Method Article

الكشف البسيط والسريع القائم على تضخيم الدائرة لنشاط توبويزوميراز 1 في العينات البيولوجية الخام

DOI:

10.3791/64484

⸱

December 2nd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 2Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 3VPCIR Biosciences ApS, 4Department of Pathology, Aarhus University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف بروتوكول للكشف الحساس والكمي عن نشاط توبويزوميراز 1 باستخدام مقايسة الكشف عن نشاط الإنزيم المعزز بالدائرة المتدحرجة. تسمح الطريقة بالكشف عن نشاط توبويزوميراز 1 من المكونات المنقاة أو مستخلصات الخلايا / الأنسجة. يحتوي هذا البروتوكول على تطبيقات واسعة النطاق في أي مجال يتضمن الكشف عن النشاط الأنزيمي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام التقنيات القائمة على التضخيم متساوي الحرارة مثل تضخيم الدائرة المتدحرجة بنجاح للكشف عن الأحماض النووية أو كميات البروتين أو الجزيئات الأخرى ذات الصلة. وقد أظهرت هذه الطرق أنها بدائل كبيرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو ELISA للتطبيقات السريرية والبحثية. علاوة على ذلك ، فإن الكشف عن كمية البروتين (عن طريق اللطخة الغربية أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية) غالبا ما يكون غير كاف لتوفير معلومات لتشخيص السرطان ، في حين أن قياس نشاط الإنزيم يمثل علامة حيوية قيمة. يسمح قياس نشاط الإنزيم أيضا بالتشخيص والعلاج المحتمل للأمراض التي تنقلها مسببات الأمراض. في جميع حقيقيات النوى ، تعد topoisomerases هي الإنزيمات الرئيسية المرتبطة بالحمض النووي المشاركة في التحكم في الحالة الطوبولوجية للحمض النووي أثناء العمليات الخلوية المهمة وهي من بين المؤشرات الحيوية المهمة لتشخيص السرطان وعلاجه.

على مر السنين ، تم التحقيق في topoisomerases بشكل كبير كهدف محتمل للأدوية المضادة للطفيليات والمضادة للسرطان مع مكتبات من المركبات الطبيعية والاصطناعية ذات الجزيئات الصغيرة التي يتم التحقيق فيها كل عام. هنا ، يتم تقديم طريقة تضخيم الدائرة المتدحرجة ، والتي تسمى فحص الكشف عن نشاط الإنزيم المعزز بالدائرة المتدحرجة (REEAD) والتي تسمح بالقياس الكمي لنشاط توبويزوميراز 1 (TOP1) بطريقة بسيطة وسريعة وخالية من الهلام. من خلال شق وربط ركيزة الحمض النووي المصممة خصيصا ، يقوم TOP1 بتحويل قليل النوكليوتيد DNA إلى دائرة مغلقة ، والتي تصبح نموذجا لتضخيم الدائرة المتدحرجة ، مما ينتج عنه ~ 103 منتجات دائرة درفلة ترادفية متكررة. اعتمادا على دمج النوكليوتيدات أثناء التضخيم ، هناك إمكانية لطرق قراءة مختلفة ، من التألق إلى التلألؤ الكيميائي إلى القياس اللوني. نظرا لأن كل ربط انقسام بوساطة TOP1 يولد دائرة DNA مغلقة واحدة ، فإن الفحص حساس للغاية وكمي بشكل مباشر.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتمي Topoisomerases إلى فئة الإنزيمات المعدلة للحمض النووي وقد أثبت العديد منها فائدتها كمؤشرات حيوية للأمراض البشرية1،2،3،4،5،6. يشارك TOP1 في حل الإجهاد الطوبولوجي المرتبط بالعمليات الخلوية مثل تكرار الحمض النووي ، والنسخ الجيني ، وإعادة التركيب ، وفصل الكروموسومات7. يمكن ل TOP1 حل كل من الملفات الفائقة السلبية والإيجابية من خلال آلية تتضمن تكوين كسر عابر أحادي الشريط في الحمض النووي 8,9. بعد الارتباط بالحمض النووي ، يضع TOP1 التيروزين النشط (Tyr723) لأداء هجوم نووي على العمود الفقري للفوسفوديستر. ثم يتم إنشاء مركب انشقاق TOP1-DNA مع الإنزيم المرتبط تساهميا بالطرف 3 'من شريط الحمض النووي المكسور. هذا يطلق الإجهاد الالتوائي من خلال السماح للطرف 5 'من الشريط المشقوق بالدوران حول الخيط السليم. أخيرا ، تقوم مجموعة الهيدروكسيل من الطرف 5 بهجوم نووي على رابطة 3'-phosphotyrosyl. نتيجة لذلك ، يتم إطلاق TOP1 ، ويتم استعادة العمود الفقري للحمض النووي8.

تم تطوير العديد من المقايسات للتحقيق في خطوات الدورة التحفيزية TOP1 ، بما في ذلك مقايسة الاسترخاء10 ، ومقايسة إزاحة الحركة الكهربائية (EMSA) 11،12 ، ومقايسات ربط انقسام انتحار الحمض النووي 13،14 ، ومقايسة مجمع الإنزيمات في الجسم الحي (ICE) 15 . ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات لها العديد من القيود لأنها تعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي ، والذي يتطلب عوامل إقحام الحمض النووي ، أو أنها تتطلب تدريبا ومعدات عالية التخصص. علاوة على ذلك ، تتطلب المقايسات كميات كبيرة من إنزيم TOP1 المنقى (تتراوح من 1 إلى 5 نانوغرام لمقايسة الاسترخاء و 50 إلى 200 نانوغرام ل EMSA ومقايسة ربط الانقسام) أو مقتطفات من 106 خلايا على الأقل لأداء الأداء الأمثل. لذلك ، تم تطوير طريقة حساسة للغاية تمكن من الكشف المحدد عن نشاط TOP1 في العينات البيولوجية الخام وعلى مستوى الحدث الحفاز الفردي ، تسمى مقايسة REEAD ،16.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول للكشف عن نشاط TOP1 باستخدام اختبار REEAD16 . يصور الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا للمقايسة. يتم توصيل شبكة سيليكون مصممة خصيصا بشريحة وظيفية لإنشاء إعداد متعدد الآبار بشريحة زجاجية ، يسمى صانع الآبار في ما يلي (الشكل 1 أ). ويتبع ذلك اقتران برايمر معدل 5'-amino بمجموعات NHS الوظيفية في آبار الشريحة (الشكل 1B). يحول تفاعل الانقسام والربط بوساطة TOP1 ركيزة معينة من الحمض النووي إلى دائرة مغلقة. تطوى الركيزة الخاصة ب TOP1 (الشكل 1C) تلقائيا إلى شكل دمبل يحتوي على ساق مزدوج تقطعت به السبل وحلقتان مفردتان تقطعت بهما. إحدى الحلقات مكملة للبرايمر المثبت على السطح. تحتوي المنطقة الجذعية على موقع انقسام TOP1 المفضل بثلاث قواعد في اتجاه المنبع من الطرف 3 'و 5'-هيدروكسيل متدلي. يمكن تحقيق تعميم الركيزة باستخدام إما مستخلص الخلية / الأنسجة (الشكل 1C) أو TOP1 المؤتلف المنقى (الشكل 1D).

عندما يتم شق الركيزة بواسطة TOP1 ، يصبح الإنزيم مرتبطا بشكل عابر بالطرف 3 'وينتشر الجزء ثلاثي القواعد ، مما يسمح للبروز 5'-overpl بالالتك إلى الركيزة وتسهيل الربط بوساطة TOP1. ينتج عن الربط تعميم الركيزة وبالتالي تفكك TOP1. يتم تهجين الدائرة المغلقة إلى التمهيدي المثبت على السطح (الشكل 1E) وتستخدم كقالب لتضخيم دائرة الدرفلة متساوية الحرارة (RCA) بوساطة بوليميراز phi29 ، والذي يمكنه أداء RCA مع إزاحة الشريط ، مما ينتج عنه 103 منتجات تكرار ترادفي. خلال خطوة RCA ، يمكن دمج النيوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية (الشكل 1F) أو النيوكليوتيدات المقترنة بالبيوتين (الشكل 1G)17. يسمح دمج النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت بالكشف عن RCPs إما باستخدام مجهر مضان أو ماسح ضوئي مضان. بدلا من ذلك ، يمكن للجسم المضاد المضاد للبيوتين المقترن ببيروكسيديز الفجل (HRP) (الشكل 1H) ربط النيوكليوتيدات البيوتينيلية ، مما يسمح باكتشاف منتجات الدائرة المدرفلة (RCPs) باستخدام إما التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) أو عن طريق تحويل 3،3 '، 5،5'-رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) إلى لون يمكن اكتشافه. يتبع RCA حركية تفاعل خطي ، مما يجعل مقايسة REEAD كمية مباشرة ، حيث يمثل RCP واحدا تفاعل ربط انشقاق واحد بوساطة TOP1. هنا يظهر أنه يمكن استخدام هذا الفحص للكشف عن نشاط TOP1 كإنزيم مؤتلف منقى أو مستخرج من عينات خام وكأداة فحص للأدوية المضادة ل TOP1.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: ابحث عن قائمة بالتركيبات العازلة والمعدات والمواد الأخرى المطلوبة في جدول المواد.

1. ثقافة الخلية

  1. قم بزراعة الخلايا المفضلة في وسط مناسب وقم بزراعتها وفقا للتعليمات. على سبيل المثال ، قم بزراعة Caco2 ، الخلايا المشتقة من سرطان القولون والمستقيم الغدي ، في الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) المكمل ب 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 مجم / مل ستربتومايسين. الحفاظ على مزارع الخلايا في حاضنة مرطبة (5٪ CO2/95٪ جو هواء عند 37 درجة مئوية). قم بتقطيع الخلايا إلى قوارير زراعة الأنسجة وتقسيمها كل 3 أيام للحفاظ على التقاء الخلايا بنسبة 70٪.
  2. احصد الخلايا من قارورة متقاربة بنسبة 70٪ عن طريق معالجة التربسين (0.25٪ تربسين ، 0.02٪ محلول EDTA) واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS لضبط تركيز الخلية على 0.5 × 106 خلايا / أنبوب. تدور في 200 × غرام لمدة 5 دقائق وتستنشق بعناية الطاف .
    ملاحظة: يجب استخدام الخلايا المستخدمة في REEAD طازجة وحفظها على الثلج. تم نشر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خلايا Caco2 مؤخرا17. تم اختبار الفحص مع مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا ، بما في ذلك الخلايا المشتقة من سرطان القولون والثدي والرئة وعنق الرحم18،19،20،21،22،23 ، ولكن يمكن استخدامه مع جميع العينات البيولوجية الخام التي تحتوي على TOP1 ، مثل الأنسجة والدم واللعاب.

2. إعداد الشرائح الوظيفية

  1. قم بتوصيل شبكة عازل السيليكون المصممة خصيصا بالشريحة الوظيفية ، مما يجعل صانع الآبار. اضغط على السيليكون لتجنب تكوين فقاعات الهواء (انظر الشكل 1 أ).
  2. تحضير مزيج من 5 ميكرومتر 5'-الأمينية التمهيدي في 1x المخزن المؤقت للطباعة. أضف 4 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر وضع الويلامكر في غرفة تهجين مع كلوريد الصوديوم المشبع في درجات حرارة تتراوح بين 15 درجة مئوية و 25 درجة مئوية ، محمية من الضوء.
    ملاحظة: يمكن بسهولة عمل غرفة التهجين باستخدام صندوق طرف ماصة مملوء بكلوريد الصوديوم المشبع. يستغرق التهجين 16 ساعة كحد أدنى و 72 ساعة كحد أقصى. انظر تسلسل التمهيدي 5'-amino في الشكل 1B. يتم تشغيل الشرائح مع مجموعات NHS للسماح بربط oligonucleotides المعدلة الأمينية.

3. توليد ركائز دائرية مغلقة

  1. تحضير ركائز دائرية مغلقة مع TOP1 المؤتلف أو مستخلص الخلية.
    1. قم بتحليل حبيبات خلية من 0.5 × 106 خلايا في 500 ميكرولتر من Lysis Buffer للوصول إلى كثافة خلية تبلغ 1000 خلية / ميكرولتر. احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد.
    2. تحضير خليط دائرة من 2 ميكرولتر من 5 ميكرومتر TOP1 الركيزة الخاصة (تسلسل الركيزة على النحو التالي: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') و 2 ميكرولتر من إنزيم TOP1 المؤتلف أو 2 ميكرولتر من مستخلص الخلايا (انظر الخطوة 3.1.1) في 16 ميكرولتر من 1x TOP1 رد فعل المخزن المؤقت.
      ملاحظة: يعتمد تركيز TOP1 المؤتلف المستخدم على طريقة القراءة المختارة (انظر الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5). انظر تسلسل الركيزة الخاصة ب TOP1 في الشكل 1C.
    3. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (انظر الشكل 1C ، D).
    4. أوقف التفاعل بإضافة 2 ميكرولتر من 1٪ SDS.
  2. إعداد ركائز دائرية مغلقة في وجود المخدرات
    1. قم بإعداد خليط دائري من 2 ميكرولتر من الركيزة الخاصة ب 5 ميكرومتر TOP1 و 1 ميكرولتر من 100٪ DMSO أو 1 ميكرولتر من 1.6 mM camptothecin (CPT) في 14 ميكرولتر من 1x TOP1 Reaction Buffer. أضف 2 ميكرولتر من إنزيم TOP1 المؤتلف 5 نانوغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: يمكن استخدام مركبات أو أدوية جزيئية صغيرة أخرى. في هذه الحالة، يجب إجراء معايرة للمركب. إذا تم إذابة المركب في مذيب آخر غير DMSO ، فيجب استخدام هذا كعنصر تحكم بدلا من DMSO.
    2. احتضان لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. أوقف التفاعل بإضافة 2 ميكرولتر من 1٪ SDS.

ملاحظة: يمكن بدء الخطوة 3 بالتوازي مع الخطوة 2 ، ويمكن تخزين الدوائر عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بدلا من ذلك ، يمكن تحضير دوائر الحمض النووي في نفس وقت الخطوة 4 واستخدامها على الفور. انظر تسلسل الركيزة الخاصة ب TOP1 في الشكل 1C. تطوى الركيزة إلى شكل دمبل مع منطقة جذعية مزدوجة تحتوي على موقع انقسام TOP1 مفضل وحلقتين مفردتين تقطعت بهما. يتم تحويل ركيزة الدمبل المفتوحة إلى ركيزة دائرية مغلقة عن طريق الانقسام والربط بوساطة TOP1 ويشار إليها فيما بعد باسم الدائرة. نظرا لوجود فائض من التمهيدي الأميني 5'، فلن تكون هناك منافسة بين الركائز المفتوحة والمغلقة الخاصة ب TOP1.

4. سد صانع البئر

  1. اغمر صانع البئر في صينية مقاس 5 سم × 5 سم مملوءة بالمخزن المؤقت 1 الذي تم تسخينه مسبقا إلى 50 درجة مئوية. باستخدام ماصة ، ادفع السائل داخل الآبار للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة Buffer 1 واغسل 2 × 1 دقيقة باستخدام dH2O. رج العبوة بقوة باليد.
  3. أضف المخزن المؤقت 2 الذي تم تسخينه مسبقا إلى 50 درجة مئوية. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الآبار. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
  4. اغسل 2 × 1 دقيقة باستخدام dH2O. رج العبوة بقوة باليد.
  5. يغسل ب 70٪ EtOH لمدة 1 دقيقة. يهز بقوة باليد.
  6. دع إعداد صانع البئر يجف في الهواء.
    ملاحظة: استخدم الهواء المضغوط لتجفيف الآبار. بدلا من ذلك ، من الممكن نفخ الهواء باستخدام ماصة باستور. تأكد من جفاف الآبار قبل المتابعة.

5. تهجين الدوائر إلى صانع البئر

  1. أضف 4 ميكرولتر من الدوائر (المصنوعة في الخطوة 3) إلى كل بئر مقابل.
  2. ضع صانع البئر في غرفة رطوبة لمدة 1 ساعة مع dH2O عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن عمل غرفة رطوبة باستخدام صندوق لأطراف الماصة مملوء ب dH2O. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التهجين طوال الليل عند 25 درجة مئوية في غرفة الرطوبة.

6. الغسيل

  1. اغسل صانع البئر باستخدام Buffer 3.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت 3 واستبدله بالمخزن المؤقت 4.
  3. قم بإزالة المخزن المؤقت 4 واغسله بنسبة 70٪ EtOH.
  4. قم بإزالة EtOH واترك صانع البئر يجف.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الغسيل لمدة 1 دقيقة في صينية 5 سم × 5 سم عن طريق غمر الشريحة بالكامل. تأكد دائما من عدم وجود فقاعات هواء داخل الآبار.

7. تضخيم دائرة المتداول

  1. قم بإعداد خليط RCA من 1x Phi29 Reaction Buffer المكمل ب 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر BSA ، وحدة واحدة من بوليميراز Phi29 ، وإما 0.25 mM dNTP و 0.0125 mM ATTO-488-dUTP لقراءات مضان ، أو 0.1 mM dATP ، 0.1 mM DTTP ، 0.1 mM dGTP ، 0.09 mM dCTP ، و 0.01 mM Biotin-dCTP لقراءات التلألؤ اللوني / الكيميائي. أضف 4 ميكرولتر إلى كل بئر. انظر الشكل 1E.
    ملاحظة: يجب أن يتم تحضير خليط RCA على الثلج. عند دمج النيوكليوتيدات الفلورية في RCA ، تجنب الضوء المباشر من هذه الخطوة لحماية الفلوروفور.
  2. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة. في حالة النيوكليوتيدات الفلورية المستخدمة ، اضبط غرفة الرطوبة في الظلام. انظر الشكل 1F ، G.

8. الغسيل

  1. بالنسبة لبروتوكولات التلألؤ الكيميائي أو القراءة اللونية ، اغسل صانع البئر كما في الخطوة 6 ، ثم انتقل إلى الخطوة 11.
  2. بالنسبة لبروتوكول قراءة التألق ، قم بإزالة شبكة السيليكون باستخدام ملاقط قبل الغسيل كما في الخطوات التالية.
    1. اغسل الشريحة لمدة 10 دقائق في المخزن المؤقت 3.
    2. قم بإزالة المخزن المؤقت 3 واستبدله بالمخزن المؤقت 4. يغسل لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإزالة Buffer 4 واغسله لمدة 1 دقيقة في 70٪ EtOH.
    4. قم بإزالة EtOH واترك صانع البئر يجف.

9. تصور منتجات دائرة المتداول الفلورسنت باستخدام الماسح الضوئي مضان

  1. امسح الشريحة ضوئيا في ماسح ضوئي مضان باستخدام المرشحات المقابلة للفلوروفور المستخدم. استخدم أقصى مضاعف ضوئي ممكن لا يعطي التشبع.
    ملاحظة: الماسح الضوئي الفلوري المستخدم للحصول على الصور في هذا البروتوكول مجهز بليزر 473 نانومتر وإثارة مرشح FAM 490 نانومتر ، انبعاث 520 نانومتر.
  2. استيراد الصورة إلى ImageJ وتغيير نوع الصورة إلى 8 بت (صورة | النوع | 8 بت). لقياس النطاقات بشكل منفصل، قم بالحد من المساحة المقاسة باستخدام أداة رسم المستطيل من شريط الأدوات. ارسم المنطقة المطلوبة وقم بقياس الشدة (تحليل | التدبير). بعد ذلك ، انقل المنطقة المرسومة أصلا إلى النطاق التالي وقم بالقياس.
  3. ارسم البيانات في البرنامج المطلوب. الصور التمثيلية بما في ذلك القياس الكمي المستخرج من ImageJ موضحة في الشكل 2.

10. تصور منتجات دائرة الدرفلة الفلورية باستخدام مجهر مضان

  1. باستخدام قلم مقاوم ل EtOH ، ارسم موضع الآبار قبل إزالة شبكة السيليكون واغسل الشريحة كما في الخطوة 8.2. بعد خطوات الغسيل ، قم بتركيب الشريحة باستخدام 1 ميكرولتر من وسط التركيب بدون 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) وأضف غطاء زجاجي. للسماح بالتصور في الكاميرا ، قم بلصق الشريحة على شريحة مجهر 76 مم × 26 مم.
  2. قم بالتحليل باستخدام مجهر مضان مجهز بهدف غمر الزيت 60x وكاميرا. التقط 12-15 صورة لكل عينة / بئر.
  3. استيراد الصور إلى ImageJ وتكديس الصور (صورة | أكوام | صورة للمكدس). تغيير نوع الصورة إلى 8 بت (صورة | النوع | 8 بت).
  4. تعيين الحد الأدنى (صورة | ضبط | العتبة).
    1. اضبط العتبة على النحو التالي: اضبط الشريط السفلي واضبط الشريط العلوي بحيث تكون الإشارات الصحيحة فقط حمراء والخلفية سوداء. تأكد من أن العتبة منخفضة قدر الإمكان قبل أن تبدأ الإشارات الحقيقية في الاختفاء.
    2. قم بمسح الصور الفردية وتأكد من أنها تتوافق مع الصور قبل تعيين العتبة. لاحظ أن الحد الأدنى قد يتغير من تجربة إلى أخرى.
  5. عد الإشارات (تحليل | تحليل الجزيئات). تأكد من تحديد الحقل الملخص في إعدادات ImageJ.
    1. قم بتصدير النتائج إلى جدول بيانات أو برنامج آخر لمزيد من معالجة البيانات. الصور التمثيلية بما في ذلك القياس الكمي المستخرج من ImageJ موضحة في الشكل 3.

11. اقتران الجسم المضاد المضاد للبيوتين المقترن HRP بمنتجات دائرة الدرفلة التي تحمل علامة البيوتين

  1. أضف 4 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد للبيوتين المقترن HRP المخفف 1: 300 في Buffer 5 المكمل ب 5٪ حليب منزوع الدسم خالي الدسم و 5٪ BSA لكل بئر.
  2. احتضن لمدة 50 دقيقة عند 15-25 درجة مئوية في غرفة الرطوبة (انظر الشكل 1H).
  3. اغسل 3 × 3 دقائق باستخدام Buffer 5.
  4. تجفيف صانع البئر.

12. تصور منتجات دائرة المتداول المسمى البيوتين

  1. التصور مع ECL
    1. امزج 40 ميكرولتر من ECL Luminol و 40 ميكرولتر من H 2 O2 مباشرة قبل الاستخدام. أضف 2 ميكرولتر إلى كل بئر.
    2. تصور الشريحة باستخدام كاميرا CCD أو على أفلام الأشعة السينية.
  2. التصور مع TMB
    1. بعد الخطوة 11.4 ، قم بإزالة شبكة السيليكون. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من TMB أعلى الشريحة بأكملها وضع الشريحة في غرفة الرطوبة. انتظر ~ 5-10 دقيقة لتطوير اللون. بعد تطوير اللون ، اغسل الشريحة بنسبة 70٪ EtOH.
    2. تصور تطور اللون بالعين المجردة. التقط صورة للشريحة باستخدام كاميرا صور أو هاتف محمول.
  3. استيراد الصورة إلى ImageJ وتغيير نوع الصورة إلى 8 بت (صورة | النوع | 8 بت). لقياس النطاقات بشكل منفصل، قم بالحد من المساحة المقاسة باستخدام أداة رسم المستطيل من شريط الأدوات. ارسم المنطقة المطلوبة وقم بقياس الشدة (تحليل | التدبير). بعد ذلك ، انقل المنطقة المرسومة أصلا إلى النطاق التالي وقم بالقياس.
  4. ارسم البيانات في البرنامج المطلوب. الصور التمثيلية بما في ذلك القياس الكمي المستخرج من ImageJ موضحة في الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم بروتوكول للكشف عن نشاط TOP1 باستخدام مقايسة REEAD16. تم استخدام البروتوكول للكشف عن نشاط TOP1 المؤتلف باستخدام أربع طرق قراءة مختلفة: الماسح الضوئي الفلوري ، مجهر التألق ، التلألؤ الكيميائي ، والقياس اللوني. تم استخدام البروتوكول أيضا للكشف عن نشاط TOP1 المستخرج من خلايا Caco2 ، كمثال على المستخلص الخام ، مع التلألؤ الكيميائي أو قراءات TMB. علاوة على ذلك ، تم استخدام البروتوكول كأداة لفحص الأدوية ، للكشف عن تثبيط نشاط TOP1 المؤتلف بواسطة CPT ، كمثال على مثبط خاص ب TOP1 ، باستخدام طريقة قراءة التلألؤ الكيميائي.

النتائج التي تم الحصول عليها عند تحليل نشاط TOP1 باستخدام قراءات مضان موضحة في الشكل 2 والشكل 3. يوضح الشكل 2 مسحا تمثيليا للشريحة الفلورية والقياس الكمي الناتج. كما يتضح من القياس الكمي ، فإن هذه القراءة لها حد كشف يبلغ 12.5 نانوغرام من TOP1. يتم عرض الصور التمثيلية والقياس الكمي الناتج الذي تم الحصول عليه عند استخدام قراءات المجهر الفلوري في الشكل 3. باستخدام طريقة القراءة هذه ، يكون حد الكشف أقل من 0.1 نانوغرام من TOP1. النتائج التي تم الحصول عليها عند تحليل نشاط TOP1 باستخدام قراءة التلألؤ الكيميائي موضحة في الشكل 4 ، والنتائج من القراءات اللونية موضحة في الشكل 5. حد الكشف عن طرق القراءة هذه هو 6 نانوغرام من TOP1 أو TOP1 المستخرج من 312 خلية Caco2. يوضح الشكل 6 قياسات نشاط TOP1 في وجود 80 ميكرومتر CPT أو DMSO كمثال على تطبيق فحص المخدرات. تظهر الصورة التمثيلية والقياس الكمي الناتج لثلاث تجارب مستقلة أن CPT يمنع الدوران بوساطة TOP1 للركيزة كما هو متوقع24,25.

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لبروتوكول REEAD . (أ ، ب) إعداد الشرائح الوظيفية. يتم توصيل شبكة السيليكون بالشريحة الوظيفية. بعد ذلك ، يقترن التمهيدي 5'-amino بالشريحة ، مما يتيح تضخيم الركيزة الخاصة ب TOP1. (ج، د) توليد ركائز دائرية مغلقة. تطوى الركيزة الخاصة ب TOP1 إلى شكل دمبل مع موقع انقسام TOP1 مفضل في الجذع المزدوج الذي تقطعت به السبل وتسلسل ربط التمهيدي في إحدى الحلقتين المفردتين اللتين تقطعت بهما. (ج) يتحرر TOP1 عند تحلل الخلايا. عند الانقسام والربط بوساطة TOP1 ، يتم تحويل الركيزة إلى دائرة مغلقة ؛ (د) يتم استخدام TOP1 المنقى المؤتلف. ه: تضخيم الدائرة المتدحرجة. يتم تهجين الركائز الدائرية المغلقة إلى التمهيدي المثبت على السطح وتضخيمها بواسطة RCA باستخدام Phi29 polymerase. يمكن تحقيق RCA إما عن طريق دمج النيوكليوتيدات الفلورية كما في F أو النيوكليوتيدات الحيوية كما في G. يتم تصور منتجات دائرة الدرفلة الفلورية باستخدام مجهر مضان أو ماسح ضوئي مضان. (ح) اقتران الجسم المضاد المضاد للبيوتين المقترن ب HRP. يتم تحضين منتجات دائرة الدرفلة البيوتينيلية بالجسم المضاد المضاد للبيوتين المقترن ب HRP. يتم التوسط في تطوير الإشارة بواسطة إنزيم HRP ، ويتم تصور الإشارات إما عن طريق ECL واكتشافها باستخدام كاميرا CCD أو باستخدام TMB لتوليد تصور ملون. الاختصارات: REEAD = الكشف عن نشاط الإنزيم المعزز بالدائرة المتدحرجة ؛ RCA = تضخيم الدائرة المتدحرجة ؛ TOP1 = توبويزوميراز 1 ؛ HRP = بيروكسيديز الفجل ؛ ECL = التلألؤ الكيميائي المعزز ؛ TMB = 3،3'،5،5'-رباعي ميثيل بنزيدين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: قياسات نشاط TOP1 باستخدام الماسح الضوئي الفلوري. تعرض اللوحة اليسرى صورة تمثيلية للشريحة عند تحليل نشاط 3-50 نانوغرام من TOP1 باستخدام بروتوكول قراءة الماسح الضوئي الفلوري. تظهر اللوحة اليمنى القياس الكمي الناتج. اختبار t مع تصحيح ويلش ، p = 0.0064 ، n = 4. اختصار: TOP1 = توبويزوميراز 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: قياسات نشاط TOP1 باستخدام المجهر الفلوري. تعرض اللوحة اليسرى صورا تمثيلية للشريحة عند تحليل نشاط 0.1-12.5 نانوغرام من TOP1 باستخدام بروتوكول قراءة مجهر التألق. لاحظ أن الصور عبارة عن إصدارات تم اقتصاصها لإظهار النقاط بشكل صحيح. لهذا السبب ، فهي لا تشبه عدد الإشارات في القياس الكمي الموضح في اللوحة اليمنى. اختبار t مع تصحيح ويلش ، p = 0.0136 ، n = 3. اختصار: TOP1 = توبويزوميراز 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: قياسات نشاط TOP1 باستخدام قراءات التلألؤ الكيميائي. (أ) تعرض اللوحة اليسرى صورة تمثيلية للشريحة عند تحليل نشاط 3-50 نانوغرام من TOP1 باستخدام بروتوكول قراءة التلألؤ الكيميائي. تظهر اللوحة اليمنى القياس الكمي الناتج. اختبار t مع تصحيح ويلش ، p < 0.0001 ، n = 4. (B) تعرض اللوحة اليسرى صورة تمثيلية للشريحة عند تحليل نشاط TOP1 المستخرج من 156-40000 خلية Caco2 باستخدام بروتوكول قراءة التلألؤ الكيميائي. تظهر اللوحة اليمنى القياس الكمي الناتج. اختبار t مع تصحيح ويلش ، p = 0.0224 ، n = 3. الاختصارات: TOP1 = توبويزوميراز 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: قياسات نشاط TOP1 باستخدام القراءات اللونية. (A) تعرض اللوحة اليسرى صورة تمثيلية للشريحة عند تحليل 3-50 نانوغرام من TOP1 باستخدام بروتوكول القراءة اللونية. تظهر اللوحة اليمنى القياس الكمي الناتج. اختبار t مع تصحيح ويلش ، p = 0.0012 ، n = 4. (B) تعرض اللوحة اليسرى صورة تمثيلية للشريحة عند تحليل نشاط TOP1 المستخرج من 156-40000 خلية Caco2 باستخدام بروتوكول القراءة اللونية. تظهر اللوحة اليمنى القياس الكمي الناتج. اختبار t مع تصحيح ويلش ، p = 0.0117 ، n = 3. الاختصارات: TOP1 = توبويزوميراز 1 ؛ TMB = 3،3'،5،5'-رباعي ميثيل بنزيدين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: قياسات نشاط TOP1 بعد العلاج بالعقاقير باستخدام بروتوكولات قراءة التلألؤ الكيميائي. تعرض اللوحة اليسرى صورة تمثيلية للشريحة عند تحليل 10 نانوغرام من TOP1 في وجود 5٪ DMSO أو 80 ميكرومتر CPT لمدة دقيقة واحدة. تظهر اللوحة اليمنى القياس الكمي الناتج. اختبار t مع تصحيح ويلش ، p = 0.0017 ، n = 3. الاختصارات: TOP1 = توبويزوميراز 1 ؛ CPT = كامبتوثيسين. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ Neg = السيطرة السلبية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل Topoisomerases فئة من الإنزيمات المعدلة للحمض النووي التي تجذب اهتماما بحثيا وسريريا عاليا ، كونها هدفا لمركبات الجزيئات الصغيرة ذات التأثير المحتمل في العلاج المضاد للسرطان أو في مكافحة الأمراض المعدية. علاوة على ذلك ، أثبت نشاط TOP1 البشري أنه علامة حيوية فعالة لتشخيص السرطان وعلاجه18،19،23. على الرغم من أن نشاط TOP1 هو الذي يؤثر على فعالية مثبط العلاج الكيميائي26 ، إلا أنه غالبا ما يتم تقييم كمية DNA-RNA أو كمية TOP1 في الإعدادات السريرية. ويرجع ذلك إلى عدم وجود أدوات مجانية سريعة وسهلة وقائمة على الهلام يمكن أن توفر قياسا دقيقا ودقيقا لنشاط توبويزوميراز في كل إعدادات المختبر.

هنا ، يتم وصف بروتوكول لمقايسة REEAD يسمح بقياس نشاط TOP1 بطريقة خالية من الهلام. في هذا البروتوكول ، يتم تحضين TOP1 المنقى أو المستخلص الخام من الخلايا بركيزة مصممة خصيصا على شكل دمبل DNA والتي ، عند الانقسام / الربط بوساطة TOP1 يتم تحويلها إلى جزيء دائري مغلق. ثم يتم تهجين الدوائر على سطح زجاجي وتضخيمها بواسطة RCA. للسماح بسهولة الاستخدام في أداء التفاعلات التي تحدث على الشريحة ، يتم توصيل شبكة سيليكون بالزجاج ، مما يجعل الآبار الفردية حيث تحدث التفاعلات. بهذه الطريقة ، يستفيد البروتوكول من نظام متعدد الآبار - شبكة سيليكون - تسمى صانع الآبار.

تم استخدام البروتوكول للكشف عن نشاط المؤتلف TOP1 و TOP1 المستخرج من خلايا سرطان القولون والمستقيم الغدية Caco2 ، المستخدمة كمثال. علاوة على ذلك ، كمثال على REEAD لاستخدامه كأداة لفحص الأدوية ، تم استخدام البروتوكول للكشف عن تثبيط نشاط TOP1 بواسطة مثبط TOP1 المعروف CPT24,25. اقترن الفحص بطرق قراءة مختلفة - الفحص المجهري الفلوري ، الذي يعطي حساسية عالية ، وماسح ضوئي مضان ، أو تلألؤ كيميائي ، أو قياس لوني ، والتي تتطلب معدات وتدريبا أقل تخصصا. تتميز قراءات المجهر الفلوري شديدة الحساسية بحدود الحاجة إلى إعداد مجهر مضان عالي الجودة ، وموظفين مهرة ، والحصول على الصور وتحليلها بشكل يستغرق وقتا طويلا.

لهذه الأسباب ، يتم تقديم قراءة الماسح الضوئي الفلوري الذي يسمح بالحصول على وتحليل أسرع حتى لو كان ذلك على حساب الحساسية. في حالة عدم وجود ماسح ضوئي مضان ، يمكن النظر في بديلين ممتازين ، التقلؤ الكيميائي وطرق القراءة اللونية. كلتا الطريقتين سريعة وبسيطة ، ولا تتطلب معدات باهظة الثمن أو تدريبا متخصصا. في جميع تنسيقات القراءة ، تتمتع REEAD بالعديد من المزايا مقارنة بالمقايسات الحديثة ، والتي تستغرق وقتا أطول ، وتعتمد على الهلام (مع متطلبات عوامل الإقحام) ، وأقل كمية مباشرة. ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول المقدم. عند التعامل مع فحص الدواء ، يجب تحسين النقاط الزمنية وتركيز الدواء ونسبة كمية TOP1 / ركيزة الحمض النووي مقارنة بالإعدادات الموصوفة المحسنة ل CPT. يمكن التحقيق في الدواء بإجراء حضانة مسبقة مع ركيزة الحمض النووي أو الحضانة المسبقة مع إنزيم TOP1. هذا يمكن أن يعطي معلومات قيمة حول قدرة الجزيء على تثبيط TOP1 وتقديم نظرة ثاقبة لآلية عمل الدواء.

علاوة على ذلك ، إذا كنت تعاني من إشارات منخفضة أو غائبة ، فمن المرجح أن يكون هذا بسبب تحلل غير فعال للعينة الخام أو تدهور TOP1 في المستخلص بسبب الاستخدام غير السليم لمثبطات الأنزيم البروتيني. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون هذا أيضا بسبب عدم كفاية تخزين مكونات الفحص المهمة ، مثل TOP1 المؤتلف ، وبوليميراز phi29 ، والنيوكليوتيدات ، والركيزة ، والتمهيدي. أخيرا ، يجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة لقليل النيوكليوتيدات ، لأن هذا يؤثر بشكل كبير على أداء الفحص. عند استخدام المستخلص الخام ، يجب تحسين كفاءة استخراج العينة البيولوجية المحددة وقد تختلف كمية ونشاط TOP1 عن المثال المذكور هنا. لهذا السبب ، سيتطلب كل مستخلص خام يتم اختباره معايرة لتحديد حد اكتشاف الفحص ونطاق الحساسية عند استخدام تلك العينة المعينة. تم تحسين البروتوكول للكشف عن TOP1 البشري. يمكن قياس نشاط TOP1s حقيقية النواة الأخرى ، ولكن قد يلزم تحسين تركيز كلوريد الصوديوم ووقت الحضانة وفقا لطريقة تنقية الإنزيم ونشاط الإنزيم الأمثل. ستنتج المزيد من الركائز الدائرية عن الحضانة المطولة ، في حين أن عددا أقل من الركائز الدائرية سينتج عن الحضانة القصيرة.

بالإضافة إلى التطبيقات المقدمة ، يسمح REEAD بقياس نشاط TOP1 في المستخلصات الخام من الخزعات الصغيرة من مرضى السرطان18 ، والتنبؤ بالتأثير السام للخلايا المضاد للسرطان ل CPT في خطوط الخلايا السرطانية 20،21،22 ، وحتى الكشف عن نشاط الإنزيم في الخلايا المفردة20,21 . علاوة على ذلك ، فإن إعداد REEAD المقدم باستخدام صانع الآبار يتيح فحص الأدوية متعدد الآبار لمكتبات المركبات الاصطناعية أو الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نسخة معدلة من مقايسة REEAD ، تسمى REEAD C / L. يتيح هذا الإعداد إجراء تحقيقات منفصلة لخطوات الانقسام والربط لتفاعل TOP127. مع REEAD C / L ، من الممكن تحديد آلية عمل مثبطات الجزيئات الصغيرة ووصفها بأنها مثبطات تحفيزية TOP1 مع تأثيرات مضادة للطفيليات محتملة28 أو كسموم TOP1 لاستخدامها في العلاج المضاد للسرطان24،25. وأخيرا، مع إعادة تصميم محددة لركائز الحمض النووي لتتناسب مع المتطلبات المختلفة (لربط الحمض النووي أو ربط الانقسام) لإنزيمات TOP1 الأخرى، تم استخدام REEAD أيضا للكشف عن الأمراض المعدية (كما في حالة المتصورة المنجلية، التي تسبب الملاريا29)، أو فيروس الليشمانيا دونوفاني وجدري القرود (البيانات غير معروضة). أو يمكن استخدامه لتحديد مركبات الجزيئات الصغيرة ذات التأثيرات المضادة للأمراض. يوفر البروتوكول المقدم للعلماء في مجال TOP1 طريقة سهلة للكشف عن نشاط الإنزيم مع القليل من التحسين أو بدونه مع إمكانية التكيف مع تطبيقات أوسع في المستقبل.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفان C.T. و K.M. هم موظفون في VPCIR Biosciences ApS. C.T. ، B.R.K. ، و MS هم مساهمون و / أو حاملو خيارات الأسهم. يعلن CT و B.R.K. و MS أنهم مخترعون لبراءة الاختراع EP2022 / 057172 المودعة باسم VPCIR Biosciences ApS. يعلن المؤلفون الآخرون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا فني المختبر نوريكو ي. هانسن ، قسم البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة ، جامعة آرهوس ، على المساعدة الفنية فيما يتعلق بتنقية إنزيم Phi29 و TOP1.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوية>معدات< / قوية>
كاميرا لتحليل
كاميرالتحليل الصور
الكيميائية المجهر الفلوريأوليمبوسمزود بهدف غمر الزيت 60x ومرشح GFP (https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/)
ماسح ضوئي مضانTyphoonFLA 9500مزود ب 473 ليزر ومرشح FAM
غرفة الرطوبة مع dH 2 < / sub >O
غرفة التهجين مع برنامج NaCl
ImageJفيجيتنزيل على:
https://imagej.net/software/fiji/downloadsMaterials< / strong>
زراعة الخلايا < / em>
نمو الخلية مناسب لخط
المختار TrypsinSigma#T4174
StrepeSigma#P4300
قوارير زراعة الأنسجةThermoFisher# 178983
FBSGibco# 10270106
NEEASigma#M7145
PBSThermoFisher# 10010023
< > الشرائح الوظيفية < / em >
5 '-أمين مضاد ل TOP1 التمهيديسيجما5 '- / 5AmMC6 / CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3 '
تنشيط Codelink HD الشرائحSurModics#DHD1-0023
شبكة السيليكونGrace-biolabsمخصص
Pertex الغراءHistolabs# 00801
شريحة مجهر 76 × 26 ممHounisen# 2510 1201BLاستخدام شريحة مجهر أخرى من نفس البعد
دوائر الحمض النووي وتضخيم دائرة التدحرج < / em>
الركيزة المحددة TOP1Sigma5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3 '
ATTO-488-dUTPجينا بيوساينسز# 95387
البيوتين-dCTPجينا بيوساينسز#NU-809-BIO16L
dNTPThermoFisher#R0181
Phi29 polymeraseVPCIR Biosciences# 10010041
المؤتلف TOP1VPCIR Biosciences# 10010001
الكشف عن دائرة التدحرج المنتجات< / em>
BioFX TMBSurModics#ESPM-0100-01
غطاء زجاجي
خليط ECLCytiva#RPN2236
HRP مترافق الأجسام المضادة للبيوتينMerck #A4541
وسط التركيب (vectachield)مختبرات النواقل#H-1000
<قوي>قائمة العازلة
1x PE عازلة1 ملي مولار EDTA, 8.12 مللي متر Na2HPO4· 2H2O, 1.88 mM NaH2PO4· H2O
6x المخزنللطباعة 300 ملي Na3PO4 ، الرقم الهيدروجيني 8.5
محلولBuffer 5 مكمل ب 5٪ حليب خالي الدسم و 5٪ BSA pH 9
Lysis Buffer10 ملي مولار Tris-HCl pH 7.5 ، 1 ملي EDTA + مثبطات البروتياز
10x TOP1 Reaction Buffer50 ملي مولار CaCl 2< / sub > ، 50 ملي مولار MgCl 2< / sub > ، 100 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.5
10x Phi29 عازلة330 ملي مولار ثلاثي الأسيتات 7.5 ، 100 ملي ملي أسيتات المجم ، 660 ملي كيستات ، 1٪ توين 20 ، 200 ملي مولار DTT
Buffer 150 ملي تريس ، 50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، 32 ملي إيثانولامين. ملحوظة: مخزنة في درجة حرارة 50 درجة مئوية.
المخزن المؤقت 24x SSC ، 0.1٪ SDS. ملحوظة: مخزنة في درجة حرارة 50 درجة مئوية.
العازلة 3100 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.3٪ SDS
Buffer 4100 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ Tween20
Buffer 520 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ Tween20
<قوي>مواد كيميائية للمخازن المؤقتة< / قوي>
تريسسيجما#T1506
حمض الهيدروكلوريكSigma#1.00317.2011
EDTASigma#1.08418.1000
PMSFSigma#05056489001
SDSApplichem#436143
Na2HPO4Sigma#1.06580.1000
NaH2PO4Sigma# 1.06346.1000
إيثانولامينسيجما# 411000
SSCInvitrogen# 15557-036
Tris-acetateSigma#T1258
Mg-acetateSigma#M0631
K-acetateSigma# 1.04820.1000
Tween20Sigma# 8.22184.0500
DTTسيجما#D0632
CaCl 2< / sub>Sigma# 1.02382.1000
MgCl 2< / sub >Sigma#M2670
كلوريد الصوديومسيجما# 1.06404.5000
مسحوق الحليب منزوع الدسمسيجما# 70166
BSAسيجما#A4503
الصور الفلورية CCD المشبع وسط الخلية Pen يمكن المؤقت الحجب التفاعل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).">Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
  2. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).">Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
  3. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).">Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
  4. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).">Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
  5. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).">Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
  6. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).">Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
  7. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).">Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
  8. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).">Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
  9. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).">Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
  10. Topoisomerase assays. Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3(2012).">Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M. Topoisomerase assays. Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3(2012).
  11. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).">Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
  12. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).">Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
  13. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).">Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
  14. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).">Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
  15. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).">Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
  16. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).">Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
  17. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).">Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
  18. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).">Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
  19. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).">Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
  20. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).">Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
  21. Enzymatic activity in single cells. Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).">Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R. Enzymatic activity in single cells. Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).
  22. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240(2020).">Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240(2020).
  23. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).">Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
  24. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).">Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
  25. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).">Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
  26. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398(2019).">Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398(2019).
  27. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255(2021).">Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255(2021).
  28. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).">García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
  29. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).">Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Rolling Circle AmplificationTopoisomerase 1 ActivityEnzyme Activity DetectionIsothermal AmplificationCrude Biological SamplesFluorescence MicroscopyChemiluminescence DetectionDrug Screening AssayDNA CircularizationImage J Analysis

Related Articles