مقالة منهجية

علم الوراثة العكسي لهندسة متغيرات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي

1.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63685

⸱

يونيو 9, 2022

 ,  ,  , 
1Virology Section, Department of Life Sciences, Shiv Nadar University, 2Gastroenterology, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول طريقة لإدخال التنوع الجيني الذي يمكن التحكم فيه في جينوم فيروس التهاب الكبد C من خلال الجمع بين تخليق الحمض النووي الريبي الطافر كامل الطول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ وعلم الوراثة العكسي. توفر الطريقة نموذجا لاختيار النمط الظاهري ويمكن استخدامها لجينومات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي التي يبلغ طولها 10 كيلوبايت.

الملخص

أدى عدم وجود طريقة ملائمة للتوليد التكراري للمتغيرات الفيروسية المتنوعة كاملة الطول إلى إعاقة دراسة التطور الموجه في فيروسات الحمض النووي الريبي. من خلال دمج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكامل المعرض لخطأ جينوم الحمض النووي الريبي وعلم الوراثة العكسي ، يمكن إحداث طفرات استبدال عشوائية على مستوى الجينوم. لقد طورنا طريقة باستخدام هذه التقنية لتجميع مكتبات متنوعة لتحديد الطفرات الفيروسية ذات الأنماط الظاهرية ذات الاهتمام. وتوفر هذه الطريقة، التي تسمى تخليق الحمض النووي الريبي الطافر الكامل الطول (FL-MRS)، المزايا التالية: (أ) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ج) القدرة على (ii) القدرة على إنشاء مجموعات من المكتبات بمستويات متفاوتة من التنوع الجيني عن طريق التلاعب بإخلاص بوليميراز الحمض النووي؛ (iii) إنشاء منتج PCR كامل الطول يمكن أن يكون بمثابة نموذج مباشر لتخليق الحمض النووي الريبي الطافر ؛ و (iv) القدرة على إنشاء الحمض النووي الريبي الذي يمكن تسليمه إلى الخلايا المضيفة كتجمع إدخال غير محدد لفحص الطفرات الفيروسية للنمط الظاهري المطلوب. لقد وجدنا ، باستخدام نهج الوراثة العكسية ، أن FL-MRS هي أداة موثوقة لدراسة التطور الموجه للفيروسات في جميع مراحل دورة حياة فيروس التهاب الكبد C ، عزل JFH1. يبدو أن هذه التقنية أداة لا تقدر بثمن لتوظيف التطور الموجه لفهم التكيف والتكرار ودور الجينات الفيروسية في التسبب في المرض والمقاومة المضادة للفيروسات في فيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي.

المقدمة

يبدأ الفحص الجيني الأمامي بنمط ظاهري فيروسي مثير للاهتمام ، ثم ، من خلال تسلسل جينومه ومقارنته بجينوم السلالة الأصلية ، يحاول تحديد الطفرة (الطفرات) التي تسبب هذا النمط الظاهري. في المقابل ، في الشاشات الجينية العكسية ، يتم إدخال طفرات عشوائية في الجين المستهدف ، يليها فحص النمط الظاهري (الأنماط الظاهرية) الناتج1. بالنسبة لنهج الوراثة العكسية ، فإن الطفرات في المختبر هي التقنية الأكثر استخداما لإنشاء مجموعة من المتغيرات التي يتم فحصها لاحقا بحثا عن الأنماط الظاهرية ذات الأهمية. تم الإبلاغ عن أدوات وراثية مختلفة لتحقيق طفرات عشوائية على مستوى الجينوم لفيروسات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ (ep-PCR) 2,3 ، وتمديد البلمرةالدائري 4 ، وطفرات إدخال Mu-transposon 5،6،7. تنتج الطريقتان الأخيرتان مكتبات تؤوي تنوعا محدودا في التسلسل وهي عرضة لإدخال عمليات إدراج وحذف كبيرة ، وهي قاتلة للغاية للفيروسات وتحد بشدة من استعادة المتغيرات الفيروسية المعدية.

EP-PCR هي تقنية طفرات قوية معروفة تستخدم على نطاق واسع في هندسة البروتين لتوليد إنزيمات متحولة لاختيار الأنماط الظاهرية ذات الخصائص المرغوبة ، مثل الاستقرار الحراري المعزز ، وخصوصية الركيزة ، والنشاط التحفيزي8،9،10. هذه التقنية سهلة التنفيذ لأنها تتطلب معدات بسيطة ، ولا تنطوي على معالجات مملة ، وتستخدم الكواشف المتاحة تجاريا ، وهي سريعة ؛ علاوة على ذلك ، فإنه يولد مكتبات عالية الجودة.

هنا ، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتخليق الحمض النووي الريبي الطافر الكامل الطول (FL-MRS) لتوليد جينومات كاملة لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV) من خلال دمج ep-PCR ، والذي يحفز الطفرات البديلة العشوائية على مستوى الجينوم وعلم الوراثة العكسي. حتى إدخال أو حذف نيوكليوتيدات واحدة ضار للغاية لفيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي ([+]ssRNA) ؛ ومن ثم ، فإن الطفرات البديلة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل هي الطريقة المفضلة للتوليد التكراري للمكتبات الكبيرة والمتنوعة من جينومات فيروس الحمض النووي الريبي (+) ss الكاملة ذات الصلاحية الجيدة.

FL-MRS هو نهج مباشر يمكن تطبيقه على أي فيروس RNA ذو إحساس إيجابي بطول جينوم ~ 10 كيلو بايت من خلال التصميم الدقيق لمجموعة التمهيدي التي ترتبط باستنساخ cDNA الفيروسي. pJFH1 هو استنساخ cDNA معدي يشفر النمط الجيني HCV 2a ويمكنه تلخيص جميع خطوات دورة حياة الفيروس. باستخدام نهج FL-MRS ، أظهرنا توليف مكتبات الجينوم الكامل المطفرة عشوائيا (المكتبات الطافرة [MLs]) لإنتاج متغيرات JFH1 ذات الكفاءة المتماثلة والتي لم تكن هناك معرفة مسبقة بالخصائص المرتبطة بالطفرات. عند التعرض لمضاد للفيروسات ، تغلبت بعض المتغيرات الفيروسية بسرعة على ضغط الدواء مع التغيير الظاهري المطلوب. باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، يمكن إنشاء عدد كبير من المتغيرات الفيروسية ، مما يخلق فرصا لدراسة تطور فيروسات ssRNA (+).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: كانت سلالة JFH1 (WT) المستخدمة هنا هدية كريمة من تاكاجي واكيتا ، المعهد الوطني للأمراض المعدية. كان خط خلايا الورم الكبدي البشري ، Huh7.5 ، هدية لطيفة من تشارلز رايس ، جامعة روكفلر. يظهر رسم تخطيطي للطريقة في الشكل 1.

1. الطفرات البديلة على مستوى الجينوم ل JFH1 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ

  1. لإجراء ep-PCR ، قم بإعداد المزيج الرئيسي لأربع مجموعات من التجارب باستخدام الاشعال J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' و J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (الشكل 1A) ، جنبا إلى جنب مع مكونات التفاعل الموضحة في الجدول 1 بدون قالب pJFH1 (البلازميد المعزول من سلالة JFH1).
  2. قم بقسمة المزيج الرئيسي في أربعة أنابيب ، وأضف 100 نانوغرام و 50 نانوغرام و 25 نانوغرام و 10 نانوغرام من القالب إلى الأنابيب الفردية ، واضبط الحجم الكلي للتفاعل على 50 ميكرولتر. قم بتطبيق ظروف الدورة الموضحة في الجدول 2 لتضخيم جزء زوج قاعدة 9736 (bp) يتألف من مروج T7 وجينوم HCV كامل الطول (الشكل 2).
    ملاحظة: يجب أن يحتوي منتج ep-PCR على تسلسل المروج T7 لتسهيل النسخ في المختبر للجينوم الفيروسي. لذلك ، يجب أن يكون التمهيدي الأمامي موجودا في المنبع لمروج T7 لاستنساخ cDNA الفيروسي ، ويجب أن ينتهي تسلسل التمهيدي العكسي عند نهاية 3'-end من جينوم الفيروس لتسهيل جريان النسخ. قم بتحسين كل مكون من مكونات تفاعل ep-PCR ضمن النطاق الموصى به من قبل الشركة المصنعة لبوليميراز Taq DNA لتحقيق تضخيم عالي الغلة. بالإضافة إلى كميات القوالب المتنوعة ، يمكن أيضا استخدام dNTPs غير المتوازنة (خاصة تركيز dATP و / أو dGTP المنخفض) لزيادة التنوع في طول الجينومات الفيروسية من 6-8 كيلو بايتطويلة 3.
  3. قم بتقدير منتج ep-PCR الذي تم تضخيمه عن طريق تحميل كميات متساوية من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (5 ميكرولتر) ومقارنتها بكميات معروفة من سلم الحمض النووي 1 كيلو قاعدة (kb) عن طريق تشغيل 0.8٪ من هلام الأغاروز القائم على Tris-acetate-EDTA (TAE)11. قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة تنقية العمود حسب توجيهات الشركة المصنعة.
  4. تقدير تركيز المنتج المنقى عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري12. قم بتركيز منتج ep-PCR بالتفريغ إذا لزم الأمر للحصول على تركيز المنتج ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
    ملاحظة: يمكن إجراء تقدير أكثر دقة عن طريق تحميل التخفيفات التسلسلية ذات شقين لمنتج ep-PCR ومقارنة شدتها بالكميات المعروفة من سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت.

2. تخليق الحمض النووي الريبي الفيروسي

  1. قم بإعداد تفاعل 40 ميكرولتر لهضم 5 ميكروغرام من pJFH1 النسيلي مع 4 U من إنزيم XbaI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، متبوعا بتنقية العمود وقياس الامتصاص عند 260 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي المجهري12. قم بإعداد تفاعل نسخ 20 ميكرولتر في المختبر لمنتج ep-PCR المنقى بالعمود أو clnal-pJFH1 (WT) باستخدام نظام إنتاج الحمض النووي الريبي واسع النطاق المتاح تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر ، امزج ما يقرب من 1 ميكروغرام من منتج ep-PCR المنقى (المكتبات الطافرة) أو XbaI المهضوم النسيلي-pJFH1 ، و 10 ميكرولتر من 2x buffer يحتوي على ريبونوكليوتيدات ، و 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم T7. امزج جميع المكونات وقم بتدوير المكونات لفترة وجيزة. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ، متبوعا بإضافة 1 إنزيم DNase خال من U RNase والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 1C).
  3. تنقية الحمض النووي الريبي المركب في المختبر باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واستخلاص 40 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase و DNase ، وتقدير تركيز الحمض النووي الريبي المنقى عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي microvolume12. قم بعمل الحصص حسب الحاجة (5 ميكروغرام أو 2 ميكروغرام) لتجنب تجميد الذوبان وتخزينها في -80 درجة مئوية. تحقق من سلامة وحجم النسخ الفيروسية باستخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ل MOPS الفورمالديهايد 0.8٪ هلام الأغاروز الكهربائي13 (الشكل 3).

3. تقدير نسبة الطفرات في منتجات ep-PCR (المكتبات الطافرة)

ملاحظة: في هذه الخطوة، تتحور نسبة النيوكليوتيدات عن طريق استنساخ المنتج الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2. لإثبات ميزة استخدام ep-PCR لإنشاء عدم تجانس جيني باستخدام مكتبتين متحولتين كاملتين للجينوم (ML50 و ML25) والحمض النووي الريبي الفيروسي المشتق من pJFH1. تم تقدير نسبة الطفرات في جين HCV NS5A ، والذي كان أيضا جين القراءة الظاهري (مقاومة الأدوية) في هذه الدراسة.

  1. قم بإعداد تفاعل تخليق cDNA 20 ميكرولتر عن طريق إضافة ما يقرب من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الفيروسي الذي تم تصنيعه في الخطوة 2 ، والتمهيدي العكسي 5 ميكرومتر 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3 '، و 200 U النسخ العكسي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  2. باستخدام cDNA ، قم بتضخيم جزء 2571 bp الذي يضم جين NS5A الكامل. للقيام بذلك ، قم بإعداد خليط تفاعل يحتوي على 0.5 ميكرومتر لبادئات 5272F و 7848R (التركيز النهائي ؛ الجدول 3) ، 1.5 mM MgCl2 ، 1x PCR buffer ، و 1 U بوليميراز Taq عالي الدقة في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر وتشغيل دورة تضخيم باستخدام الظروف الموضحة في الجدول 4.
  3. قم بتشغيل المنتج على جل أغاروز قائم على TAE بنسبة 0.8٪ لتأكيد حجم المنتج البالغ 2571 نقطة أساس ثم قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة تنقية العمود وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. قم بإخراج المنتج المنقى بالعمود في 40 ميكرولتر من الماء المعقم.
  4. لإضافة 3 'A متدلية إلى المنتج ، أضف 0.5 ميكرومتر dATP و 1 وحدة من بوليميراز Taq DNA منخفض الدقة واحتضان منتج PCR بالكامل عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة جنبا إلى جنب مع 1x PCR buffer و 1.5 mM MgCl2 (التركيز النهائي). قم بتنقية الخليط باستخدام مجموعة تنقية العمود حسب توجيهات الشركة المصنعة
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بإخراج المنتج الطويل ~ 9.7 كيلو بايت من الجل من الخطوة 1.4. وإجراء الاستنساخ باستخدام مجموعة متاحة تجاريا لاستنساخ منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو إجراء NGS لمنتج ep-PCR باستخدام منصة Illumina2.
  5. قم بإعداد تفاعل ربط عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من مخزن الربط 2x ، و 50 نانوغرام من الحمض النووي للناقل T ، وحوالي 3 أضعاف الفائض المولي من الحمض النووي المدرج الذي تم تصنيعه في الخطوة 3.4 ، و 3 وحدات فايس من T4 DNA ligase ، والماء الخالي من النيوكلياز إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر. احتضان هذا التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات ثم إضافة 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية DH5α مع الحمض النووي المربوط ؛ صدمة حرارية للخلايا عند 42 درجة مئوية لمدة 35 ثانية (الشكل 1 ب).
  6. أضف 1 مل من وسط Luria-Bertani (LB) (بدون مضاد حيوي) واحتضانه مع رج لطيف لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية للتعافي. قم بطرد مركزي تعليق الخلية عند 13800 × جم ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد التعليق في 200 ميكرولتر من وسط LB الجديد.
  7. صفيحة 100 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية DH5α المحولة على صفيحة LB تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. قم بإعداد minipreps من 25-30 مستعمرة في 5 مل من LB متوسط + 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
  8. في اليوم التالي ، استخرج البلازميدات باستخدام مجموعة تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وقم بإجراء هضم إنزيم التقييد بحجم 10 ميكرولتر مع 200 نانوغرام من البلازميدات المعزولة ، و 2 U من EcoR1 ، و 1x عازلة تقييد لجميع المستعمرات.
  9. بعد احتضان مخاليط الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، قم بتحليل المنتجات على 0.8٪ من جل الأغاروز القائم على TAE لتأكيد إدخال الحمض النووي البلازميد.
  10. قم بإجراء تسلسل سانجر لبلازميدات 25 مستنسخا إيجابيا باستخدام الاشعال M13 Forward و M13 العكسي و 6208-SPF و 6748-SPF (الجدول 3) لتحديد نسبة الطفرات (معبرا عنها بنسبة النيوكليوتيدات المتحورة) في الحمض النووي الريبي الفيروسي المشتق من المكتبات و pJFH1 النسيلي (الشكل 1B والشكل 4).

4. نقل الحمض النووي الريبي الفيروسي لخط خلية Huh7.5

ملاحظة: استخدم مواد زراعة الأنسجة الخالية من RNase / DNase واعمل في خزانة معقمة للسلامة البيولوجية من الفئة الثانية. العمل في مرفق الاحتواء الموصى به وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية للمنظمة.

  1. الحفاظ على خلايا Huh7.5 عن طريق الحضانة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية في دورق زراعة الأنسجة T75 سم2 يحتوي على 15 مل من وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ (حجم / حجم) مصل بقري جنيني ، بنسلين (100 وحدة / مل) ، وستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل ؛ الشكل 1 د).
  2. قم بتقسيم الخلايا بنسبة 1: 3 عندما يصل الالتقاء إلى 90٪. اغسل الخلايا بمحلول ملحي مسخن بالفوسفات 1x (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4). أضف 5 مل من محلول 1x trypsin-EDTA لتغطية طبقة الخلية بالكامل ، وقم بتدوير القارورة برفق ، ثم احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة. احتضان الخلايا حتى يتم فصل طبقة الخلية تماما عن سطح قارورة زراعة الخلايا.
  3. أضف 10 مل من 1x DMEM الكامل المسخن مسبقا ، وقم بتفريق الخلايا عن طريق تكرار السحب ، واجمع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل أو 50 مل. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 252 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 6 مل من DMEM الكامل ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2.
  4. للصيانة المستمرة لخلايا Huh7.5 الساذجة أو المنقولة أو المصابة بالفيروس ، كرر الخطوة 4.2. والخطوة 4.3.
  5. قبل يوم واحد من النقل ، قم بتقسيم الخلايا كما هو موضح في الخطوات 4.1.-4.3 ، واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم ، وزرع خلايا Huh7.5 بكثافة 0.6 × 106 في أطباق 35 مم في 2 مل من DMEM الكامل ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2.
  6. في اليوم التالي ، قم بإعداد مجمع الدهون النص. للقيام بذلك ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من كاشف النقل في 50 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي ، وقم بتخفيف 5 ميكروغرام من النسخ الفيروسية بشكل منفصل في 50 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي.
  7. احتضان كلا الخليطين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم امزجهما في أنبوب طرد مركزي معقم واحد واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتشكيل مركب الدهون النسخة.
  8. بعد 16 ساعة من حضانة الخلايا ، قم بإزالة وسط الاستزراع من طبق الاستزراع ، واغسل الخلايا 2x باستخدام 1x PBS المسخن مسبقا ، وأضف 1.5 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي. أضف ببطء مركب الدهون النصية إلى الطبق وقم بتدوير اليدين برفق لضمان توزيع موحد للمجمعات.
  9. احتضان الخلايا في حاضنة CO2 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا المنقولة 2x ب 1 مل من 1x PBS المسخن مسبقا ، وأضف 2 مل من DMEM الكامل.

5. إنتاج الفيروسات

  1. قم بتقسيم خلايا Huh7.5 المنقولة كل يومين أو 3 أيام عندما تصل إلى التقاء 90٪. اجمع طاف الفيروس عند كل انقسام وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
  2. في كل انقسام ، راقب انتشار الفيروس باستخدام مقايسة تشكيل التركيز (FFA) كما هو موضح في الخطوة 6.2. احصد الفيروس حتى يصل انتشار الفيروس إلى >80٪ من الخلايا المنقولة (الشكل 1 د).
    ملاحظة: قم بتقسيم الخلايا المنقولة بنسبة 1: 1 للمقاطع القليلة الأولى لإنقاذ أكبر عدد ممكن من المتغيرات الفيروسية. يتباطأ انتشار الفيروس وتقل قابلية البقاء مع زيادة نسب الطفرات في MLs الجينومالكامل 2.

6. القياس الكمي لعيارات الفيروس

  1. القياس الكمي للحمض النووي الريبي الفيروسي
    1. اعزل الحمض النووي الريبي الفيروسي من 140 ميكرولتر من طاف الثقافة باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. قم بإعداد تفاعل qRT-PCR سعة 10 ميكرولتر باستخدام مجموعة qRT-PCR تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم التمهيدي الأمامي R6-130-S17 ، التمهيدي العكسي R6-290-R19 (التركيز النهائي 0.2 ميكرومتر لكل منهما) ، والمسبار R9-148-S21FT (التركيز النهائي 0.3 ميكرومتر) لقياس كمية HCV RNA (الجدول 3). اضبط ظروف التشغيل على 48 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم 45 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي المسبار على صبغة مراسل الفلورسنت 6-كربوكسي فلوريسئين (FAM) وصبغة التبريد 6-كربوكسي-رباعي ميثيل رودامين (TAMRA) عند نهايات 5 'و 3' ، على التوالي.
    3. قم بتشغيل ردود الفعل في جهاز PCR في الوقت الفعلي. إعداد ضوابط سلبية ، أي الحمض النووي الريبي المستخرج من طاف الخلايا المصابة وهمية والمياه الخالية من النيوكلياز في وقت واحد لضمان عدم وجود تلوث متبادل.
    4. في موازاة ذلك ، قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام عدد نسخ معروف مخفف بشكل متسلسل بمقدار 10 أضعاف من نسخ HCV (1 × 108 إلى 0) لقياس كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي. إجراء القياس الكمي في ثلاث نسخ (الشكل 1D).
  2. القياس الكمي لعيار الفيروسات المعدية باستخدام جرعة معدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50٪ (TCID50)
    1. قبل حوالي 16 ساعة من إضافة الفيروس ، لوحة 6.5 × 103 خلايا Huh7.5 / بئر في لوحة 96 بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    2. في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف (1 مل لكل منها) تغطي 1 × 10−1 إلى 1 × 10−6 تخفيفات (ثمانية تخفيفات) للفيروس المحصود (يتم الحصول عليها عندما يصل انتشار الفيروس إلى >80٪ من الخلايا كما هو موضح في الخطوة 5). أضف 100 ميكرولتر / بئر (مع ثمانية تكرارات) من الفيروس المخفف لإصابة خلايا Huh7.5 والحفاظ على اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
    3. بعد 3 أيام ، اغسل الخلايا المصابة 3x ب 0.1 مل من PBS في كل مرة ، وقم بإصلاح الخلايا ونفاذها ب 0.1 مل من الميثانول المثلج البارد عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل الآبار باستخدام 1x PBS 3x ثم 1x باستخدام PBS-T (1x PBS / 0.1٪ [v / v] Tween-20).
    4. بعد إزالة PBS-T ، قم بسد الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام 0.1 مل من 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) الذي يحتوي على 0.2٪ حليب منزوع الدسم في PBST. قم بإزالة محلول الحجب وعالج الخلايا لمدة 5 دقائق باستخدام 0.1 مل من 3٪ H 2 O2محضر في 1x PBS.
    5. مرة أخرى ، اغسل الخلايا 2x باستخدام 1x PBS و 1x باستخدام PBS-T ، ثم أضف 50 ميكرولتر / بئر من anti-NS5A 9E10 mAb (1: 10000 ، مخزون 1 مجم / مل ؛ هدية كريمة من تشارلز رايس ، جامعة روكفلر) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل الآبار مرة أخرى 3x باستخدام 1x PBS و 1x باستخدام PBS-T.
    6. أضف 50 ميكرولتر / بئر من IgG الثانوي المضاد للفأر من الماعز المترافق HRP (1: 4000) ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة الجسم المضاد غير المرتبط عن طريق غسل الآبار ب 0.1 مل من 1x PBS.
    7. أضف 30 ميكرولتر من الركيزة الملونة DAB (ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد) واحتضن اللوحة بتأرجح لطيف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تطور الركيزة راسبا بنيا على سطح البئر يشير إلى مستضد HCV NS5A. قم بإزالة محلول DAB واغسل الآبار 2x باستخدام 1x PBS و 1x بالماء المقطر. أضف 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.03٪ أزيد الصوديوم.
    8. افحص كل بئر تحت مجهر ضوئي مقلوب باستخدام هدف 10x. احسب عدد الآبار الإيجابية. إذا كان البئر يحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا الإيجابية NS5A ، فهو إيجابي ؛ إذا أظهر البئر عدم وجود خلايا إيجابية NS5A ، فهذا يعني أنه سلبي. استخدم حاسبة Reed and Muench لتقدير تخفيف نقطة النهاية الذي يصيب 50٪ من الآبار (TCID50) 14,15. مقلوب التخفيف المطلوب لإنتاج TCID50 هو عيار عدوى الفيروس (وحدات تشكيل البؤر) لكل وحدة حجم.
      ملاحظة: تختلف عيارات عدوى الفيروس باختلاف المكتبات الطافرة.

7. اختيار المتغير الفيروسي المقاوم للأدوية

  1. قم بإذابة بيبرينتاسفير (PIB) ، وهو مثبط NS5A ، في DMSO بنسبة 100٪ إلى تركيز 1 mM وقم بتخفيفه في DMEM الكامل إلى تركيز 10 نانومتر.
  2. لتحديد التركيز الفعال بنسبة 50٪ من PIB ، قم بزرع خلايا Huh7.5 بكثافة 0.6 × 10 6 / بئر في صفيحة ذات6 آبار واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. بعد 16 ساعة من حضانة الخلايا ، أضف جرعة فيروس إما من ML50 أو فيروس JFH1 النسيلي لإصابة 50٪ من الخلايا ، وبعد ذلك ، في 12 ساعة بعد الإصابة (h p.i.) ، عالج الخلايا بسلسلة تخفيف ثنائية من PIB تتراوح من 0.5-100 pM. قم بقياس FFA وتحديد FFU كما في الخطوة 6.2. بعد 3 أيام من الحضانة.
  3. ارسم منحنيات الجرعة والاستجابة باستخدام قيم مقايسة تقليل FFU في برنامج التحليل الإحصائي. من المنحنى السيني ، احصل على تركيز فعال بنسبة 50٪ (EC50; الشكل 5).
    ملاحظة: قد يختلف نطاق التركيز الفعال اعتمادا على الفئة ، بين مضادات فيروسات التهاب الكبد C من نفس الفئة ، واعتمادا على مكتبة الطفرة.
  4. بالنسبة للتجربة ، تصيب خلايا Huh7.5 الساذجة عند التقاء 70٪ بفيروس ML50 (المتغيرات المشتقة من ML50 RNA) جرعة لإصابة 50٪ من الخلايا لمدة 12 ساعة ، ثم نقل الخلايا المصابة إلى 6 لوحات جيدة بعد 24 ساعة من الإصابة.
  5. أضف 1x EC50 PIB (47.3 pM) إلى الخلايا المصابة بعد 16 ساعة من انقسام الخلية. افعل ذلك بعد انقسام كل خلية لمدة ستة مقاطع متتالية (18 يوما) ، تليها ثلاث دورات مرور خالية من المخدرات ، وراقب انتشار الفيروس باستخدام FFAs كما هو موضح في الخطوة 6.2. توسيع نطاق كواشف FFA حسب منطقة النمو. احصد الطافات الفيروسية في كل ممر واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن تعريف الانتشار الفيروسي إلى أكثر من 50٪ من الخلايا أثناء متابعة العلاج على أنه اختراق ، ويمكن تعريف الانتشار الفيروسي خلال فترة انسحاب الدواء على أنه انتكاسة فيروسية16.
  6. استخرج الحمض النووي الريبي الفيروسي من المادة الطافية في اليوم 18 ، كما هو موضح في الخطوة 6.1.1 ، ثم قم بتوليف cDNA ، كما هو موضح في الخطوة 3.1. تضخيم جين NS5A باستخدام 5 ميكرولتر من cDNA المخفف 1: 5 ومكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضحة في الخطوة 3.2. ثم اتبع الخطوات 3.3.-3.5. لتحديد طفرات مقاومة الأدوية NS5A في 6-8 بلازميدات بكتيرية إيجابية باستخدام بادئات تسلسل NS5A 6186F و 6862F و 6460R (الجدول 3 والجدول 4).
    ملاحظة: هنا في هذه الدراسة ، أبلغنا عن بدائل في NS5A للمتغيرات المختارة أثناء علاج PIB عند 1x EC50. سيؤدي ذلك إلى استبعاد مساهمة البدائل بخلاف NS5A في تقليل القابلية للإصابة ب PIB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن إنشاء عدد كبير من متغيرات HCV كاملة الطول وفحصها بحثا عن الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية ذات الأهمية باتباع الإجراءات الموضحة في الشكل 1. تم تصنيع مكتبات الجينوم الطافرة الكاملة باستخدام clnal-pJFH1 بكميات متناقصة (100-10 نانوغرام) ، كما هو موضح في الشكل 2. تراوح متوسط إنتاجية منتجات ep-PCR (المكتبات الطافرة) بين 3.8-12.5 نانوغرام / ميكرولتر. يوضح الشكل 3 النسخ الفيروسية المركبة من pJFH1 النسيلي والمكتبة الطافرة التمثيلية (تم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، قمنا بتفصيل إجراء FL-MRS بسيط وسريع يدمج ep-PCR18 وعلم الوراثة العكسي لتوليف مكتبات الجينوم الكامل HCV ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في نظام زراعة الخلايا لتوليد متغيرات مختصة بالتكرار لفحص الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية. يعد استخدام Taq DNA polymerase منخفض الدقة شرطا أساسيا ل ep-PCR الذي يسمح بدمج البدائل أثناء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لجينوم فيروسي كامل الطول. اختبرنا العديد من بوليميراز Taq DNA منخفض الدقة ووجدنا أن بوليميراز الحمض النووي Platinum Taq أسفر عن منتج ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تقديم الدعم التمويلي (رقم المنحة BT / PR10906 / MED / 29/860/2014) لهذه الدراسة من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي  أنبوب الطردFisher
1.5 ملTarsons500010
15 مل أنبوب الطرد المركزيTarsons546021
35 مم صحن ثقافة الخلية   ؛Tarsons960010
50 مل أنبوب الطرد المركزيTarsons546041
حمض الخليكMerckA6283
Agarose HiMediaMB080
وحدة الرحلان الكهربائي لهلام AgroseBioRad1704406
خزانة السلامة الحيوية ، ClassIIESCOAC2 4S
ألبومين مصل الأبقار HiMediaMB083
الطرد المركزي   ؛Eppendorf5424-R
CFX Connect نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيBioRad1855201
لوحات الاستنساخ 90 مم & nbsp;Tarson460091
CO2 حاضنة نيو برونزويكغالاكسي 170R
كوليبري مطياف حجم صغيرTitertek-Berthold11050140
DAB  الركيزة  المجموعة Abcamab94665
dATP SolutionNEBN0440S
Deoxynucleotide (dNTP) مجموعة الحلولNEBN0446
ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)   ؛SRL الكيميائية46791
ثنائي ميثيل كبريتات (DMSO)HiMediaMB058
DMEM نسبة عالية من الجلوكوزLonzaBE12-604F
EcoR1-HFNEBR3101
EDTA رباعي الصوديوم ملح ثنائي هيدراتهايميدياGRM4918
Ethidium BromideAmrescoX328
مصل الأبقار الجنينية Gibco26140079
الفورمالديهايد هلام Fishser Scientific12755
ALPHA IMAGER
جسم مضاد ثانوي للماعز IgG (H + L) ، HRPThermo FisherA16066
بيروكسيد الهيدروجين 30٪Merck107209
مجهر مقلوبNickon& nbsp ؛ كسوف Ts2
مرق رطل HiMediaM1245
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher116680270كاشف التعداء
مجموعة الماصات الميكانيكيةEppendorf   ؛  3120000909
ميثانولميرك106009
مايكرو تيبس 0.2-10 & مايكرو ؛ l Tarsons521000
مايكرو تيبس 10 - 100 & مايكرو ؛ l Tarsons521010
مايكرو تيبس 200-1000 & l Tarsons521020
MOPS buffer GeNei3601805001730
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)Gibco11140050
طلقة واحدة TOP10 المختصة كيميائيا  الإشريكية القولونيةInvitrogenC404010الإشريكية القولونية DH5 & ألفا ;
Opti-MEMGibco1105-021متوسطة أساسية
بسيطة 0.2 ملTarsons510051
Pencillin / streptomycin Gibco15070063
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360T-vector
DNA Fossil Buffer Saline (PBS)HiMediaTI1099
Phusion  بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةNEBM0530S
PibrentasvirCayman Chemical27546
تحكم ماصة   ؛جيلسون F110120
Platinum Taq DNA Polymerase Thermo10966034
PrismGraphPadبرنامج التحليل الإحصائي
QIAamp Viral RNA Mini kit طقم عزل الفيروس Qiagen52904
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
QIAquick PCR PurificationQIAGEN28104طقم تنقية الكوكوم
RNeasy Mini Kit   ؛QIAGEN74104طقم تنظيف الحمض النووي الريبي
الماصات المصلية 25 ملثيرمو فيشر170357N
ماصات مصلية 5 ملثيرمو فيشر170355N
ماصات مصلية 10 ملثيرمو فيشر170356N
الحمض النووي الريبي أحادية الخيط 0.2-10 كيلو بايتميركR7020
حليب خالي الدسم  HiMediaM530
أزيد الصوديوم 0.1 متر حلMerck8591
SuperScript III Reverse Transcriptase  Invitrogen18080044النسخ العكسي
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
قارورة ثقافة الخلية T175  Tarsons159910
قارورة ثقافة الخلايا T25 Tarsons950040
T7 RiboMax Express نظام إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق واسع بروميجاP1320  نظام إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق واسع 
قارورة ثقافة الخلايا T75  Tarsons950050
Taq DNA PolymeraseGenetix Biotech (Puregene)PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step KitAppliedBiosystems 4392653
TaqMan RNA-to-CT & nbsp ؛ 1-الخطوة  كيتثيرمو فيشر4392653مجموعة qRT-PCR التجارية  
TOPO-XL - 2 طقم استنساخ PCR كاملThermo FisherK8050-10Kit لاستنساخ منتج PCR طويل   ؛
Tris قاعدةHiMediaTC072
Trypsin-EDTA حلHiMediaTCL007
Tween 20HiMediaMB067
مكثف فراغ  Eppendorf, Concentrator Plus100248
حمام مائي  جرانتJBN-18
Xba1NEBR0145S
المركزي Thermo 10787018 نظام توثيق أنابيب PCR Kit علامة

المراجع

  1. Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
  2. Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327(2020).
  3. Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932(2018).
  4. Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
  5. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182(2008).
  6. Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
  7. Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455(2017).
  8. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  9. Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
  10. Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
  11. Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
  12. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  13. Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
  14. Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
  15. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
  16. Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
  17. Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325(2020).
  18. Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NS5A

مقالات ذات صلة