الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة في الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشبك البشري

Salome Funes; Daryl A. Bosco

doi:10.3791/64323

مقالة منهجية

الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة في الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشبك البشري

DOI:

10.3791/64323

⸱

أغسطس 18, 2022

Salome Funes¹^,² , Daryl A. Bosco¹

¹Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, ²Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول عملية تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة لإجراء التجارب في المختبر . نقوم أيضا بتضمين إجراء مفصل لتوليد المشابك البشرية من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC والتي يمكن استخدامها كركيزة لفحوصات البلعمة في المختبر باستخدام أنظمة تصوير الخلايا الحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة من أصل نخاعي تحافظ على التوازن في البيئة الدقيقة للدماغ وأصبحت لاعبا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية. تمثل دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في مجال الصحة والمرض تحديا بسبب الإمداد المحدود للغاية بالخلايا البشرية. يمكن استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من الأفراد البشريين للتحايل على هذا الحاجز. هنا ، يتم توضيح كيفية التمييز بين iPSCs البشرية إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة (iMGs) للتجارب في المختبر . تظهر هذه الخلايا الجذعية المستغلة الخصائص المتوقعة والفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك التشكل الشبيه بالخلايا الدبقية الصغيرة، والتعبير عن العلامات المناسبة، والبلعمة النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وثائق لعزل ووضع العلامات على ركائز متشابكة مشتقة من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC البشرية (i³LMNs). يتم استخدام اختبار التصوير الطولي للخلايا الحية لمراقبة ابتلاع المشابك البشرية الموسومة بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني ، مما يسمح بإجراء تحقيقات في قدرة البلعمة في iMG. تنطبق البروتوكولات الموصوفة هنا على نطاق واسع على المجالات المختلفة التي تبحث في بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ومساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في المرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا مهما في تطوير الجهاز العصبي المركزي. الخلايا الدبقية الصغيرة مهمة أيضا في دماغ البالغين للحفاظ على التوازن والاستجابة بنشاط لعمليات الصدمات والأمراض. تظهر الأدلة التراكمية أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي المساهمين الرئيسيين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية النمائية والتنكسية العصبية ^1,2. على الرغم من أن المعرفة الحالية حول بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة قد تم اشتقاقها في الغالب من نماذج الفئران ، فقد أوضحت الدراسات الحديثة اختلافات مهمة بين الفئران والخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، مما يؤكد الحاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة الوظائف الوراثية والبيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ^3,4. يمكن أن يؤدي عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة الأولية المشرحة إلى تعديل خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة^{بشدة 5} ، مما قد يؤدي إلى نتائج مربكة تم الحصول عليها باستخدام هذه الخلايا. الهدف العام من هذه الطريقة هو التمييز بين iPSCs البشرية إلى iMGs ، وبالتالي توفير نظام زراعة الخلايا لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في ظل الظروف القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم تضمين اختبار البلعمة باستخدام نظام نموذج بشري بالكامل هنا كوسيلة لدراسة وظائف iMGs ، كإجراء لمراقبة الجودة وتقييم الخلل الوظيفي في iMG في سياق المرض.

ظهرت مؤخرا بروتوكولات متعددة لتمايز الخلايا الدبقية الصغيرة من iPSCs في الأدبيات⁶،⁷،⁸،⁹^،¹⁰. تشمل العيوب المحتملة لبعض البروتوكولات فترات التمايز الممتدة أو الطويلة ، وإضافة عوامل نمو متعددة ، و / أو الإجراءات التجريبية المعقدة⁶،⁹^،¹⁰. هنا ، يتم توضيح طريقة تمايز "سهلة الاستخدام" تلخص جوانب تطور الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تمايز iPSCs إلى خلايا سلائف تسمى سلائف البلاعم البدائية (PMPs)^7,11. يتم إنشاء PMPs كما هو موضح سابقا ، مع بعض التحسينات المقدمة هنا¹². تحاكي PMPs الضامة المشتقة من كيس الصفار المستقل عن MYB ، والتي تؤدي إلى ظهور الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء التطور الجنيني عن طريق غزو الدماغ قبل إغلاق حاجز الدم في الدماغ¹³. للتمييز النهائي بين PMPs و iMGs ، استخدمنا طريقة زراعة أحادية سريعة ومبسطة تعتمد على بروتوكولات Haenseler et al. و Brownjohn et al. ، مع بعض التعديلات لتوليد طريقة تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة الفعالة التي تعبر فيها iMGs بقوة عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرة^{المخصبة} ^7,8. يمكن استنساخ طريقة التمايز هذه في المختبرات ذات الخبرة في ثقافة iPSCs ومع أهداف بحثية تهدف إلى دراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام نظام نموذج بشري.

تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC مصدرا ذا صلة بيولوجيا للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية لإجراء التجارب في المختبر وهي أداة مهمة للتحقيق في الوظائف الكنسية للخلايا الدبقية الصغيرة ، بما في ذلك البلعمة. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا البلعمية المهنية في الدماغ والجهاز العصبي المركزي، حيث تزيل حطام الخلايا، والبروتينات المجمعة، والمايلين¹⁴ المتحلل. تعمل الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في إعادة تشكيل متشابك عن طريق ابتلاع نقاط الاشتباك العصبي وفي الدفاع ضد الالتهابات الخارجية من خلال البلعمة من مسببات الأمراض^15,16. في هذا البروتوكول ، يتم تقييم البلعمة بواسطة iMGs باستخدام المشابك البشرية كمواد لابتلاع iMG. تحقيقا لهذه الغاية ، تم وصف وصف لعزل التشابك العصبي المشتق من الإنسان i³LMNs. يتم تمييز المشابك البشرية المشتقة من i³LMN بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني تسمح بتحديد كمية التشابك العصبي المترجمة داخل المقصورات الحمضية أثناء معالجة البلعمة وتدهورها في المختبر. يظهر اختبار البلعمة باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية لمراقبة العملية الديناميكية لابتلاع الخلايا الدبقية الصغيرة في الوقت الفعلي. يضع هذا الفحص الوظيفي أساسا للتحقيق في العيوب المحتملة في البلعمة الدبقية الصغيرة في الصحة والمرض باستخدام نظام بشري كامل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول معقمة، ويجب تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة. يتم وصف جميع خطوط iPSC ، بالإضافة إلى وسائط الصيانة والتمايز ، في جدول المواد. تعتمد طريقة تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة الموضحة أدناه على البروتوكولات^{المنشورة مسبقا 7}،⁸^،¹² مع التعديلات الجديدة الموضحة هنا.

1. تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: يتم تلخيص نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1.

زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)
ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل التي تصف تقنيات زراعة iPSC في مكان آخر¹⁷.
1. الذوبان والصيانة
  1. قم بإعداد وسيط iPSC ، وقسمة الوسط ، وتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. قم بإذابة القسمة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية واستخدمها لمدة تصل إلى 1 أسبوع. اترك الوسائط في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
  2. قم بتغطية آبار صفيحة مكونة من 6 آبار بإضافة 1 مل من 10 ميكروغرام / مل من laminin 521 المخفف في DPBS الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم¹⁸. احتفظ بالأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂لمدة ساعتين على الأقل أو يفضل طوال الليل. بمجرد تخفيفه ، قم بتخزين اللامينين في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر.
  3. تحضير 10 mM Rho كيناز مثبط Y27632 (ROCK Inhibitor) محلول الأسهم عن طريق التخفيف في الماء المعقم. جعل القسمة ذات الاستخدام الواحد من محلول مثبطات ROCK وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  4. قم بإعداد 0.5 mM EDTA عن طريق تخفيف محلول المخزون البالغ 0.5 M EDTA في DPBS.
  5. لإذابة قارورة من iPSCs المجمدة ، ضع القارورة في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية حتى يتم إذابتها في الغالب. انقل محتوى القارورة على الفور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من وسط iPSC. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة.
  6. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا بإضافة 1 مل من وسط iPSC الذي يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK ببطء على جدار الأنبوب لتجنب إزعاج المستعمرات.
  7. أضف 1.5 مل من وسط iPSC الذي يحتوي على مثبط صخرة 10 ميكرومتر إلى كل من الآبار المطلية وانقل المستعمرات المعاد تعليقها قطرة قطرة إلى الآبار التي تحتوي على الوسط.
    ملاحظة: استخدم 5-7 قطرات من الخطوة 1.1.1.6 لصيانة المستنبتة ولكن اضبط كثافة البذر المثلى لكل خط iPSC.
  8. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار عن طريق خلط اللوحة يدويا جنبا إلى جنب ومن الخلف إلى الأمام. ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. في اليوم التالي ، استبدل الوسط تماما بإضافة وسيط iPSC جديد بدون مثبط ROCK.
  9. للصيانة ، قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على الخلايا دون تغيير الوسيط لمدة 2 أيام إذا كان وسيط iPSC المستخدم يسمح بجدول تغذية مرن. ينصح بقصر هذا على مرة واحدة لكل مقطع وفقط إذا كانت الخلايا أقل من 50٪ متقاربة.
2. تقسيم
  1. نضح الوسط وغسل الخلايا مع 1 مل من DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم).
  2. لإزاحة الخلايا ، أضف 1 مل من 0.5 mM EDTA واحتضانها لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى ترتفع حواف مستعمرات الخلايا من سطح البئر. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DPBS وأضف 1 مل من وسط iPSC.
  3. افصل مستعمرات الخلايا عن طريق كشطها برفق باستخدام رافع الخلية. كشط كل منطقة من البئر مرة واحدة فقط لتجنب إزعاج المستعمرات.
    ملاحظة: يمكن العثور على طرق بديلة لإزاحة المستعمرات من البئر في مكان آخر¹⁷.
  4. باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل ، اجمع الخلايا وانقلها قطرة قطرة بنسبة 1: 6 (خلايا إلى متوسطة) إلى آبار مطلية مسبقا (كما هو مذكور في الخطوة 1.1.1.2) تحتوي على 1.5 مل من وسط iPSC.
تمايز iPSC إلى الخلايا الدبقية الصغيرة (iMGs)
ملاحظة: يتم إذابة الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو في ألبومين مصل الأبقار المعقم المصفى بنسبة 0.1٪ في DPBS إلى تركيز مخزون أعلى 1000 مرة من التركيز النهائي. يوصى بتمييز iPSCs إلى iMGs أثناء الممرات المبكرة. ينصح بالتنميط النووي الروتيني لخطوط iPSC.
1. تحضير محلول الطلاء القياسي
  1. قم بإذابة محلول المخزون لكاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجليد عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Prechill وأطراف ماصة المرشح عند 4 درجات مئوية.
  3. حصة 250 ميكرولتر من كاشف طلاء المصفوفة المركزة خارج الخلية في كل أنبوب ووضعها على الفور على الجليد. قم بتخزين القسمة في -20 درجة مئوية.
  4. لتحضير محلول الطلاء ، قم بإذابة أحد حصص كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجليد عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  5. أضف 50 مل من وسائط DMEM-F12 الباردة والجليدية المحسنة لنمو الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمستحثة متعددة القدرات (المشار إليها باسم DMEM-F12) إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا واحتفظ بها على الجليد.
  6. قم بتبريد طرف ماصة سعة 1 مل عن طريق سحب DMEM-F12 المثلج لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم استخدم طرف الماصة على الفور لنقل 250 ميكرولتر من كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على وسط DMEM-F12.
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول الطلاء القياسي لمدة 2 أسابيع عند 4 °C.
2. تكوين الجسم الجنيني (EB)
  1. قم بإعداد وسيط EB الذي يمكن الحفاظ عليه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام.
  2. بمجرد أن تصل iPSCs إلى 80٪ من التقاء ، افصل المستعمرات عن طريق الغسيل باستخدام 1 مل من DPBS وإضافة 1 مل من كاشف التفكك لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بإزاحة المستعمرات باستخدام رافع الخلايا عن طريق الكشط عدة مرات لإنشاء تعليق أحادي الخلية. اجمع الخلايا وانقل كل شيء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من DPBS.
  3. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط EB. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا وخفف 1: 1 باستخدام Trypan blue. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، وبناء على عدد الخلايا ، قم بتخفيف مخزون الخلايا إلى تخفيف نهائي يبلغ 10000 خلية لكل 100 ميكرولتر. بالنسبة لخلايا الطلاء ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لكل بئر إلى لوحة منخفضة الالتصاق ، مستديرة القاع ، 96 بئرا.
    ملاحظة: بشكل عام ، يمكن الحصول على 48 بئرا من لوحة 96 بئرا من كل بئر متقارب بنسبة 80٪ من iPSCs.
  4. جهاز طرد مركزي للصفيحة عند 125 × جم لمدة 3 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 4 أيام. قم بإجراء تغيير نصف متوسط في اليوم 2 باستخدام ماصة متعددة القنوات وجمع 50 ميكرولتر من الوسط القديم برفق ، ثم إضافة 50 ميكرولتر من وسيط EB الجديد.
    ملاحظة: في اليوم 4 ، ستشكل iPSCs هياكل خلوية كروية تسمى EBs كما هو موضح في قسم النتائج. يمكن تمديد عملية تمايز EB حتى 7 أيام ، إذا لزم الأمر.
3. توليد سلائف البلاعم البدائية (PMPs)
  1. تحضير قاعدة PMP المتوسطة ، مرشح معقم ، وتخزينها في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر.
  2. قم بتغطية آبار صفيحة مكونة من 6 آبار بإضافة 1 مل من محلول طلاء Matrigel المثلج البارد واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة₂ساعة على الأقل أو يفضل طوال الليل.
  3. في اليوم 4 من تمايز EB ، انقل EBs إلى الآبار المطلية ب Matrigel عن طريق جمع EBs بأطراف ماصة 1 مل (باستخدام ماصة). ماصة لأعلى ولأسفل مرة أو مرتين لإزاحة EBs من البئر. امسك اللوحة المكونة من 6 آبار بزاوية مائلة للسماح ل EBs بالاستقرار على حافة البئر.
    ملاحظة: يمكن طلاء تسعة أو عشرة EBs لكل بئر مطلي.
  4. بمجرد أن تستقر جميع EBs ، ماصة برفق وإزالة الوسيط القديم باستخدام طرف ماصة 1 مل مع الحفاظ على EBs على حافة البئر. أضف 3 مل من الوسط الكامل PMP الطازج إلى كل بئر. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار عن طريق خلط اللوحة يدويا جنبا إلى جنب ومن الخلف إلى الأمام. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
  5. لا تزعج اللوحة لمدة 7 أيام للسماح ل EBs بالالتصاق بقاع البئر. بعد ذلك الوقت ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط PMP الكامل.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب إرفاق معظم EBs باللوحة. يمكن إزالة أي EBs عائمة.
  6. بعد 5-7 أيام ، افحص EBs تحت مجهر المجال الضوئي عند تكبير 4x للتأكد من أنها متصلة بقاع الآبار. قم بتغيير الوسيط كما هو موضح في 1.2.3.5. في اليوم 21 ، قم بإجراء تغيير متوسط كامل مع 3 مل من وسيط PMP الكامل.
    ملاحظة: قد تكون السلف النخاعية العائمة في الوسط واضحة في هذه المرحلة. يجب التخلص من هذه الخلايا أثناء التغيير المتوسط.
  7. في اليوم 28 ، ابحث عن الخلايا المستديرة المشار إليها باسم PMPs في المادة الطافية واجمع الوسيط الذي يحتوي على PMPs باستخدام ماصة سعة 10 مل وماصة أوتوماتيكية. احرص على عدم إزعاج EBs. انقل PMPs والوسط إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وتابع كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
    ملاحظة: عادة ما يمكن جمع PMPs من نفس خط iPSC من خمسة آبار من لوحة 6 آبار وتجميعها معا في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل.
  8. أضف 3 مل من وسيط PMP الكامل الجديد لمزيد من الصيانة ل EBs. نظرا لأن PMPs تظهر باستمرار من EBs لأكثر من 3 أشهر ، قم بجمعها كل 4-7 أيام (لا تسمح للوسيط بتغيير اللون إلى درجة اللون الأصفر) كما هو موضح في الخطوتين 1.2.3.7 و 1.2.3.8.
    ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن جمع PMPs لعدة أشهر ، إلا أنها قد تغير نمطها الظاهري بمرور الوقت.
4. التمايز إلى iMGs
  1. قم بإعداد الوسط الأساسي iMG (جدول المواد) ، وفلتر معقم وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
  2. بمجرد جمع PMPs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، قم بطرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق PMPs باستخدام 1-2 مل من الوسط القاعدي iMG. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم عن طريق أخذ حصة صغيرة وتخفيف 1: 1 باستخدام Trypan blue.
    ملاحظة: عادة ما يتم الحصول على 0.5-1.5 × 10⁶ PMPs كل أسبوع اعتمادا على خط iPSC وعمر ثقافة EB.
  3. جهاز طرد مركزي لبقية الخلايا مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. قم بتخفيف PMPs إلى التركيز المطلوب بحيث يتم طلاء الخلايا بكثافة ~ 10⁵ / سم² على الألواح المعالجة بزراعة الخلايا باستخدام وسط iMG الكامل الطازج. قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط iMG الكامل المحضر حديثا كل 3-4 أيام طوال 10-12 يوما للسماح بالتمايز النهائي.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تكتسب الخلايا مورفولوجيا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة. لتأكيد التزام PMPs بمصير الخلايا الدبقية الصغيرة ، يتم إجراء تحليل التألق المناعي لتأكيد التعبير عن العلامات الغنية بالخلايا الدبقية الصغيرة مثل مستقبلات purinergic P2RY12 والبروتين عبر الغشاء 119 (TMEM119) ⁹.
  4. للحفاظ على صحة الخلية وقابليتها للحياة ، قم بإجراء جميع التجارب بين الأيام 10 إلى 12 من تمايز iMG.

2. مقايسة البلعمة باستخدام المشابك البشرية المشتقة من الخلايا العصبية الحركية

التمايز بوساطة عامل النسخ للخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC (i³LMNs)
ملاحظة: تم استخدام خط WTC11 مع إدخال مستقر لشريط عامل النسخ المستحث hNIL الذي يحتوي على عوامل نسخ neurogenin-2 (NGN2) و islet-1 (ISL1) و LIM homeobox 3 (LHX3) في موضع الملاذ الآمن CLYBL لعملية التمايز كما هو موضح سابقا¹⁷. تم الحفاظ على خط iPSC كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 ولكن مع ظروف الطلاء الموضحة في الخطوة 1.2.1. يمكن استخدام أي كاشف طلاء مصفوفة خارج الخلية لزراعة iPSCs التي سيتم استخدامها للتمايز العصبي لأن laminin 521 غير مطلوب. تتم موازنة جميع الوسائط مع درجة الحرارة المحيطة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
1. قم بتغطية أطباق 10 سم ب 5 مل من محلول الطلاء القياسي كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.
  ملاحظة: هنا ، تم استخدام 3-4 أطباق 10 سم لكل تمايز.
2. قم بإعداد وسط قاعدة الحث ، مرشح معقم ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
3. تحضير الوسط الخلايا العصبية ، مرشح معقم ، وتخزينها في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
4. تحضير محلول البورات عن طريق خلط 100 مليمول حمض البوريك، و25 مليمول من رباعي الصوديوم، و75 مليمول من كلوريد الصوديوم في ماء معقم. اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.5 وقم بتصفيته بشكل معقم.
5. بمجرد أن تصل iPSCs إلى 80٪ من الالتقاء ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS وقم بإزاحة المستعمرات بإضافة 0.5 mM EDTA.
  ملاحظة: عادة ما يكون بئران كافيين لكل طبق 10 سم.
6. احتضان الخلايا لمدة 4-5 دقائق في درجة الحرارة المحيطة. قم بإزالة EDTA وأضف 3 مل من DMEM / F12 مع HEPES إلى كل بئر.
7. اكشط الخلايا باستخدام رافع الخلايا واستخدم ماصة سعة 10 مل لإزالة الخلايا من قاع البئر عن طريق سحب الأنابيب برفق لأعلى ولأسفل 2-3x.
8. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 300 × جم لمدة 3 دقائق.
9. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط iPSC الذي يحتوي على مثبط ROCK 10 ميكرومتر وقم بحسابها باستخدام مقياس الدم.
10. لوحة 1.5 × 10⁶ iPSCs في طبق 10 سم مغلفة مسبقا مع 12 مل من وسط iPSC يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK.
11. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا باستخدام DPBS. أضف 12 مل من وسط الحث الكامل الطازج للحث على التعبير عن عوامل النسخ.
12. في اليوم الثاني ، قم بتغطية أطباق 10 سم ب 5 مل من محلول طلاء الخلايا العصبية المحضر بأحجام متساوية من 0.1 مجم / مل من بولي دي ليسين و 1 مجم / مل من بولي إل أورنيثين المخفف في محلول بورات. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
13. في اليوم الثالث ، اغسل الأطباق المطلية بالماء المعقم 3x ، واستنشق الماء تماما ، واترك الأطباق تجف عن طريق إمالة الأطباق وتركها مكشوفة جزئيا داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة الحرارة المحيطة.
14. بمجرد أن تجف الأطباق تماما ، قم بتغطيتها ب 6 مل من وسط الحث الكامل المكمل ب 15 ميكروغرام / مل من اللامينين و 40 ميكرومتر BrdU لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
  ملاحظة: يوصى بعلاج BrdU للقضاء على الخلايا النشطة انقساميا وبالتالي تعزيز نقاء الثقافات العصبية. آثار BrdU على صحة الخلايا العصبية ضئيلة.
15. عالج الخلايا المتمايزة ب 3 مل من كاشف التفكك لكل طبق 10 سم واحتضانها لمدة 3-4 دقائق في درجة الحرارة المحيطة.
16. أضف 6 مل من DPBS إلى اللوحة دون إزالة كاشف التفكك وماصة الخلايا في محلول لأعلى ولأسفل 4-5x مع ماصة 10 مل لفصل الخلايا.
17. اجمع معلق الخلية ومرره عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 1 مل من وسط قاعدة الحث لشطف المصفاة.
18. أجهزة الطرد المركزي للخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. نضح الوسط وإعادة تعليق الخلايا في 3 مل من وسط الحث الكامل الذي يحتوي على 40 ميكرومتر BrdU.
19. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بتقطيع ما يقرب من 2.5 × 10⁶ خلايا لكل طبق 10 سم في أطباق مغلفة مسبقا عن طريق تخفيف الخلايا في 6 مل من وسط الحث الكامل الذي يحتوي على 40 ميكرومتر BrdU دون إزالة محلول الطلاء المضاف في الخطوة 2.1.14.
20. في اليوم 4 ، قم بشفط الوسط ، واغسل الخلايا 1x باستخدام DPBS ، وأضف وسط تحريض كامل جديد يحتوي على 40 ميكرومتر BrdU.
21. في اليوم 6 ، قم بنشاق الوسط ، واغسل الخلايا 1x باستخدام DPBS ، وأضف وسط الخلايا العصبية المكمل ب 1 ميكروغرام / مل من اللامينين.
22. في اليوم 9 ، قم بتغيير 1/3^{الثالثة} من الوسط عن طريق استبداله بوسط عصبي جديد مكمل ب 1 ميكروغرام / مل من اللامينين.
23. حافظ على³LMNs لمدة 25 يوما إضافية عن طريق إجراء تغييرات نصف متوسطة مع وسيط Neuron مع 1 ميكروغرام / مل طازج من laminin كل 3-4 أيام.
  ملاحظة: في هذه النقطة الزمنية ، يجب أن تقدم^{i 3}LMNs مورفولوجيا عصبية مع عمليات طويلة. تميل الخلايا العصبية أيضا إلى تكوين كتل أو مجموعات من الخلايا. يمكن العثور على وصف أكثر تفصيلا لكيفية التحقق من صحة تمايز i³LMNs في مكان آخر¹⁷.
تنقية المشبك ووضع العلامات
ملاحظة: الحفاظ على ظروف معقمة وتنفيذ جميع الخطوات داخل خزانة السلامة البيولوجية.
1. اغسل³ LMNs مرتين باستخدام DPBS.
2. أضف 2 مل من كاشف تحلل الخلايا الباردة لعزل التشابك العصبي ، واحتضان الجليد لمدة دقيقتين ، وكشط الخلايا العصبية بإحكام.
3. انقل المحللة إلى أنابيب دقيقة متعددة سعة 2 مل (~ 1.5 مل لكل أنبوب) وأجهزة طرد مركزي عند 1200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  ملاحظة: حافظ على الأنابيب على الجليد طوال هذا الإجراء.
4. اجمع المادة الطافية (تخلص من الحبيبات) وأجهزة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حفظ وإعادة تعليق الحبيبات التي تحتوي على المشابك العصبية بحجم مماثل (مثل المحللة الأصلية) بنسبة 5٪ DMSO في DPBS.
  ملاحظة: يمكن تسمية السينابتوزومات على الفور بفلوروفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
5. قم بإجراء فحص بروتين حمض Bicinchoninic (BCA) لجميع الأنابيب لتقييم العائد الكلي للبروتين في إعداد المشبك.
  ملاحظة: يمكن استخدام مقايسات أخرى لقياس تركيز البروتين. تم تضمين إجمالي محصول البروتين الذي تم الحصول عليه من المستحضرات المختلفة في الجدول 1 كمرجع. يوصى بإجراء تحليل اللطخة الغربية لإعداد المشبك لتأكيد وجود بروتينات ما قبل المشبكي وما بعد المشبكي. هنا ، تم اختيار علامة ما قبل المشبكي ، synaptophysin (SYP) ، وعلامة ما بعد المشبكي ، بروتين كثافة ما بعد المشبكي 95 (PSD95) لتحليل النشاف الغربي كما هو موضح سابقا¹⁹.
6. تحضير محلول من 100 مليمتر من بيكربونات الصوديوم في الماء ، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.5 ، ومرشح معقم.
7. إذابة 1 ملغ من مسحوق مجفف بالتجميد من الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني المستخدمة في 150 ميكرولتر من DMSO. اصنع حصصا للاستخدام مرة واحدة وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية.
8. أجهزة الطرد المركزي للتشابك العصبي عند 15000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
9. تمييع ما يصل إلى 1 ملغ من المشابك في 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم 100 mM.
10. لتسمية المشبك العصبي ، أضف 1 ميكرولتر من الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني المعاد تشكيلها لكل 1 ملغ من الجيبتوسومات وقم بتغطية التفاعل بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء. يهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة باستخدام شاكر أنبوب.
11. أضف 1 مل من DPBS إلى الأنبوب وجهاز الطرد المركزي للتشابك العصبي المسمى عند 15000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
12. قم بإزالة المادة الطافية وقم بإجراء أربع عمليات غسل إضافية كما هو موضح في الخطوة 2.2.11.
13. بعد الغسيل والدوران النهائي ، قم بإزالة المادة الطافية قدر الإمكان دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق المشابك العصبية الموسومة بنسبة 5٪ DMSO في DPBS بحجم التركيز المطلوب (0.7 ميكروغرام / ميكرولتر المستخدمة هنا). تحضير القسمة ذات الاستخدام الواحد وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. تأكد من تجنب التعرض للضوء للتشابك العصبي المسمى.
مقايسة البلعمة بالخلايا الحية
1. اللوحة 20-30 × 10 4 PMPs إلى 96 لوحة بئر في 100 ميكرولتر من iMG وسط كامل واتبع عملية التمايز لمدة 10 أيام كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
2. في يوم الفحص ، قم بإعداد محلول التلوين النووي عن طريق إضافة قطرة واحدة من البقعة النووية للخلايا الحية إلى 2 مل من الوسط القاعدي iMG.
3. قم بإزالة 40 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من لوحة 96 بئرا وأضف 10 ميكرولتر من محلول التلوين النووي باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة₂ ساعة.
4. ذوبان المشابك المسمى على الجليد وسونيكات بلطف باستخدام سونيكاتور الماء لمدة 1 دقيقة. نقل المشابك على الفور مرة أخرى إلى الجليد. تمييع المشابك المسمى في الوسط الكامل iMG بنسبة 1 ميكرولتر من المشابك لكل 50 ميكرولتر من المتوسط.
  ملاحظة: يعتمد تركيز المشبك العصبي على الفحص وقد يتطلب التحسين. للحفاظ على نسبة منخفضة نسبيا (أي 0.1٪ أو أقل) من DMSO في الوسط ، ينصح بعدم إضافة أكثر من 2 ميكرولتر من التشابك العصبي لكل بئر.
5. كعنصر تحكم سلبي ، قم بمعالجة بعض الآبار بالسيتوكلاسين D لمنع بلمرة الأكتين وبالتالي البلعمة. تحضير محلول 60 ميكرومتر سيتوكلاسين D في وسط كامل iMG. أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة.
6. أخرج الطبق من الحاضنة واحتضنه عند 10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. حافظ على الصفيحة على الجليد وأضف 50 ميكرولتر من الوسط المحتوي على المشابك العصبية المحضرة كما هو موضح في الخطوة 2.3.4.
7. قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 270 × جم لمدة 3 دقائق عند 10 درجات مئوية وحافظ على اللوحة على الجليد حتى الحصول على التصوير.
اقتناء التصوير وتحليله
1. أدخل اللوحة في قارئ تصوير الخلايا الحية وحدد الآبار المراد تحليلها.
2. حدد عدسة موضوعية 20x .
3. اضبط التركيز ، وشدة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، ووقت التكامل ، وكسب قنوات برايت فيلد والأزرق (4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول [DAPI]). يجب أن يكون مضان المشبك ضئيلا في النقطة الزمنية الأولية. للتركيز على القناة الحمراء (RFP) ، استخدم قناة برايتفيلد كمرجع. يمكن أن يختلف وقت التكامل والكسب بين التجارب. استخدم هذه الإعدادات الأولية للقناة الحمراء: LED: 4 ، وقت التكامل: 250 ، والكسب: 5.
4. حدد عدد البلاط الفردي الذي سيتم الحصول عليه في مونتاج لكل بئر (الحصول على 16 بلاطة في مركز البئر ، وبالتالي تصوير ما يقرب من 5٪ من إجمالي مساحة البئر). اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية والفاصل الزمني المطلوب للتصوير.
  ملاحظة: تم الحصول على الصور كل 1-2 ساعة لمدة تصل إلى 16 ساعة في هذه الدراسة.
5. افتح برنامج التحليل.
  1. افتح التجربة التي تحتوي على الصور. انقر على أيقونة تقليل البيانات.
  2. في القائمة ، اختر خياطة التصوير ضمن معالجة التصوير لإنشاء صورة كاملة من المربعات الفردية 4 × 4 في المونتاج مع المعلمات الموضحة في الجدول 2.
  3. بمجرد إنشاء الصور المخيطة ، حدد عتبة الكثافة باستخدام قنوات DAPI و RFP لهذه الصور. افتح صورة وانقر على تحليل; ضمن تحليل، حدد التحليل الخلوي، وضمن قناة الكشف، اختر صورة مخيطة إما في قنوات DAPI أو RFP. انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد وقم بإنشاء قيمة عتبة وقيم حجم الكائن التي تحدد بشكل صحيح نوى الخلية في قناة DAPI أو إشارة المشبك في قناة RFP. كرر العملية مع صور مختلفة حتى يتم تحسين المعلمات التي يمكن تطبيقها على التجربة بأكملها.
    ملاحظة: يمكن العثور على القيم المقترحة في الجدول 2.
  4. لحساب عدد النوى، انتقل إلى قائمة تقليل البيانات، وضمن تحليل الصورة، حدد التحليل الخلوي. انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد وضمن القناة ، حدد الصور المخيطة DAPI واستخدم المعلمات الموضحة في الجدول 2.
  5. انتقل إلى علامة التبويب المقاييس المحسوبة وحدد عدد الخلايا. للحصول على منطقة إشارة المشبك ، انتقل إلى قائمة تقليل البيانات وضمن التحليل ، حدد التحليل الخلوي.
  6. انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد وضمن القناة ، حدد الصور المخيطة RFP واستخدم المعلمات المفصلة في الجدول 2.
  7. انتقل إلى علامة التبويب المقاييس المحسوبة وحدد منطقة مجموع الكائن. في علامة التبويب تقليل البيانات ، انقر فوق "موافق " واسمح للبرنامج بتحليل جميع الصور التي تم الحصول عليها.
  8. قم بتصدير قيم ناحية مجموع الكائنات وعدد الخلايا لكل نقطة زمنية. قسم منطقة مجموع الكائن على عدد الخلايا لحساب المنطقة التي تمت تسويتها لكل نقطة زمنية. في حالة مقارنة علاجات أو أنماط جينية متعددة ، احسب مؤشر البلعمة باستخدام المعادلة (1):
    (1)
  9. حفظ النتائج ودمج البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإنشاء iMGs باستخدام هذا البروتوكول ، من المهم البدء ب iPSCs غير المتمايزة التي تظهر مورفولوجيا مستعمرة مدمجة ذات حواف محددة جيدا (الشكل 2 أ). ستشكل iPSCs المنفصلة التي يتم الاحتفاظ بها كما هو موضح في قسم تكوين EB مجاميع كروية ، تسمى EBs ، والتي ستنمو في الحجم حتى اليوم 4 من التمايز (الشكل 2B). بمجرد جمع EBs وطلائها في الظروف المناسبة لتوليد PMP ، فإنها تلتصق بالألواح المطلية ب Matrigel ، وسوف تنتشر طبقة من الخلايا وتحيط بالركام الكروي (الشك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة فعالة للحصول على خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC في ~ 6-8 أسابيع بنقاوة عالية وفي عائد كاف لإجراء تجارب التألق المناعي والمقايسات الأخرى التي تتطلب عددا أكبر من الخلايا. وقد أسفر هذا البروتوكول عن 1 × 10⁶ iMGs في أسبوع واحد ، مما يسمح باستخراج البروتين والحمض النووي الريبي والتحليلات النهائية المقابلة (على سبيل المثال ، RNASeq ، qRT-PCR ، اللطخة الغربية ، قياس الطيف الكتلي). ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذا البروتوكول هو أن عائد iMGs قد يقيد تطبيقات معينة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون مايكل وارد على توفير خط WTC11 hNIL iPSC لتمايز الخلايا العصبية الحركية ومختبرات جاكسون لتزويد خط KOLF2.1J WT clone B03 iPSC المستخدم في تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة. كما نشكر دوروثي شافر على دعمها أثناء تنفيذ البروتوكولات ، وأنتوني جيامبيتروزي وجون لاندرز لمساعدتهم في نظام التصوير بالخلايا الحية وكذلك هايدن جاد لمساهماته الفنية أثناء المراجعات وجوناثان جونغ لتعاونه في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق دان وديان ريتشيو لعلم الأعصاب من كلية الطب UMASS Chan و Angel Fund، Inc.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<الأجسام المضادة > القوية لتحليل التألق المناعي < / قوي >
مضاد ل IBA1 أجسام مضادة للأرانب	واكو كيميكال الولايات المتحدة الأمريكية	NC9288364	1:350 التخفيف
المضاد للأجسام المضادة للأرانب P2RY12	سيجما ألدريتش	HPA014518	1:50 التخفيف
المضاد للأرانب المضادة TMEM119	سيجما ألدريتش	HPA051870	:100 التخفيف
<الأجسام المضادة القوية> لتحليل اللطخة الغربية< / قوي >
مضاد بيتا ؛ - توبولين أجسام مضادة للأرانب	Abcam	ab6046	1: 500 التخفيف
المضاد للمتشابك (SYP) الأرانب المضادة للجسم المضاد	Abclonal	A6344	1: 1،000 التخفيف
المضاد للجسم المضاد للفأر PSD95	Millipore	MAB1596	1: 500 تخفيف
<قوي > بورات عازلة المكونات< / قوي >
حمض البوريك (100 ملم)	سيجما	B6768
بيكربونات الصوديوم (NaHCO_{3< / sub>) BioXtra}	Sigma-Aldrich	S6297-250G
كلوريد الصوديوم (75 ملم)	سيجما	& nbsp ؛ S7653
رباعي الصوديوم (25 ملم)	سيجما	221732
<قوي > مواد زراعة الخلايا < / ألواح قوية >
6 آبار	Greiner Bio-One	657160
40 & mu ؛ م مصافي الخلية	Falcon	352340
100 مم × 20 مم زراعة الأنسجة المعالجة	CELLTREAT	229620
رافع الخلايا ، طرف مزدوج ، شفرة مسطحة و شفرة ضيقة ، معقمة		CELLTREAT 229305
التصاق منخفض الالتصاق لوحة مستديرة القاع 96 بئر	Corning	7007
Primaria 24 بئر سطح سفلي مسطح معدل لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار	Corning	353847 ،
Primaria 6 خلايا بئر شفافة القاع المسطح المعدل متعدد الآبار لوحة	الثقافة Corning	353846
Primaria 96-well Clear Flat أسفل الصفيحة الدقيقة	كورنينج	353872
<قوية>كواشف تفكك الخلية
Accutase		25058CI	المستخدمة في تمايز الخلايا العصبية الحركية السفلية
كاشف TrypLE	تقنيات الحياة	12-605-010	كواشف التفكك المستخدمة في تمايز الخلايا الدبقية
الدقيقة UltraPure 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0	Invitrogen	15575020
كواشف الطلاء لزراعة الخلايا < / strong>
Matrigel GFR مصفوفة الغشاء	Corning & trade ؛	354230	يشار إلى كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	يشار إليه باسم laminin 521
Poly-D-Lysine	Sigma	P7405	إعادة التكوين إلى 0.1 مجم / مل في مخزن البورات
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655	إعادة التكوين إلى 1 ملغ / مل في البورات العازلة
< قوية > مكونات <م > iPSC وسائل الإعلام < / م >< / قوي>
& nbsp ؛ mTeSR Plus Kit	تقنية STEMCELL	100-0276	لتحضير iPSC media < / em> خلط المكونات إلى 1x
< قوية>مكونات EB media< / em>< / strong>
BMP-4	Fisher Scientific		PHC9534 التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل
iPSC الوسائط < / em >			التركيز النهائي 1x
مثبط الصخور Y27632	فيشر Scientific	BD 562822	التركيز النهائي 10 & M
SCF	PeproTech	300-07	التركيز النهائي 20 نانوغرام / مل
VEGF	PeproTech	100-20A	التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل
<قوي>مكونات الوسائط الأساسية PMP< / em>< / strong>
GlutaMAX	Gibco	35050061	التركيز النهائي 1x
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)	جيبكو	15140122	التركيز النهائي 100 U / mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	التركيز النهائي 1x
مكونات PMP الوسائط الكاملة < / em >< / strong >
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	التركيز النهائي 55 & micro ؛ M
IL-3	PeproTech	200-03	التركيز النهائي 25 نانوغرام / مل لتر
M-CSF	PeproTech	300-25	التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل
< م > PMP الوسائط الأساسية < / م >			التركيز النهائي 1x
< قوي> مكونات الوسائط الأساسية iMG< / em>< / strong>
Advanced DMEM / F12	Gibco	12634010	التركيز النهائي 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	التركيز النهائي 1x
N2 الملحق ، 100x	Gibco	17502-048	التركيز النهائي 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL)	Gibco	15140122	التركيز النهائي 100 U /
mL مكونات iMG الوسائط الكاملة < / em >< / قوي>
55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول	جيبكو	21985023	التركيز النهائي 55 & M
IL-34	PeproTech أو Biologend	200-34 أو التركيز النهائي 577904	100 نانوغرام / مل
iMG الوسائط الأساسية < / م >			التركيز النهائي 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	التركيز النهائي 5 نانوغرام / مل
TGF- & بيتا ؛	PeproTech	100-21	التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل
< م >< قوي > مكونات الوسائط الأساسية التعريفي < / قوي >< / م >
DMEM / F12 مع HEPES	Gibco	11330032	التركيز النهائي 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	التركيز النهائي 1x
N2 الملحق ، 100x	Gibco	17502-048	النهائي تركيز 1x
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 100x	Gibco	11140050	التركيز النهائي 1x
< قوي>مكونات وسائط الحث الكاملة< / قوي >< / em>
مركب E	Calbiochem	565790	التركيز النهائي 0.2 & M وإعادة تشكيل كاشف المخزون إلى 2 ملي مولار في 1: 1 الإيثانول و DMSO
Doxycycline	Sigma	D9891	التركيز النهائي 2 & mu ؛ جم / مل وإعادة تكوين كاشف المخزون إلى 2 مجم / مل في DPBS
الوسيط الأساسي التعريفي< / em>			التركيز النهائي 1x
مثبط ROCK Y27632	فيشر Scientific	BD 562822	التركيز النهائي 10 & مو ؛ M
مكونات وسائط الخلايا العصبية < / strong >< / em >
B-27 Plus نظام الثقافة العصبية	Gibco	A3653401	التركيز النهائي 1x للوسائط والتعليق
GlutaMAX	Gibco	35050061	التركيز النهائي 1x
N2 الملحق ، 100x	Gibco	17502-048	التركيز النهائي 1x
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 100x	Gibco	11140050	التركيز النهائي 1x
< خطوط >iPSC القوية المستخدمة في هذه الدراسة < / strong>
KOLF2.1J: استنساخ WT B03	مختبرات
WTC11 hNIL	المعهد الوطني للصحة
< قوي > كواشف عزل المشبك < / قوي>
مجموعة فحص البروتين BCA	الحرارية العلمية بيرس	23227
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	سيجما	D2650
Syn-PER كاشف استخراج البروتين المشبكي	الحراري العلمي	87793	يشار إليه باسم كاشف تحلل الخلية لعزل المشابك
العصبي <أصباغ >فحص البلعمة القوية < / قوية>
كاشف NucBlue Live Ready	Invitrogen	R37605
pHrodo أحمر, إستر السكسينيميديل	ThermoFisher العلمي	P36600	يشار إليها إلى صبغة حساسة للأس الهيدروجيني
<قوية > كواشف زراعة الخلايا الأخرى < / قوية >
تريبان بلو ، محلول 0.4٪	AMRESCO INC	K940-100ML
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	سيجما	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	إعادة التكوين إلى 40 ملي مولار في ماء معقم
Cytochalasin D	Sigma		التركيز النهائي 10 & ميكرو; M
DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم	Corning	21-030-CV
DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم	Corning	21-031-CV	المشار إليها باسم DPBS
KnockOut ؛ DMEM / F-12	Gibco	12660012	يشار إليه باسم DMEM-F12 الأمثل لنمو الخلايا الجذعية البشرية الجنينية والمستحثة
بروتين الفأر اللامينين ، 23017015 جيبكو الطبيعي			يشار إليه باسم اللامينين
<قوي> البرامج والمعدات < / قوي >
طرد	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 تصوير الخلايا الحية قارئ	Biotek
Gen5 Microplate Reader و Imager Software	Biotek	الإصدار 3.03
Multi-Therm Heat-Shake	Benchmark		يشير إلى شاكر الأنبوب
سونيكاتير الصوت المائي		Elma Mode Transsonic 310

1 كواشف تفكك Corning اللغوية جاكسون متعددة القدرات جهاز مركزي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).
Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098(2013).
Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).
Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).
Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).
Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).
Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).
Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة في الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشبك البشري

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة