Method Article

القياس الكمي التجريبي للتفاعلات بين أنظمة توصيل الدواء والخلايا في المختبر: دليل لتقييم الطب النانوي قبل السريري

DOI:

10.3791/64259

⸱

September 28th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 2Department of Infectious Diseases, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 3Victorian Infectious Diseases Service, Royal Melbourne Hospital at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 4Department of Infectious Diseases, Alfred Hospital and Monash University, 5Department of Chemical Engineering, The University of Melbourne, 6Department of Biomedical Engineering, The University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توضيح سير العمل للقياس الكمي المطلق للتفاعلات بين الخلايا الناقلة للأدوية باستخدام قياس التدفق الخلوي للسماح بتقييم عقلاني أفضل لأنظمة توصيل الأدوية الجديدة. ينطبق سير العمل هذا على ناقلات المخدرات من أي نوع.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتعلق أحد المكونات الرئيسية لتصميم أنظمة توصيل الأدوية بكيفية تضخيم أو تخفيف التفاعلات مع أنواع معينة من الخلايا. على سبيل المثال ، قد يعمل العلاج الكيميائي بجسم مضاد لتعزيز الارتباط بالخلايا السرطانية ("الاستهداف") أو يعمل باستخدام البولي إيثيلين جلايكول للمساعدة في التهرب من التعرف على الخلايا المناعية ("التخفي"). حتى على المستوى الخلوي ، يعد تحسين ربط وامتصاص حامل الدواء مشكلة تصميم بيولوجية معقدة. ومن ثم، من المفيد فصل مدى قوة تفاعل الناقل الجديد مع الخلية عن الفعالية الوظيفية لبضاعة الناقل بمجرد تسليمها إلى تلك الخلية.

لمواصلة مثال العلاج الكيميائي ، فإن "مدى ارتباطها بخلية سرطانية" هي مشكلة منفصلة عن "مدى نجاحها في قتل خلية سرطانية". المقايسات الكمية في المختبر لهذا الأخير راسخة وعادة ما تعتمد على قياس الجدوى. ومع ذلك ، فإن معظم الأبحاث المنشورة حول تفاعلات الناقل الخلوي هي نوعية أو شبه كمية. بشكل عام ، تعتمد هذه القياسات على وضع العلامات الفلورية للناقل ، وبالتالي الإبلاغ عن التفاعلات مع الخلايا في الوحدات النسبية أو التعسفية. ومع ذلك ، يمكن توحيد هذا العمل وجعله كميا تماما مع عدد صغير من تجارب التوصيف. مثل هذا القياس الكمي المطلق ذو قيمة ، لأنه يسهل المقارنات العقلانية بين الطبقات وداخلها لأنظمة توصيل الأدوية المختلفة - الجسيمات النانوية ، والجسيمات الدقيقة ، والفيروسات ، واتحادات الأجسام المضادة والأدوية ، والخلايا العلاجية المهندسة ، أو الحويصلات خارج الخلية.

علاوة على ذلك ، يعد القياس الكمي شرطا أساسيا للتحليلات التلوية اللاحقة أو في مناهج نمذجة السيليكو . في هذه المقالة ، يتم تقديم أدلة الفيديو ، بالإضافة إلى شجرة قرار حول كيفية تحقيق القياس الكمي في المختبر لأنظمة توصيل الأدوية الحاملة ، والتي تأخذ في الاعتبار الاختلافات في حجم الناقل وطريقة وضع العلامات. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة المزيد من الاعتبارات للتقييم الكمي لأنظمة توصيل الأدوية المتقدمة. يهدف هذا إلى أن يكون بمثابة مورد قيم لتحسين التقييم العقلاني والتصميم للجيل القادم من الطب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اجتذب تصميم تركيبات توصيل الأدوية التي تظهر سلوكا محددا ومصمما اعتمادا على نوع الخلية التي تواجهها اهتماما بحثيا كبيرا. تشمل تركيبات توصيل الأدوية المحتملة أو "الناقلات" تركيبات الدهون ، أو المواد غير العضوية المزروعة بالنانو ، أو التجمعات البوليمرية ، أو الحويصلات خارج الخلية ، أو الخلايا البكتيرية الوظيفية ، أو الفيروسات المعدلة. كل هذه يمكن أن تظهر خصوصية العضو أو الأنسجة أو الخلية بسبب الخصائص الفيزيائية أو خصائص السطح أو الوظائف الكيميائية الهندسية مثل ارتباط الجسم المضاد 1,2.

تتمثل الخطوة المنتشرة في كل مكان تقريبا في تقييم الناقل في المختبر في احتضان الخلايا بتعليق ي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اختيار الدفق المناسب

  1. اتبع شجرة القرار الموضحة في الشكل 1 لتحديد أفضل سير عمل (دفق) (الشكل 2) للإعداد التجريبي المستخدم. ارجع إلى المناقشة للحصول على مزيد من التعليقات حول اختيار البث هذا.
  2. إذا كنت تتبع دفق مقياس الخلايا، فتابع الخطوات 2.1.1-2.2.7. إذا كنت تتبع البث المجمع، فتابع الخطوات 3.1.1.1-3.1.5.7.

figure-protocol-1
الشكل 1: شجرة قرار دفق العمل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما نوقش سابقا ، تتطلب أنواع ناقلات المخدرات المختلفة استخدام تقنيات مختلفة للقياس الكمي المطلق لارتباط حامل الخلية. على سبيل المثال ، 633 نانومتر من جزيئات البولي (حمض الميثاكريليك) (PMASH) ذات القشرة الأساسية كبيرة وكثيفة بما يكفي للكشف باستخدام مقياس التدفق الخلوي الحساس. على هذا النحو ، تم تصنيف هذه الجسيمات بالفلورسنت ، ثم تم تسويتها وحسابها باستخدام تشتت الضوء بزاوية جانبية (SALS ، مماثلة ل SSC) ، بالإضافة إلى قناة الفلورسنت المناسبة (الشكل 3). كان الفرق في عدد الأحداث في كل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح توصيف التفاعلات بين ناقلات المخدرات والخلايا ذا أهمية متزايدة في تطوير أنظمة جديدة لتوصيل الأدوية. على وجه التحديد ، للسماح بالتقييم والمقارنة العقلانيين لمختلف هياكل الناقل ، فإن القياس الكمي المطلق لأداء الناقل المذكور للتفاعل مع الخلايا المستهدفة وغير المستهدفة أمر بالغ الأهمية. يصف هذا البروتوكول منهجية ثنائية المسار تسمح لأي باحث يعمل مع حامل دواء بتحويل بيانات قياس التدفق الخلوي النسبية شبه الكمية حول ارتباط حامل الخلية إلى نتائج كمية مطلقة. تنطبق العملية المحددة على أي نوع من الناقلات - الصغيرة أو الكبيرة أو .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحظي هذا العمل بدعم المجلس الوطني الأسترالي للبحوث الصحية والطبية (NHMRC; منحة البرنامج رقم GNT1149990) ، المركز الأسترالي لأبحاث فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد (ACH2) ، بالإضافة إلى هدية من تركة ريجان لويز لانجلوا. تقر F.C. بمنح زمالة الأبحاث الرئيسية العليا للمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) (GNT1135806). تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أليكسا فلور 647 C2 MaleimideInvitrogenA20347صبغة مستقرة الأس الهيدروجيني تستخدم لتسمية 150 نانومتر أو 235 نانومتر أو 633 نانومتر PMASH< / sub> ناقلات ؛ مثال على صبغة جيدة لاستخدامها في دراسات ارتباط الخلايا الحاملة
Apogee A50 MicroflowApogeeمقياس التدفق الخلوي الحساس القادر على اكتشاف الناقلات الصغيرة لعد
CytoFLEX S Flow CellularBeckman Coulterمقياس التدفق الخلوي الحساس قادر على الكشف عن الناقلات الصغيرة للعد وقراءتها للتجارب النهائية لحاجز الخلية يستخدم
FCS ExpressDe NovoSoftware لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي ، أي إجراء البوابات واستخلاص قيم شدة التألق المتوسطة للسكان المفضلين. تشمل البدائل FlowJo و OMIQ و Python
Infinite 200 PROTecan Lifesciencesقارئ الصفيحة الدقيقة القياسية المستخدمة لقياسات التألق السائبة للناقلات في المحلول
LSRFortessa Cell AnalyzerBD Biosciencesمقياس التدفق الخلوي الأقل حساسية ، ولكن واحد متاح بشكل عام للباحثين. يمكن استخدامها لقراءة التجربة النهائية لحاملي الخلية
NanoSight NS300Malvern PanalyticalInstrument المستخدمة في تحليل تتبع الجسيمات
النانوية Prism 8GraphPadSoftware المستخدم في رسم وحساب المنحنيات القياسية. تشمل البدائل Microsoft Excel و Origin و Minitab و Python وغيرها الكثير من مجموعات
Quantum MESF Alexa Fluor 647Bangs Laboratories647حبات القياس الكمي المطلق لقياس التدفق الخلوي. تستخدم لتحويل شدة التألق المقاسة بكميات كبيرة على قارئ الألواح الدقيقة إلى شدة التألق المقاسة على مقياس التدفق الخلوي باستخدام معيار MESF
برنامج أداة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48(2014).
  2. Cheng, Q., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drug Delivery SystemsNanoparticle TrackingFlow CytometryCarrier Cell InteractionQuantitative In Vitro AssayFluorescence MeasurementStandard Curve GenerationAntibody Drug ConjugatesCarrier Uptake QuantificationPreclinical Nanomedicine Evaluation

Related Articles