نحن نصف بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية.
مقالة منهجية
نحن نصف بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية.
يعتمد استكشاف الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة على سهولة العزلة والفعالية نحو التمايز وموثوقية ومتانة المصدر. نصف هنا بروتوكولا تدريجيا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة عن أنسجة الحبل السري البشري (uMSCs) ، وتنميطها المناعي ، وانتشار هذه الثقافات عبر عدة ممرات. في هذا الإجراء ، تكون صلاحية uMSCs عالية لأنه لا يوجد هضم إنزيمي. علاوة على ذلك ، فإن إزالة الأوعية الدموية ، بما في ذلك شرايين الحبل السري والوريد ، تضمن عدم وجود تلوث للخلايا ذات الأصل البطاني. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تكون uMSCs عند العزل CD45−CD34− ، مما يشير إلى عدم وجود خلايا من سلالة المكونة للدم. الأهم من ذلك ، أنها تعبر عن علامات السطح الرئيسية ، CD105 ، CD90 ، و CD73. عند إنشاء الثقافات ، تصف هذه الورقة طريقة فعالة للحث على التمايز في هذه uMSCs في سلالة العضلات الهيكلية. يكشف تحليل مفصل للتقدم العضلي في uMSCs المتمايزة أن uMSCs تعبر عن Pax7 ، وهي علامة للأسلاف العضلية المنشأ في المراحل الأولية من التمايز ، تليها التعبير عن MyoD و Myf5 ، وأخيرا ، علامة تمايز طرفية ، سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC).
يعود الفضل إلى الحبل السري البشري في امتلاك خزان قوي من الخلايا الجذعية الوسيطة ، والتي يتم استكشافها حاليا للعلاجات التجديدية بسبب معدلات انتشارها وتمايزها القوية ، وخصائصها المناعية ، وقدرتها على توليد الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث1. يتكون نسيج الحبل السري من مقصورات متعددة مثل دم الحبل السري، وبطانة الوريد السري الفرعية، وهلام وارتون (WJ)، والذي يشمل في حد ذاته ثلاث مناطق غير واضحة - المنطقة المحيطة بالأوعية الدموية، والمنطقة بين الأوعية الدموية، والسلى الفرعي أو بطانة الحبل السري (CL)2. في حين يمكن عزل uMSCs عن كل هذه المناطق المختلفة والتعبير على نطاق واسع عن علامات MSC الرئيسية ، لا يوجد وضوح حول ما إذا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على استخدام أنسجة الحبل السري في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية ، ومعهد العلوم والتكنولوجيا الصحية الانتقالية (IEC-THSTI) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية للمستشفى المدني ، جوروجرام ، هاريانا ، واللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية ، THSTI. تم حصاد عينات أنسجة الحبل السري البشري من الولادات الأجل في وقت الولادة. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص . تم تنفيذ جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.
1. عزل MSCs من أنسجة الحبل السري
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
نجاح عزل uMSCs من أنسجة الحبل السري هو >95 ٪ ، على عكس معدلات النجاح الضعيفة من دم الحبل السري الكامل. عند العزل الناجح ل uMSCs ، يكشف تحليل FACS أن جميع الخلايا هي CD34−CD45−CD105+CD90+. ومع ذلك ، في التحليل المقارن ، تظهر uMSCs المعزولة من دم الحبل السري مجموعات غير متجانسة ، حيث تظهر نسبة من الخلايا CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15٪). بالإضافة إلى ذلك ، فإن CD105 + CD90 + ذات الموجب المزدوج أقل عددا (~ 5٪) (الشكل ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
خطوات حاسمة
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في جمع الأنسجة في ظل ظروف معقمة ، من وقت التسليم إلى صيانة الثقافات المعقمة ، طوال مدة الانتشار. أثناء جمع الحبل ، من الضروري ألا يلمس الحبل أي سطح غير معقم ويتم مسحه خارجيا بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل جمعه في أنابيب تحتوي على PBS مكملة بالمضادات الحيوية. من المهم تحديد الوقت بين جمع الحبل ومعالجة الأنسجة لعزل uMSC. في حالة وجود حاجة لنقل الأنسجة من موقع التجميع إلى المختبر ، يجب توخي الحذر للحفاظ على الأنسجة في المخازن المؤقتة المحتوية على المضادا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
ونشكر السيد أوخاس تيكو على مساعدته في التصوير وإنتاج الفيديو. كما نعترف بالمساعدة التي تلقيناها من موظفي GARBH-Ini (المجموعة متعددة التخصصات المعنية بالبحوث المتقدمة ونتائج الولادة - DBT India) والممرضات وكبار مسؤولي الأبحاث في مستشفى Gurugram المدني والدكتور Pallavi Kshetrapal للمساعدة في الخدمات اللوجستية. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى سوتشيترا جوبيناث من إدارة التكنولوجيا الحيوية، الهند (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) | ثيرمو فيشر Scientific | D1306 | |
| أمفوتريسين ب | سيجما ألدريتش | A2411 | |
| محلول مضاد حيوي 100x سائل ، تم اختبار السموم الداخلية (10،000 U Penicillin و 10 mg Streptomycin / مل في محلول ملحي عادي 0.9٪) HiMedia | A001A-50mL | ||
| الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH | Sigma Aldrich | G8795 | |
| الجسم المضاد المضاد ل MyHC (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| الجسم المضاد المضاد ل MyoD (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| الجسم المضاد المضاد للميوجينين (استنساخ F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| الأجسام المضادة ل Pax7 | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC الفأر المضاد للإنسان استنساخ CD90 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| الكولاجين نوع 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) الجلوكوز | سيجما Aldrich | G7021 | |
| ديكساميثازون | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II أو FACSAria III | BD Biosciences | ||
| مصل الأبقار الجنيني ، مؤهل البرازيل | GIBCO | 10270106 | يجب ألا يكون معطلا للحرارة |
| FITC Mouse مضاد للإنسان استنساخ CD106 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD14 M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD31 WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD34 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD45 استنساخ HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| استنساخ FITC Mouse Anti Human CD49D 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse Anti Human HLA-A ، B ، C استنساخ G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ IgG G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| برنامج FlowJo | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| مصل الحصان | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification بدون L-glutamine و ribo- و deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568. FS | الوسط القاعدي ل uMSCs |
| PE Mouse مضاد للإنسان استنساخ CD105 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD44 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD49E llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE ماوس مضاد للإنسان استنساخ IgG G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 ماوس مضاد للإنسان CD73 Clone AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، الأس الهيدروجيني = 7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin / EDTA (1x 0.25٪ تريبسين و 0.02٪ EDTA في محلول الملح المتوازن Hanks (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن