عالية الدقة قياس سلوك رائحة يحركها يرقات ذبابة الفاكهة في

ملخص

في هذه المقالة الفيديو ، ونحن تصف طريقة جديدة تسمح للبناء التدرجات الرائحة مع هندستها مستقر وتحت السيطرة. باختصار نحن لتوضيح كيف يمكن استخدام هذه التدرجات للكشف عن العيوب الشمية (خشام الكامل والجزئي) ، ودراسة ملامح أكثر مكرا من السلوك الكيميائي.

الملخص

وقد ردود يرقات ذبابة الفاكهة في حاسة الشم درس تقليديا في أطباق بتري واحد يتألف من مصدر الرائحة الطرفية. في هذا النموذج السلوكي ، والمجرب يفترض عادة أن الانتشار السريع للجزيئات الرائحة من المصدر يؤدي إلى خلق الانحدار مستقرة في الطبق. لإنشاء علاقة بين كمية المدخلات الحسية والاستجابات السلوكية ، فمن الضروري لتحقيق مزيد من توصيف دقيق للشروط التحفيز الرائحة. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن تصف طريقة جديدة تسمح للبناء التدرجات الرائحة مع هندستها مستقر وتحت السيطرة. باختصار نحن لتوضيح كيف يمكن استخدام هذه التدرجات للكشف عن العيوب الشمية (خشام الكامل والجزئي) ، ودراسة ملامح أكثر مكرا من السلوك الكيميائي.

البروتوكول

1. المعدات والكواشف

رائحة التخفيفات :

• زيت البرافين (سيغما ، CAS رقم : 8012-95-1)
• الروائح من أعلى نقاء المتاحة التي يتسبب يرقات ذبابة الفاكهة في جذب ^1. في هذه المقالة الفيديو ، تم اختبار الحيوانات مع خلات isoamyl (سيغما ، CAS رقم : 123-92-2).
• قنينة زجاجية مع غطاء 1.5ml تفلون (اجيلنت تكنولوجيز)
• مقياس رقمي قياس دقيق للتخفيف من وزنها

الساحة مقايسة انشاء :

• Agarose (Promega)
• الأغطية من 96 جيدا Microplate دينار بحريني (فالكون ، رقم الكتالوج : 353071). ساحتنا السلوكية يتكون من ثلاثة أغطية مكدسة.
• على قناة واحدة 10-20 pipetter ميكرولتر أو متعدد القنوات pipetter لتحميل الحبرية الرائحة (ق) في الغطاء العلوي من المكدس. لإعداد مقايسة المصدر متعددة ، ونحن نستخدم 50-50 ميكرولتر الماصة لايت متعدد القنوات pipetter من Rainin.

يرقات ذبابة الفاكهة إعداد الاختبارات السلوكية :

• 15 ٪ (وزن / وزن) حل السكروز
• أطباق بتري العادية دينار بحريني (فالكون) لغسل وتخزين اليرقات
• فرشاة طلاء (4 - 5mm طول الشعر الخشن) لمعالجة ونقل اليرقات

تسجيل حركة اليرقات :

• دبابيس صغيرة برأس مسطح لنقل اليرقات في الساحة
• ملقط أو الفرشاة لإزالة اليرقات بعد تسجيل
• مرحلة مضيئة مع غير متجانسة التدفئة مصدر للضوء ، "سليم الحافة" لوحة كهربائية الخفيفة المصنعة من قبل لوغان
• مجلس الوزراء لتطويق الساحة السلوكية ومراقبة ظروف الإضاءة
• تتبع نظام الفيديو لتسجيل الحركة الحيوانية. نحن نستخدم برنامج Ethovision (Noldus ، هولندا).
• اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا وبطاقة فيديو الإطار المختطف (بيكولو EureCard عاديه) التي تم شراؤها مع برنامج Ethovision
• ميزان الحرارة والرطوبة مسجل لرصد الأحوال الجوية خلال اختبارات سلوكية (اختياري)
• MATLAB (وMathworks) مخصصة لتحليل البيانات (اختياري)

2. الساحة السلوكية

الساحة السلوكية يتكون من ثلاثة أغطية مكدسة طبق 96 - جيدا. ويستخدم الغطاء السفلي لعزل بقية النظام من لوحة الخفيفة وتقليل الحمل الحراري في الساحة. الغطاء ثانية ، مغطاة 25ml من هلام agarose 3 ٪ ، بمثابة مرحلة ليرقات السير على. الغطاء العلوي يحمل رائحة قطرات التي لا تزال معلقة بسبب التوتر السطحي.

وpipetted قطرات رائحة مباشرة في آبار غطاء صحن 96 - جيدا. ويمكن استخدام مصادر رائحة واحدة أو عدة لتوليد التدرجات مع لمحات مميزة وقابلة للتحقق ^2. لاختبار الشم والعيوب الكيميائي في اليرقات ، نقترح استخدام التاليين المقايسات.

2.1. واحد مقايسة مصدر الرائحة : رائحة قطرة واحدة وضعت في البئر # E7 (معيار 96 - جيدا نظام مرجعي لوحة).

• التحفيز : 10μl رائحة المخفف في زيت البرافين
• وأدخلت يرقة واحدة تحت مصدر الرائحة (أو في جوارها وثيقة) : الشروط الأولية.
• الملاحظات الأساسية : للحصول على مؤثرات جذابة (مثل isoamyl خلات) ، wildtype اليرقات تتكدس تحت المصدر. خشامي الحيوانات او الحيوانات تتعرض لعيوب الشمية التجول بسرعة بعيدا عن الحبرية.
• مدة المحاكمة : 3 دقائق. وتسجل حركة حيوان معين حتى وقت المحاكمة قد انقضت أو في أقرب فرصة الاتصالات الحيوانية جدار اللوحة.
• ممكن قياسات لتقدير السلوكية : النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه حيوان في منطقة دائرية صغيرة تركز على مصدر الرائحة ، يعني المسافة للوصول إلى مصدر الرائحة ؛ دوام المسافة إلى مصدر الرائحة ، الخ.

هذا الاختبار بكفاءة لاختبارات الشم الأساسية في يرقات متحولة. ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد موثوق عتبة الكشف عن الروائح خاص ^2.

2.2. مصدر الرائحة متعددة مقايسة

وضعت عدة قطرات رائحة في البئر من الغطاء العلوي. في مقالة الفيديو الحالية ، أنشأنا التدرجات على طول صف هاء المركزية قدمت ما مجموعه ست قطرات في الآبار # E2 ، E4 # # E6 ، # E8 ، E10 E12 # # و (معيار 96 - جيدا مرجع لوحة النظام ). في المقابل مع طبق بتري واحد المقايسات مصدر الرائحة ، ومصدر الرائحة متعددة مقايسة يسمح الرقابة النوعية للهندسة التدرج أنشئت على طول وعرض الساحة. تم استخدام هذا الاختبار لتوصيف آليات الحسية يرقات ذبابة الفاكهة السماح لchemotax ^2.

• التحفيز : يتم وضع قطرات رائحة 10μl بالتناوب في الآبار على طول الصف. هذا الترتيب يؤدي إلى إنشاء معامل تركز الصف المحدد. لإنشاء التدرج متجانسة على طول عرض على الساحة ، ويمكن تحميل عدة صفوف مع مصادر متعددة.
• وأدخلت يرقة واحدة تحت مصدر الرائحة بين الآبار و# # E3 : الشروط الأوليةE4.
• الظواهر الأساسية : اليرقات خشامي التجول عشوائيا من نقطة البداية. لمحفزات جذابة (مثل isoamyl خلات) ، والحيوانات التي هي قادرة على التنقل على طول رائحة اتجاه تركيز رائحة متزايدة. يرتبط دقة مع حيوان الذي يصعد درب رائحة مع قدرته على الإحساس وعملية التحفيز الرائحة. وغالبا ما تسبب مسارات متعرجة عن عيوب الحسية. مرة حيوان قد وصل إلى أعلى نقطة تركيز في المحاكمة ، إلا أنها تبقى على مقربة من هذا الموقف.
• مدة المحاكمة : 3 الحد الأقصى للدقيقة (فترات أطول تتبع تميل إلى إدخال الضوضاء واليرقات ويفقد الاهتمام في نهاية المطاف التخلي عن الانحدار). لالتدرجات هو موضح في هذه المقالة الفيديو ، وسجلت حركة لليرقة الفردية حتى الحيوان الذي تم التوصل إليه في المنطقة من مصدر أعلى تركيز (جيد # E12). تم ايقاف التسجيل في أقرب وقت الحيوان وصلت إلى المنطقة المستهدفة أو اتصلت بأي جدار الساحة.
• المقاييس الممكنة لالكمي السلوكية : النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه حيوان تحت خط الرائحة (مستطيل أزرق) ؛ البند يعني بالنسبة لاتجاه المحلية التدرج رائحة ؛ درجة الكيميائي مجتمعة قياس الميل العالمي للحيوان لمتابعة الرائحة السطر ^2.

3. التدرج ملف التحقق

قبل اختبار اليرقات في الانحدار وجه الخصوص ، من المهم تحديد استقرارها على مر الزمن. على هذا الأساس ، يمكن تحديد المجرب حيث المدة الكافية لكل محاكمة وعدد اليرقات التي يمكن تتبعها بشكل متسلسل في الساحة نفسها. لاختبار الاستقرار في الانحدار ، قمنا بتطوير طريقة تقوم على التحليل الطيفي IR ^2. هذا الأسلوب هو خارج نطاق هذا البروتوكول ، وسوف لا يكون بمزيد من التفصيل.

4. بروتوكول لإعداد تجربة

4.1. إعداد لوحة agarose والتخفيفات الرائحة :

1. 1. صب 25ml من agarose 3 ٪ على الجزء العلوي من غطاء مسطح طبق 96 - جيدا ؛ agarose تسمح ليبرد ويصلب (~ 30 دقيقة).
   
   هام : تأكد من أن أغطية 96 - جيدا هي على سطح مستو قبل صب agarose لأن وجود منحدر على agarose هلام طدت قد تؤثر في سلوك اليرقات. عندما صب جل ، وإزالة أي فقاعات التي تشكل على السطح.
   
   
2. 2. تخفيف الروائح لتركيزات المطلوب في زيت البارافين باستخدام مقياس رقمي لقياس دقيق لكميات من زيت البرافين والرائحة في كل التخفيف.

ملاحظات : عندما تستخدم تركيزات منخفضة رائحة ، فمن الأفضل لإعداد مجموعة من تركيزات المصدر استنادا التخفيفات المتسلسلة. البدء ، على سبيل المثال ، مع حل 1.0M وإجراء التخفيف 1:02 للحصول على حل 0.5M. قبل الشروع متكرر ، واحد يحصل على تخفيف عقب سلسلة تطور 1.0M ، 0.5M هندسية ، 0.25M ، 0.12M ، 0.06M ، 0.03M ، 0.015M.

المهم : منذ العديد من الروائح العضوية تتفاعل مع البلاستيك ، ويجب أن يتم تخزين التخفيفات الرائحة في قارورة زجاجية مع قبعات التفلون. من الناحية المثالية ، ينبغي إعداد الروائح العذبة قبل كل تجربة للحد من التقلبات في تركيز الرائحة الفعلية عبر التجارب. هذا ينطبق بشكل خاص عند استخدام المواد الكيميائية شديدة التقلب.

4.2. يرقات التحضير :

1. 1. إعداد 15 ٪ سكروز حل في الماء المقطر.
   
   ملاحظات : حل 15 ٪ سكروز هو أكثر كثافة من اليرقات ويؤدي إلى أن يشعر بالارتياح إزاء منهم الى السطح من الحل. ومع ذلك ، غير منحل قطع الغذاء يطير لديها أكبر كثافة من الحل وتغرق بسرعة إلى أسفل. وهكذا ، وذلك باستخدام هذا الحل يوفر السكروز وسيلة فعالة لفصل اليرقات من الطعام. حل السكروز هو وسيلة ممتازة لالملوثات البيولوجية ، وإذا كان هذا الحل يمكن أن يصبح غائما سواء تعقيم فلتر لإزالة التلوث.
   
   
2. الحصول على قنينة مع 6 ايام من العمر اليرقات أو اليرقات في هذه المرحلة التنموية المنشودة.
   
   ملاحظات : يتم تنفيذ جميع التجارب لدينا خارجا مع اليرقات البالغة من العمر 6 ايام (منتصف المرحلة الثالثة التنموية طور مرحلي) ؛ اليرقات في هذه المرحلة التنموية هي كبيرة بما يكفي لسهولة الكشف مع برنامج تتبع لدينا ، ولكن أيضا بدور نشط للغاية.
   
   
3. صب في قارورة السكروز الغذائية التي تحتوي على اليرقات.
4. استخدام ملعقة وتفتيت وإذابة المواد الغذائية يطير برفق للافراج عن اليرقات. وسوف تصل اليرقات سراح تطفو إلى السطح.
5. السماح لبضع دقائق لقطع المواد الغذائية جوا الى بالوعة إلى الجزء السفلي من القارورة ، ثم اسكب السكروز واليرقات في طبق بتري. إذا كان الاختيار الأولي لليرقات ضروري ، يمكن جمع الحيوانات التي تتدفق من خلال مرشح السكروز. ويمكن بعد ذلك يتم نقل اليرقات إلى طبق لاختيار مع فرشاة الرسم.
6. ترك اليرقات لحوالي 30 دقيقة في لياليحل ucrose قبل الشروع في الاختبارات السلوكية للسماح للحيوانات لروض في حل السكروز. كما لا تظهر اليرقات لتتغذى على السكروز ، فإن هذه الحيوانات تواجه حالة من الجوع مما يحسن أداء الكيميائي.
7. يمكن ملء غطاء صحن بيتري مع الماء (أو السكروز) واستخدامها بوصفها وعاء للحيوانات بعد تجاهل اختبارات سلوكية.

5. بروتوكول لتنفيذ تسجيلات السلوكية

5.1. الساحة انشاء :

1. 1. قطرات تطبيق الرائحة على الجانب السفلي (الجانب حفر آبار) من غطاء صحن 96 - الطازجة جيدا.
   
   المهم : لتجنب التلوث من الروائح المختلفة ، وتركيز الرائحة ، يجب استخدام غطاء جديد لتحميل كل مجموعة المتابعة. يتم تدوير أي من الأغطية التي تحتوي على مصادر الرائحة بعد التجربة. اعتمادا على مدى تركيز الرائحة المستخدمة ، وقد تم العثور على التدرجات الرائحة إلى أن تكون مستقرة فقط لمدة 10 إلى 20 دقيقة في نظام مغلق. ولذلك فمن المهم لتقليل الوقت بين التدرج انشاء والبداية الفعلية للاختبار السلوكية.
   
   
2. عكس الغطاء وذلك المكدس فوق غطاء second المغلفة مع طبقة agarose 3 ٪.
   
   المهم : عكس الغطاء بعناية لمنع رائحة قطرات من الانتشار إلى الآبار المجاورة.
   
   
3. على عكس من غطاء رأس على سطح agarose ، والسماح لنشر رائحة لمدة 30 ثانية قبل إدخال اليرقة.

5.2. تحميل اليرقات :

1. رفع الغطاء العلوي الذي يحتوي على قطرات الرائحة يكفي للسماح التحميل من اليرقة.
2. نقل اليرقة من محلول السكروز إلى طبقة agarose. نقطة الانطلاق للحيوان يعتمد على مقايسة المستخدمة :
   
   لمقايسة رائحة مصدر واحد ، يتم الافراج اليرقات تحت قطرات الرائحة.
   
   لمقايسة رائحة مصدر متعددة ، يتم الافراج اليرقات بين الآبار # # E3 و E4.
   
   المهم : المشرق الحيوانات التي أدخلت حديثا بطريقة متناسقة. علينا توجيه حيواناتنا في اتجاه الانحدار ، وضمان أن جسم الحيوان ورئيس تواجه أعلى تركيز. الحيوانات قدم في اتجاه معاكس لهذا التدرج الشروع في سلوك البحث. في رأينا ، هذه الفترة البحث الأولي يمثل مصدرا لا لزوم لها من الضوضاء. السيطرة على اتجاه الرأس يقلل من عدد الحيوانات التي اتصل جدار الساحة خلال سلوكهم استكشافية. هذه الممارسة لا رئيس اتجاه الحركة للحيوان أو زيادة كبيرة في عدد الحيوانات خشامي chemotaxing على طول خط الرائحة عن طريق الصدفة (أي إيجابية كاذبة في الاختبارات الرائحة).
   
   
3. استبدال الغطاء العلوي وبدء التسجيل على الفور.
   
   ملاحظات : اليرقات صحية بدء الزحف فور بدء العمل بها في الساحة ، وربما يغطي مسافة 1cm خلال الثواني ال 10 الاولى. إذا المجرب بطيئة في بدء تسجيل ، ستفقد datapoints الأولي. لهذا السبب نحن نوصي بأن يصبح المجرب تعرف جيدا مع أوامر لبدء تسجيل البرنامج قبل محاولة تشغيل التجربة.
   
   
4. السماح لليرقة على التصرف لمدة التسجيل (عادة 3 دقائق).
   
   ملاحظات : يتم إنهاء التسجيلات قبل نهاية 3 دقيقة إذا كان يضرب الجدار اليرقة الساحة أو تصل إلى المنطقة المستهدفة (مثل التدرج في مقايسة).
   
5. في نهاية عملية التسجيل ، ورفع الغطاء فورا وإزالة اليرقات بالملقط أو فرشاة الرسم ملف. وضع الحيوانات في مجنزرة غطاء صحن بيتري المياه التي تحتوي على (أو السكروز).
   
   هام : لا يتم استخدامها الحيوانات المسجلة. طبق الماء هو مجرد وعاء مناسب لفصل الحيوانات المسجلة وغير المسجلة أثناء تشغيل التجارب.
   
6. إذا تعقب الحيوانات متعددة تحت ساحة مجموعة المتابعة ، تحميل فورا اليرقة المقبل وبدء عملية التسجيل كما هو مبين أعلاه.
   
   المهم : يجب أن يكون وقرر عدد من التجارب التي أجريت في الساحة نفس مجموعة المتابعة على أساس استقرار التدرج التي ينبغي التحقق منها قبل إجراء أي تجربة السلوكية ^2.
   
7. مرة واحدة كل اليرقات لفحصها تحت الساحة انشاء وقد تم تعقب وإزالتها من الساحة ، تجاهل الغطاء العلوي وطبقة agarose. ويمكن إعادة تدويرها غطاء المتوسطة (أي غطاء agarose).
   
   ملاحظة : ننصح المستخدمين Ethovision لاختيار الأسلوب 'خلفية الطرح" الكشف.

6. التجارب أثبتت عينة في مقالة فيديو

6.1. مصدر واحد مقايسة مع رائحة 1.0M من خلات isoamyl.

اختبرنا عمياء ten Or83b / -- المسوخ وعشرة نوع البرية (W1118) إلى كل من اليرقات التي تم تعيين عدد كان. تجربة تتبعإيه لم تتلق أي معلومات عن التركيب الوراثي من كل حيوان. بعد كل تسجيل ، تم تعيين النمط الظاهري التنبؤي لاختبار كل حيوان : smellers ، إذا لوحظ تراكم تحت مصدر للمحاكمة بأكملها ، وعدم smellers ، إذا كان المسار الأيسر بسرعة حي مصدر الرائحة. بعد أن سجلت في سلوك الحيوانات 20 ، وقد جمعت وفقا لمسارات النمط الظاهري. ثم تمت مقارنة نتيجة لهذا التجمع مع التركيب الوراثي الفعلي لليرقات : تم العثور على جميع الاحالات التي تجرى لتكون صحيحة.

6.2. مقايسة متعددة مصدر الرائحة مع التدرجات والأسي خطية من خلات isoamyl.

في هذه التجربة ، قارنا أداء نوع من اليرقات البرية على طول خطي chemotaxing والتدرج الأسي. وسجلت السلوكيات الكيميائي لمدة التدرجات التي تقام مع نفس التركيز أعلى من 0.5M. وتراوحت مصادر رائحة التدرج الأسي كما هو موضح في المادة ، بين 0،015 و 0.5M. وتراوحت مصادر الانحدار الخطي بين 0.25 و 0.5M (حسابي التقدم مع فرق مشتركة 0.05M).

الانحدار الخطي يمثل بيئة الكيميائي أكثر تحديا والفرق المحلية في التركيز المستمر وكانت صغيرة نسبيا ، ومدى التركيز الضيق (0.25M). في المقابل ، كان تركيز مجموعة من التدرج الأسي أكبر مع تزايد الخلافات المحلية في التركيز على طول الطريق.

وسجلت خمسة عشر يرقات لكل من البلدين وهندستها التدرج مسارات فرضه في رسم بياني واحد. والفحص البصري من الرسوم البيانية التي حفلين البرية يرقات نوع موثوق به وقادر على الصعود الى الانحدار لكلا هندستها ولكن هذا المبلغ كان أكبر من التعرجات للشرط الانحدار الخطي. هذا يشير إلى أن يتم الكشف عن مزيد من موثوق الحاضر اشارة على طول الانحدار لشكل من الأسي لاحد الخطية.

6.3. مقايسة متعددة مصدر الرائحة مع التدرج خلات isoamyl في الهندسة "سقف".

نحن هنا تحقق من أن أدخلت اليرقات في الانحدار رائحة حساسة للتغيرات المحلية في تركيز الرائحة بدلا من مجرد وجود أو عدم وجود رائحة. أنشئ التدرج isoamyl من تطبيق قطرات رائحة مع التركيزات التالية : 0.06 ، 0.12 ، 0.25 ، 0.5 ، 0.25 ، 0.12M. يشبه الهندسة التدرج التي تلت an غير المتكافئة "سقف" وتبلغ ذروتها في 0.5M.

وأفرج عن اليرقات بين قطرات رائحة 0.06M 0.12M و. وكان لدينا فرضية أنه إذا كانت اليرقات الحوسبة مجرد وجود رائحة انهم اتباع التدرج بأكمله دون تفضيل خاص للتركيز الأقصى. في المقابل ، إذا اليرقات حساسة للتغيرات المحلية في تركيز أنها تتراكم تحت قطرات 0.5M. وسجلت خمسة عشر اليرقات ، ووجد أنه بعد فترة قصيرة استكشافية جميع اليرقات المتراكمة تحت أعلى تركيز جيدا. هذا يشير إلى أن التغيرات المحلية في تركيز الرائحة يتم حسابها وإبلاغ السلوك الكيميائي لليرقات ذبابة الفاكهة.