عن البروتينات التي تعزز التهرب من الاستجابة المناعية للمضيف (على سبيل المثال ، PD1 / PDL1)8. يعزز عدم تنظيم هذه المسارات المعقدة الورم ويزيد من الإمكانات الخبيثة.

ضمن عينات الورم الدبقي الغازي ، كان الهدف هو تقييم التعبير التفاضلي للبروتينات الرئيسية لنمو الخلايا وبقائها وانتشارها ، والتكامل الهيكلي للبيئة المكروية بين المكونات الغازية وغير الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، سعينا إلى دراسة التنظيم التفاضلي للبروتينات ذات الدور المناعي النشط ، وتقديم نظرة ثاقبة للآلية التي يمكن من خلالها للدفاعات المناعية للمضيف المخترقة أن تعزز الإمكانات التكاثرية والغازية للأورام الدبقية. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى اتساع نطاق الأبحاث الحديثة التي توضح كيف يمكن أن تكون علامات المناعة ودوافع عدم التنظيم في الورم الخبيث بمثابة أهداف للعلاج المناعي. يتطلب تحديد الأهداف العلاجية القابلة للتطبيق بين العديد من البروتينات المشاركة في المراقبة المناعية والتفاعل نهجا حساسا وشاملا للغاية.

بالنظر إلى المجموعة الواسعة من البروتينات المرشحة التي يمكن دراستها ، سعينا إلى طريقة أقرب إلى الكيمياء الهيستولوجية المناعية ولكن مع كفاءة معالجة البيانات المحسنة. في مجال بيولوجيا السرطان ، برزت DSP كتقنية قوية ذات مزايا مهمة على الأدوات البديلة للتحليل البروتيني والقياس الكمي. السمة المميزة ل DSP هي قدرتها على تعدد الإرسال عالية الإنتاجية ، مما يسمح بالدراسة المتزامنة للعديد من البروتينات المختلفة داخل العينة ، مما يمثل تمييزا مهما عن التقنيات القياسية ولكن الأقل تكرارا مثل الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) 9,10. لا تؤثر ميزة تعدد الإرسال في DSP على دقتها كأداة كمية وتحليلية ، كما يتضح من الدراسات التي تقارن DSP ب IHC. عند استخدامه للقياس الكمي البروتيني لعينات سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة ، على سبيل المثال ، فقد ثبت أن DSP له نتائج مماثلة ل IHC11. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر DSP مواصفات إقليمية قابلة للتخصيص ، حيث يمكن للمستخدمين تحديد المناطق يدويا لإجراء تحليل بروتيني. هذا يمثل ميزة على طرق تعدد الإرسال ذات القسم الكامل10,12. في جولة واحدة من المعالجة ، يقدم DSP طبقات متعددة من التحليل من خلال مسح العديد من أهداف البروتين عبر مناطق متعددة ذات أهمية.

DSP له تطبيقات في العديد من الإعدادات المرضية المختلفة. يعد DSP مفيدا بشكل خاص في تحليل الأورام ، حيث يمكن أن يرتبط التباين المكاني بالتحول الخلوي والتعبير التفاضلي للبروتين. على سبيل المثال ، تم استخدام DSP لمقارنة الملف البروتيني لسرطان الثدي بالبيئة المكروية للورم المجاورة. هذا يحمل آثارا مهمة لفهم التاريخ الطبيعي لهذا الورم وتطوره ، وكذلك الاستجابة المحتملة للعلاج13. تشمل السياقات الإضافية التي توضح تنوع DSP القياس الكمي المكاني لتنوع البروتين في سرطان البروستاتا14 ، وارتباط تعبير علامة الخلايا المناعية بتطور المرض في سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة 15 ، وإظهار التدرج الظهاري - الوسيطة لتعبير البروتين الذي يميز سرطان المبيض النقيلي عن سرطان المبيض الأولي الصافي16 . من خلال تنفيذ DSP ، نقوم بتوصيف التضاريس المكانية للبروتينات التي يمكن أن تؤثر على تكوين الورم وغزو الأورام الدبقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع البروتوكول الموضح أدناه إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في دارتموث-هيتشكوك. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى الذين تم تضمين عينات أنسجتهم في هذه الدراسة. راجع قسم جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الشرائح17

  1. استرجع أو أعد الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين من الأورام الدبقية البشرية من النوع البالغ المتسلل بشكل منتشر.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام كتل خزعات مدمجة بالبارافين من ثلاثة مرضى يعانون من الورم الأرومي الدبقي.
  2. إنشاء كتلة ميكروأري الأنسجة (TMA). خذ عدة نوى 2 مم من كل خزعة وضعها في كتلة TMA واحدة (الشكل 1 ، أعلى). قم بقص المقاطع من كتلة TMA عند 4 ميكرومتر وقم بتركيبها على شرائح زجاجية. ضع كل شريحة داخل حشية حامل المنزلق. احتضان الشريحة عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

2. إعداد نظام IHC شبه الآلي وتكوين البرامج (لتحميل وتشغيل الشرائح)17

  1. قم بإعداد الكواشف. انقر فوق الزر "إعداد الكاشف ". انقر فوق إضافة في علامة التبويب الإعداد .
    1. قم بتسجيل مخزن مؤقت للغسيل عن طريق كتابة اسم له في حقل الاسم . حدد ملحق في حقل النوع . انقر فوق حفظ.
    2. قم بتسجيل حل حظر عن طريق تكرار نفس الخطوات المذكورة أعلاه (تم تعديلها حسب الاقتضاء ، على سبيل المثال ، في حقل الاسم) ، ولكن مع تحديد الجسم المضاد الأساسي في حقل النوع. حدد البروتوكولات المطلوبة في المربعات المنسدلة لبروتوكول التلوين الافتراضي وبروتوكول HIER الافتراضي. حدد خيار بروتوكول الإنزيم الافتراضي إذا رغبت في ذلك (تم ترك هذا المربع فارغا في البروتوكول الحالي). انقر فوق حفظ.
  2. سجل نظام الكشف ، الذي يتكون من علبة حاوية كاشف مشفرة بالباركود. امسح الرمز الشريطي ضوئيا.
    1. ابدأ في إدخال تفاصيل نظام الكاشف في نافذة إضافة نظام كاشف البحوث . اكتب اسما لنظام الكشف.
    2. اكتب تاريخ انتهاء الصلاحية. قم بتمييز الصف الأول من مخطط الكواشف وامسح الرمز الشريطي لحاوية كاشف جديدة سعة 30 مل ، وفي ذلك الوقت سيتم ملء الرمز الشريطي بالصف 1.
    3. ضع الحاوية في الموضع 1 من نظام الكشف. حدد اسم المخزن المؤقت للغسيل في المربع المنسدل لعمود الكاشف وانقر فوق إضافة. كرر هذه الخطوات لإضافة أي كواشف إضافية في الصفوف اللاحقة ، بما في ذلك حل الحظر.
  3. قم بإعداد بروتوكول البروتين ل IHC. انقر فوق إعداد البروتوكول. قم بتمييز الصف المقابل للبروتوكول المطلوب وانقر فوق نسخ. أدخل الاسم واملأ أي حقول أخرى ذات صلة في نافذة تحرير خصائص البروتوكول .
    1. حدد المربع لإظهار خطوات الغسيل. تأكد من صحة حقلي Inc (min) و DispenseType لكل كاشف (10 دقائق لمحلول الحجب ، و 0 دقيقة للمخزن المؤقت للغسيل ، و 150 ميكرولتر لكل DispenseType). انقر فوق حفظ.
  4. تحضير الدراسة. املأ الحاوية في الموضع 1 بمخزن غسيل مؤقت. املأ 150 ميكرولتر لكل شريحة و 5 مل من الحجم الميت ؛ اترك الغطاء مفتوحا. كرر هذه الخطوات للحاوية في الموضع 2 ، والتي يجب ملؤها بمحلول حظر. يجب أن تحتوي هذه الحاوية على 150 ميكرولتر لكل شريحة و 350 ميكرولتر من الحجم الميت.
    1. قم بتحميل درج حاوية الكاشف على الجهاز. اسمح للنظام بإجراء إجراءات التعرف على الحاوية وتأكيد الحجم. انقر فوق إعداد الشريحة | إضافة دراسة. أدخل معرف الدراسة واسم الدراسة وحدد 150 ميكرولتر ضمن حجم التوزيع | البروتوكول المطلوب في القائمة المنسدلة لبروتوكول التحضير (يقترح Bake and Dewax ). قم بتمييز الدراسة وانقر فوق إضافة شريحة.
    2. حدد أنسجة الاختبار تحت نوع الأنسجة | 150 ميكرولتر تحت حجم الاستغناء | مفرد وروتيني من مربعات القائمة المنسدلة وضع التلطيخ . حدد عملية (IHC للدراسة الحالية) | اسم حل الحظر في المربع المنسدل لحقل العلامة | بروتوكول IHC DSP في حقل التلوين في علامة التبويب البروتوكولات | * اخبز وأزيل الشمع للتحضير | * HIER 20 دقيقة مع ER1 ل HIER. اترك حقل الإنزيم فارغا.
    3. كرر هذه العملية لكل شريحة. انقر فوق إغلاق بمجرد الانتهاء ، ثم انقر فوق طباعة الملصقات. تحقق من جميع ملصقات الشرائح التي لم تتم طباعتها بعد للدراسة الحالية وانقر فوق طباعة. قم بتثبيت الملصقات على أعلى الشرائح.
  5. تحميل وتشغيل الشرائح. قم بتحميل الشرائح على درج الشرائح ، مع التأكد من أن العينة والملصق متجهان لأعلى. ضع بلاط الغطاء فوق الشرائح ، مع التأكد من توجيه الشرائح بعلامات تبويب في الأسفل. قم بتحميل صواني الشرائح على الجهاز.
    1. اضغط على زر LED لخفض الدرج والسماح للأداة ببدء المسح الضوئي والتعرف على الشرائح. انقر فوق الزر " ابدأ" لبدء التجربة.
  6. قم بإنهاء التجربة. اضغط على زر LED عندما يومض باللون الأخضر ، مما يشير إلى اكتمال التشغيل. قم بإزالة الدرج من الجهاز ، وارفع بلاط الغطاء بعناية من كل شريحة. ضع الشرائح في محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد ، وحدد كل قسم من الأنسجة بقلم كاره للماء لإنشاء حاجز كاره للماء.

3. حضانة الأجسام المضادة وتلطيخ النوى17

  1. حدد لوحة من الأجسام المضادة لتحديد موقع المستضدات ذات الأهمية (انظر الجدول 1 للأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة).
    ملاحظة: تم بالفعل اقتران كل جسم مضاد بقليل النوكليوتيد DNA مع مقطع قابل للأشعة فوق البنفسجية (PC-oligo) يحدده بشكل فريد (فهرسة oligos، الشكل 2).
  2. اصنع حلا فعالا للأجسام المضادة PC-oligo عن طريق إضافة ، لكل شريحة ، 8 ميكرولتر من كل جسم مضاد (مخفف 1:40) في اللوحة. استخدم كاشف الحجب كمخفف للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر لكل شريحة. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية (الشكل 3 ، الخطوة 1).
    ملاحظة: يمكن أيضا إضافة علامات التشكل أو الأصباغ البيولوجية أو الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت إلى المحلول في هذه الخطوة.
  3. في اليوم التالي ، ضع الشريحة في جرة كوبلين واغسلها 3 × 10 دقائق في 1x TBS-T. Postfix في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها 2 × 5 دقائق في 1x TBS-T.
  4. أضف صبغة SYTO13 النووية (مخففة 1:10 في 1x TBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 2x ب 1x TBS-T ، ثم قم بتخزين الشريحة في 1x TBS-T.

4. التصور الفلوري ، وتحديد عائد الاستثمار ، والانقسام الضوئي للأشعة فوق البنفسجية على أداة DSP17

  1. بعد تمرير الماوس فوق جمع البيانات في مركز التحكم ، حدد جديد / متابعة تشغيل.
  2. ضع الشريحة في حامل الشريحة، مع وضع التسمية باتجاه المستخدم. قم بخفض مشبك درج الشريحة ، وتأكد من أن الأنسجة مرئية في النافذة الممدودة. أضف 6 مل من Buffer S.
  3. اتبع المطالبات في مركز التحكم. قم بالتكبير/التصغير بين المحاور المختلفة باستخدام منزلقات X وY لتحديد منطقة للمسح الضوئي. حدد مسح ضوئي. اسمح للفحص بالمتابعة حتى يتم تصوير المنطقة المستهدفة المحددة بالكامل.
  4. قم بإنشاء صورة 20x. حدد عائد الاستثمار إما تلقائيا أو يدويا (الشكل 3 ، الخطوة 2). لاتباع هذا البروتوكول ، حدد ثلاثة عائد استثمار دائري متساوي الحجم (قطر 250 ميكرومتر) لكل نواة نسيج (الشكل 4 ، أسفل).
    ملاحظة: عائد الاستثمار قابل للتخصيص من حيث الحجم والشكل. يمكن تحديد العديد من عائد الاستثمار داخل كل قسم. في هذه التجربة ، يتم تحديد عائد الاستثمار الدائري يدويا.
  5. وافق على عائد الاستثمار بالنقر فوق الزر "الخروج من مساحة عمل المسح الضوئي ". انتظر حتى يشق ضوء الأشعة فوق البنفسجية oligos من الأجسام المضادة.
  6. عند اكتمال عملية أداة التنظيف ، حدد جمع بيانات جديد لمتابعة الشرائح أو اللوحة الحالية. وإلا، فحدد إزالة الشرائح واللوحة الدقيقة.
  7. افتح نافذة إنهاء اللوحة بالنقر المزدوج على منطقة أيقونة اللوحة في أسفل يمين مركز التحكم. إذا كان رقم حزمة رمز التهجين (Hyb) معروفا ، فأدخل الرقم وانقر فوق تحديث (اختياري أثناء هذه الخطوة). انقر فوق إنهاء.
  8. افصل حامل الشريحة ولوحة التجميع باتباع المطالبات. قم بتخزين الشرائح في TBS-T. إذا لم يتم استخدام الشرائح لفترة طويلة ، فقم بتغطيتها بوسط مائي وغطاء غطاء.

5. قراءات البروتين17

  1. استخدم ختما قابلا للنفاذ وجفف الفتحات عند 65 درجة مئوية في دورة حرارية مع فتح الجزء العلوي. أضف 7 ميكرولتر من المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات واخلطها. احتضن في RT لمدة 10 دقائق ، ثم قم بالدوران بسرعة.
  2. اختر معادلات المسبار R والمسبار U المناسبة من الجدول 2 لتوجيه إنشاء مزيج المسبار / المخزن المؤقت. بناء على عدد رموز Hyb اللازمة للتهجين في التجربة الحالية ، قم بتطبيق المعادلة (1) على النحو التالي. تخلط وتدور بسرعة.
    # Hyb رموز مسبار R مسبار تجمع العمل U مخزن تهجين تجمع العمل n = _____ (n × 8 ميكرولتر) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
  3. أضف 84 ميكرولتر من مزيج المسبار / المخزن المؤقت إلى كل حزمة Hyb Code لاستخدامها. نفض الغبار لخلط وتدور لأسفل. في لوحة تهجين جديدة مكونة من 96 بئرا ، أضف 8 ميكرولتر من كل Hyb Code Master Mix إلى جميع الآبار ال 12 في الصف المشار إليه.
  4. انقل 7 ميكرولتر من لوحة تجميع DSP إلى البئر المقابل في لوحة التهجين. تخلط بلطف. ختم الحرارة وإجراء تدور سريع. ثم احتضنها طوال الليل عند 67 درجة مئوية. تبريد لوحة على الجليد وإجراء تدور سريع.
  5. قم بتجميع منتجات hyb من كل بئر في أنبوب شريطي ، وقم بضخ كل بئر برفق 5x للخلط. قم بتغطية أنبوب الشريط وقم بتدويره. قم بتجميد أي منتجات hyb غير مجمعة متبقية عند -80 درجة مئوية. قم بتحميل أنابيب الشريط في نظام التحليل.
  6. احفظ ملف CDF على محرك أقراص USB ، ثم انقل البيانات من أداة DSP إلى المحلل الرقمي. أكمل الإعداد عن طريق تنفيذ الخطوات التالية.
    1. قم بتحميل المواد الاستهلاكية والعينات المجمعة على محطة الإعداد. على الشاشة، اضغط على بدء المعالجة. حدد حساسية عالية، متبوعا بالتالي. اضغط على اختيار الكل لعدد الآبار التي تحتوي على عينات | إنهاء | التالي على إشعار البريد الإلكتروني | بداية.
    2. بمجرد الانتهاء من محطة التحضير ، أغلق الخرطوشة وانقلها إلى المحلل الرقمي. اضغط على بدء العد ، وحدد موضع المرحلة ، واضغط على تحميل ملف CDF الحالي وحدد الملف الذي تم تحميله مسبقا. اضغط على تم، وحدد موضع المرحلة مرة أخرى، واضغط على تم | ابدأ في تشغيل البرنامج.
  7. احفظ الملف المضغوط لملفات تحويل عدد المراسلين من نظام التحليل إلى محرك أقراص USB ثم قم بإدراج محرك الأقراص في جهاز DSP. في مركز تحكم DSP ، مرر مؤشر الماوس فوق جمع البيانات ، ثم انقر فوق تحميل التهم. حدد الملف المضغوط ذي الصلة.

6. تحليل البيانات17

  1. انقر فوق السجلات في مركز تحكم DSP. لعرض عمليات الفحص في قائمة الانتظار، حدد إضافة عمليات المسح الضوئي المحددة إلى قائمة الانتظار | قائمة انتظار التحليل الخاصة بي. حدد دراسة جديدة من قائمة الانتظار بعد التمرير فوق خيار تحليل البيانات في مركز التحكم.
  2. اختر مراقبة الجودة من خيارات شريط المهام. استمر في القيم الافتراضية أو اضبطها إذا رغبت في ذلك. حدد تشغيل مراقبة الجودة وراجع شبكة النتائج. انقر فوق تشغيل مراقبة الجودة للمتابعة وإنشاء مجموعة بيانات جديدة ، وتطبيع القيم إلى عناصر التحكم في التهجين الإيجابي.
  3. قم باستيراد العلامات الجديدة إلى ملف XLSX. حدد إدارة التعليقات التوضيحية في جزء عمليات الفحص ، ثم قم بتنزيل قالب، وأدخل العلامات، واستورد الملف.
  4. اختياري: بعد تشغيل QC ، اضبط البيانات بشكل أكبر باستخدام خيارات شريط الأدوات الأخرى. استخدم الأدوات الموجودة في جزء المرئيات لرسم البيانات المحولة.
  5. انتقل إلى مربع القائمة المنسدلة الرمادي للمعلمات لإنشاء كل مخطط في جزء المرئيات . حدد منطقة معينة داخل مخطط لتصور المقاطع المميزة المقابلة في جزء عمليات المسح وانقر بزر الماوس الأيمن لإنشاء علامات أو مجموعات. ضمن ملخص مجموعة البيانات، راجع المخططات من التسوية والقياس والخيارات الأخرى للتحليل والعرض.
  6. احفظ تصورا عن طريق تحديد الرمز المراد حفظه ؛ راجع المرئيات المحفوظة بالفعل ضمن الملخص. حدد الزر تصدير (.svg) لتصدير مرئيات بتنسيق .svg. تصدير البيانات التي يعتمد عليها التصور بالنقر فوق الزر تصدير (.xlsx). قم بتصدير جميع البيانات الموجودة في مجموعة بيانات محددة عن طريق تحريك المؤشر فوق اسم مجموعة البيانات في الجزء الثاني والنقر فوق رمز التصدير .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 4 النتائج التمثيلية من تجربة DSP التي أجريت على عينات من الورم الأرومي الدبقي. يتم تقديم خريطة حرارية توضح إحدى الطرق التي يمكن من خلالها التقاط البيانات بصريا باستخدام برنامج DSP. تمثل الصفوف أهداف البروتين ، ويتوافق كل عمود مع منطقة الاهتمام. يشير نطاق الألوان من الأزرق إلى الأحمر إلى تعبير منخفض إلى مرتفع ، على التوالي. يعكس تباين اللون داخل الصف عدم تجانس البروتين الإقليمي ويشير إلى ارتباط مكاني محتمل مع تعبير البروتين التفاضلي. على سبيل المثال ، في التجربة الحالية ، S100 و CD...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لتنوع البروتينات التي يمكن أن تؤثر على عدوانية الأورام الدبقية وفكرة أن العديد من هذه البروتينات لا تزال غير مكتشفة ، فإن طريقة قياس كمية البروتين عالية الإنتاجية هي نهج تكنولوجي مثالي. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن البيانات المكانية في عينات الأورام غالبا ما ترتبط بالتعبير التفاضلي18 ، فإن دمج التنميط المكاني في نهج تحديد كمية البروتين يسمح بإجراء تحليل أكثر فعالية.

يتيح النهج عالي الإنتاجية ل DSP أيضا استخدامه في نهج يشبه البندقية ، وهو مثالي لاكتشاف المؤشرات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بدعم مختبر علم الجينوم السريري والتكنولوجيا المتقدمة في قسم علم الأمراض والطب المخبري في نظام دارتموث هيتشكوك الصحي. يقر المؤلفون أيضا بالمورد المشترك لعلم الأمراض في مركز دارتموث للسرطان مع منحة دعم مركز السرطان NCI 5P30 CA023108-37.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام الكشف عن أبحاث BONDLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانياDS9455نظام الكشف المفتوح الذي يحتوي على حاويات مفتوحة في صينية كاشف
BOND WashLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانياAR95010X محلول عازل مركز لغسل الأنسجة
الثابتة Buffer WNanoString ، سياتل ، واشنطناتصل بشركةحظر
كاشف Cy3 مجموعة الاقترانAbcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدةAB188287مجموعة اقتران الأجسام المضادة الفلورية Cy3
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)NanoString ، سياتل ، واشنطن، شركة الاتصالبنظام لتصوير وتوصيف البروتين وأهداف الحمض النووي الريبي
GeoMx DSP Instrument BufferKitNanoString ، سياتل ، واشنطن100471مجموعة Buffer ل GeoMX DSP (بما في ذلك المخازن المؤقتة لمعالجة العينات وتحضيرها)
GeoMx Hyb Code Pack_ProteinNanoString ، سياتل ، واشنطن121300401عناصر التحكم لتشغيل GeoMX DSP experiemtns
لوحة الخلايا المناعية GeoMx (Imm Cell Pro_Hs) NanoString، سياتل ، واشنطن121300101وحدة البروتين مع أهداف للخلايا المناعية البشرية والأهداف المناعية للأورام
المناعية GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)NanoString ، سياتل ، واشنطن121300105وحدة البروتين مع أهداف لأنواع الأورام البشرية المتعددة وعلامات الانتقال الظهاري الوسيط
GeoMx Protein Slide Prep FFPENanoString ، سياتل ، واشنطن121300308كواشف تحضير العينة لتحليل البروتين GeoMX DSP
LEICA Bond RXLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانيااتصل بشركةمجموعة أدوات تلطيخ IHC المؤتمتة
بالكامل - 12 تفاعلاNanoString ، سياتل ، واشنطن100052المواد والكواشف للاستخدام مع نظام تحليل
nCounter نظام تحليلnCounter NanoString ، سياتل ، واشنطنشركة الاتصالبالنظام الآلي لقياس كمية التعبير المستهدف المتعدد (لاستخدامه مع GeoMx DSP)
TMA Master II3DHistech Ltd. ، بودابست ، المجرلإنشاء كتلة المصفوفة الدقيقة للأنسجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
  2. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
  3. Iwadate, Y. Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression. Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).
  4. Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183(2020).
  5. Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
  6. Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
  7. Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas. Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).
  8. Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
  9. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  10. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  11. Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
  12. Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253(2022).
  13. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  14. Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426(2021).
  15. Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349(2021).
  16. Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
  17. GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
  18. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  19. Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
  20. Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
  21. Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
  22. Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
  23. Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
  24. Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
  25. Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
  26. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  27. Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
  28. Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928(2021).
  29. Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366(2016).
  30. Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
  31. NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Digital Spatial ProfilingGlioma MicroenvironmentProtein Expression ProfilingTissue MicroarrayFluorescence MicroscopyRegion Of InterestTumor HeterogeneityImmune Cell ProfilingAntibody Oligonucleotide ConjugatesSpatial Proteomics

مقالات ذات صلة