مقالة منهجية

توليد الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية

6.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63725

⸱

أغسطس 31, 2022

 , 
1Translational Health Science and Technology Institute (THSTI), NCR Biotech Science Cluster

في هذه المقالة

ملخص

نحن نصف بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية.

الملخص

يعتمد استكشاف الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة على سهولة العزلة والفعالية نحو التمايز وموثوقية ومتانة المصدر. نصف هنا بروتوكولا تدريجيا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة عن أنسجة الحبل السري البشري (uMSCs) ، وتنميطها المناعي ، وانتشار هذه الثقافات عبر عدة ممرات. في هذا الإجراء ، تكون صلاحية uMSCs عالية لأنه لا يوجد هضم إنزيمي. علاوة على ذلك ، فإن إزالة الأوعية الدموية ، بما في ذلك شرايين الحبل السري والوريد ، تضمن عدم وجود تلوث للخلايا ذات الأصل البطاني. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تكون uMSCs عند العزل CD45−CD34− ، مما يشير إلى عدم وجود خلايا من سلالة المكونة للدم. الأهم من ذلك ، أنها تعبر عن علامات السطح الرئيسية ، CD105 ، CD90 ، و CD73. عند إنشاء الثقافات ، تصف هذه الورقة طريقة فعالة للحث على التمايز في هذه uMSCs في سلالة العضلات الهيكلية. يكشف تحليل مفصل للتقدم العضلي في uMSCs المتمايزة أن uMSCs تعبر عن Pax7 ، وهي علامة للأسلاف العضلية المنشأ في المراحل الأولية من التمايز ، تليها التعبير عن MyoD و Myf5 ، وأخيرا ، علامة تمايز طرفية ، سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC).

المقدمة

يعود الفضل إلى الحبل السري البشري في امتلاك خزان قوي من الخلايا الجذعية الوسيطة ، والتي يتم استكشافها حاليا للعلاجات التجديدية بسبب معدلات انتشارها وتمايزها القوية ، وخصائصها المناعية ، وقدرتها على توليد الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث1. يتكون نسيج الحبل السري من مقصورات متعددة مثل دم الحبل السري، وبطانة الوريد السري الفرعية، وهلام وارتون (WJ)، والذي يشمل في حد ذاته ثلاث مناطق غير واضحة - المنطقة المحيطة بالأوعية الدموية، والمنطقة بين الأوعية الدموية، والسلى الفرعي أو بطانة الحبل السري (CL)2. في حين يمكن عزل uMSCs عن كل هذه المناطق المختلفة والتعبير على نطاق واسع عن علامات MSC الرئيسية ، لا يوجد وضوح حول ما إذا كانت هذه المقصورات تحتوي على نفس عدد السكان من uMSCs أو تعرض اختلافات في قدرات التمايز الخاصة بها3. وبالتالي ، تتطلب بروتوكولات عزل uMSCs دقة أكبر في أسلوبها ومنطقة عزلتها ، والتوصيف القوي لإمكانات التمايز ، وأخيرا ، تحليل مقارن من مقصورات مختلفة من الحبل.

في هذا السياق ، أظهرت دراسات قليلة اختلافات في إمكانات uMSC التكاثرية والتفاضلية بين أجزاء مختلفة من الحبل. ومن بين هذه الوسائل، كشفت التحليلات المقارنة بين uMSCs المعزولة من منطقتي CL و WJ عن إمكانات تكاثرية أكبر في uMSCsالمشتقة من CL 3,4. وفي دراسة منفصلة، كان أداء uMSCs المشتقة من WJ أفضل في مقايسات الانتشار مقارنة بالخلايا المحيطة بالأوعية الدموية (HUCPV)5. عند فحص الاختلافات بين uMSCs المشتقة من دم الحبل السري و uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري الخالية من تلوث الأوعية الدموية ، تم الإبلاغ عن التعبير التفاضلي لعلامات MSC الرئيسية بين المقصورتين ، بالإضافة إلى زيادة معدلات الانتشار في uMSCs المشتقة من أنسجة الحبلالسري 6.

من بين العديد من الدراسات التي تدرس إمكانات التمايز ل uMSCs في المقام الأول في أنسجة سلالة الأديم المتوسط مثل السلالات العظمية والشحمية والغضروفية ، قدم عدد قليل جدا بروتوكولات مفصلة للتمايز العضلي والتوصيف اللاحق ، بالإضافة إلى تحليلات مقارنة بين مقصورات الحبل المختلفة. في هذا السياق ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتمايز العضلات ولاحظنا أن uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري تظهر قدرات تمايز عضلي المنشأ متفوقة مقارنة بدم الحبل السري6. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول تدريجي لعزل uMSCs عن أنسجة الحبل السري بأكملها الخالية من الخلايا المرتبطة بالأوعية الدموية ، وتوصيفها ، وتمايزها في السلالة العضلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على استخدام أنسجة الحبل السري في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية ، ومعهد العلوم والتكنولوجيا الصحية الانتقالية (IEC-THSTI) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية للمستشفى المدني ، جوروجرام ، هاريانا ، واللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية ، THSTI. تم حصاد عينات أنسجة الحبل السري البشري من الولادات الأجل في وقت الولادة. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص . تم تنفيذ جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.

1. عزل MSCs من أنسجة الحبل السري

  1. في وقت التسليم ، اقطع ما لا يقل عن 5 سم من الحبل ، ويفضل أن يكون أقرب إلى المشيمة ، وقم بتعقيم الحبل عن طريق مسح السطح الخارجي بنسبة 70٪ من الإيثانول. انقل قطعة أنسجة الحبل السري بالتتابع من أنبوب تجميع سعة 50 مل يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى أنبوب آخر يحتوي على نفس الشيء. انقل أنبوب التجميع الذي يحمل اسم الشخص على الجليد إلى المختبر في غضون 1 ساعة.
    ملاحظة: بالنسبة لدراسة أكبر، قد يكون من المفيد ترميز العينات بالباركود لتمكين تتبعها طوال فترة الدراسة. الأهم من ذلك ، يجب أن يعرض على جميع الموظفين الذين يتعاملون مع الأنسجة البشرية النظام الكامل للقاح التهاب الكبد B.
  2. في المختبر، قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 25 دقيقة في غطاء محرك السيارة BSL-2 لتعقيم الأدوات والماصات المعقمة قبل الاستخدام.
  3. انقل قطعة أنسجة الحبل السري من أنبوب التجميع إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة بحجم 10 سم 2 يحتوي على PBS غني بجلوكوز 5 جم / لتر ، وجنتاميسين 50 ميكروغرام / مل ، و2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B ، و 100 U / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (مخطط في الشكل 1).
  4. باستخدام مشرط ، قم بتقطيع أنسجة الحبل عموديا على طول محورها الطولي للحصول على قطعتين نصف أسطوانيتين. بسبب التواء الحبل والسطح المخاطي ، قم بتثبيت الأنسجة بزوج من الملقط في اليد الأخرى.
  5. عند هذه النقطة، راقب الشرايين والوريد السري وأزل الأوعية الدموية باستخدام مشرط لكشطها في اتجاه واحد من السطح. شطف أنسجة الحبل السري مرة أخرى في PBS لإزالة جميع الدم المتبقي المرتبط بالأنسجة. تأكد من أن الكشط لطيف للحفاظ على سلامة الخلايا في WJ المحيطة بالأوعية.
  6. افرم كل نصف من أنسجة الحبل السري إلى شظايا بحجم 0.5 سم3 سم وضع الشظايا مع السطح المضيء المواجه لأسفل على الطبق. احتضن الطبق لفترة وجيزة لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2.
  7. بعد الحضانة ، قم بإغراق الطبق الذي يحتوي على قطع أنسجة الحبل السري ب 20 مل من الوسط الذي يحتوي على تعديل MEM Alpha بدون L-glutamine و ribo- و deoxyribonucleosides ، و 15٪ مصل بقري جنيني (غير معطل حراريا) ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. أضف وسط النمو بلطف على طول الجانبين لمنع إزالة الأنسجة من اتجاهها. أضف الوسط الزائد لحساب جزء سيتم امتصاصه بواسطة الأنسجة أثناء الحضانة.
  8. بعد 3 أيام من الحضانة ، أضف وسيطا طازجا إلى الثقافات. تأكد من حماية الثقافات من الصدمات وحركة النباتات أثناء التعامل مع الأطباق.
  9. بعد 1 أسبوع ، قم بإزالة شظايا الأنسجة بشكل فردي باستخدام ملقط معقم وتخلص منها باستخدام أكياس المخاطر البيولوجية المناسبة للتخلص منها. احتفظ بالوسط الموجود وأضف 10 مل من وسط النمو الطازج. استبدل وسيط النمو كل 4 أيام حتى تصل المستعمرات الفردية إلى التقاء 70٪.
    ملاحظة: من المحتمل ألا يتم توزيع الخلايا بشكل موحد في جميع أنحاء الطبق ، حيث ستكون هناك مستعمرات تكاثرية فردية تحتاج إلى مراقبة الالتقاء مع مرور الوقت. بشكل عام ، في غضون شهر ، يولد طبق 10 سم2 خلايا كافية ليتم تقسيمها إلى طبق منفصل.
  10. حصاد الخلايا الملتصقة باستخدام محلول التربسين / EDTA (1x 0.25٪ التربسين و 0.02٪ EDTA في محلول الملح المتوازن Hanks [HBSS]). الطرد المركزي تعليق الخلية في 470 × غرام لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وإعادة تعليق بيليه الخلية في وسط النمو.

2. التنميط المناعي وانتشار uMSCS

  1. انتقل إلى التنميط المناعي بمجرد أن تصل الخلايا الملتصقة إلى التقاء 50٪ -60٪ وتنتشر بشكل جيد. لا تقم بإجراء تحليل علامة MSC على الثقافات المتقاربة بالكامل ، لأن هذا يميل إلى التسبب في انخفاض تنظيم علامات MSC الرئيسية.
  2. بعد التربسين ، قم بتوزيع تعليق خلوي من 1 × 106 خلايا / مل في أنابيب FACS (1 × 105 خلايا / أنبوب) ووصمة عار بالأجسام المضادة المناسبة المرتبطة بالفلوروفور (كل تخفيف 1:50) في تركيبة : غير ملطخة ؛ CD105 + CD90 ؛ CD105 + CD73 ؛ CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (الفلوروفور الشائع) ؛ ضوابط النمط المتماثل لكل فلوروفور. سجل عددا إجماليا من الأحداث لا يقل عن 10000 على مقياس التدفق الخلوي لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: نظرا لأنه يتم تحليل الخلايا لكل علامة سطح على حدة، فإن البوابات على المجموعات الفرعية للخلايا غير مطلوبة.
  3. بالإضافة إلى العلامات المذكورة أعلاه ، تأكد من وجود علامات سطح إيجابية وسلبية في خطوط uMSC التي تم إنشاؤها من عينات أنسجة الحبل السري الفردية (الجدول 1).
  4. تحليل الخلايا المصنفة بواسطة قياس التدفق الخلوي وتحديد النسبة المئوية لخلايا CD105 + CD90 + و CD105 + CD73 +. تحليل خلايا CD105+ وCD34−CD45− بشكل منفصل.

3. تمايز uMSCs إلى العضلات الهيكلية

  1. قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة ب 0.01٪ من الكولاجين و 20 ميكروغرام / مل من اللامينين في PBS. قم بتغطية هذه اللوحات لمدة لا تقل عن 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  2. لوحة uMSCs بكثافة 10000 خلية / سم2 في وسط النمو.
  3. عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 70٪ ، قم بشفط وسط النمو وشطف الثقافات 2x باستخدام PBS. أضف وسط التمايز العضلي المنشأ (M1) الذي يتكون من DMEM + مصل الحصان 5٪ + 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون + 50 ميكرومتر هيدروكورتيزون إلى uMSCs. لتحديد حركية التقدم العضلي ، أضف وسط M1 كل يوم إلى الثقافات.
  4. لتحديد حركية التقدم العضلي ، قم بتحليل uMSCs ل Pax7 و MyoD و Myogenin وتعبير MyHC في يومين و 4-5 أيام و 6-7 أيام و 10-14 يوما ، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نجاح عزل uMSCs من أنسجة الحبل السري هو >95 ٪ ، على عكس معدلات النجاح الضعيفة من دم الحبل السري الكامل. عند العزل الناجح ل uMSCs ، يكشف تحليل FACS أن جميع الخلايا هي CD34−CD45−CD105+CD90+. ومع ذلك ، في التحليل المقارن ، تظهر uMSCs المعزولة من دم الحبل السري مجموعات غير متجانسة ، حيث تظهر نسبة من الخلايا CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15٪). بالإضافة إلى ذلك ، فإن CD105 + CD90 + ذات الموجب المزدوج أقل عددا (~ 5٪) (الشكل ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

خطوات حاسمة
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في جمع الأنسجة في ظل ظروف معقمة ، من وقت التسليم إلى صيانة الثقافات المعقمة ، طوال مدة الانتشار. أثناء جمع الحبل ، من الضروري ألا يلمس الحبل أي سطح غير معقم ويتم مسحه خارجيا بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل جمعه في أنابيب تحتوي على PBS مكملة بالمضادات الحيوية. من المهم تحديد الوقت بين جمع الحبل ومعالجة الأنسجة لعزل uMSC. في حالة وجود حاجة لنقل الأنسجة من موقع التجميع إلى المختبر ، يجب توخي الحذر للحفاظ على الأنسجة في المخازن المؤقتة المحتوية على المضادا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

ونشكر السيد أوخاس تيكو على مساعدته في التصوير وإنتاج الفيديو. كما نعترف بالمساعدة التي تلقيناها من موظفي GARBH-Ini (المجموعة متعددة التخصصات المعنية بالبحوث المتقدمة ونتائج الولادة - DBT India) والممرضات وكبار مسؤولي الأبحاث في مستشفى Gurugram المدني والدكتور Pallavi Kshetrapal للمساعدة في الخدمات اللوجستية. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى سوتشيترا جوبيناث من إدارة التكنولوجيا الحيوية، الهند (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)ثيرمو فيشر ScientificD1306
أمفوتريسين بسيجما ألدريتشA2411
محلول مضاد حيوي 100x سائل ، تم اختبار السموم الداخلية (10،000 U Penicillin و 10 mg Streptomycin / مل في محلول ملحي عادي 0.9٪) HiMediaA001A-50mL
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDHSigma AldrichG8795
الجسم المضاد المضاد ل MyHC (My32)Novus BiologicalsNBP2-50401AF647
الجسم المضاد المضاد ل MyoD (5.8A)Novus BiologicalsNB100-56511
الجسم المضاد المضاد للميوجينين (استنساخ F5D)Novus BiologicalsNBP2-34616AF594
الأجسام المضادة ل Pax7DSHBDSHB-C1-576
APC الفأر المضاد للإنسان استنساخ CD90 5E10BD Biosciences559869
الكولاجين نوع 1MerckC8919
D (+) الجلوكوزسيجما AldrichG7021
ديكساميثازونSIGMAD4902
FACSCanto II أو FACSAria IIIBD Biosciences
مصل الأبقار الجنيني ، مؤهل البرازيلGIBCO10270106يجب ألا يكون معطلا للحرارة
FITC Mouse مضاد للإنسان استنساخ CD106 51-10C9BD Biosciences551146
FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD14 M5E2BD Biosciences557153
FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD31 WM59BD Biosciences557508
FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD34 581BD Biosciences555821
FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD45 استنساخ HI30BD Biosciences555482
استنساخ FITC Mouse Anti Human CD49D 9F10BD Biosciences560840
FITC Mouse Anti-Human CD90 clone 5E10BD Biosciences555595
FITC Mouse Anti Human HLA-A ، B ، C استنساخ G46-2.6BD Biosciences557348
FITC ماوس مضاد للإنسان استنساخ IgG G18-145BD Biosciences555786
برنامج FlowJoBD Biosciences
GentamicinSigma AldrichG1264
مصل الحصانHiMediaRM1239
HydrocortisoneMerckH4001
LamininMerckL2020
MEM Alpha Modification بدون L-glutamine و ribo- و deoxyribonucleosidesHycloneSH30568. FSالوسط القاعدي ل uMSCs
PE Mouse مضاد للإنسان استنساخ CD105 266BD Biosciences560839
PE ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD44 515BD Biosciences550989
PE ماوس مضاد للإنسان استنساخ CD49E llA1BD Biosciences555617
PE ماوس مضاد للإنسان استنساخ IgG G18-145BD Biosciences555787
PE-Cy7 ماوس مضاد للإنسان CD73 Clone AD2BD Biosciences561258
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، الأس الهيدروجيني = 7.4HiMediaM1866
Trypsin / EDTA (1x 0.25٪ تريبسين و 0.02٪ EDTA في محلول الملح المتوازن Hanks (HBSS)HiMediaTCL049-100mL
محلول محلول

المراجع

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726(2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD105 CD90 CD73

مقالات ذات صلة