مقالة منهجية

تحضير البروتينات أحادية الخلية لتحليل قياس الطيف الكتلي باستخدام تحلل الحرارة بالتجميد وحامل متساوي الضغط

DOI:

10.3791/63802

⸱

ديسمبر 9, 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية تحضير خلايا الثدييات لتحليل البروتينات أحادية الخلية عبر قياس الطيف الكتلي باستخدام الكواشف والمعدات المتاحة تجاريا ، مع خيارات لكل من السحب اليدوي والآلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تحليل البروتينات أحادية الخلية طرقا حساسة ودقيقة كميا ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع وقوية. لتلبية هذه المتطلبات ، تم تطوير بروتوكول ProtEomics أحادي الخلية (SCoPE2) كطريقة من الجيل الثاني لقياس مئات إلى آلاف البروتينات من عينات محدودة ، وصولا إلى مستوى خلية واحدة. حققت التجارب التي تستخدم هذه الطريقة تحديد أكثر من 3000 بروتين عبر 1500 خلية ثديية مفردة (500-1000 بروتين لكل خلية) في 10 أيام من وقت أداة مطياف الكتلة. يستفيد SCoPE2 من دورة التجميد والحرارة لتحلل الخلايا ، مما يغني عن الحاجة إلى تنظيف الخلايا المفردة وبالتالي تقليل فقد العينات ، مع تسريع إعداد العينة وتبسيط أتمتتها. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم الطريقة حاملا متساوي الضغط ، مما يساعد على تحديد البروتين ويقلل من فقد العينات.

يوفر بروتوكول الفيديو هذا إرشادات مفصلة لتمكين اعتماد التحليل الآلي للبروتين أحادي الخلية باستخدام المعدات والكواشف التي يمكن الوصول إليها على نطاق واسع فقط. نوضح الخطوات الحاسمة في إجراء إعداد الخلايا المفردة للتحليل البروتيني ، من الحصاد إلى الحقن إلى تحليل الطيف الكتلي الترادفي اللوني السائل (LC-MS / MS). بالإضافة إلى ذلك ، يتم توجيه المشاهدين من خلال مبادئ التصميم التجريبي مع الناقل متساوي الضغط ، ومراقبة الجودة لكل من الناقل متساوي الضغط والمستحضرات أحادية الخلية ، والنتائج التمثيلية مع مناقشة قيود النهج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم تحليل الخلية الواحدة على نطاق واسع لدراسة مستوى عدم التجانس داخل الأنظمة البيولوجية التي لا يمكن تمييزها من خلال القياسات المجمعة1،2،3. يمكن أن يكون لهذا التنوع الخلوي عواقب وظيفية يمكن أن تعزز فهم العمليات البيولوجية المتكاملة ، من المقاومة العلاجية للخلايا السرطانية4،5،6 إلى عدم التجانس من خلية إلى خلية في مرض السكري7،8،9،10. ركزت العديد من التحقيقات على قياس الأحماض النووية في الخلايا المفردة ، عن طريق قياس المستويات الجينية أو النسخية ومكنت من تصنيف أنواع الخلايا وحالاتها. ومع ذلك ، لا يمكن لمثل هذا التقدم في مساحة الحمض النووي سد الفجوة المعرفية في تنظيم ما بعد النسخ11 ، مما يؤدي إلى الحاجة إلى قياسات بروتين عالية الإنتاجية مماثلة في الخلايا المفردة12،13،14،15.

لقد طورنا SCoPE216,17 لتلبية الطلب على البروتينات أحادية الخلية الصارمة والقوية لأنظمة الثدييات. إنها طريقة متعددة الإرسال ، مما يسمح بزيادة الإنتاجية عن طريق وضع العلامات على العديد من الخلايا وتحليلها بالتوازي18 ، على عكس mthods الخالية من الملصقات التي تحلل خلية واحدة في وقت19,20. تسمح منهجية تحضير العينات ونهج قياس الطيف الكتلي وخطوات تحليل البيانات اللاحقة بالتحديد الكمي الدقيق لمئات إلى آلاف البروتينات لكل خلية واحدة. تجعل هذه الطريقة تحليل مطياف الكتلة للخلايا المفردة ممكنا من خلال الناقلمتساوي الضغط 21 ، وهي عينة صغيرة من الخلايا (عادة 25-200) تشبه بيولوجيا مجموعة الخلايا الواحدة ذات الاهتمام. يتم مضاعفة هذه المادة الحاملة في مجموعة ذات قناة مرجعية لنفس المادة وخلايا مفردة من خلال استخدام علامات الكتلة الترادفية (ملصقات TMT). تقلل القناة الحاملة من فقد العينة إلى المناطق السطحية وتوفر شظايا العمود الفقري الأيوني لتحديد الببتيد بنجاح. تساعد القناة المرجعية ، التي يتم تحضيرها بكميات كبيرة ثم تخفيفها لاحقا إلى 5-10 مكافئات خلية لكل مجموعة أحادية الخلية ، على التحكم في التباين الفني في التحليل. على وجه التحديد ، يسمح المرجع بتطبيع التباين الناجم عن التأثيرات المرتبطة ب LC-MS / MS ، مثل أخذ العينات الأيونية وكفاءة التأين. عادة ، يتم إجراء المرجع والقنوات الحاملة من نفس عدد الخلايا.

بروتوكول تحضير العينات هذا هو طريقة من الجيل الثاني تعتمد على SCoPE-MS22 من خلال تحسينات تآزرية متعددة. تتضمن التحسينات طريقة تحلل الخلايا التي تتجنب تنظيف العينات ، وهي خطوة شائعة في مستحضرات البروتينات MS. يستخدم mPOP (الحد الأدنى من تحضير عينة ProteOmic)23 ، وهي طريقة تحلل الحرارة بالتجميد. مكنت هذه الطريقة من تحلل الخلايا المفردة بأحجام أصغر وفي ألواح متعددة الآبار بدلا من القوارير ، مما يسهل معدل إنتاجية أعلى وأتمتة بواسطة الدراجات الحرارية. إجمالا ، خفضت هذه الطريقة التكلفة لكل خلية واحدة وزادت من الدقة الكمية مقارنة ب SCoPE-MS16,24.

يصف هذا البروتوكول كيفية تحضير الخلايا المفردة للتحليل البروتيني ، بما في ذلك كيفية تحضير الناقل والقنوات المرجعية باستخدام ملصقات TMTpro 18-plex متساوية الضغط. من المحتمل أن تكون خلايا الثدييات الموجودة في تعليق أحادي الخلية والتي يمكن عزلها إلى 384 لوحة بئر قابلة لهذا البروتوكول. كما تم تضمين نتائج تمثيلية لمجموعات ناجحة أحادية الخلية ، تعرض العديد من مخططات مراقبة الجودة التي تم إنشاؤها بواسطة تطبيق R Shiny ، DO-MS25. أدت أدوات البرامج المنشورة الأخرى 26,27 والمبادئ التوجيهية التجريبية 17,21 إلى تحسين اعتماد هذا البروتوكول. نأمل أن يساعد هذا الدليل المرئي الباحثين على إجراء تجارب البروتينات أحادية الخلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تكون درجة حرارة الغرفة (RT) 18-22 درجة مئوية.

1. الناقل وتوليد المواد المرجعية

  1. عزل الخلية
    1. اجمع الخلايا ذات الأهمية في معلقات الخلايا في برنامج تلفزيوني 1x بارد.
      ملاحظة: إذا أمكن ، يجب تحضير الناقل والمواد المرجعية من مجموعة (مجموعات) الخلية المختارة لدراستها على مستوى الخلية الواحدة. يجب أن تشكل أعداد مماثلة من الخلايا من الظروف التجريبية المختلفة (مثل الخلايا المناعية المحفزة وغير المحفزة) الناقل والمرجع. في الحالات التي لا يمكن فيها حصاد عدد كبير بما فيه الكفاية من هذه الخلايا ، يجب اختيار مجموعة خلايا مناسبة بناء على التشابه البيولوجي.
    2. باستخدام مقياس الدم أو غيرها من وسائل عد الخلايا (مثل FACS) ، احسب عدد الخلايا في التعليق.
    3. قم بتدوير وإعادة تعليق 22000 خلية من كل نوع خلية في 11 ميكرولتر من الماء بدرجة HPLC ، بشكل منفصل في أنابيب PCR (أنابيب PCR القياسية 250 ميكرولتر).
      ملاحظة: عدد الخلايا الموصى بها هنا كاف للناقلات ومراجع لعدد المجموعات التي يمكن تحضيرها من لوحة 384 بئر مليئة بالخلايا المفردة. يمكن تحجيم مدخلات الخلية في هذه الخطوة وكميات الكاشف في الخطوات اللاحقة بشكل متناسب لعدد أكبر من المجموعات. تعتمد سرعة الدوران لأسفل على ممارسات زراعة الخلايا في المختبر. تدور نموذجي لأسفل: 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. انقل العينات إلى فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      نقطة التوقف: يمكن أن تظل العينات مجمدة لعدة أشهر دون أي عواقب على بيانات الخلية الواحدة.
  2. تحلل الخلايا
    1. قم بتسخين أنبوب PCR مع الخلايا إلى 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (مع ضبط غطاء الدورة الحرارية على 105 درجة مئوية) ، ثم اترك الأنابيب تبرد إلى 12 درجة مئوية مباشرة بعد دورة التسخين.
    2. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة ، ثم قم بتدويره لأسفل في دوار أنبوب PCR أعلى الطاولة في RT لجمع كل السائل في قاع الأنبوب.
    3. في سونيكاتور حمام مائي ، صوتنة الأنابيب لمدة 5 دقائق ، ثم ضعها على الثلج في RT.
  3. هضم التربسين
    1. أضف 2.2 ميكرولتر من المزيج الرئيسي (انظر الجدول 1 للمكونات) إلى كل أنبوب عينة أثناء وجوده على الثلج.
      تنبيه: يمكن أن يسبب التربسين تهيج الجلد والجهاز التنفسي والعين. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية. التعامل مع تحت غطاء الدخان الكيميائي.
    2. دوامة الأنابيب لفترة وجيزة لخلط وتدور لأسفل في أنبوب PCR الدوار أعلى مقاعد البدلاء في RT لجمع كل السوائل في الجزء السفلي من كل أنبوب.
    3. سخني العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات (مع ضبط غطاء الدورة الحرارية على 52 درجة مئوية).
  4. رد فعل وسم TMT
    1. قم بتدوير العينات بعد الهضم في أنبوب PCR الدوار على مقاعد البدلاء في RT.
    2. قسم كل عينة إلى حجمين متساويين كل منهما 6.6 ميكرولتر ، بحيث يحتوي كل أنبوب على 11000 خلية.
    3. إلى الأنابيب المخصصة للناقل ، أضف 3.3 ميكرولتر من ملصق TMT 126 الذي أعيد تعليقه بتركيز 85 مللي مول.
    4. إلى الأنابيب المخصصة للمرجع ، أضف 3.3 ميكرولتر من ملصق TMT 127N الذي تم إعادة تعليقه بتركيز 85 مللي مول.
    5. دوامة الأنابيب لفترة وجيزة وتدور لأسفل في أنبوب PCR الدوار أعلى مقاعد البدلاء في RT لجمع السائل في الأسفل.
    6. اترك الأنابيب في RT لمدة 1 ساعة.
  5. تبريد تفاعل وسم TMT
    1. أضف 1.65 ميكرولتر من 0.5٪ هيدروكسيلامين إلى كل أنبوب.
      تنبيه: هيدروكسيلامين يمكن أن يسبب تهيج الجلد. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية.
    2. دوامة الأنابيب لفترة وجيزة وتدور لأسفل في أنبوب PCR الدوار أعلى مقاعد البدلاء في RT لجمع السائل في الأسفل.
    3. اترك الأنابيب في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. الجمع بين الناقل والمرجع
    1. إذا تم وضع علامات منفصلة على العينات التي ستشكل الناقل ، فقم بمزجها بنسب متساوية.
    2. إذا تم تصنيف العينات التي ستشكل المرجع بشكل منفصل ، فقم بمزجها بنسب متساوية.
    3. امزج الناقل والمرجع بحيث يكون التركيز النهائي للناقل 100-200 خلية / ميكرولتر ، والتركيز المرجعي 5-10 خلايا / ميكرولتر.
    4. تقييم جودة الناقل والمواد المرجعية قبل دمجها مع مجموعات أحادية الخلية.
      ملاحظة: يمكن إجراء مراقبة جودة الناقل والمواد المرجعية من خلال مجموعة متنوعة من الطرق ، ولكن يوصى باستخدام برنامج DO-MS ، المتاح في17 do-ms.slavovlab.net. تشمل القياسات الحرجة للجودة معدل الشقاق (<25٪ ، وهو مقياس محسوب على أنه عدد الببتيدات المحددة بثقة مع انشقاق مفقود مقسوما على عدد الببتيدات المحددة بثقة في المجموع) وكفاءة وضع العلامات (>99٪ ، وهو مقياس محسوب على أنه عدد مواقع وضع العلامات ، وهي الببتيد N-terminus و Lysine ، مع تسمية مقسومة على العدد الإجمالي لمواقع وضع العلامات).
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الناقل والمواد المرجعية عند -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
مكونتركيز المزيجالتركيز النهائي لكل أنبوب
التربسين الذهب50 نانوغرام/ميكرولتر8.33 نانوغرام/ميكرولتر
TEAB ، درجة الحموضة = 8.5500 مللي متر83.33 مللي متر
نوكلياز بنزوناز1.2 وحدة0.2 وحدة

الجدول 1: كمية الكاشف من المزيج الرئيسي. يتم سرد التركيزات النهائية للكواشف اللازمة لهضم التربسين.

2. إعداد عينة SCoPE2

  1. عزل الخلية
    1. تكملة المياه HPLC الصف مع 25 fmol لكل الببتيد لكل ميكرولتر من محلول الببتيد الاصطناعية.
      ملاحظة: محلول الببتيد Waters MassPrep هو مثال على ما يمكن استخدامه. يتكون من سبعة ببتيدات لا تتأين جيدا. هذا هو الجانب الرئيسي لهذا الحل: هذه الببتيدات لا تتداخل مع القياس الكمي الدقيق لقياس الطيف الكتلي للخلايا المفردة. أي خليط عالي النقاء من عدد قليل من الببتيدات من غير المحتمل أن يكون في العينات ذات الأهمية سيكون مناسبا.
    2. أضف 1 ميكرولتر من هذا المزيج إلى كل بئر من لوحة 384 بئرا باستخدام روبوت توزيع السوائل أو ماصة يدوية.
    3. أغلق اللوحة وقم بتدويرها لأسفل في لوحة دوارة أعلى الطاولة في RT لجمع السائل في الأسفل.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الألواح التي تحتوي على هذا المحلول عند -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
    4. الحصول على تعليق للخلايا غير الثابتة المصنفة.
      ملاحظة: تعتمد كيفية الحصول على تعليق الخلية بالضبط على نوع الخلية محل الاهتمام. فيما يلي أمثلة عامة:
      1. الخلايا المعلقة: قم بتدوير الخلايا إلى حبيبات ، وقم بإزالة وسط زراعة الخلية.
      2. الخلايا الملتصقة: قم بإزالة الخلايا من الطبق أو القارورة من خلال التربسين أو الكشط. ثم قم بتدويرها لأسفل لإزالة وسط زراعة الخلية.
    5. اغسل معلق الخلية مرتين باستخدام 1x PBS بارد. اترك الخلايا معلقة في 1x PBS بعد الغسيل الثاني.
    6. إذا تم تجميد لوحة البئر 384 ، قم بإذابتها في RT. قم بتدويرها لأسفل للتأكد من وجود كل السائل في قاع الآبار.
    7. استخدم فارز الخلايا أو غيرها من الوسائل المتاحة ، مثل الانتقاء اليدوي ، لتوزيع الخلايا المفردة في الآبار المعنية.
      ملاحظة: أضف خلايا مفردة إلى الآبار مع ترك بعض الآبار فارغة للعناصر التحكم السلبية والإيجابية (انظر المناقشة). عند استخدام قياس التدفق الخلوي ، استخدم أقل معدل تدفق ممكن لمقياس التدفق الخلوي. يعتقد أن معدل التدفق المنخفض ألطف للتعامل مع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون حجم الفوهة مناسبا للاستخدام مع الخلايا ذات الاهتمام. يوصى بالتعاون مع مرفق قياس التدفق الخلوي.
    8. أضف عناصر تحكم إيجابية من 2-5 خلايا مكافئة للتحلل إلى الآبار المختارة التي يتم سحبها يدويا أو باستخدام روبوتات مناولة السوائل.
    9. قم بإغلاق اللوحة وتدويرها بخلايا مرتبة في دوار لوحة أعلى الطاولة في RT لجمع السائل في الأسفل. قم بتجميد اللوحة عند -80 درجة مئوية في أسرع وقت ممكن.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الألواح ذات الخلايا المفردة المصنفة عند -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
  2. تحلل الخلايا
    1. خذ لوحة 384 بئر مع الخلايا المفردة المصنفة وضعها في العجلة الحرارية في أسرع وقت ممكن.
    2. سخني الطبق إلى 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (مع ضبط درجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية) ، ثم اترك الطبق يبرد إلى 12 درجة مئوية.
    3. قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة في دوار لوحة أعلى مقاعد البدلاء في RT.
    4. في سونيكاتور حمام مائي ، صوتنة اللوحة لمدة 5 دقائق في RT ، ثم ضعها على الثلج.
  3. هضم التربسين
    1. قم بإعداد 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي (انظر الجدول 1 للمكونات) لكل لوحة 384 بئر.
    2. إلى كل بئر من لوحة 384 بئر ، أضف 0.2 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المحضر في الخطوة 2.3.1 باستخدام معالج سائل.
      ملاحظة: استخدم كميات أكبر إذا تم استخدام السحب اليدوي ، مع التأكد من أن التركيزات النهائية للكواشف لا تزال كما هي لكل بئر.
    3. أغلق اللوحة ، دوامة لمدة 5 ثوان ، وقم بتدويرها لأسفل في دوار لوحة أعلى الطاولة في RT.
    4. سخني صفيحة البئر 384 عند 37 درجة مئوية (مع ضبط درجة حرارة الغطاء على 52 درجة مئوية) لمدة 3 ساعات.
  4. رد فعل وسم TMT
    1. أخرج مخزون 85 مللي مللي أمبير من ملصقات TMT (من 128 نيوتن إلى 135 نيوتن) من الفريزر -80 درجة مئوية. قم بتسخين الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتحها.
    2. تمييع الملصقات إلى 22 mM في الأسيتونيتريل اللامائية.
      تنبيه: الأسيتونيتريل سائل قابل للاشتعال. يمكن أن تهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي والجهاز العصبي المركزي. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية. التعامل مع تحت غطاء الدخان الكيميائي.
    3. باستخدام استراتيجية وضع العلامات هذه ، أضف 0.5 ميكرولتر من ملصقات TMT المخففة إلى كل بئر من لوحة البئر 384. استخدم إما روبوت توزيع السوائل (إذا كنت تستخدم معالج سائل ، فتأكد من استخدام المعدات المرتبطة المناسبة للمذيبات العضوية) أو ماصة يدوية.
      ملاحظة: انظر الجدول 2 للاطلاع على استراتيجية وضع العلامات. انظر الجدول 3 للحصول على مثال لتخطيط اللوحة.
    4. أغلق اللوحة ، دوامة لمدة 5 ثوان ، وقم بتدويرها لأسفل في دوار لوحة أعلى الطاولة في RT.
    5. دع تفاعل وضع العلامات يستمر عند RT لمدة 1 ساعة.
  5. تبريد تفاعل وسم TMT
    1. إلى كل بئر من لوحة البئر 384 ، أضف 0.2 ميكرولتر من 0.5٪ هيدروكسيلامين (مخفف في ماء بدرجة HPLC) باستخدام معالج سائل.
      ملاحظة: استخدم كميات أكبر إذا تم استخدام السحب اليدوي ، مع التأكد من أن التركيزات النهائية للكواشف لا تزال كما هي لكل بئر.
    2. أغلق اللوحة ، دوامة لمدة 5 ثوان ، وقم بتدويرها لأسفل في دوار لوحة أعلى الطاولة في RT.
    3. احتفظ بالطبق في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. التحضير لتحليل LC-MS / MS: مزيج من الخلايا المفردة وآبار التحكم مع الناقل / المواد المرجعية
    1. قم بإزالة الحامل / المواد المرجعية المدمجة من الفريزر -80 درجة مئوية.
    2. لكل مجموعة ، ماصة 1 ميكرولتر من الناقل والمواد المرجعية في البئر الأول الذي سيكون جزءا من مجموعة واحدة. ماصة الحجم الكامل للبئر الأول إلى البئر اللاحق. استمر في سحب الحجم الكامل من خلية إلى أخرى حتى يتم دمج جميع الآبار التي سيتم تضمينها في مجموعة واحدة في البئر النهائي.
      ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الناقل والمواد المرجعية بتركيز مكافئ 200 و 5 خلايا ، على التوالي ، ولكن كما نوقش سابقا21 ، قد تختلف هذه الكميات. يجب أن تحتوي كل مجموعة ، على النحو المبين في استراتيجية وضع العلامات (انظر الجدول 2) ، على حامل ومرجع وما يصل إلى 12 أو 14 عينة أحادية الخلية أو عينة تحكم عند استخدام TMTpro-16plex أو TMTpro-18plex ، على التوالي (انظر الخطوة 2.4.3).
    3. لكل مجموعة ، أضف 5 ميكرولتر من الأسيتونيتريل بنسبة 50٪ (مخفف في ماء بدرجة HPLC) إلى أول بئر أحادي الخلية يتم تضمينه في كل مجموعة. ماصة الحجم الكامل من البئر الأول إلى البئر التالي. استمر في سحب الحجم الكامل من خلية إلى أخرى حتى يتم دمج جميع الآبار التي سيتم تضمينها في مجموعة واحدة في البئر النهائي.
      ملاحظة: يمكن أن تساعد خطوة الغسيل هذه في استعادة العينات من الآبار.
    4. انقل كل مجموعة إلى إدخالات زجاجية فردية لأخذ العينات الأوتوماتيكية.
      ملاحظة: يمكن أيضا دمج هذه المجموعات في آبار مفردة للوحة 384 بئرا ووضعها مباشرة في جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي للحقن28.
    5. بمجرد دمج جميع المجموعات ووضعها في إدخالات زجاجية ، جفف العينات.
      نقطة وقفة: يمكن تخزين المجموعات المجففة في -80 °C لمدة 1 أسبوع على الأقل قبل التشغيل على مطياف الكتلة.
    6. قبل تحليل LC-MS / MS ، أضف 1.2 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ (المخفف في الماء بدرجة HPLC) إلى كل مجموعة لإعادة تعليق الببتيدات الموصوفة.
      تنبيه: حمض الفورميك سائل قابل للاشتعال. يمكن أن يسبب تلفا خطيرا في العين أو حروقا جلدية. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية. التعامل مع في منطقة جيدة التهوية.
    7. ضع إدخالات أخذ العينات الأوتوماتيكية في قوارير زجاجية لأخذ العينات الأوتوماتيكية وأغلق كل عينة بغطاء.
    8. دوامة كل قارورة لمدة 5 ثوان للتأكد من اكتمال إعادة التعليق ، ثم تدور لأسفل في قارورة دوارة في RT.
    9. تأكد من أن كل عينة في الجزء السفلي من الملحق ، بدلا من رشها على الجانبين.
    10. ضع القوارير في درج أخذ العينات الآلي.
    11. لكل مجموعة ، قم بحقن 1 ميكرولتر لتحليل LC-MS / MS.
تسميه126127 نيوتن127 ج128 نيوتن128 ج129 نيوتن129 ج130 نيوتن130 ج....135 نيوتن
نوع العينةحمالمرجعأجوفأجوفSC / التحكمSC / التحكمSC / التحكمSC / التحكمSC / التحكم....SC / التحكم

الجدول 2: مثال على مخطط وضع العلامات SCoPE2 TMTpro-18plex. عادة ما يتم تسمية الناقل والمرجع في أول ملصقين TMT. بعد ذلك ، يتم تخطي العلامتين التاليتين بسبب التلوث النظيري المحتمل الذي من شأنه أن يجعل الكمية أقل دقة. التسميات الأخرى المتبقية مخصصة للخلايا الفردية أو عناصر التحكم.

128 ج129 نيوتن129 ج130 نيوتن130 ج131 نيوتن131 ج132 نيوتن132 ج133 شمالا133ج134N128 ج129 نيوتن129 ج130 نيوتن130 ج131 نيوتن131 ج132 نيوتن132 ج133 شمالا133ج134N
123456789101112131415161718192021222324
Aإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سي+إس سيإس سيإس سي
Bإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سي+
Cإس سي-إس سي-إس سيإس سيإس سي+إس سي-إس سيإس سيإس سيإس سي+إس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-
Dإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سي+إس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي
Eإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سي
Fإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سي+إس سيإس سي
Gإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سي
Hإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي
أناإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي
J-إس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي
Kإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سي+إس سي--إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي
Lإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سي
Mإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سي
N+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي
Oإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سيإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي
Pإس سيإس سي-إس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سيإس سي+إس سيإس سيإس سي-إس سي

الجدول 3: مثال على تخطيط اللوحة لوضع العلامات باستخدام TMTpro-16plex. باستخدام تنسيق لوحة 384 بئر (أو أي تنسيق لوحة آخر) ، من المهم اختيار الآبار التي يتم فرز الخلايا فيها عشوائيا. سيتم استخدام تخطيط لوحة مختلف ل TMTpro-18plex.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستلزم النتائج الإيجابية للبروتوكول التحقق من أن عددا من الخطوات الحاسمة في البروتوكول قد نفذت بنجاح؛ وتشمل هذه إعداد الناقل ، وعزل خلية واحدة ، والتحلل ، والهضم ، ووضع العلامات الباركود ، وتحسين معلمة MS. تسمح مخططات DO-MS بالتقييم السهل لإكمال كل خطوة حاسمة في البروتوكول. الناقل الذي تم إعداده بنجاح ، والذي يتوافق عادة مع 25 و 200 خلية في الكمية (لكل مجموعة) ، يتم هضمه جيدا وتصنيفه جيدا. تسمح المؤامرات من DO-MS بتحديد شدة العينة (لتقدير الكمية) ، وكفاءة الهضم (من الناحية المثالية <25٪ من الانقسامات) ، وكفاءة وضع العلامات (يجب أن تكون >99٪). والأهم من ذلك ، أن العينات الحاملة التي لم يتم تصنيفها بالكامل قد تسمح بالتفاعل المتقاطع مع الرموز الشريطية المخصصة للخلايا المفردة وتضيف إشارة زائفة إلى القياس الكمي للببتيدات أحادية الخلية.

تشمل آبار التحكم السلبي جميع الكواشف التجريبية ولكنها تفتقر إلى خلية. هذا لا يسمح فقط بتقييم ضوضاء الخلفية ولكن أيضا تحديد كفاءة عزل الخلية من خلال توفير إشارة تمثيلية لبئر فارغ. يقدم تقرير DO-MS مخططات لتقييم الإشارة المقاسة لبئر التحكم جنبا إلى جنب مع الآبار أحادية الخلية لتحديد نجاح عزل الخلية وضوضاء الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم جودة القياس الكمي باستخدام خط أنابيب SCoPE2 (متوفر على GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) أو حزمة SCP Bioconductor29.

قد لا يتم فحص كفاءة الهضم ووضع العلامات للخلايا المفردة بشكل مباشر كما هو الحال مع الناقل ، ولكن DO-MS يوفر مرة أخرى مخططات تسمح بتقدير كفاءة الهضم ووضع العلامات. من خلال تضمين عنصر تحكم من 100-200 خلية جنبا إلى جنب مع تحضير الخلايا المفردة (أي تلقي جميع إضافات الكاشف نفسها) ، يمكن تقييم كفاءات الهضم ووضع العلامات على هذا التحكم ، ويفترض أن يتم تقاسمها بواسطة الخلايا المفردة المعدة جنبا إلى جنب. سيتم الإشارة إلى سوء الهضم من خلال نسبة عالية من شدة الببتيدات المشقوقة إلى نظيراتها المشقوقة تماما (الشكل 1).

هناك عامل آخر يجب مراعاته في المجموعات وهو جزء البيانات المفقودة ومتوسط كثافة أيون المراسل في كل قناة TMT (الشكل 2). عندما يتم إعداد الخلايا المفردة بنجاح ، تكون كمية البيانات المفقودة لكل خلية والتحكم الإيجابي أقل بكثير من عينات التحكم السلبية. وبالمثل ، فإن متوسط كثافة السلائف أعلى بكثير في الخلايا المفردة والضوابط الإيجابية منه في الضوابط السلبية. تمت مناقشة تحسين معلمات MS على نطاق واسع في مكان آخر21 ، ويمكن تحديد المعلمات المثلى باستخدام أدوات مثل DO-MS أو SCP Companion25,27.

figure-results-1
الشكل 1: مراقبة جودة إعداد الناقل. مخططات DO-MS التي تصور (أ) كفاءة وضع العلامات لحامل تم إعداده بنجاح في مواقع وضع العلامات باستخدام TMT: الأمين الأساسي على السلسلة الجانبية لليسين والببتيد N-terminus ، و (B) كفاءة الهضم في بقايا الأحماض الأمينية من الانقسام التربتيكي. اختصار: TMT = علامة الكتلة الترادفية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مراقبة جودة تحضير الخلية الواحدة. مخططات DO-MS التي تصور (أ) جزء البيانات المفقودة في الخلايا المفردة (C5-10) ، وعناصر التحكم (C13،16) ، والناقل (C1) ، والمرجع (C2) ، و (B) كثافة الخلايا المفردة وعناصر التحكم. العلامات 127C و 128N و 131C و 132N و 133N و 133C ، والتي تتوافق مع C3 و C4 و C11 و C12 و C15 ، غير مستخدمة في هذه المجموعة المحددة. يتكون التحكم الإيجابي من مادة خلوية تتم معالجتها إلى ببتيدات بكميات كبيرة ، ثم يتم تخفيفها إلى مستوى 2-5 خلايا / ميكرولتر قبل وضع العلامات. يتكون التحكم السلبي من بئر يخضع لجميع الخطوات التحضيرية المستخدمة للخلايا المفردة ، فقط دون إضافة خلية واحدة. اختصار: TMT = علامة الكتلة الترادفية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحد مفاتيح التحضير والتحليل الناجح للخلايا المفردة بواسطة SCoPE2 هو إعداد القنوات الحاملة والمرجعية. حجم الناقل المقترح هو 100 إلى 200 خلية ؛ ومع ذلك ، يمكن تحديد عدد الخلايا اللازمة لتجربة خلية واحدة معينة بناء على المبادئ كما تمت مناقشته في مكان آخر21. بالنسبة للحجم المقترح ، هناك حاجة إلى ~ 11,275 خلية على الأقل لكل لوحة 384 بئرا ، مما يسمح بحامل 200 خلية ومرجع 5 خلايا في كل مجموعة. قد يكون من المفيد عزل المزيد من الخلايا إذا لم تكن مجموعات الخلايا المرغوبة عاملا مقيدا ، لمجرد الحصول على مواد إضافية في حالة حدوث أخطاء (كما حدث في هذا البروتوكول ، عزل 22000 خلية بدلا من 11275 خلية). يجب تحضير مقدار الناقل والمرجع اللازم لعدد الألواح المطلوبة في دفعة واحدة لتقليل أي اختلاف من دفعة إلى أخرى يمكن أن يتسبب في اختلاف تحديد الببتيد أو القياس الكمي بين الدفعات.

قبل عزل الخلايا المفردة في آبار من لوحة 384 بئر ، من المهم مراعاة تصميم تخطيط اللوحة. داخل كل لوحة من 384 بئرا ، يوصى بتنفيذ كل من الضوابط الإيجابية والسلبية. الضوابط السلبية هي الآبار التي لا تضاف فيها خلايا ولكنها تخضع لنفس إضافات وإجراءات الكاشف مثل الآبار أحادية الخلية. الضوابط الإيجابية هي الآبار التي يتم فيها إضافة محللة الخلية المخففة إلى 2-5 خلايا / ميكرولتر بدلا من الخلايا المفردة. هذا مهم بشكل خاص للتنفيذ عندما لا يتم التحقق من صحة طرق عزل الخلية الواحدة بشكل جيد. يجب أن تحتوي كل لوحة من 384 بئرا بشكل مثالي على توزيع عشوائي للخلايا المفردة والضوابط (على سبيل المثال ، لا تحتوي على عناصر تحكم سلبية أو إيجابية في صف واحد فقط). يجب أن يكون لكل صفيحة توزيع متساو لجميع مجموعات الخلايا ذات الاهتمام ، بدلا من عزل نوع خلية واحد في لوحة واحدة ونوع خلية ثان في لوحة ثانية. سيؤدي ذلك إلى تجنب ربط تأثيرات الدفعات بأنواع الخلايا ذات الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من لوحة واحدة من 384 بئرا للتحليل ، فمن المستحسن عزل الخلايا في جلسة واحدة ، بدلا من نشر خطوة العزل على مدار عدة أيام ، إن أمكن.

يحدث تحلل كل من الخلايا المفردة والناقل / المرجع في الماء من خلال دورة التجميد والحرارة23. من المتوقع أن تكون معظم البروتياز قد تم تغيير طبيعتها خلال هذه الخطوة. ثم يضاف التربسين مباشرة بعد خطوة التمسخ بتركيز عال ، والعديد من أوامر الحجم أكبر في التركيز حتى من البروتياز الخلوي الأكثر وفرة. من خلال العمل الجماعي ، فإن معظم منتجات نشاط البروتياز ستكون بسبب التربسين.

لا يتم إجراء تقليل / ألكلة بقايا السيستين في هذا البروتوكول قبل هضم التربسين. تمثل الببتيدات المحتوية على السيستين حوالي 10٪ من الببتيدات التربتية من البروتين البشري. نلاحظ عددا أقل من الببتيدات المحتوية على السيستين باستخدام نهج بدون اختزال / ألكلة. تستخدم هذه الخطوات الكواشف التي لا تتوافق مع وضع العلامات بواسطة TMT (كيمياء NHS-ester) مباشرة بعد الهضم.

في استراتيجية وضع العلامات TMT هذه ، يتم تمييز الناقل والمراجع ب 126 و 127N ، على التوالي ، بينما يتم تمييز آبار الخلية الواحدة والتحكم ب 128C حتى 135N. لا يتم استخدام التسميتين بعد المرجع ، 127C و 128N ، بسبب التلوث المتبادل النظيري الناشئ عن القنوات الحاملة والمرجعية ، والتي من الواضح أنها أكثر وفرة في مادة الببتيد من الخلايا المفردة. في المجموع ، هناك 12 قناة TMT لكل مجموعة يمكن استخدامها لوضع العلامات على الخلايا المفردة أو التحكم في الآبار باستخدام TMTpro-16plex ، أو 14 قناة TMT لكل مجموعة باستخدام TMTpro-18plex.

تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول لإجراء قياسات البروتينات أحادية الخلية باستخدام هذا البروتوكول تحضير الناقل ، وعزل الخلية الواحدة ، والتحلل ، والهضم ، ووضع العلامات على الباركود ، ومعلمات قياس الطيف الكتلي المناسبة. تم توضيح هذه الخطوات في هذه الوثيقة وتم تفصيلها على نطاق واسع في مكان آخر17،21،25. تحتوي كل خطوة على مخطط مطابق أو مجموعة من المؤامرات في DO-MS تسمح بمراقبة الجودة بسهولة. على سبيل المثال ، في حالة الإنشاء الناجح للناقل ، تسمح المؤامرات التي تصور عدد الببتيدات المحددة ، وكفاءة وضع العلامات ، والنسبة المئوية لمعدل الانشقاق بالتحقق من تحضيرها بنجاح. يتم تضمين تقارير DO-MS التمثيلية في هذا المنشور ويمكن الاطلاع عليها في http://scope2.slavovlab.net/ للحصول على البيانات الأصلية16. تسمح تقارير DO-MS هذه بتقييم تحسين الطريقة في الاتجاهات التي لم يتم التحقيق فيها بعد من قبل المؤلفين ، مثل تدرجات LC الأطول ، أو إنزيمات الهضم المختلفة ، أو الرموز الشريطية الكيميائية البديلة.

حاليا ، يحد التحليل التسلسلي للببتيدات بواسطة خوارزميات الاستحواذ المعتمدة على البيانات من عدد الببتيدات التي يمكن تحليلها في تشغيل LC بطول معقول. ويرجع ذلك جزئيا إلى أوقات التعبئة الأطول المطلوبة للاكتساب الناجح لأيونات كافية لقياس كمية خلية واحدة موثوقبها 21. أحد القيود المتأصلة في استخدام الناقل هو عدم وجود تقييم مباشر لعملية الهضم وكفاءة وضع العلامات للخلايا المفردة. حاليا ، يتمثل أحد الحلول لهذا القيد في إجراء مراقبة الجودة على عينة أكبر تتم معالجتها جنبا إلى جنب مع الخلايا المفردة.

اقترحنا عددا من الفرص لتحسين البروتينات أحادية الخلية ، مثل بناء مطياف الكتلة مع أجهزة تحليل متعددة. تسمح الطريقة الحالية بتحديد كمية آلاف البروتينات من خلايا الثدييات المفردة بسرعة حوالي 100 خلية يوميا باستخدام الكواشف والمعدات المتاحة تجاريا. وقد تحسن الجيل الثاني من نهج SCoPE-MS بشكل كبير مقارنة بسابقه فيما يتعلق بعدد الخلايا القابلة للتحليل لكل وحدة زمنية، وعدد البروتينات القابلة للتحليل لكل وحدة زمنية، والوقت اللازم لإعداد العينات، وإمكانية الوصول إلى الكواشف والمعدات، والتكلفة الإجمالية للتحضير والتحليل لكل خلية واحدة. يمكن الوصول إلى البروتينات المرتبطة بالغشاء باستخدام تحلل الحرارة بالتجميد وهضم البروتياز ، كما هو موضح بالمقارنة مع تحلل اليوريا23. تحدد الطريقة العديد من البروتينات من الثلث العلوي من البروتين فيما يتعلق بالوفرة16. إذا كان البروتيوفورم المعدل في الثلث العلوي من البروتين ، وكان الببتيد المعدل قابلا لتحليل قياس الطيف الكتلي (يتأين جيدا ، وله فرق كتلة عن الببتيد غير المعدل) ، فمن المرجح أن يكون قابلا لهذا البروتوكول. يمكن تطبيق هذه الطريقة بشكل مثمر في الأنظمة البيولوجية حيث يوجد عدم تجانس ذي مغزى بين الخلايا ، كما هو الحال في التمايز أو الشيخوخة أو الاستجابات المناعية (أي البلعمة).

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعترف بجائزة برنامج NSF I-Corps لخريف 2021 (موقع جامعة نورث إيسترن) التي مولت هذا المنشور.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
يجب استخدام لوحة 384 بئر ، لوحة PCR القياسيةThermo Fisher ScientificAB1384ألواح البولي بروبلين ، إذا لزم الأمر للاستبدال. إذا تم استبدالها ، فيجب تقييم مستويات تلوث البوليمر المحتمل من الألواح الأخرى قبل تحضير SCoPE2.
الأسيتونيتريل (لتحضير المخازن المؤقتة) ، Optima LC-MS / MS الصففيشر ScientificA955-1يستخدم هذا الأسيتونيتريل لأي مخازن مؤقتة ، وهي الأسيتونيتريل بنسبة 50٪ التي تستخدم للمرور عبر الآبار بعد المرور عبر الناقل والمرجع عند الجمع بين مجموعات SCoPE2.
تحذير: الأسيتونيتريل سائل قابل للاشتعال. يمكن أن يهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي والجهاز العصبي المركزي. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية. التعامل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
الأسيتونيتريل (لتحضير TMT) ، اللامائي ، 99.8٪سيجما ألدريتش271004-100 مليستخدم هذا الأسيتونيتريل لإعادة تعليق ملصقات TMT عند تركيز الشركة المصنعة.
تحذير: الأسيتونيتريل سائل قابل للاشتعال. يمكن أن يهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي والجهاز العصبي المركزي. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية. التعامل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
رقائق لوحة PCR لاصقةThermo Fisher ScientificAB0626
Autosampler قارورة أغطية الخيط اللولبيةThermo Fisher ScientificC5000-51B
قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية الدوار (أي myFuge 5)MTC BioC2595النموذج لا يحتوي على أي تحكم في السرعة. يتم استخدامه ببساطة لتجميع السائل في الجزء السفلي من قوارير أخذ العينات الآلية.
نوكلياز بنزونازسيجما ألدريتشE1014-25KU
قوارير خيط لولبية زجاجية شفافة ، 9 ممثيرمو فيشر Scientific60180-509
حمض الفورميك ، بيرس ، LC-MS / MS الصفثيرمو فيشر العلمي85178تحذير: حمض الفورميك سائل قابل للاشتعال. يمكن أن يسبب تلفا خطيرا في العين أو حروقا في الجلد. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية. التعامل مع في منطقة جيدة التهوية.
إدخالات زجاجية لأخذ العينات التلقائية ، 9 ممThermo Fisher ScientificC4010-630
Hydroxylamine (HA) ، 50٪ بالوزن / حجمSigma Aldrich467804-50MLتحذير: يمكن أن يسبب الهيدروكسيلامين تهيج الجلد. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية.
رقائق السرعوف الدقيقة ، رقائق 3PFE منخفضة الحجمFormulatrixMCLVPR2من المفترض أن تستخدم هذه الرقائق مع معالج السوائل Mantis microfluidics لتوزيع المحاليل العضوية. يمكن استخدامها لتوزيع ملصقات TMT.
رقائق السرعوف الدقيقة ، رقائق السيليكون منخفضة الحجمFormulatrixMCLVS12من المفترض أن تستخدم هذه الرقائق مع معالج السوائل Mantis microfluidics لتوزيع المحاليل المائية. لا يمكن استخدامها لتوزيع ملصقات TMT.
معالج السوائل الدقيقة MantisFormulatrixLiquidler. ومع ذلك ، من المهم التحقق مما إذا كان النظام متوافقا مع الأسيتونيتريل بنسبة 100٪ (كما في حالة ملصقات TMT) ، وأن النظام لا يدخل تلوثا بالبوليمر أو أي نوع آخر من التلوث في العينات.
محول لوحة Mantis PCR مع دبابيس مخروطية عريضة للتعامل الآلي مع الألواحFormulatrix232400
خليط الببتيد MassPREPWaters186002337خليط من تسعة ببتيدات غير تريبتيك أنبوب
PCR الدوار (أي جهاز طرد مركزي دقيق 16 مكانا لأنابيب 0.2 مل)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية2621-0016النموذج لا يحتوي على أي تحكم في السرعة. يتم استخدامه ببساطة لجمع السائل في قاع الأنابيب.
أنابيب PCR: TempAssure 0.2 مل PCR 8-tube شرائطUSA Scientific1402-3900إذا تم استبدالها ، فيجب تقييم مستويات تلوث البوليمر المحتمل من الألواح الأخرى قبل تحضير SCoPE2.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 10x ، درجة الحموضة 7.4 ،الحراري Thermo Fisher ScientificAM9625
(أي جهاز طرد مركزي دقيق PlateFuge)المعيارالنموذج العلمي C2000يحتوي هذا النموذج على أي تحكم في السرعة. يتم استخدامه ببساطة لجمع السائل في قاع الآبار.
Thermal Cycler (أي C1000 Touch مع وحدة 384 بئر)Biorad1851138
TMTpro 16plex مجموعة كاشف الملصقات ، 1 × 5 مجمThermo Fisher ScientificA44520
ثلاثي إيثيل أمونيوم بيكربونات (TEAB) ، 1 م ، درجة الحموضة 8.5سيجما ألدريتشT7408100ML
تريبسين الذهب مطياف الكتلة الصفPromegaV5280هذا هو التربسين ذو نقاء عالي جدا. يمكن أن تختلف كواشف التربسين الأخرى في مستويات نقائها. مستوى النقاء مهم لتحقيق نتائج SCoPE2 الإيجابية.

تحذير: يمكن أن يسبب التربسين تهيج الجلد والجهاز التنفسي والعين. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية. التعامل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
دوامة (خلاط دوامة تناظرية)VWRموديل 58816-121
سونيكي حمام مائي (أي منظف بالموجات فوق الصوتية سعة 2.8 لتر مع مؤقت رقمي)VWR97043964
Water ، Optima LC-MS / MS الصففيشر ScientificW6-1يوصى بتصنيع جميع الحلول التي تحتاج إلى تخفيفها أو صنعها باستخدام مياه درجة قياس الطيف الكتلي. يجب أن تكون أي تخفيفات و / أو خلطات رئيسية طازجة. يمكن أن يؤثر التلوث الناتج عن المياه منخفضة الدرجة سلبا على اكتشاف الببتيد وجودة البيانات أحادية الخلية.
هذا يمكن استبدال هذا الدوار الخالي من RNase لا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Symmons, O., Raj, A. What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism. Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).
  2. Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).
  3. Levy, E., Slavov, N. Single cell protein analysis for systems biology. Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).
  4. Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition. Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22(2021).
  5. Shaffer, S. M., et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 555 (7695), 274(2018).
  6. Pan, D., Jia, D. Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024(2021).
  7. Segerstolpe, Å, et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  8. Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas. Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).
  9. Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity. Frontiers in Immunology. 12, 751701(2021).
  10. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  11. Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. Post-transcriptional regulation across human tissues. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535(2017).
  12. Slavov, N. Unpicking the proteome in single cells. Science. 367 (6477), 512-513 (2020).
  13. Specht, H., Slavov, N. Transformative opportunities for single-cell proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).
  14. Slavov, N. Learning from natural variation across the proteomes of single cells. PLoS Biology. , (2021).
  15. Slavov, N. Driving single cell proteomics forward with innovation. Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).
  16. Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology. 22 (1), 50(2021).
  17. Petelski, A. A., et al. Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2. Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).
  18. Slavov, N. Scaling up single-cell proteomics. Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179(2022).
  19. Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
  20. Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).
  21. Specht, H., Slavov, N. Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers. Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).
  22. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  23. Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics. BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).
  24. Singh, A. Towards resolving proteomes in single cells. Nature Methods. 18 (8), 856(2021).
  25. Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods. Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).
  26. Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. DART-ID increases single-cell proteome coverage. PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082(2019).
  27. Cheung, T. K., et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).
  28. Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).
  29. Vanderaa, C., Gatto, L. Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data. bioRxiv. , (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SCoPE2

مقالات ذات صلة