مقالة منهجية

إنشاء مفصل الركبة على رقاقة لنمذجة أمراض المفاصل واختبار الأدوية

DOI:

10.3791/64186

⸱

يناير 27, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh Swanson School of Engineering, 3Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University, 5Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, University of North Texas Health Science Center, 6Department of Bioengineering, Stanford University, 7McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 8The Chinese University of Hong Kong

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم طرقا مفصلة لتوليد أربعة أنواع من الأنسجة من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية ، والتي تستخدم لتلخيص الغضروف والعظام ووسادة الدهون والغشاء الزليلي في مفصل الركبة البشري. يتم دمج هذه الأنسجة الأربعة في مفاعل حيوي مخصص وتوصيلها من خلال الموائع الدقيقة ، وبالتالي توليد مفصل الركبة على رقاقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل ارتفاع معدل انتشار أمراض المفاصل المنهكة مثل هشاشة العظام (OA) عبئا اجتماعيا واقتصاديا كبيرا. حاليا ، الأدوية المتاحة التي تستهدف اضطرابات المفاصل هي في الغالب ملطفة. إن الحاجة غير الملباة إلى أدوية OA الفعالة المعدلة للمرض (DMOADs) ناتجة في المقام الأول عن عدم وجود نماذج مناسبة لدراسة آليات المرض واختبار DMOADs المحتملة. هنا ، نصف إنشاء نظام فسيولوجي دقيق يحاكي المفصل الزليلي المصغر (miniJoint) يتألف من مكونات الأنسجة الدهنية والليفية والعظمية الغضروفية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSCs). للحصول على الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) ، تم تغليف MSCs في الجيلاتين الميثكريليت القابل للربط الضوئي قبل أو بعد التمايز. ثم تم دمج تركيبات الأنسجة المحملة بالخلايا في مفاعل حيوي مطبوع 3D ، لتشكيل miniJoint. تم إدخال تدفقات منفصلة من الوسائط العظمية والليفية المنشأ والشحمية للحفاظ على الأنماط الظاهرية للأنسجة المعنية. تم اختراق تيار مشترك بشكل شائع من خلال الغضروف والأنسجة الزليلية والدهنية لتمكين تداخل الأنسجة. يسمح نمط التدفق هذا بتحريض الاضطرابات في واحد أو أكثر من مكونات الأنسجة للدراسات الآلية. علاوة على ذلك ، يمكن اختبار DMOADs المحتملة إما عن طريق "الإدارة الجهازية" من خلال جميع التيارات المتوسطة أو "الإدارة داخل المفصل" عن طريق إضافة الأدوية إلى تدفق محاكاة "السائل الزليلي" المشترك فقط. وبالتالي ، يمكن أن يكون miniJoint بمثابة منصة متعددة الاستخدامات في المختبر لدراسة آليات المرض بكفاءة واختبار الأدوية في الطب الشخصي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض المفاصل مثل هشاشة العظام (OA) منتشرة للغاية وموهنة وتمثل سببا رئيسيا للإعاقة في جميع أنحاء العالم1. تشير التقديرات إلى أنه في الولايات المتحدة وحدها ، يؤثر OA على 27 مليون مريض ويحدث في 12.1٪ من البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 60 وما فوق2. لسوء الحظ ، فإن معظم الأدوية المستخدمة حاليا لإدارة أمراض المفاصل ملطفة ، ولا تتوفر أدوية OA فعالة لتعديل المرض (DMOADs)3. تنبع هذه الحاجة الطبية غير الملباة في المقام الأول من عدم وجود نموذج فعال لدراسة آليات المرض وتطوير DMOADs المحتملة. لا تعكس زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) الطبيعة ثلاثية الأبعاد لأنسجة المفاصل ، وغالبا ما يتم إعاقة زراعة الأنسجة من خلال موت الخلايا الكبير وعادة ما تفشل في تكرار الترابط الديناميكي للأنسجة4. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل الاختلافات الجينية والتشريحية بشكل كبير من الأهمية الفسيولوجية للنماذج الحيوانية4.

تعد الأجهزة على الرقائق (OoCs) ، أو الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة ، مجالا بحثيا واعدا في واجهة الهندسة والبيولوجيا والطب. هذه المنصات في المختبر هي الحد الأدنى من الوحدات الوظيفية التي تكرر السمات الصحية أو المرضية المحددة لنظيراتها في الجسم الحي 5. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الأنظمة المصغرة استضافة خلايا ومصفوفات متنوعة ومحاكاة التفاعلات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية بين الأنسجة المختلفة. لذلك ، فإن النظام الفسيولوجي الدقيق الذي يمكنه تلخيص المفصل الزليلي الأصلي بأمانة يعد بتقديم منصة فعالة لنمذجة أمراض المفاصل وتطوير DMOADs المحتملة.

يمكن عزل الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSCs) من العديد من الأنسجة في جميع أنحاء الجسم وتمييزها إلى سلالات عظمية المنشأ ، غضروفية ، وأديبوجينية6. تم استخدام MSCs بنجاح لهندسة الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية6 ، مما يعني أنها تمثل مصدرا واعدا للخلايا لهندسة مكونات الأنسجة في مفصل الركبة. لقد طورنا مؤخرا نظاما مصغرا يحاكي المفاصل ، يسمى miniJoint ، والذي يشتمل على أنسجة العظام والغضاريف والأنسجة الليفية والدهنية المشتقة من MSC7. على وجه الخصوص ، يتيح التصميم الجديد الحديث المتبادل للأنسجة عن طريق تدفق الموائع الدقيقة أو التغلغل (الشكل 1). هنا ، نقدم بروتوكولات تصنيع مكونات الرقاقة ، وهندسة مكونات الأنسجة ، وزراعة الأنسجة المهندسة في الرقاقة ، وجمع الأنسجة للتحليلات النهائية.

figure-introduction-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لشريحة miniJoint يوضح ترتيب مكونات الأنسجة المختلفة والتدفقات المتوسطة. OC = الأنسجة العظمية الغضروفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية الأخلاقية لجامعة بيتسبرغ ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة بيتسبرغ. يتم سرد المعلومات حول المواد المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تصنيع المفاعلات الحيوية المطبوعة 3D

  1. استخدم برنامج كمبيوتر لتصميم المفاعلات الحيوية العظمية الغضروفية (الشكل 2 أ) والمفاعلات الحيوية الصغيرة (الشكل 2 ب) التي تتضمن حجرات وإدخالات وأغطية. يتم عرض معلومات الأبعاد لكل جزء في الشكل S1.
  2. انقل التصميم إلى طابعة 3D ، واطبع باستخدام حبر فوتوبوليمر.
  3. شطف الأجزاء المطبوعة 3D (الشكل 2C-F) مع 15 مل من الإيثانول 95 ٪ ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بربط القطع المطبوعة بالكامل لمدة 200 ثانية في جهاز بلمرة مصباح يدوي.
  4. أضف حلقات O إلى الإدخالات والأغطية (الشكل 2C ، D) ، واختبر ما إذا كانت الأجزاء مناسبة (الشكل 2G ، H).

figure-protocol-1
الشكل 2: تصنيع المكونات المختلفة لصنع المفاعل الحيوي miniJoint (A ، B) ، نماذج 3D للمفاعلات الحيوية لإنشاء (A) هشاشة العظام و (B) رقائق miniJoint . (C ، D) 3D مطبوعة (C) الأغطية و (D) إدراج مع تثبيت الحلقة O. (E ، F) غرف مطبوعة 3D ل (E) العظم الغضروفي و (F) زراعة الأنسجة المصغرة. (ز ، ح) تجميع (G) رقائق العظم الغضروفي و (H) miniJoint . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. هندسة مكونات الأنسجة

ملاحظة: تم وصف عمليات تصنيع الليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) والجيلاتين الميثيل (GelMA) في الدراسات السابقة8،9.

  1. لإنشاء GelMA، اتبع الخطوات أدناه.
    1. أضف 17 جم من الجيلاتين من النوع B إلى 500 مل من الماء المقطر ، ثم اخلطه على شاكر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. ثم أضف 13 مل من أنهيدريد الميثاكريليك ، وضعه مرة أخرى على شاكر 37 درجة مئوية ، واتركه يهتز طوال الليل.
    3. في اليوم التالي ، قم بقسمة GelMA في أكياس غسيل الكلى الفردية ، مع ~ 60 مل في كل كيس.
    4. ضع جميع أكياس غسيل الكلى في الماء المقطر بقضيب تقليب ، واتركها لمدة 7 أيام من غسيل الكلى. قم بتغيير الماء عدة مرات في اليوم ، واترك الأكياس عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    5. في اليوم 7 ، قم بتجميد GelMA عند -80 درجة مئوية. بمجرد تجميدها تماما ، انتقل إلى التجفيد.
    6. ضع GelMA في طبق في غرفة التفريغ في مجفف التجميد ، واتركه يجف بالتجميد. تأكد من تجفيف GelMA تماما قبل إزالته من مجفف التجميد.
  2. قم بإذابة GelMA في محلول ملح هانك المتوازن (HBSS مع Ca 2+ و Mg2+) عند 15٪ (وزن / حجم). للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني عند 7.4 ، أضف هيدروكسيد الصوديوم بكميات صغيرة حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. استكمل المحلول ب 1x مضاد حيوي مضاد حيوي و 0.15٪ (وزن / حجم) LAP بناء على الحجم المكتسب. قم بتخزين محلول GelMA بنسبة 15٪ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام ، وقم بحمايته من الضوء.
  3. ضع غرف المفاعل الحيوي ثنائي التدفق المطبوعة 3D ، والأغطية ، وإدراج في أكياس الأوتوكلاف ، والأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع البخار ثم لمدة 20 دقيقة مع الحرارة الجافة.
  4. داخل خزانة السلامة البيولوجية ، انقع غرف المفاعل الحيوي والأغطية والإدخالات في 15 مل من المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات طوال الليل ، وبعد ذلك اتركها حتى تجف.
  5. عزل MSCs المشتقة من نخاع العظم البشري من إجمالي النفايات الجراحية لرأب المفاصل بموافقة IRB (جامعة بيتسبرغ وجامعة واشنطن).
    1. على وجه التحديد ، اطرد نخاع العظم من العظم التربيقي لعنق الفخذ ورأسه ، وأعد تعليقه في وسط النسر المعدل في Dulbecco (DMEM).
    2. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة 40 ميكرومتر ، وطرد مركزي التدفق عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الكريات باستخدام وسط النمو [DMEM ، مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات] ، ثم ضعه في قوارير زراعة الأنسجة.
    4. قم بتغيير وسط الثقافة كل 3 أيام إلى 4 أيام. تأكد من الوصول إلى التقاء 70٪ إلى 80٪ قبل المضي قدما.
    5. فصل الخلايا عن طريق الحضانة مع التربسين-EDTA لمدة 2-3 دقائق ، والمرور بمعدل 1 مليون خلية لكل قارورة T150.
    6. قم بتوسيع الخلايا إلى P5. بعد التربسين ، قم بتعليق الخلايا ، وعدها ، ثم الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 300× جم لمدة 5 دقائق.
  6. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق الخلايا عند 20 × 106 خلايا / مل في محلول GelMA بنسبة 15٪.
    ملاحظة: أطفئ ضوء خزانة السلامة البيولوجية.
  7. باستخدام قفازات معقمة ، اضغط على قالب سيليكون معقم وجاف على طبق بتري. بعد ذلك ، ضع ملحقا واحدا في كل فتحة من قالب السيليكون بالملقط ، بحيث يكون جانب فتحة الملحق متجها لأسفل.
  8. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، أضف تعليق الخلية لملء الملحق (~ 50 ميكرولتر لكل إدخال).
  9. استخدم مصباح يدوي للأشعة فوق البنفسجية (ضوء LED بطول موجي 395 نانومتر) لربط الجزء العلوي من الجل / الإدراج لمدة 1.5 دقيقة. ثم أضيء الجانب الآخر لمدة 30 ثانية. يحدث التشابك عندما يتعرض البادئ الضوئي LAP لضوء الأشعة فوق البنفسجية.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بتعليق الخلية في الحاضنة خلال هذه الفترة أو حمايته من الضوء.
  10. باستخدام ملقط معقم ، انقل الحشوات على الفور إلى 8 مل من وسط النمو في لوحة غير أنسجية ذات 6 آبار (DMEM مكمل ب 10٪ [v / v] FBS و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات) للسماح للخلايا بالتعافي بين عشية وضحاها.
  11. فرق الخلايا نحو أربع سلالات.
    1. لهندسة الأنسجة الدهنية (AT) ، انقل الحشوات إلى 8 مل من الوسط الدهني (AM ؛ ألفا-ميم، 10٪ FBS، 0.2 مللي متر إندوميتاسين، 1x أنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم (ITS)، 0.45 مللي متر 3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين، 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون، و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات) لبدء التمايز. من الناحية المثالية ، يتم وضع أربعة إدخالات في بئر واحد من صفيحة بئر غير الأنسجة مع 8 مل من الوسط الشحمي. استزرع الخلايا في ألواح البئر لمدة 28 يوما ، مع تغييرات متوسطة كل يوم.
    2. لهندسة الوحدات العظمية الغضروفية (OC) ، ضع الإدخالات في غرف مفاعل حيوي مزدوج التدفق ، وقم بتغطية الآبار ، وغرس التيارين بشكل منفصل بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة مع 35 مل من الوسط العظمي (OM; DMEM, 10٪ FBS, 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات, 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون, 0.01 M β-glycerophosphate, 100 نانوغرام/مل بروتين مورفوجينيك عظمي 7 (BMP7), 50 ميكروغرام/مل حمض الأسكوربيك, و10 نانومتر فيتامين D3) و35 مل من وسط غضروفي (CM; DMEM ، 1x مضاد حيوي مضاد حيوي ، 1x ITS ، 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 40 ميكروغرام / مل برولين ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، و 10 نانوغرام / مل تحويل عامل النمو β3) 10. الحفاظ على تمايز الخلايا لمدة 28 يوما عن طريق إجراء تغييرات متوسطة كل أسبوعين.
    3. لاشتقاق الخلايا الليفية ، قم بتمييز MSCs في ثقافة ثنائية الأبعاد على مدار 21 يوما في دورق زراعة الأنسجة T150 سم2 باستخدام 20 مل من الوسط الليفي (FM ؛ DMEM المتقدم ، 5٪ FBS ، 1x GlutaMAX ، 1x مضاد حيوي مضاد حيوي ، و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك). تغيير الوسيط كل أسبوع. استخدم 4 مل من التربسين لفصل الخلايا ، وتغليف المواد الهلامية ثلاثية الأبعاد داخل الإدخالات ، باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، للحصول على الأنسجة الليفية الزليلية (SFT).
      ملاحظة: يمكن العثور على تركيبات جميع وسائط التمايز في الجدول 1.

3. إنشاء شريحة miniJoint

  1. الأوتوكلاف غرف المفاعل الحيوي 3D miniJoint ، أنابيب السيليكون بقطر داخلي 0.062 بوصة وقطر خارجي 0.125 بوصة ، وموصلات F 1/16 Luer-lock. قم بتوصيل أنبوب السيليكون بشوكة المفاعل الحيوي miniJoint في أحد طرفيه ، وقم بتوصيل قفل Luer في الطرف الآخر.
  2. قم بإعداد AM و OM (إزالة BMP7) وFMCM المذكورة في الخطوة 2.11. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد الوسط المشترك المشترك (SM ؛ DMEM الخالي من الفينول الأحمر ، 1x مضاد حيوي مضاد حيوي ، 1x Na-pyruvate ، 1x ITS ، 40 ميكروغرام / مل برولين ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.5 نانوغرام / مل عامل النمو المحول β3) لاستخدامها في ثقافة miniJoint . قم بتحميل 35 مل من كل وسط في الخزانات المتوسطة.
  3. استخدم ملقط مستقيم لنقل الوحدة العظمية الغضروفية من المفاعل الحيوي ثنائي التدفق إلى البئر الأيمن للمفاعل الحيوي miniJoint . نقل إدراج الأنسجة الدهنية وإدخال الأنسجة الليفية في الآبار اليسرى والوسطى ، على التوالي. قم بتغطية جميع الآبار بأغطية معقمة.
  4. قم بتوصيل مداخل رقاقة miniJoint بالخزانات المتوسطة والمنافذ بالمحاقن (الشكل 3A-C).
  5. قم بتركيب المحاقن على مضخة حقنة (الشكل 3C) ، وانقل المضخة والرقائق إلى حاضنة. يتم الاحتفاظ بالخزانات المتوسطة على الجليد خارج الحاضنة.
  6. قم بتشغيل المضخة في وضع السحب ، وسحب الوسط من الخزان المتوسط إلى غرفة المفاعل الحيوي miniJoint . تستمر عملية الاستزراع المشتركة المصغرة هذه 28 يوما.
  7. لنمذجة التهاب المفاصل وتنكس الغضروف ، أضف إنترلوكين 1β (IL-1β) إلى التيار المتوسط الليفي المنشأ عند 10 نانوغرام / مل. استبدل المحاقن في اليوم الثالث من علاج IL-1β ، وقدم IL-1β طازجا للوسط الليفي المنشأ. يستمر العلاج لمدة 7 أيام.
  8. أثناء خطوة اختبار الدواء ، بعد 3 أيام من علاج IL-1β ، قم بإعطاء الدواء إما في الوسط المشترك ، ومحاكاة "الإدارة داخل المفصل" (الشكل 3D) عند استخدام الدواء محليا في مفصل الركبة ، أو في جميع الأنواع المتوسطة ، محاكاة "الإدارة الجهازية" (الشكل 3E) عندما يعمل الدواء على مفصل الركبة من خلال الدورة الدموية.
  9. جمع الأنسجة الفردية لتحليلها بعد 7 أيام من العلاج IL-1β سواء خضعت العينات للعلاج الدوائي لمدة 4 أيام السابقة أم لا.

figure-protocol-2
الشكل 3: تجميع المفصل الصغير. (أ ، ب) يتم إدخال الوسائط الخاصة بالأنسجة من المداخل 1-3 (I1-3) ونقلها من المنافذ 1-3 (O1-3). يتم توزيع الوسيط المشترك من I4 إلى O4. (ج) الإعداد الكامل للثقافة المشتركة المصغرة. يمكن إدخال الأدوية (الأشكال الشبيهة بالشمس الخضراء) في (د) الوسط المشترك فقط أو (ه) جميع الوسائط لمحاكاة "الإدارة داخل المفصل" أو "الإدارة الجهازية" على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. جمع الأنسجة الفردية

  1. استخدم ملقط منحني معقم لإزالة الحشوات.
  2. ادفع لكمة خزعة من خلال مركز الملحق لإزالة الجل ، ووضع الجل في برنامج تلفزيوني.
  3. قطع المواد الهلامية العظمية الغضروفية إلى النصف عند تقييم التعبير الجيني.
    ملاحظة: بما أن الجل العظمي الغضروفي يتكون من نوعين من الأنسجة ، فمن المهم فصل الخلايا العظمية والخلايا الغضروفية.
  4. جمع الوسائط والأنسجة المشروطة لإجراء تجارب مختلفة.
    1. اجمع حوالي 1.5 مل من كل مصدر وسيط.
    2. قم بتجميد الوسائط المكيفة في النيتروجين السائل بعد الطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق والتخلص من الرواسب.
    3. بالنسبة للتلطيخ النسيجي والمناعة ، قم أولا بإصلاح عينات OC و SFT في الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ ، وقم بتجفيفها في الإيثانول بتركيزات تصاعدية ، وقم بإزالتها في الزيلين ، وقم بتضمينها في البارافين ، وأخيرا قسمها بسمك 6 ميكرومتر.
    4. بالنسبة للأنسجة الدقيقة AT ، قم بتثبيت العينات في 10٪ من الفورمالين المخزن ، وقم بتلطيخها مباشرة بمحلول Oil Red O أو BODIPY.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع جميع أنسجة المفصل الصغير لتحليل أنماطها الظاهرية بعد 28 يوما من الثقافة في المفصل الصغير (الشكل 4 أ). تم تفصيل ذلك في منشورنا السابق7.

من خلال استخدام RT-qPCR ، والتلوين المناعي ، والتلوين النسيجي ، تم التأكيد على أن الأنماط الظاهرية الخاصة بالأنسجة قد تم الحفاظ عليها جيدا للأنسجة الدقيقة الفردية (الشكل 4). على سبيل المثال ، أعرب المكون العظمي للأنسجة الدقيقة OC (OC-O) ، ولكن ليس مكونات الأنسجة الأخرى ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا لإنشاء نظام مفصل الركبة على رقاقة ، حيث يتم تشكيل العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية والأنسجة الشبيهة بالغشاء الزليلي من MSCs ويتم استزراعها بشكل مشترك داخل مفاعل حيوي مخصص. يمثل هذا النظام متعدد المكونات المشتق من الخلايا البشرية مع ميزات التوصيل والتشغيل أداة جديدة لدراسة التسبب في أمراض المفاصل وتطوير الأدوية.

بالنظر إلى أن الأنسجة المختلفة تفضل وسائط استزراع معينة ، فمن الأهمية بمكان توفير الوسيط المعني لكل نسيج ومنع التبادل الوسيط الحر بين التدفقات. على وجه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث في المقام الأول بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (UG3 / UH3TR002136 ، UG3 / UH3TR003090). بالإضافة إلى ذلك ، نشكر الدكتور بول مانر (جامعة واشنطن) على توفير عينات الأنسجة البشرية والدكتور جيان تان لمساعدتهم في عزل MSCs وإنشاء تجمع الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma -AldrichI17018-1G
6 جيد لوحة ثقافة غير الأنسجةCorning Falcon & reg ؛ لوحات351146
24 بئر لوحة ثقافة غير أنسجةCorning Falcon & reg ؛ لوحات351147
30 مل محاقنBD حقنة Luer Lock Cascade Health302832
Alcian Blue stainEK Industries11981٪ وزن / حجم ، درجة الحموضة 1.0
Advanced DMEMGibco12491-015
& alpha ؛ MEMGibco12571-063
المضادات الحيوية المضادة للفطرياتGibco15240-062
لكمة الخزعةIntegra Miltex12-460-407
BODIPY & reg ؛الجزيئية
البروتين المورفولوجي للعظام 7 (BMP7)ملقط منحني Peprotech
ماركة فيشر16100110
DMEMGibco11995-065Dulbecco s النسر المعدل متوسط
DexmethasomeSigma -Aldrich02-05-2002
E-Shell 450 photopolymer فيEnvisionTecRES-01-4022
مصل الأبقار الجنينيمنتجات الجوزاء الحيوية900-208
GlutaMAXGibco3505-061
الجيلاتين من جلد البقرHyclone1003372809
Hank’ s محلول ملح متوازنسيجما -ألدريتشSH30588.02
إندوميتاسينسيجما -ألدريتشI7378-56
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامين (ITS)جيبكو51500-056
إنترلوكين 1 وبيتا ؛موصلات Peprotech200-01B
Leur-locCole-Parmer Instruments45508-50
L-prolineSigma -Aldrich115388-93-7
& beta ؛ -glycerophosphateSigma -Aldrich1003129352
أكياس متوسطةKiYATECFC045
ميثاكريليك أنهيدريدسيجما -Aldrich102378580
فوسفات مخزن ملحيCorning21-040 سم
ملقط مدببفيشر العلامة التجارية12000122
قالب السيليكونMcMaster-CarrRC00114P
حلقات السيليكونMcMaster-CarrZMCCs1X51 مم × 5 مم
SolidWorksDassault Syst & egrave ؛ mes SE ، V & eacute. lizy-Villacoublay ، فرنسا
شفرات جراحيةIntegra Miltex4-122
مضخة حقنةLagato210P ، KD ScientificZ56963110 رفوف حقن
T-182 قوارير زراعة الأنسجةFisher العلامة التجاريةFB012939
زراعة الأنسجة 150 ممماركة فيشرFB012925
تحويل عامل النمو بيتا (TGF-& الإصدار بيتا; 3)Peprotech100-36E
TrypsinGibco25200-056
مصباح يدوي للأشعة فوق البنفسجيةKBSKB70109395 نانومتر
طابعة Vida Desktop 3DEnvisionTec
Vitamin D3Sigma -Aldrich32222-06-31،25-dihydroxyvitamin D3
المجسات الفلوروفورية طبق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
  2. Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
  3. Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
  4. He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194(2020).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  6. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  7. Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909(2022).
  8. Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
  9. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  10. Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
  11. Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575(2016).
  12. Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411(2019).
  13. Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
  14. Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
  15. He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400(2022).
  16. Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059(2020).
  17. Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة