تقدير إنتاجية المركبات على لوحة TLC عبر تقنية الإضاءة Blue-LED

يستخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على نطاق واسع كتقنية نوعية وكمية في مجال الكيمياء العضوية¹،^2،3. تتمثل المزايا الرئيسية ل TLC في أنه يوفر كشفا سريعا ومتطلبات عينة مرنة ولا يتطلب معدات متخصصة⁴. حتى الآن ، على الرغم من إنشاء العديد من الأساليب المتقدمة ، لا يزال TLC هو الطريقة الرئيسية لتحديد العينات غير المعروفة في الخليط. ومع ذلك ، فإن التحدي الذي يواجهه هذا النهج هو عدم وجود معدات آمنة وغير مكلفة لتحديد عائد العينة ، خاصة لتطوير المختبرات ذات الميزانيات المحدودة. لذلك ، هدفت الدراسة الحالية إلى تطوير طريقة فعالة وآمنة وغير مكلفة تتحد مع TLC لتقدير إنتاجية العينات.

على عكس TLC عالي الأداء (HPTLC) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، وكروماتوغرافيا الغاز (GC) مع متطلبات عينة صارمة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وإشراك خطوات متعددة لإعداد العينات ^1,5 ، أظهر TLC العديد من المزايا. أولا ، لإعداد العينة ، لا يمكن ل HPLC و GC اكتشاف المستخلص الخام لأن المستخلص الخام قد يسد عمود HPLC و GC. ثانيا ، عندما لا تكون العينات مناسبة للأشعة فوق البنفسجية (مهمة لتحليل HPLC) أو ذات تقلب منخفض (مهم لتحليل GC) ، يمكن تطبيق TLC على هذه العينات ، واستخدام كاشف التصور يجعل العينات المعزولة مرئية على طبقات رقيقة⁶،^7،8. ثالثا ، بالنسبة للمستخدمين العاديين ، يتطلب HPLC و GC عموما وقتا طويلا نسبيا قبل التدريب قبل العمل بشكل مستقل ، مقارنة ب TLC. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لتحليل TLC الكمي ، المعروف باسم TLC عالي الأداء (HPTLC) ، رقمنة المعلومات الموجودة على لوحة TLC باستخدام ماسح ضوئي شديد الحساسية. ومع ذلك ، فإن تكلفة نظام HPTLC مكلفة نسبيا. على هذا النحو ، يعد تطوير نهج فعال من حيث التكلفة وسريع لتحديد العينات على لوحة TLC موضوعا مهما.

وقد وضعت أساليب مماثلة لتحديد كمية غلة TLC؛ على سبيل المثال ، أبلغ جونسون⁹ عن تقنية تسمح بتحديد كمية العينات على لوحة TLC باستخدام ماسح ضوئي مسطح متصل بجهاز كمبيوتر. في عام 2001 ، طور الجندي وآخرون ¹⁰ طريقة TLC- قياس الكثافة ، والتي تم استخدامها للكشف عن المركب بكثافة بصرية ، وتم تطبيق هذه التقنية أيضا بواسطة Elkady et ^al.11. في عام 2007 ، قدم Hess² طريقة TLC (DE-TLC) المحسنة رقميا المطبقة للكشف عن عائد مركب على لوحة TLC باستخدام كاميرا رقمية مدمجة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قارن هيس أيضا فروق التكلفة بين طريقة HPTLC و DE-TLC وخلص إلى أنه يمكن استخدام طريقة DE-TLC في مختبرات المدارس الثانوية والكليات بسبب تكلفتها المعقولة². ومع ذلك ، كانت تكلفة طريقة TLC-densitometric لا تزال باهظة الثمن ، ويتطلب تشغيل الأشعة فوق البنفسجية تدريبا مسبقا كافيا في حالة تعرض المستخدمين للأشعة فوق البنفسجية. لذلك ، متوافق مع TLC ، من المستحسن تطوير طريقة فعالة وآمنة وغير مكلفة لتحديد عائد العينة.

وصفت الدراسة الحالية بروتوكولا للكشف عن العينة على لوحة TLC باستخدام مصباح LED الأزرق ، وطورت نموذج انحدار بموثوقية عالية (قيمة R مربعة عالية) لقياس أبعاد النطاقات ، ثم تحديد العائد المركب. أخيرا ، وجد أن طريقة إضاءة LED الزرقاء آمنة نسبيا (مقابل. طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية) ، رخيصة (مقابل. GC و HPLC و HPTLC) ، ونهج فعال (مقابل طريقة المقايسة الحيوية) لتحديد كمية الغلة.

يوصف البروتوكول الحالي باستخدام لوفاستاتين كمثال. تم استخراج لوفاستاتين من فطر الرشاشيات تيريوس البالغ من العمر أسبوعا واحدا.

1. استخراج مركب

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول استخراج المركب ، يرجى الاطلاع على الشكل 1.

1. ثقافة الرشاشيات تيريوس على أجار سكر العنب البطاطس (PDA ، انظر جدول المواد) وسط عند 30 درجة مئوية.
2. جفف المزرعة عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. انقل المزرعة المجففة إلى أنبوب سعة 50 مل باستخدام ملاقط معقمة وأضف 15 مل من أسيتات الإيثيل.
3. رج الخليط بقوة عن طريق التحريك لمدة دقيقة واحدة واحتضانه لمدة 1 ساعة عند 40 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة.
4. سونيك الخليط باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية 40 كيلو هرتز (انظر جدول المواد) عند 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
5. قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 5000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقم بالتصفية من خلال ورق ترشيح 11 ميكرومتر.
6. استخراج المرشح مع حجم متساو من الماء المعقم في قمع فصل.
7. بعد فصل الطور ، اجمع الطبقة العضوية ، ثم تبخر في مبخر دوار (انظر جدول المواد). حل البقايا في 2 مل من خلات الإيثيل.

2. فصل المستخلص الخام بواسطة عمود امتزاز المرحلة العادية (NP)

1. قم بتعبئة العمود بهلام السيليكا NP كمرحلة ثابتة ، واستخدم n-hexane: خلات الإيثيل: حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (H: E: T ؛ 80: 20: 0.1 ، v / v / v) كمرحلة متحركة.
2. قم بتحميل 2 مل من المستخلص (الخطوة 1) على العمود وأضف مذيب الطور المتحرك بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة لتقليب المستخلص.
   ملاحظة: تم التحكم في معدل التدفق يدويا باستخدام محبس.
3. تحقق من النفايات السائلة بواسطة TLC للتأكد من وجود لوفاستاتين ، ثم تتبخر في مبخر دوار عند 45 درجة مئوية حتى تتم إزالة المذيب. تستغرق هذه الخطوة حوالي 20-25 دقيقة.
4. قم بإذابة البقايا في 1 مل من أسيتات الإيثيل ، ثم اخلطها مع حجم متساو من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 1٪.
5. الطرد المركزي الخليط في 5000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع الطبقة العضوية في أنبوب زجاجي جديد.

3. تحضير وتحميل ألواح كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC)

1. ضع 5 ميكرولتر من العينات ومعايير لوفاستاتين (انظر جدول المواد) على خط الأساس للوحة TLC باستخدام ماصة شعرية ، تاركا حدا يبلغ 1 سم على جانبي لوحة TLC.
2. جفف طبق TLC في غطاء دخان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. ضع اللوحة برفق بواسطة ملقط في غرفة زجاجية مشبعة تحتوي على مذيب الطور المتحرك. قم بتغطية الحجرة بغطاء زجاجي واترك اللوحة تتطور بالكامل.
4. أخرج اللوحة من الحجرة عندما يصل خط المذيب إلى 1 سم من أعلى اللوحة.

4. تحليل بواسطة مصباح LED أزرق

1. ضع علامة على خط المذيبات بقلم رصاص. جفف الطبق في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. بعد التجفيف ، انقع اللوحة على الفور في مذيب 10٪ H₂SO₄ ، ثم جفف في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. ضع اللوحة على لوحة التسخين حتى تظهر البقع البنية. تأكد من عدم ارتفاع درجة حرارة اللوحة ، لأن هذا قد يجعل تصور لوفاستاتين صعبا.
4. انقل اللوحة إلى مصباح LED الأزرق وامسحها ضوئيا باستخدام برنامج مجاني متوافق (MiBio Fluo) (انظر جدول المواد).

5. تقدير العائد بواسطة نموذج الانحدار

1. قم بقياس أبعاد النطاقات باستخدام برنامج ImageJ (انظر جدول المواد).
2. إنشاء نموذج انحدار باستخدام برنامج تحليل البيانات والرسوم البيانية (انظر جدول المواد) بناء على التركيزات التنازلية لمعايير لوفاستاتين ، بما في ذلك 1 مجم / مل و 0.75 مجم / مل و 0.5 مجم / مل و 0.25 مجم / مل.
3. تطبيق نموذج الانحدار لتقدير عائد العينات.

قدمت هذه الدراسة طريقة إضاءة LED الزرقاء لتقدير إنتاجية المركبات ، وتم التحقق من صحة هذه الطريقة ومقارنتها بالطرق المكتشفة للأشعة فوق البنفسجية (الجدول 1). تم تطوير نماذج الانحدار بناء على أبعاد النطاقات وتركيز المعايير لثلاث طرق ، على التوالي ، للتنبؤ بإنتاجية العينات. أولا ، في نتائج طريقة المقايسة الحيوية ، كان مربع R بين أبعاد منطقة التثبيط ومعايير لوفاستاتين 0.99 ، وكان عائد العينة 0.56 مجم تنبأ به نموذج الانحدار (الشكل 2). ثانيا ، في طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية ، كان مربع R بين معايير لوفاستاتين وأبعاد النطاقات على لوحة TLC 0.97 ، وكان عائد العينة الذي تنبأ به نموذج الانحدار 0.53 مجم (الشكل 3). والجدير بالذكر أن حواف النطاق كانت ضبابية ، ولوحظت نطاقات شدة إشارة منخفضة نسبيا (الشكل 3 أ). ثالثا ، في طريقة إضاءة LED الزرقاء ، كان مربع R بين معايير لوفاستاتين وأبعاد النطاقات على لوحة TLC 0.98 ، وكان عائد العينة 0.54 مجم تنبأ به نموذج الانحدار (الشكل 4). كان العائد المتوقع باستخدام مصباح LED الأزرق أقرب إلى طريقة المقايسة الحيوية (تم ضبطها كعنصر تحكم). كان بعد النطاق متناسبا مع كمية لوفاستاتين ، وتم الحصول على النطاقات الواضحة بطريقة الإضاءة الزرقاء LED. بالإضافة إلى ذلك ، كانت ساعات عمل طرق المقايسة الحيوية والأشعة فوق البنفسجية المكتشفة وإضاءة LED الزرقاء حوالي 24 ساعة و 2 ساعة و 1 ساعة على التوالي ؛ (ملاحظة: ساعة العمل تعني إجمالي الوقت المستغرق في فحص العائد من لوفاستاتين).

الشكل 1: تدفق العمل للبروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: طريقة المقايسة الحيوية. (أ) المقايسة الحيوية للوفاستاتين ضد Neurospora crassa (المحتضنة لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية). في نهاية التجربة ، تم تصوير لوحات أجار 90 ملم تحت الضوء المرئي. (ب) كانت تركيزات ستة معايير لوفاستاتين: رقم 1 (1 مجم / مل) ، رقم 2 (0.75 مجم / مل) ، رقم 3 (0.5 مجم / مل) ، ورقم 4 (0.25 مجم / مل). تم تخفيف العينة رقم 5 إلى 0.25× (1: 4). تم تخفيف العينة رقم 6 إلى 0.5× (1: 2). تم قياس بعد منطقة التثبيط (مم2) بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرمجة الرسوم البيانية استنادا إلى بعد منطقة التثبيط للمعايير. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: لوحة كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC) معرضة لضوء الأشعة فوق البنفسجية. (أ) تم استخدام n-hexane: أسيتات الإيثيل (2: 3 v / v) كمرحلة متحركة في تحليل TLC ، وتم تعريض لوحة TLC لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) بعد نقعها في المطور (10٪ H2SO4). (ب) كانت تركيزات ستة معايير لوفاستاتين: رقم 1 (1 مجم / مل) ، رقم 2 (0.75 مجم / مل) ، رقم 3 (0.5 مجم / مل) ، ورقم 4 (0.25 مجم / مل). تم تخفيف العينة رقم 5 إلى 0.25× (1: 4). تم تخفيف العينة رقم 6 إلى 0.5× (1: 2). تم قياس بعد منطقة التثبيط (مم2) بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرامج الرسوم البيانية بناء على أبعاد نطاقات لوفاستاتين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: لوحة كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC) ممسوحة ضوئيا بواسطة مصباح LED الأزرق. (أ) تم استخدام n-hexane: أسيتات الإيثيل (2: 3 v / v) كمرحلة متنقلة في تحليل TLC ، وتم مسح لوحة TLC بواسطة مصباح LED الأزرق. (ب) كانت تركيزات ستة معايير لوفاستاتين: رقم 1 (1 مجم / مل) ، رقم 2 (0.75 مجم / مل) ، رقم 3 (0.5 مجم / مل) ، ورقم 4 (0.25 مجم / مل). تم تخفيف العينة رقم 5 إلى 0.25× (1: 4). تم تخفيف العينة رقم 6 إلى 0.5× (1: 2). تم قياس بعد منطقة التثبيط (مم2) بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرامج الرسوم البيانية بناء على أبعاد نطاقات لوفاستاتين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: مقارنة بين طرق الكشف الثلاثة المستخدمة في هذه الدراسة.

الجدول 2: مقارنة بين الطرق السابقة والدراسة الحالية.

الشكل التكميلي 1: تم مسح لوحة كروماتوجرام الطبقة الرقيقة (TLC) مع الأمبيسلين بطريقة إضاءة LED الزرقاء. (أ) أسيتات الإيثيل: تم استخدام الميثانول (9:13 فولت / فولت) كمرحلة متنقلة في تحليل TLC ، وتم مسح لوحة TLC بواسطة مصباح LED الأزرق. (ب) كان تركيز أربعة معايير للأمبيسيلين: رقم 1 (100 مجم / مل) ، رقم 2 (75 مجم / مل) ، رقم 3 (50 مجم / مل) ، ورقم 4 (25 مجم / مل). تم قياس أبعاد النطاقات بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرمجيات الرسوم البيانية استنادا إلى أبعاد نطاقات الأمبيسيلين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: لوحة كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC) مع أبراميسين ممسوحة ضوئيا بطريقة إضاءة LED الزرقاء. (أ) الميثانول: تم استخدام الماء (6: 5 فولت / فولت) كمرحلة متحركة في تحليل TLC وتم مسح لوحة TLC بواسطة مصباح LED الأزرق. (ب) كان تركيز أربعة معايير أبرامايسين: رقم 1 (50 مجم / مل) ، رقم 2 (40 مجم / مل) ، رقم 3 (30 مجم / مل) ، ورقم 4 (20 مجم / مل). تم قياس أبعاد النطاقات بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرمجيات الرسوم البيانية استنادا إلى أبعاد نطاقات الأبراميسين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.