يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظام من الفئران

8.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64566

⸱

يونيو 23, 2023

 ,  ,  , 
1Department of General Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظم من الفئران.

الملخص

للبلاعم الكبيرة وظائف مستجيبة مهمة في الاتزان الداخلي والالتهاب. هذه الخلايا موجودة في كل نسيج في الجسم ولديها القدرة الهامة على تغيير ملفها الشخصي وفقا للمنبهات الموجودة في البيئة المكروية. يمكن أن تؤثر السيتوكينات بشكل عميق على فسيولوجيا البلاعم ، وخاصة IFN-γ و interleukin 4 ، مما يولد أنواع M1 و M2 على التوالي. بسبب تعدد استخدامات هذه الخلايا ، يمكن أن يكون إنتاج مجموعة من الضامة المشتقة من نخاع العظم خطوة أساسية في العديد من النماذج التجريبية لبيولوجيا الخلية. الهدف من هذا البروتوكول هو مساعدة الباحثين في عزل وثقافة البلاعم المشتقة من أسلاف نخاع العظام. يتم تحويل أسلاف نخاع العظم من الفئران C57BL / 6 الخالية من مسببات الأمراض إلى بلاعم عند التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) الذي يتم الحصول عليه في هذا البروتوكول من طاف سلالة الخلايا الليفية للفأرة L-929. بعد الحضانة ، تتوفر البلاعم الناضجة للاستخداممن اليوم 7 إلى اليوم 10. يمكن أن يكون واحد مصدرا لما يقرب من 2 × 107 البلاعم. لذلك ، فهو بروتوكول مثالي للحصول على كميات كبيرة من البلاعم الأولية باستخدام الطرق الأساسية لزراعة الخلايا.

المقدمة

الخلايا الوحيدة والبلاعم هي خلايا بلعمية أحادية النواة يمكن اشتقاقها من السلف الموجود في نخاع العظم. أفادت الدراسات الحديثة أن البلاعم تنشأ أيضا من أسلاف الكريات الحمر النخاعيةالمشتقة من كيس الصفار 1. بغض النظر عن اشتقاقها ، فإن كريات الدم البيضاء هذه لها وظائف مستجيبة مهمة في التوازن والالتهاب 2,3. الخلايا الوحيدة هي خلايا من الدم المحيطي يمكن أن تتمايز بشكل أكبر إلى بلاعم في الأنسجة 2,4 ، في حين أن البلاعم هي خلايا غير متجانسة تظهر أنماطا ظاهرية ووظائف ينظمها التعرض المحلي لعوامل النمو والسيتوكينات5. نظرا لأن البلاعم تظهر مثل هذا التنوع الوظيفي ، فقد تمت دراستها في العديد من نماذج الأمراض. وهكذا ، أصبحت ثقافة البلاعم في المختبر أداة مهمة لفهم فسيولوجيتها ودورها في الأمراض المختلفة. يعد نخاع العظم مصدرا مهما للخلايا السلفية ، بما في ذلك أسلاف البلاعم ، والتي يمكن عزلها ومضاعفتها ، مما يزيد بشكل كبير من عدد البلاعم التي تم الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر البلاعم المشتقة من نخاع العظم مهمة بشكل خاص لتجنب التأثيرات الناتجة عن البيئة المكروية للأنسجة ، لأن البلاعم تغير نمطها الظاهري استجابة للمنبهات المختلفة في الأنسجة 6,7. تتحول أسلاف نخاع العظم إلى بلاعم عند التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF)8. لا يمكن تمييز البلاعم المشتقة من نخاع العظم عن الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة بواسطة علامات كيميائية حيوية في الأنسجة. تمثل هذه الخلايا مجموعة متجانسة للغاية من الخلايا الأولية ، والتي يمكن مقارنتها في كثير من النواحي الأخرى بالبلاعم البريتونية 6,9.

بسبب مجموعة الوظائف الخلوية غير المتجانسة ، تمت دراسة البلاعم بدقة من قبل الباحثين. يمكن استخدام هذه الخلايا في نماذج تجريبية مختلفة ، بما في ذلك الأمراض المعدية والالتهابية ، لأنها تظهر في هذه العمليات 10,11. يمكن أن تكون مفيدة أيضا للتحقيق في استقطاب البلاعم استجابة لمختلف المحفزات البيئية الدقيقة12,13. وبالتالي ، يتم توفير بروتوكول بسيط وموثوق هنا لغرض الحصول على أعداد كبيرة من الضامة الأولية من نخاع عظم الفأر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا للمجلس الوطني لمراقبة التجارب على (Concea) وبموافقة لجنة أخلاقيات واستخدام (CEUA). تم شراء الفئران C57BL / 6 من Biotério Central من جامعة ميناس جيرايس الفيدرالية (UFMG) ، بيلو هوريزونتي ، البرازيل. يجب استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE) مثل معاطف المختبر والقفازات وحماية العين في جميع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الخلايا الليفية L-929 السلالة طافية كمصدر ل M-CSF

  1. تذويب خلايا سلالة الخلايا الليفية L-929 (خط الخلايا المعتمد من مجموعة الثقافة الأمريكية - ATCC CCL1) وابدأ عملية الاستزراع على الفور للحفاظ على الجدوى.
  2. في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي ، باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، قم بنقل خلايا سلالة الخلايا الليفية L-929 من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
  3. استخدم ماصة مصلية لإضافة 50 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، خال من الكالسيوم والمغنيسيوم.
  4. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  5. أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من متوسط النسر المعدل F12 من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (P / S) (DMEM / F12-10) باستخدام ماصة مصلية.
  6. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق زراعة الخلايا T75.
  7. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 حتى التقاء كامل.
    ملاحظة: أثناء معالجة القارورة ، احرص على تجنب ترطيب الغطاء بالمحلول ، حيث يمكن أن يكون ذلك مصدرا للتلوث. للحصول على كمية مناسبة من المادة الطافية ، من الضروري تكرار الخلايا بعد أن تغطي السطح الكامل لقارورة زراعة الخلايا. يتم تثبيط خلايا L-929 عن طريق الاتصال. محلول دافئ من التربسين / حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، DMEM / F12-10 ، و PBS معقم إلى 37 درجة مئوية لبدء توسيع زراعة الخلايا ، كما هو موضح في الخطوات التالية.
  8. بمجرد الوصول إلى الالتقاء الكامل ، تخلص من المادة الطافية من دورق زراعة الخلايا ، داخل خزانة السلامة الحيوية للتدفق الصفحي.
  9. اغسل قارورة زراعة الخلايا ب 20 مل من برنامج تلفزيوني معقم باستخدام ماصة مصلية وتجاهل المحلول.
  10. أضف 10 مل من التربسين / EDTA (محلول 0.05٪) إلى دورق زراعة الخلايا الذي يحتوي على الخلايا الملتصقة.
  11. نقل قارورة زراعة الخلايا من التدفق الصفحي إلى حاضنة CO2 37 درجة مئوية ، 5٪ واحتضانها لمدة 3 دقائق.
  12. هز دورق زراعة الخلايا لفصل الخلايا عن سطح دورق المزرعة واستخدم مجهرا للتأكد من أن جميع الخلايا قد تم فصلها.
  13. قم بتعطيل التربسين / EDTA (محلول 0.05٪) مع 10 مل من وسط DMEM / F12-10.
  14. انقل المحلول باستخدام ماصة مصلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
  15. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  16. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط DMEM / F12-10.
  17. أضف 1 مل من معلق الخلية إلى دورق زراعة الخلايا T175 (1:10 مزرعة).
  18. كرر الإجراء للحصول على عشر قوارير زراعة الخلايا T175.
  19. أضف 50 مل من DMEM / F12-10 إلى كل قارورة زراعة خلية.
  20. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 حتى التقاء كامل.
    ملاحظة: تضمن هذه الخطوات 500 مل من طافي الخلية L-929. في اليوم 5 ، بعد أن تغطي الخلايا سطح قارورة زراعة الخلايا T175 ، سيتم إثراء المادة الطافية ل M-CSF ويجب جمعها14.
  21. قم بإزالة قارورة ثقافة الخلية من الحاضنة في اليوم 5 بعد تثبيط الاتصال.
  22. نقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
  23. أجهزة الطرد المركزي عند 3200 × جم ، عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  24. اجمع المادة الطافية المخصبة ب M-CSF وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. يحفظ في الثلاجة على حرارة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: الطرد المركزي مهم للغاية لإزالة الخلايا والحطام من المواد الطافية.
  25. L-929 الطافي هو مصدر مناسب وغير مكلف لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ويحتوي عادة على 5 إلى 10 نانوغرام / مل من M-CSF8. تحتوي هذه المواد الطافية أيضا على كميات ضئيلة من السيتوكينات وعوامل النمو الأخرى ، لكنها لا تمارس تأثيرا عميقا على فسيولوجيا البلاعم15. ومع ذلك ، يمكن شراء M-CSF المنقى واستخدامه كبديل لطاف L-929 بتركيزات من 1 إلى 2 نانوغرام / مل8.

2. إزالة عظم الفخذ والساق

  1. المضي قدما في القتل الرحيم لذكور الفئران من النوع البري C57BL-6 البالغ من العمر 8 أسابيع عن طريق خلع عنق الرحم بعد اختناق ثاني أكسيد الكربون ، وفقا للقرار المعياري رقم 18 للمجلس الوطني للتجارب على (Concea) وبموافقة لجنة أخلاقيات واستخدام (CEUA).
  2. نقع الماوس مع محلول الإيثانول 70 ٪ واستخدام مقص معقم لعمل شق 1 سم على طول البطن.
  3. قم بإزالة الجلد حتى تتعرض عضلة الساقين الخلفيتين بالكامل.
  4. إزالة الساقين الخلفيتين على ارتفاع الورك ، مع الحرص على عدم كسر عظم الفخذ والساق.
  5. ضع الأرجل الخلفية في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل بمحلول إيثانول 70٪.
    ملاحظة: استخدم دائما الفئران الخالية من مسببات الأمراض. تأكد من جمع كلا الساقين لتحقيق عدد أكبر من الخلايا. يتم تنفيذ الخطوة 2 في بيئة غير معقمة (منضدة). وبالتالي ، من المهم إزالة عظم الفخذ والساق بعناية حتى تظل سليمة لتجنب التلوث البكتيري. يتم تنفيذ الخطوات المتبقية من هذا الإجراء في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي. يجب أن يقتصر وقت تعرض الساقين لمحلول الإيثانول بنسبة 70٪ على 10 دقائق. إذا كان الوقت أطول ، يمكن أن تتأثر أسلاف نخاع العظم.

3. الحصول على أسلاف نخاع العظم من تجويف الساق وعظم الفخذ

  1. قم بإزالة الأرجل من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ ونقلها إلى برنامج تلفزيوني معقم.
  2. استخدام ملقط ومناديل مطهرة لإزالة جميع العضلات واللفافة. يجب أن تكون العظام نظيفة بعد هذه الخطوة.
  3. استخدم شفرة مشرط جراحية معقمة لقطع المشاش العظمي على كلا الطرفين لكشف نخاع العظم.
  4. املأ حقنة سعة 20 مل ب 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم مكمل بمحلول 2٪ بنسلين / ستربتومايسين وقم بتوصيل إبرة 26 جرام.
  5. امسك العظم باستخدام ملقط تشريح تشريحي بيد واحدة ، واستخدم الأخرى لإدخال الإبرة في تجويف العظام. احرص على عدم سحق العظم بالملقط.
  6. اغسل الجزء الداخلي من العظم باستخدام برنامج تلفزيوني واجمع نخاع العظم في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم. بعد هذه الخطوة ، يجب أن يظهر تجويف العظام أبيض.
  7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM / F12-10.
  9. تجانس وإضافة 9 مل أخرى من وسط DMEM / F12-10 ليصل إجمالي الخلايا إلى 10 مل.

4. ثقافة البلاعم

  1. أضف 1 مل من أسلاف الخلايا إلى كل من أطباق بتري البلاستيكية المستديرة مقاس 100 مم × 20 مم (إجمالي 10 أطباق) ، وانشر الخلايا عبر الأطباق باستخدام ماصة للحصول على توزيع موحد. لا تستخدم الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة.
  2. أضف 9 مل من DMEM / F12-10 مع 20٪ من طافية الخلية L-929 إلى كل طبق.
  3. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  4. فياليوم الثالث ، أضف 10 مل من وسط DMEM / F12-10 المكمل ب 20٪ من الخلايا الطافية L-929 إلى كل طبق. وبهذه الطريقة ، تحتوي أطباق الاستزراع الآن على ما مجموعه 20 مل من وسط الثقافة ، وهو ما يكفي لنمو الخلايا حتى نهاية نضجها.
    ملاحظات: يجب عدم استخدام الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة لأن البلاعم ، كخلايا ملتصقة طبيعية تتميز بتفاعلات قوية مع الأسطح ، لن تنفصل بسهولة عن الطبق لاحقا. عادة ، يمكن زرع أسلاف الخلايا من فأر واحد (عظم الفخذ) في 10 أطباق ثقافة. ستتحول أسلاف الخلايا إلى بلاعم ، والتي يمكن استخدامها من يوم الحضانة 7 إلى 10. يتم تحديد تأكيد النضج من خلال التغييرات في مورفولوجيا البلاعم. الضامة الناضجة ملتصقة وتظهر مورفولوجيا غير متجانسة ، موضحة بانبعاث الأقدام الكاذبة في اتجاهات مختلفة. وتوضح النتائج التمثيلية أمثلة على هذه الخلايا الناضجة.

5. حصاد البلاعم

  1. تخلص من المواد الطافية من جميع أطباق الثقافة.
  2. اغسل كل طبق مزرعة ب 10 مل من برنامج Mg2+ المعقم الدافئ (37 درجة مئوية) و Ca2+ مجانا.
  3. تجاهل الحل من كل طبق.
  4. قم بتسخين محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمية مسبقا إلى 37 درجة مئوية وأضف 3 مل إلى كل طبق. احتضان لمدة 10 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 . استخدم مجهرا مقلوبا لتصور ما إذا كانت البلاعم تنفصل عن أطباق الاستزراع.
    ملاحظة: يجب أن يسمح استخدام الألواح البلاستيكية غير المعالجة بزراعة الأنسجة بتفكك الخلايا بسهولة وتجنب الحاجة إلى كشط الخلايا من اللوحة.
  5. اغسل الأطباق باستخدام ماصة مصلية بمحلول تفكك الخلايا غير الأنزيمية مرارا وتكرارا ، وقم بحركات دائرية لتأكيد فصل جميع البلاعم عن الطبق.
  6. اجمع محلول جميع أطباق الاستزراع معا في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
  7. أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم تم تسخينه مسبقا إلى أطباق الاستزراع الفارغة وتابع كما في الخطوة 5.4. هذا الإجراء هو تكرار للخطوة 5.4 ويهدف إلى ضمان جمع جميع البلاعم.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من DMEM / F12-10. تجانس ببطء وبعناية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة لتجنب إتلاف الخلايا.
  10. تحضير حصصة من 10 ميكرولتر من محلول البلاعم المخفف مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: في اليوم السابع ، سينتج كل طبق ما يقرب من 2 × 106 بلاعم. هذا يعني أن فأرا واحدا يمكن أن ينتج ما يقرب من 2 × 107 بلاعم أولية عند حصاده في عشر أطباق. نظرا لأن M-CSF يدفع فقط نضوج الضامة ، فإن الإجراء يضمن مجموعة من الخلايا التي هي في الأساس مجرد بلاعم وخالية من كريات الدم البيضاء الملوثةالأخرى 16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الضامة هي خلايا كبيرة وملتصقة ذات خصائص فسيولوجية خاصة. إنها تظهر مجموعة متنوعة من العروض المورفولوجية في الثقافة بسبب القدرة على الالتصاق بالزجاج والبلاستيك ، ويرتبط مورفولوجيا انتشارها النموذجية بانبعاث امتدادات السيتوبلازم (الشكل 1). بمجرد تعرض أسلاف نخاع العظم ل M-CSF من طاف الخلية L-929 والبدء في التحول إلى الضامة الناضجة ، فإنها تصبح ملتصقة بلوحة بتري.

يوضح الشكل 2 حركية تحول أسلاف نخاع العظم إلى بلاعم ناضجة. في اليوم الثالث ، ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد إنتاج مجموعة من البلاعم المشتقة من نخاع العظم خطوة أساسية في العديد من النماذج التجريبية لبيولوجيا الخلية ، خاصة عندما يكون من المهم تحقيق مجموعة متجانسة من الخلايا الأولية. كما ذكرنا ، يمكن أن تتحول أسلاف الخلايا إلى بلاعم فقط في وجود M-CSF. يمكن استخدام طافات الخلايا L-929 كمصدر رئيسي ل M-CSF. بخلاف التكلفة ، لا توجد مشكلة في استخدام M-CSF المؤتلف نفسه 8,17. هناك بعض الأدلة على أن بلاعم M-CSF المؤتلفة تظهر توحيدا أفضل في الثقافة. ومع ذلك ، فإن استخدام طاف R...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) ، من خلال Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) و Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16) ، والمجلس الوطني البرازيلي للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حقنة 20 سم مكعبDESCARPACKSI100S4Gحقنة معقمة
26-G إبرBD497AQDKT7إبر معقمة
أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 ملSARSTEDT62547254أنابيب مخروطية بلاستيكية مناسبة للطرد المركزي
70٪ محلول الإيثانولEMFAL490محلول الإيثانول للتعقيم
التشريح التشريحي ملقط3B SCIENTIFICW1670الحفاظ على دورق معقم يحتوي على 70٪ محلول الإيثانول
C57Bl / 6 فأر من النوع البريتم شراؤها من Biot & eacute ؛ ريو سنترال في جامعة ميناس جيرايس الفيدراليةلا ينطبقيجب أن تكون الفئران خالية من مسببات الأمراض ، وتتراوح أعمارها بين 6 و 10 أسابيع. تحتاج الفئران إلى استيعاب قبل أسبوع واحد على الأقل للتعافي من ضغوط النقل
قارورة ثقافة الخلية T175GREINERC7481-50EAT-175 قارورة ، رقبة معلقة ، مساحة السطح 75 سم 2 ، مع غطاء مرشح ، خالي من DNase ، قارورة
ثقافة الخلية خالية من RNase T75GREINERC7231-120EAT-75 قارورة ، رقبة معلقة ، مساحة السطح 75 سم 2 ، مع غطاء مرشح ، خالي من DNase ،
مناديل مطهرة أو مناديل مبللة للأطفال؟كلوركسغير قابل للتطبيقيساعد في تنظيف العظام
الماء المقطرGIBCO15230الماء المقطر المعقم
DMEM / F12-10غير قابل للتطبيقغير قابل للتطبيقأضف 10 مل من مصل الأبقار الجنيني (FBS) و 1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (P / S) إلى DMEM / F12 (q.s.p. 100 مل)
DMEM / F12-10 + طاف خلايا L-929غير قابل للتطبيقإضافة 20٪ من الطاف لزراعة خلايا L929 على DMEM / F-12-10
Dulbecco & prime ؛ s النسر المعدل & رئيس الوزراء ؛ s متوسط - F12 (DMEM / F12)GIBCO12500096DMEM: يحتوي F-12 Medium على 2.5 ملي مولار من الجلوتامين ، و 15 ملي مولار HEPES ، و 0.5 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 1200 مجم / لتر بيكربونات الصوديوم. أعد تعليق المسحوق إلى 1 لتر من الماء المقطر
وأضف 3,7 جم من بيكربونات الصوديوم. اضبط درجة الحموضة على 7,2 وقم بالتصفية ب 0,22 & ميكرو ؛ التخزين عند 2 - 8 درجة ؛ مصل الأبقار الجنينية في الفريزر
C ، معتمد ، معطل بالحرارة ، الولايات المتحدة (FBS)GIBCO10082147تخصيب لمقياس الدم DMEM-F12
SIGMA-ALDRICHZ359629يستخدم لحساب البلاعم في الفحص المجهري
خلايا L-929SIGMA-ALDRICHATCC # CCL-1L-929 هو سلالة من خلايا الخلايا الليفية للفأر تستخدم كمصدر لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF)
نيكون TI eclipse NIKON غير قابل للتطبيقNikon TI Eclipse عبارة عن مجهر مضان وتباين طور
محلول تفكك الخلايا غير الأنزيميCELLSTRIPER (CORNING)25-056-CIتفكك الخلايا غير الزيائي يزيل البلاعم من اللوحة دون إتلافها
أطباق الثقافة المستديرة غير المعالجة 100 & 20 & ndash; ممكورنينجCLS430591لا تستخدم أطباق بتري المعالجة بزراعة الأنسجة أو أي صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة
P3199 البنسلين G ملح البوتاسيومUSBIOLOGICAL113-98-4المضادات الحيوية
محلول البنسلين والستربتومايسين (P / S)استخدم 0,26 جرام من البنسلين و 0,40 جرام من الستربتومايسين. تخلط مع 40 مل من PBS المعقم. داخل خزانة التدفق الصفحي الأفقية ، استخدم 0,22 & micro ؛ يقوم M بتصفية وتخزين كميات 1.0 مل في أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 مل في الفريزر (-20 درجة ؛ ج)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات خال من الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS) MEDIATECH21-040-CMمعقم
S7975 كبريتات الستربتومايسين ، 650-850U / mgUSBIOLOGICAL3810-74-0المضادات الحيوية
الماصات المصلية 10 مل أو 25 ملSARSTEDT861254001تستخدم الماصات المصلية بأحجام أعلى من 1 مل
بيكربونات الصوديومSIGMA-ALDRICH144-55-8تصحيح الأس الهيدروجيني لبرنامج DMEM-F12
Nis Elements ViewerNIKONغير قابل للتطبيقNIS-Elements Viewer هو برنامج مستقل مجاني لعرض ملفات الصور ومجموعات البيانات
Sterile PBS و 2٪ من محلول P / SLABORCRIN590338أضف 1 مل من P / S في 40 مل من
مقص القزحية المستقيمةالمعقم KATENAغير قابل للتطبيقالحفاظ في دورق معقم يحتوي على محلول 70٪ من الإيثانول
طافية خلايا L-929غير قابلة للتطبيقغير قابل للتطبيقL-929 هي سلالة من خلايا الخلايا الليفية للفأر تستخدم كمصدر لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF). تم الحصول على الطاف L-929 من البروتوكول
شفرة المشرط الجراحية رقم 24 الفولاذ المقاومSWANN-MORTON311المستخدمة لفضح المشاشية من العظام
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪جيبكو15250061تريبان الأزرق ، 0.4٪ ، يستخدم بشكل روتيني كبقعة خلية لتقييم صلاحية الخلية باستخدام اختبار استبعاد الصبغة
محلول التربسين / EDTA 0،05٪جيبكو25300-062تستخدم لفصل الخلايا من زجاجة المزرعة
ماء للحقن (WFI) لزراعة الخلاياGIBCOA12873مياه معقمة وخالية من السموم الداخلية
محلول PBS للصدأ محلول

المراجع

  1. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  2. van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).
  3. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  4. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).
  5. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  6. Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).
  7. Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (112), e54244(2016).
  8. Gonçalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).
  9. Varol, C., Mildner, A., Jung, S. Macrophages: development and tissue specialization. Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).
  10. Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).
  11. Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages. Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).
  12. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).
  13. Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. In vitro macrophage phagocytosis assay. Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).
  14. Hosoe, S., et al. Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor. Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).
  15. Rice, H. M., et al. rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria. Journal of Immunological Methods. 477, 112693(2020).
  16. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
  17. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).
  18. Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  19. Stanley, E. R. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1). Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).
  20. Bou Ghosn, E. E., et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).
  21. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

بلعميات نخاع العظمعزل البلعمياتزراعة البلعمياتبلعميات الفأرأسلاف نخاع العظمتمايز الخلاياقياس التدفق الخلويمقايسة البلعمةالواسم F480الواسم CD11B
عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظام من الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.