تحضير ناقل Lentiviral لتعديل الجينات والحمض النووي الريبي الدقيق الفعال للبلاعم المقيمة في أنسجة التجويف البريتوني في الجسم الحي في الفئران

ملخص

نعرض بروتوكولا خطوة بخطوة للتحقيق في وظيفة الجينات في الضامة المقيمة في الأنسجة البريتونية في الجسم الحي ، باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية.

الملخص

الضامة المقيمة في الأنسجة البريتونية لها وظائف واسعة في الحفاظ على التوازن وتشارك في الأمراض داخل الأنسجة المحلية والمجاورة. وظائفها تمليها الإشارات البيئية الدقيقة. وبالتالي ، من الضروري التحقيق في سلوكهم في مكانة فسيولوجية في الجسم الحي . في الوقت الحالي ، تستخدم منهجيات محددة لاستهداف البلاعم البريتونية نماذج معدلة وراثيا للفأر الكامل. هنا ، يتم وصف بروتوكول للتعديل الفعال في الجسم الحي ل mRNA وأنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة (على سبيل المثال ، microRNA) في البلاعم البريتونية باستخدام جزيئات الفيروس العدسي. تم إجراء مستحضرات Lentivirus في خلايا HEK293T وتنقيتها على طبقة سكروز واحدة. كشف التحقق من فعالية الفيروس العدسي في الجسم الحي بعد الحقن داخل الصفاق عن العدوى السائدة للبلاعم المقتصرة على الأنسجة المحلية. كان استهداف البلاعم البريتونية ناجحا أثناء التوازن والتهاب الصفاق الناجم عن الثيوغليكولات. تتم مناقشة قيود البروتوكول ، بما في ذلك الالتهاب منخفض المستوى الناجم عن التوصيل داخل الصفاق لفيروس lentivirus والقيود الزمنية للتجارب المحتملة. بشكل عام ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا سريعا ويمكن الوصول إليه للتقييم السريع لوظيفة الجينات في الضامة البريتونية في الجسم الحي.

المقدمة

البلاعم المقيمة في الأنسجة (Mφ) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا المناعية البلعمية التي تستشعر مسببات الأمراض الغازية وتستجيب لها ^1,2. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تلعب دورا أساسيا في تطوير الأنسجة ، وإعادة تشكيلها ، والحفاظ على التوازن ^1,3. العديد من الأنسجة Mφ مستمدة من أسلاف كيس الصفار أثناء التطور الجنيني وتستمر في الأنسجة طوال الحياة ^4,5. يتم تحديد النمط الظاهري ووظائف هذه الخلايا من خلال التفاعلات التعاونية والهرمية لعوامل النسخ المحددة والبيئة المكروية^{المحلية 6،7،8،9}. يزيد الفهم المتزايد لهذه التبعية من الحاجة إلى طرق فعالة في الجسم الحي لمعالجة الجينات ل Mφ ضمن مكانتها ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

النواقل الفيروسية هي أداة تستخدم بشكل متكرر لمعالجة الأحماض النووية في مجموعات خلايا معينة في الجسم الحي^10،11،12 ، لا سيما بسبب قدرتها على إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة والاندماج بثبات في الجينوم المضيف^13،14. على مدى العقدين الماضيين ، تم تحسين تقنية توصيل فيروس lentivirus ، وتم التحقيق في المغلفات البديلة والمروجين الاصطناعية لزيادة استهداف النسب^{المحدد 8,15}. نظرا لانتحاء الخلية الواسع ، أصبح البروتين السكري المغلف بفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)^16,17 هو المغلف "القياسي الذهبي" المستخدم في تقنية الفيروسات العدسية.

في هذا البروتوكول¹⁸ ، يتم استخدام جزيئات الفيروسات العدسية ذات النمط الكاذب VSV-G لإثبات التوصيل المستهدف والفعال للحمض النووي الريبي قصير الدبوس (shRNA) والحمض النووي الريبي الدقيق (miR) إلى الماوس البريتوني Mφ (pMφ) في الجسم الحي ، في الحالة المستقرة¹⁹. كان التعبير الجيني المحوري مدفوعا بمروج فيروس تشكيل تركيز الطحال (SFFV). تم تعريف العدوى المنتجة للخلايا من خلال التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز المشتق من فيروس العدس (GFP). سمح استخدام هذا النهج بقراءات سهلة لتجارب الفيروس العدسي في الجسم الحي لتحديد الجرعة المثلى والإطار الزمني التجريبي. أخيرا ، كشف التحدي الفيروسي العدسي في الجسم الحي للفئران أثناء الالتهاب الناجم عن الثيوغليكولات عن الميل الطبيعي لعدوى pMφ الانتقائية.

البروتوكول

تم إجراء جميع الأعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووزارة الداخلية في المملكة المتحدة.

ملاحظة: يجب إجراء جميع الدراسات في الجسم الحي مع فيروس lentivirus وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية بشأن الاستخدام الأخلاقي للحيوانات في البحث ، وكذلك الالتزام بجميع اللوائح المرتبطة باستخدام المواد المعدية من الفئة الثانية. يجب أيضا مراقبة رعاية وفقا للوائح المحلية. في هذه الخطوة من البروتوكول ، يجب توخي الحذر الشديد عند العمل مع جزيئات الفيروسات العدسية والأدوات الحادة.

1. تحضير الخلايا HEK293T للنقل

ملاحظة: نفذ هذه الخطوات تحت خزانة السلامة البيولوجية لزراعة الأنسجة المعقمة.

1. تحضير وسط النسر المعدل (cDMEM) الكامل من Dulbecco للخلايا HEK293T من خلال الجمع بين 450 مل من DMEM مع 10٪ (v / v) مصل عجل الجنين (50 مل) وتركيز نهائي قدره 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين.
2. تذويب الخلايا HEK293T قبل 1 أسبوع على الأقل من النقل المخطط له. الحفاظ على ظروف نمو صحية والمرور كل 2-3 أيام باستخدام التربسين + EDTA لفصل الخلايا عن القارورة.
3. قبل يوم واحد من النقل ، قم بشفط وسط النمو بعناية من الخلايا واغسل الخلايا برفق باستخدام DPBS المعقم. أضف 1-5 مل من التربسين إلى القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪ لمدة 2-5 دقائق.
4. أضف 5-10 مل من cDMEM وقم بتدوير الخلايا بمعدل 350 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة السائل وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من cDMEM. عد الخلايا والبذور 10-11 × 10⁶ خلايا HEK293T قابلة للحياة لكل قارورة T175 في 20 مل من cDMEM.
5. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪ طوال الليل للسماح للخلايا HEK293T بالوصول إلى التقاء 70٪ -80٪.
6. في اليوم التالي ، تأكد من التقاء الخلايا تحت المجهر الضوئي.
7. قم بإزالة الوسائط من القارورة باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية.
8. أضف 10 مل من DPBS برفق وهز اللوحة لغسل الخلايا ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقة الأحادية للخلية.
9. قم بإزالة DPBS باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل.
10. أضف 15 مل من cDMEM الجديد على الحائط لكل قارورة T175 حتى لا تزعج الطبقة الأحادية للخلية ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.

2. نقل الخلايا HEK293T باستخدام كاشف نقل الدهون غير الشحمية

1. في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، قم بإعداد مكونات الفيروسات العدسية: 2 ميكروغرام من البلازميد الفيروسي ، 1.5 ميكروغرام pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) ، و 1 ميكروغرام pMD2.G (pCMV-MD2.G) مع Buffer EC (مجموعة كاشف النقل) إلى حجم نهائي يبلغ 600 ميكرولتر.
2. أضف 36 ميكرولتر من محلول المحسن. امزج المكونات باستخدام ماصة سعة 1 مل عن طريق امتصاص جزء من السائل بشكل متكرر وإعادته قطرة قطرة مباشرة على المحلول المتبقي. اتركيه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. أضف 120 ميكرولتر من كاشف النقل واخلطه على النحو الوارد أعلاه حوالي 20 مرة. احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
4. أضف 5.2 مل من cDMEM واخلطها على النحو الوارد أعلاه مع شريط مصلي 5 مل.
5. باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها ، أضف مزيج النقل بالتنقيط مباشرة على الطبقة الأحادية للخلايا HEK293T (تجنب جدران القارورة) ، وانشر المزيج في أماكن مختلفة في القارورة.
6. قم بتوزيع البلازميد عن طريق هز القارورة برفق من جانب إلى آخر. تجنب الحصول على أي سائل في غطاء القارورة.
7. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪ لمدة 48 ساعة. تأكد من النقل الفعال للخلايا HEK293T من خلال ظهور علامة الفلورسنت ، هنا GFP ، في غضون 24 ساعة من النقل الذي يتم مراقبته تحت مجهر الفلورسنت لتصوير الخلايا.
   ملاحظة: بالنسبة للتركيبات التي لا تحتوي على علامة الفلورسنت ، يجب اختبار الخلايا HEK293T لوجود جين العلامة المستخدم أو عن طريق تغيير التعبير في الجين / البروتين محل الاهتمام بالتقنيات المناسبة ، على سبيل المثال ، qPCR. بدلا من ذلك ، يمكن التحقق من النقل الناجح بشكل غير مباشر أثناء اختبار مجموعة الفيروسات العدسية على خلايا Jurkat في المراحل اللاحقة من البروتوكول بواسطة التقنيات المذكورة أعلاه.
   تنبيه: تعتبر الخلايا HEK293T المنقولة معدية ، ويجب تنفيذ احتياطات السلامة المناسبة عند التعامل مع هذه الخلايا. وينبغي اتباع القواعد المحلية، التي يمكن أن تشمل عادة العمل تحت خزانة سلامة البيولوجيا من الفئة الثانية، واستخدام قفازات مزدوجة، ومحلول مناسب لإزالة التلوث للتطهير، على سبيل المثال، زيادة تركيز مبيض النفايات (2000 جزء في المليون) أو محلول مكافئ وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للسلامة الأحيائية. يجب تطهير جميع المحاليل والمواد البلاستيكية التي تتلامس مع مستحضر فيروس العدس وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية.

3. جمع جزيئات الفيروسات العدسية

1. تحضير محلول إزالة التلوث ، وهو محلول مبيض عالي التركيز (2000 جزء في المليون) (هيبوكلوريت الصوديوم) ، أو عامل مكافئ وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للسلامة الأحيائية في دلو ووضعه في خزانة سلامة البيولوجيا.
2. قم بإعداد خزانة سلامة البيولوجيا عن طريق إزالة أي عناصر زائدة ، مثل رفوف الأنابيب الفارغة وما إلى ذلك.
3. قم بتسمية أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل لكل دورق خلايا HEK293T T175 مسبقا وقم بإزالة الغطاء من أنبوب الطرد المركزي. ضع الأنابيب في رف ثابت.
4. استرجع القارورة من الحاضنة وتأكد من تعبير GFP باستخدام مجهر الفلورسنت بليزر 488 نانومتر (الشكل 1 أ). تعتمد شدة الإشارة على كفاءة نقل الإجراء والتركيبات المستخدمة.
5. اجمع الوسائط من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل المسمى مسبقا. قم بإمالة قارورة T175 HEK293T بخلايا منقولة بحيث يتجمع الوسط في الزاوية السفلية من القارورة. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، اجمع الوسط دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية. قد تكون بعض الخلايا العائمة مرئية في هذه المرحلة. انقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل وأغلق الغطاء.
   1. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، أضف 25 مل من cDMEM الطازج والدافئ إلى القارورة. تأكد من توجيه التدفق المتوسط على جدران القارورة حتى لا تزعج الطبقة الأحادية للخلية. أعد القارورة مع خلايا HEK293T المنقولة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂).
      ملاحظة: يمكن إجراء مجموعة ثانية من فيروس lentivirus والمزيد من التنقية بعد 24 ساعة إضافية باتباع الإجراء الموضح في الخطوات أعلاه.
6. عند اكتمال جمع فيروس lentivirus بعد 24 ساعة أو 48 ساعة ، أضف محلول إزالة التلوث إلى الخلايا ، مع التأكد من أنه يغطي الطبقة الأحادية للخلية. حافظ على القارورة أفقية لمدة 24 ساعة التالية ، ثم تخلص منها باتباع لوائح الفئة الثانية المناسبة.

4. تنقية فيروس عدسي

1. تصفية جمع الوسيط من الخطوة 3.5.
   1. قم بإزالة المكبس من المحقنة سعة 50 مل وأدخل مرشح معقم من البولي إيثر منخفض البروتين أو فلوريد البولي فينيليدين 0.45 ميكرومتر في نهاية المحقنة. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، أضف الوسط الذي تم جمعه من الخطوة 3.5.1 إلى المحقنة وأعد المكبس برفق.
   2. ادفع القابس ببطء لتمرير الوسيط عبر المرشح إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل. إذا انخفض التدفق بشكل كبير ، ضع المحقنة مع توجيه المرشح لأعلى واسحب المكبس بدرجة كافية لإزالة الوسط من الفلتر.
   3. بعناية ، استبدل المرشح الموجود على المحقنة بآخر جديد وتخلص من المرشح المستخدم في محلول إزالة التلوث. استمر في الترشيح المتوسط. عند الانتهاء ، قم بإزالة التلوث من الفلتر والمحقنة عن طريق غمر المرشح وملء المحقنة بمحلول إزالة التلوث.
2. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي الفائق مسبقا عن طريق ضبط درجة الحرارة على 4 درجات مئوية وإغلاق الغطاء للسماح لدرجة الحرارة بالتأقلم.
3. أضف 3 مل من محلول السكروز 20٪ (20٪ وزن / فولت في ماء عالي النقاء ، مرشح معقم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر) في قاع أنبوب الطرد المركزي المخروطي الفائق.
4. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، قم بتراكب وسط مرشح أعلى طبقة السكروز ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقات.
   1. استخدم إعداد السرعة الأدنى على فتى الماصة. قم بزاوية أنبوب الطرد المركزي المخروطي إلى حوالي 45 درجة وأضف ببطء الوسط المحتوي على فيروس العدس المصفى من الخطوة 4.1 إلى جدار الأنبوب. تأكد من عدم اختلاط الوسط والسكروز ، وأن الفصل الواضح للطبقات مرئي (الشكل 1 ب). مع زيادة حجم الطبقة المتوسطة ، قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي الفائق ببطء إلى وضع رأسي.
5. إذا كان الحجم الإجمالي ، بما في ذلك السكروز والوسط ، في أنبوب الطرد المركزي الفائق أقل من 29 مل ، فقم بتعبئة cDMEM جديد لتجنب انهيار الأنبوب أثناء الدوران. بالنسبة لمجموعات T175 mL المتعددة ، امزج المستحضرات المتوسطة المفلترة واستخدم أنابيب طرد مركزي متعددة. قم بتعبئة أنبوب الطرد المركزي النهائي بالوسط كما هو مطلوب.
6. تأكد من نظافة دلاء أجهزة الطرد المركزي الفائقة ؛ لا توجد بقايا متوسطة في قاع الجرافة أو الأغطية. إذا لزم الأمر ، امسح باستخدام ~ 70٪ كحول. ضع محولات الأنبوب المناسبة في الجزء السفلي من كل دلو (الشكل 1C) وقم بخفض أنابيب الطرد المركزي الفائقة برفق في الجرافات.
7. أغلق الجرافات بإحكام وعلقها على المساحات المخصصة على الدوار الدوراني.
8. تأكد من أن الدلاء متوازنة مع نفس أحجام السكروز والمتوسطة. يجب عدم تشغيل الدوار الدوار بدون جرافات ، على الرغم من أنه قد يتم ترك الجرافات المتعارضة فارغة²⁰ (الشكل 1 د).
9. أدخل الدوار بعناية في جهاز الطرد المركزي الفائق وقم بتشغيل الفراغ. اضبط معدل تسارع وتباطؤ أجهزة الطرد المركزي الفائقة على أدنى إعداد ، وقم بتشغيل الاستعدادات لفيروس lentivirus عند 85000 × g لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
10. انتظر حتى يصل جهاز الطرد المركزي الفائق إلى السرعة المطلوبة (حوالي 3-5 دقائق) قبل الابتعاد للتأكد من إدخال الدوار بشكل صحيح ولن ينتهي الدوران.
11. أثناء تشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق ، قم بتنظيف مساحة العمل وفقا لمتطلبات السلامة من الفئة الثانية وقم بإعداد المساحة للخطوات التالية.
12. عند انتهاء الدوران ، قم بتعطيل الفراغ وإزالة الدوار بعناية حتى لا تزعج العينات.
13. تحقق من أجهزة الطرد المركزي الفائقة بحثا عن أي انسكابات وتأكد من عدم وجود تسرب من الجرافات. في حالة الانسكاب ، قفاز مزدوج وتطهير أجهزة الطرد المركزي والسطح الخارجي للدلاء بمنتجات مضادة للفيروسات.
14. قم بإزالة الدلاء من أجهزة الطرد المركزي الفائقة وانقل الدلاء بعناية إلى خزانة أمان البيولوجيا من الفئة الثانية.
    ملاحظة: تتجمع جزيئات Lentivirus في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق. الحبيبات غير مرئية للعين المجردة.
15. صب السكروز والمتوسط بحركة واحدة سلسة مباشرة في حاوية النفايات باستخدام محلول إزالة التلوث.
16. الحفاظ على أنبوب الطرد المركزي ultra مقلوبا ، ونقله إلى طبقة مزدوجة من الأنسجة واتركه ليجف لمدة 10 دقائق. في هذه الأثناء ، امسح الجزء الداخلي من الدلاء بمنديل مبلل بالماء وجففه بالهواء رأسا على عقب.
17. جفف بعناية أي سائل متبقي من حافة أنبوب الطرد المركزي الفائق بالأنسجة قبل قلبه في وضع مستقيم. تطهير الأنسجة والسطح تحتها.
18. أعد تعليق حبيبات الفيروس في 1 مل من الوسائط الخالية من المصل أو المحلول المطلوب لمزيد من التجارب عن طريق سحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل. اتركه لمدة 15 دقيقة في RT داخل خزانة سلامة الأحياء من الفئة الثانية.
19. امزج مستحضرات فيروس العدس برفق باستخدام ماصة سعة 1 مل قبل الاقتباس في أنابيب علوية لولبية سعة 1.5 مل (على سبيل المثال ، أنابيب التبريد). تحضير الحصص للعمل في الجسم الحي (تعدد 100 ميكرولتر) ولعيار فيروس lentivirus في خلايا Jurkat T (1 × 20 ميكرولتر) (انظر الخطوة 5).
20. تجنب دورات التجميد والذوبان ؛ يمكن تخزين المستحضرات الفيروسية العدسية عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر دون تأثير سلبي على العدوى.

5. معايرة إنتاج الفيروس العدسي في خلايا Jurkat T

1. قم بإعداد وسط معهد روزويل بارك التذكاري 1640 الكامل (cRPMI-1640) لخلايا Jurkat T عن طريق استكمال 500 مل من RPMI-1640 مع مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (v / v) والتركيز النهائي ل 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين.
2. لضمان ثقافة صحية من الخلايا التائية Jurkat ، والحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 1 أسبوع قبل الإصابة.
3. في يوم معايرة الفيروس العدسي ، قم بإخراج خلايا Jurkat T القابلة للحياة في صفيحة 24 بئرا عند 2 × 10⁵ خلايا / بئر في 200 ميكرولتر لكل بئر من cRPMI-1640.
4. استخدم فيروس العدس الذي تم جمعه حديثا أو قم بإذابة قارورة فيروس العدس التي تحتوي على 20 ميكرولتر على الثلج واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
5. باستخدام التخفيف التسلسلي في cRPMI-1640 ، تصيب خلايا Jurkat T ب 0.25 ميكرولتر و 0.5 ميكرولتر و 1 ميكرولتر و 2.5 ميكرولتر و 5 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من مخزون الفيروسات العدسية. هز اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي لفيروس العدس. تعمل خلايا Jurkat T غير المصابة كعنصر تحكم سلبي.
6. احتضان اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية. بعد 4 ساعات ، قم بتعبئة كل بئر باستخدام cRPMI إلى حجم إجمالي قدره 400 ميكرولتر. أعد اللوحة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
7. بعد 48 ساعة بعد الإصابة، تأكد من تعبير GFP تحت نظام التصوير بالفلورسنت.
8. بعد 3 أيام من الإصابة ، اجمع كل بئر من صفيحة 24 بئرا في أنابيب تجميع منفصلة سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي للخلايا عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
9. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهايد (PFA) المحضرة إلى 2٪ (وزن / حجم) في DPBS واتركها لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
10. قم بطرد الخلايا عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) (DPBS معقم + 4٪ FCS + 1 mM EDTA معقم).
11. تحليل تردد تعبير GFP ومتوسط شدة الفلورسنت للمصابين بفيروس lentivirus وخلايا التحكم الخاصة به باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2).

6. عدوى الفيروس العدسي في الجسم الحي للبلاعم البريتونية المقيمة في الأنسجة

1. في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، قم بتحميل إبر الأنسولين بحجم إجمالي 200 ميكرولتر من وسط الوسائط الخالية من المصل الذي يحتوي على الكمية المطلوبة من فيروس العدس (استخدم الإبر ذات الاستخدام الواحد ، 30 جم لرعاية ولتجنب فقدان السوائل في الإبرة).
2. ضع غمد الإبرة مرة أخرى على الإبرة باستخدام تقنية المغرفة بيد واحدة. احتفظ بالإبرة على الثلج وحقنها في غضون 30 دقيقة.
3. في منشأة ، قم بإعداد خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية قبل الحقن (الشكل 1E).
   1. وضع ورقة من الأنسجة النظيفة. قم بفك الغمد الموجود على إبرة الأنسولين التي تحتوي على فيروس العدس.
   2. قم بإعداد طبق بتري يحتوي على قطع صغيرة من الأنسجة ومطهر قائم على غلوكونات الكلورهيكسيدين ، وأنبوب سعة 50 مل يحتوي على محلول إزالة التلوث (محلول تبييض 2000 جزء في المليون) ، وحاوية آمنة حادة.
4. كبح جماح الفأر عن طريق الإمساك بالجلد عند مؤخرة الرقبة²¹. الماوس المقيد بشكل صحيح غير متحرك ، وهذا مطلوب للسلامة.
5. مع توجيه البطن لأعلى ، وجه رأس لأسفل قليلا. حقن الفيروس العدسي داخل الصفاق في الربع الأيمن السفلي من تجويف البطن. هذا لتجنب الحقن في أي أعضاء تجويف البريتوني.
6. قبل تحرير الماوس ، املأ المحقنة بمحلول إزالة التلوث وتخلص منها بأمان في الصندوق الآمن الحاد.
7. امسح موقع الحقن على بطن الفأر بأنسجة مبللة بالمطهر وأعد إلى القفص.
8. ضع الفأر المحقون بفيروس العدس في الفئة الثانية من سكانتينر أو أقفاص التهوية الفردية (IVC) (أقفاص معزولة مع ترشيح هواء عالي الكفاءة) لمدة لا تقل عن 72 ساعة بعد الحقن. ضع بطاقة معلومات مناسبة في مقدمة القفص.
9. انقل الماوس إلى الفئة الجديدة I التي تحمل القفص بعد 72 ساعة بعد الإصابة ، اعتمادا على موافقات السلامة المحلية. مراقبة الفئران يوميا لمدة 3 أيام من الحقن.

7. جمع الخلايا البريتونية من الفئران المصابة بفيروس lentivirus

تنبيه: بالنسبة للمجموعات في غضون 72 ساعة بعد حقن فيروس العدس ، اتبع قواعد السلامة البيولوجية المؤسسية من الفئة الثانية. يجب تطهير الفراش وقفص الاحتجاز حيث تم الاحتفاظ بالحيوانات المصابة في أول 72 ساعة بعد حقن فيروس العدس وفقا لقواعد السلامة البيولوجية المؤسسية من الفئة الثانية.

1. القتل الرحيم للفئران باتباع اللوائح المؤسسية ، على سبيل المثال ، عن طريق استنشاق تركيز متزايد من CO₂ ، يليه تأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم.
2. تنظيف البطن من الماوس مع 70 ٪ الأيزوبروبانول وقطع الجلد بعناية لفضح غشاء تجويف البريتوني.
3. اغسل التجويف البريتوني ب 6 مل من محلول FACS المثلج باستخدام حقنة 10 مل وإبرة 23 جرام. تجنب ثقب أي أعضاء.
4. قم بتدليك الصفاق برفق لإزاحة الخلايا إلى المخزن المؤقت FACS.
5. جمع السائل البريتوني باستخدام نفس المحقنة والإبرة.
6. قم بإزالة الإبرة ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
7. الحفاظ على غسل البريتوني على الجليد.
8. جمع الأعضاء الأخرى المطلوبة وتخزينها بما يتناسب مع الدراسة.
9. تخلص من جثث وفقا لإرشادات والسلامة المحلية.

8. تلطيخ الخلايا البريتونية وتحليلها

1. أجهزة الطرد المركزي غسل الصفاق عند 350 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتجاهل المادة الطافية في محلول إزالة التلوث ، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS.
2. عد الخلايا المجمعة واللوحة 4 × 10⁵ خلايا لكل بئر في لوحة 96 بئر ذات قاع V.
3. قم بإجراء تلطيخ الجدوى باستخدام كاشف قابل للتثبيت (على سبيل المثال ، مجموعة بقع الخلايا الميتة القريبة من الأشعة تحت الحمراء القابلة للإصلاح المستخدمة هنا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. إذا كانت الخلايا مصابة خلال ال 72 ساعة الماضية ، فقم بتثبيت الخلايا في 2٪ PFA لمدة 15 دقيقة على الجليد. أضف حجما متساويا من DPBS البارد وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
5. تحضير المخزن المؤقت للحجب: امزج 4 ميكروغرام / مل 2.4G2 من الجسم المضاد في مصل الفئران بنسبة 10٪ (v / v) في المخزن المؤقت FACS لتلطيخ السطح أو المخزن المؤقت للنفاذية للتلطيخ داخل الخلايا.
6. أعد تعليق كل بئر يحتوي على حبيبات خلوية في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
7. تحضير مزيج الأجسام المضادة إما في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (لتلطيخ السطح) أو المخزن المؤقت للنفاذية (للتلطيخ داخل الخلايا) لكل عينة. سيكون حجم التلوين النهائي لكل عينة 100 ميكرولتر ، بما في ذلك 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. احسب تركيزات الأجسام المضادة وفقا لذلك (الجدول 1).
8. أضف 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة إلى العينات و 50 ميكرولتر من عناصر التحكم في النمط المتماثل ومخزن التحكم للتحكم في العينات. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. قم بتضمين الخلايا غير الملوثة وعناصر التحكم في النمط المتماثل كما هو مطلوب.
9. اغسل كل بئر ب 100-200 ميكرولتر من DPBS المثلج البارد وأجهزة الطرد المركزي على اللوحة عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة لإزالة أي أجسام مضادة غير مقيدة. تحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي.

9. استخراج الخلايا من الأعضاء

1. تحضير 1 مل من مزيج الهضم لكل عضو: امزج محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، 2 مجم / مل كولاجيناز من النوع الرابع ، و 0.03 مجم / مل DNase I (بما في ذلك 1.5 مجم / مل من الهيالورونيداز لهضم الرئة).
2. نقل العضو الذي تم جمعه إلى 1 مل من مزيج الهضم وفرمه بالمقص.
3. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
4. في حالة عزل الخلايا من الرئة أو الطحال أو الكبد ، تحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام محلول تحلل ACK (150 mM NH₄Cl ، 10 mM KHCO₃ ، 0.1 mM_{Na 2}EDTA pH = 7.4). قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
5. تلطيخ وتحليل الخلايا كما هو موضح في القسم 8.

النتائج

عند اتباع هذا البروتوكول بشكل كامل وصحيح ، ينتج ما مجموعه 1.5 مل من مخزون فيروس العدس عالي الجودة لكل مستحضر واحد ، وهو ما يكفي لاثني عشر حقنة في الجسم الحي بالحجم الأمثل المحدد في هذه الدراسة¹⁸. يمكن تقييم نجاح النقل في وقت مبكر من البروتوكول. يجب أن تعرض خلايا HEK293T السليمة والملتصقة ، إذا كانت موجودة في البلازميدات ، إشارة علامة يمكن اكتشافها بسهولة (على سبيل المثال ، GFP المستخدم في هذه الدراسة) بعد 48 ساعة من انتقال البلازميد (الشكل 1 أ). يمكن أن تشير الكثافة المنخفضة للإشارة ، والانفصال المفرط للخلايا ، وانخفاض الالتقاء في الخطوات المبكرة للبروتوكول إلى موت الخلايا وسيؤدي إلى انخفاض إنتاجية تحضير الفيروس العدسي. بعض انفصال الخلايا قبل المجموعة الاختيارية II (الخطوة 3.5.1.) مرئي ومتوقع.

تستخدم ثلاثة بلازميدات في هذا البروتوكول لتوليد جزيئات فيروس العدس: pCMV-ΔR8.91 تغليف البلازميد ترميز بروتين HIV-1 الهيكلي (Gag) ، والبروتينات الملحقة Tat و Rev ، وبوليميراز النسخ العكسي (Pol) ²² ؛ pMD2.G ترميز مغلف VSV-G تحت مروج CMV¹³ ؛ و pHR'SIN-cPPT-SEW البلازميد (ترميز علامة GFP المحسنة)¹⁹ المعدلة وفقا للتعبير عن shRNA أو microRNA.

تتم معايرة مستحضرات Lentivirus في خط خلايا Jurkat T بسبب معديتها^{العالية 23}. سيحقق التحضير الناجح لفيروس العدس معدل إصابة يزيد عن 95٪ بجرعة صغيرة تصل إلى 5 ميكرولتر (الشكل 2 أ). يستمر متوسط كثافة الفلورسنت للخلايا المصابة في الزيادة مع الجرعات الأعلى (الشكل 2B ، C). إذا لزم الأمر ، يمكن قياس التتر الفيروسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للمكونات الفيروسية المتكاملة ، على سبيل المثال ، مروج SFFV ، والذي يرتبط خطيا مع النسبة المئوية للخلايا المعبرة عن GFP ولوغاريتميا مع GFP MFI (الشكل 2D). اعتمادا على البنية ، خاصة تلك التي تحتوي على ملحق كبير²⁴ ، يمكن لبعض مستحضرات فيروس lentivirus أن تظهر عدوى منخفضة في خلايا Jurkat T ، كما هو موضح في بنية Cre-GFP المستخدمة في هذه الدراسة (الشكل 2E ، F). في مثل هذه الحالة ، يمكن الجمع بين مستحضرات متعددة من جزيئات فيروس العدس وإعادة تعليقها في 1 مل. نوصي بالتحقق من صحة الاستجابات المناعية لتلك المستحضرات في الجسم الحي قبل التجربة. بطبيعة الحال ، قد تظهر مستحضرات الفيروس العدسي مع مستقبلات دخول بديلة ل VSV-G المستخدمة هنا كفاءة عدوى مختلفة في خط خلايا Jurkat T ، اعتمادا على تعبير المستقبل على الخلايا. يجب اختيار خطوط الخلايا المستخدمة في المعايرة بحيث تعبر عن المستقبل الذي تستخدمه جزيئات الفيروس العدسي لدخول الخلايا ويفضل أن تفتقر أو يكون لها تعبير منخفض جدا عن عوامل^{التقييد 25}.

يتضح الإنتاج الناجح للجسيمات الفيروسية العدسية أيضا من خلال إصابة pMφ (المعرفة على أنها CD11b ⁺ F4 / 80 ⁺ و Tim4 ⁺ السكانية) ¹⁸ (الشكل 3A). لقد قررنا أن الحقن داخل الصفاق لتحضير 100 ميكرولتر من فيروس العدس (في الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل) ينتج أعلى نسبة وشدة لإشارة GFP في هذه الخلايا (الشكل 3B ، C). لم يكن لحقن جرعات أعلى (150 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من تحضير فيروس العدس) أي تأثير مفيد على تعبير GFP في pMφ. كشفت تجارب الدورة الزمنية في 4 ساعات و 3 أيام و 7 أيام و 14 يوما بعد الحقن داخل الصفاق (i.p) مع 100 ميكرولتر من فيروس lentivirus عن نسبة كبيرة من pMφ المقيم المعبر عن GFP في اليومين 3 و 7 ، يليه اختفاء السكان المصابين في اليوم 14 (الشكل 3D ، E). ومن المثير للاهتمام ، أن التعبير عن GFP pMφ يختفي في الغالب بحلول اليوم 14 بعد الإصابة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى التعرف المناعي على علامة GFP. في الواقع ، تمنع تجارب الفيروسات العدسية مع علامة GFP في الفئران الانتقائية T-Reg Foxp3-DTR-eGFP رفض pMφ المقيم المصاب حتى اليوم 21 على الأقل (الشكل 3F). بالنسبة لمستحضرات فيروس العدس ذات الفعالية المتناقصة في خلايا جوركات ، ستكون هناك حاجة إلى كمية أكبر لتحقيق معدل الإصابة المتوقع في الجسم الحي. ومع ذلك ، كما هو موضح مع إعداد Cre-GFP lentivirus ، اعتمادا على تصميم البناء ، حتى جرعة 300 ميكرولتر في 7 أيام بعد الحقن i.p قد تسفر عن نتيجة سيئة (الشكل 3G). لقد أثبتنا سابقا الاستخدام الناجح لهذا البروتوكول للإفراط في التعبير وضربة قاضية للجينات في الجسم الحي في الفئران pMφ ، بما في ذلك Map3k8 و Gata6 بوساطة الفيروسية ، و Gata6 الإفراط في التعبير¹⁹. هنا ، نظهر أنه يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول بنجاح للتعبير المفرط عن الحمض النووي الريبي الميكروي للفأر 146b (mmu-miR-146b) ولضربة قاضية لجزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM1 ، CD54) باستخدام shRNA المشتق من الفيروسات العدسية في pMφ المقيم (الشكل 3H ، I).

تتطلب عدوى الخلايا الأولية ، مثل الضامة ، مدخلات أعلى من فيروس العدس ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى وجود عوامل تقييد في هذه الخلايا. عوامل التقييد هي آليات حماية طبيعية للخلايا تتداخل مع خطوات دورة حياة الفيروسات ، مثل النسخ العكسي أو التكامل ، مما يؤدي إلى تثبيط التعبير الجيني من البنى.

علاوة على ذلك ، أظهر التحقق من صحة البروتوكول في الجسم الحي عدم وجود تأثير لتوصيل الفيروس العدسي i.p على صلاحية الخلايا المناعية البريتونية (الشكل 4A) وأشار إلى عدوى مميزة للمجموعات الفرعية pMφ المقيمة (المحددة بتعبير علامات CD73 و Tim4) (الشكل 4B ، C). الأهم من ذلك ، اقتصرت عدوى فيروس العدس المنتجة على Mφ المقيم في موقع الحقن كما يتضح من عدم وجود تعبير كبير عن GFP في العقدة الليمفاوية المساريقية (mLN) أو الرئة أو الكبد أو الطحال Mφ بعد 7 أيام بعد التحدي (الشكل 4D). بالنظر إلى أنه في كثير من الحالات ، يلزم إجراء الاستهداف الجيني ل Mφ في ظل ظروف التهابية ، قمنا بالتحقيق في فعالية هذا البروتوكول في الفئران التي تم تحديها داخل الصفاق مع 0.1 مل من 4٪ ثيوغليكولات. يؤدي حقن الثيوغليكولات إلى تدفق الخلايا الوحيدة الالتهابية المشتقة من Mφ والخلايا الوحيدة التي يمكن تقسيمها إلى 5 مجموعات متميزة (الشكل 4E). كشف تحليل قياس التدفق الخلوي عن نمط ظاهري حراري للخلايا الشبيهة بالوحيدات (Ly6C^hi population 1 و 2) لعدوى فيروس lentivirus ، بما يتماشى مع النتائج السابقة في الخلايا البشرية²⁶. في المقابل ، ظلت Mφ المقيمة والوحيدات (المجموعات 3-5) أكثر عرضة للإصابة (الشكل 4F).

كشف تحليل التدفق الخلوي التفصيلي عن تعبير GFP في الغالب في Mφ البريتوني المقيم ومعقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة II ⁺ pMφ المقيم (MHCII ⁺ F4 / 80 ⁺ Tim4 ⁺) (حتى 60٪ في اليوم 3 بعد الحقن) (الشكل 5 أ). تم اكتشاف إشارة GFP قليلة أو معدومة في مجموعات الخلايا البريتونية الأخرى ، بما في ذلك Mφs / DCs البريتونية المشتقة من نخاع العظم (MHCII ⁺ ، CD11b ⁺ ، CD11c ⁺) ، الخلايا البائية (CD19 ⁺) ، الخلايا التائية (CD3 ⁺) ، الخلايا البدينة (CD11b^- ، FcεR1⁺) ، الحمضات (Siglec-F ⁺) ، الخلايا القاتلة الطبيعية (CD19^- ، NK1.1⁺) والعدلات (Ly6G ⁺) (الشكل 5A ، B). تبع طول العمر تعبير GFP (الشكل 5C) في جميع السكان هذا من Mφ البريتوني المقيم (الشكل 1D). تم تسجيل زيادة عابرة في تردد العدلات بعد 4 ساعات من حقن i.p بمقدار 100 ميكرولتر (في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل) من فيروس lentivirus (الشكل 5D) ، مما يشير إلى التهاب خفيف مبكر موجود في التي تواجه تحديات. أخيرا ، شهد pMφ المقيم انخفاضا كبيرا في التردد بين اليومين 7 و 14 بعد الإصابة (الشكل 5E) ، مما يشير إلى أفضل نافذة تجريبية بين اليومين 3 و 7 بعد الحقن.

الشكل 1: إنتاج فيروس Lentivirus في الخلايا HEK293T. (أ) صور التألق المناعي التمثيلي للخلايا HEK293T بعد 48 ساعة من النقل الناجح (المجهر الفلوري [ذروة الإثارة 488 نانومتر ، ذروة الانبعاث 510 نانومتر] ، التكبير 20x ، شريط المقياس = 400 ميكرومتر). (ب) صورة لأنبوب مخروطي للطرد المركزي يحتوي على طبقة من السكروز بنسبة 20٪ (أسفل ، شفاف) وطبقة من الوسط تم جمعها من خلايا HEK293T المنقولة (أعلى ، أحمر). (ج) صورة للإدخال الصحيح لجهاز الطرد المركزي المخروطي في الجرافة، بما في ذلك المحول. (د) صور فوتوغرافية توضح التوازن الصحيح وغير الصحيح لدوار جهاز الطرد المركزي الفائق. (ه) صورة للإعداد الأمثل لخزانة Cat II ومواد الحقن في الجسم الحي للفرد الأيمن. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Ipseiz N et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: معايرة فيروس Lentivirus في خلايا Jurkat T. (أ) تحليل التدفق الخلوي التمثيلي لخلايا جوركات التائية بعد 72 ساعة من الإصابة بجرعات متزايدة من الفيروس العدسي المحتوي على بلازميد GFP يوضح النسبة المئوية لخلايا GFP ⁺ (GFP ⁺) ، (B) متوسط شدة التألق (MFI) لخلايا GFP ⁺ و (C) رسم بياني تمثيلي لتعبير GFP. (د) مخطط مبعثر يوضح MFI (يسار Y) والنسبة المئوية للخلايا المصابة بفيروس عدسي يعبر عن GFP (Y) مقابل عدد نسخ الفيروس المكتشف لكل جزء من الحمض النووي (المحور السيني). (ه) رسم بياني تمثيلي لعدوى الخلايا التائية Jurkat مع تحضير فيروس Cre-GFP lentivirus (Cre-GFP LV) دون المستوى الأمثل والتحكم في الفيروس العدسي GFP (GFP LV) و (F) بيانات موجزة توضح النسبة المئوية لخلايا Jurkat T المصابة بفيروس Cre-GFP (GFP ⁺). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Ipseiz N et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: كفاءة العدوى ل pMФ المقيم. (أ) استراتيجية البوابات لخلايا pMφ المقيمة (CD11b ⁺ ، Tim4 ⁺ ، F4 / 80⁺) وخلايا Tim4^- ، F4 / 80⁺ . كانت الخلايا مغلقة على مفردات ، متبوعة ب CD11b ⁺. (ب) مخططات نقطية تمثيلية ، و (ج) ملخص لتكرار العدوى (٪ خلايا GFP +) وشدة (MFI) لخلايا GFP ⁺ المعزولة بعد 3 أيام من الإصابة في الجسم الحي بكميات مختلفة من تحضير GFP lentivirus. (د) مخطط نقطي تمثيلي ، و (ه) ملخص لتكرار العدوى (٪ خلايا GFP +) وشدة (MFI) لخلايا GFP + المعزولة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة في الجسم الحي ب 100 ميكرولتر من فيروس lentivirus في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من وسط الوسائط الخالية من المصل. (F) ملخص لأعداد الخلايا في الأيام 7 و 14 و 21 بعد التسليم داخل الصفاق لفيروس العدس المعرب عن GFP في الفئران Foxp3-DTR-eGFP يوضح عدد pMφ المعبرة عن GFP والبلاعم الالتهابية والخلايا المتغصنة (InfMØs / DCs [F480^low]). (ن = 1-2 لكل مجموعة). (ز) مخطط نقطي تمثيلي للعدوى دون المستوى الأمثل في الجسم الحي ل Gata6-KO ^{mye 19} pMφ المقيم مع 300 ميكرولتر من الفيروس العدسي Cre-GFP بعد 7 أيام من الحقن i.p. (H) القياس الكمي RT-qPCR لتعبير mmu-miR-146b-5p للبريتوني المقيم Mφ الذي تم تحديه في الجسم الحي باستخدام 100 ميكرولتر من الفيروسات العدسية المشفرة للفأر microRNA-146b (miR-146b) أو التحكم (C). pMφ المقيم (دوائر بيضاء) وخلايا Tim4^- و F4 / 80⁺ (دوائر رمادية). (I) مخطط نقطي تمثيلي للتنظيم الناجح ل ICAM1 على pMφ في إناث الفئران 129S6 ، بعد 7 أيام من حقن i.p لفيروس lentivirus الذي يحتوي على shRNA المستهدف. يظهر التحكم shRNA. يظهر التراكب التحكم في النمط المتماثل. البيانات المعبر عنها كمتوسط ± SEM ، n≥2 الفئران. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Ipseiz N et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: كفاءة العدوى للمجموعات السكانية الفرعية المقيمة pMφ. (أ) النسبة المئوية لإجمالي الخلايا المفردة و Mφ المقيمة القابلة للحياة بعد 7 أيام من 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل (-) أو GFP lentivirus (+) i.p injection. (ب) استراتيجية البوابات التي تظهر أربع مجموعات رئيسية من pMφ الموجودة في الجسم الحي: CD73 ⁺ Tim4 ⁺ ، CD73-Tim4^- ، CD73 ⁺ Tim4^- ، CD73-Tim4 ⁺ ، و (C) تكرار العدوى المقابل (٪ خلايا GFP +) وشدة (MFI لخلايا GFP +) لهؤلاء السكان. (د) النسبة المئوية لخلايا GFP + في أعضاء متعددة بعد 7 أيام من حقن 100 ميكرولتر من فيروس العدس. الاختصارات: mLN ، العقدة الليمفاوية المساريقي. (ه) تم حقن الفئران i.p مع 0.1 مل من 4٪ ثيوغليكولات لمدة 5 أيام تليها حقن i.p مع lentivirus. استراتيجية البوابات من pMφ وحيدات بعد 3 أيام بعد حقن فيروس العدس i.p. (F) تكرار العدوى ، MFI ، وتحليل رقم الخلية لوحيدات GFP + (Ly6C ⁺) و Mφ (^Ly6C-). البيانات المعبر عنها كمتوسط ± SEM ، n≥3 الفئران. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Ipseiz N et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تأثير حقن فيروس العدس على الالتهاب البريتوني. تم حقن الفئران في الجسم الحي i.p مع GFP معبرا عن فيروس lentivirus. (أ) تواتر العدوى لتجمعات الخلايا في التجويف البريتوني بعد كميات مختلفة من حقن الفيروس العدسي (50 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر أو 150 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر). (ب) شدة تعبير GFP في مجموعات الخلايا المصابة منتجا في 7 أيام بعد الحقن i.p. (ج) تواتر العدوى لتجمعات الخلايا في التجويف البريتوني في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن i.p. (د) و(ه) النسبة المئوية للخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن i.p. تم إجراء جميع حقن الفيروس العدسي بنفس الحجم الإجمالي البالغ 200 ميكرولتر الذي تم إكماله بواسطة وسيط وسائط خال من المصل. ما لم ينص على خلاف ذلك ، تم استخدام جرعة 100 ميكرولتر من فيروس العدس. تلقت الفئران الضابطة ("C") 200 ميكرولتر من وسيط الوسائط الأنيق الخالي من المصل. البيانات المعبر عنها كمتوسط ± SEM ، n≥3 الفئران. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Ipseiz N et ^al.18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هدف الأجسام المضادة	فلوروفور	استنساخ	التخفيف المستخدم	التركيز النهائي [ميكروغرام / مل]
مستضد فيروس نقص المناعة البشرية -1 الأساسي	RD1	FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	بيركبسي سي 5.5	م5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G	بيركبسي سي 5.5	1 أ 8	1/400	0.5
CD3e	بيركبسي سي 5.5	17 أ 2	1/200	1
CD3e	بي / سي 7	500 أ 2	1/400	0.5
CD11c	بي / سي 7	إن 418	1/800	0.25
CD11c	BV605	إن 418	1/400	0.5
سي دي 226	AF647	10 ه 5	1/400	1.25
تيم 4	AF647	RTM4-54	1/600	0.83
سي دي 4	ايه بي سي	جي كي 1.5	1/400	0.5
CD11b	AF700	م1/70	1/700	0.71
CD11b	بيركبسي سي 5.5	م1/70	1/400	0.5
F4/80	أزرق المحيط الهادئ	بي إم 8	1/700	0.71
F4/80	BV605	بي إم 8	1/400	0.25
F4/80	BV711	بي إم 8	1/400	0.5
سي دي 73	إي فلور 450	تاي/11.8	1/400	2.5
سي دي 19	في 450	1D3	1/400	0.5
سي دي 19	ايه بي سي	1D3	1/400	0.5
CD8a	إي فلور 450	53-6.7	1/400	0.5
سيجليك إف	BV421	اي ٥٠-٢٤٤٠	1/400	0.5
NK1.1	APC/CY7	PK136	1/400	0.5
إفسي آر 1	إي فلور 450	مارس-1	1/400	0.5
إيكام1	بى	1أ 29	1/100	2
الجرذ IgG1 ، κ التحكم في النمط المتماثل	بى		1/100	2

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة

المناقشة

تؤدي البلاعم المقيمة في الأنسجة مجموعة من الوظائف الخاصة بالأنسجة الاستتبابية^{والالتهابية 1,2} التي تمليها بيئتها^{الفسيولوجية 6،7،8،9}. في هذا البروتوكول ، تم تقديم طريقة فعالة¹⁸ لمعالجة البلاعم المقيمة البريتونية في الجسم الحي باستخدام جزيئات lentivirus للتحقيق في وظيفة البلاعم في بيئتها الدقيقة البيولوجية.

من الضروري لنجاح البروتوكول استخدام خلايا HEK293T صحية. من أفضل الممارسات تذويب الخلايا قبل أسبوع على الأقل من بدء هذا البروتوكول لضمان استعادة الخلايا وأعداد جيدة. يجب أن تزرع الخلايا في حجم مناسب من الوسط قبل يوم واحد من النقل المخطط له ويجب أن تصل إلى حوالي 80٪ التقاء في يوم النقل. ستؤدي الاستعدادات الخلوية تحت أو الإفراط في الانكراء إلى انخفاض إنتاجية فيروس العدس. نوصي بنقل الخلايا HEK293T باستخدام كاشف النقل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للحصول على أفضل النتائج. تشمل الخطوات الأساسية لعملية النقل الخلط المناسب للبلازميدات والكواشف وإضافة المزيج بالتنقيط مباشرة إلى الطبقة الأحادية للخلية HEK293T. يمكن استخدام نقل فوسفات الكالسيوم للخلايا HEK293T^27,28 في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يجب أن يدرك المستخدم أن فعالية هذه الطريقة يمكن أن تختلف ، ويمكن أن تؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل.

يجب مراعاة احتياطات السلامة في البروتوكول من يوم نقل الخلايا HEK293T. ويشمل ذلك العمل في خزانة أمان من الفئة الثانية ، وارتداء قفازات مزدوجة عند التعامل مع المواد الملوثة ، والتبييض المناسب للمواد الملوثة (بمحلول إزالة التلوث ، على سبيل المثال ، محلول مبيض 2000 جزء في المليون) لمدة 4 ساعات على الأقل. وينبغي للمستعملين الرجوع إلى لوائحهم المؤسسية المتعلقة بالعمل مع مسببات الأمراض والنفايات من الفئة الثانية.

في هذا البروتوكول ، يتم تنقية مستحضر الفيروس العدسي أولا باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة حطام الخلية HEK293T. يجب تجنب استخدام المرشحات الأصغر (0.22 ميكرومتر) وأغشية إستر السليلوز لأنها ستؤدي إلى فقدان جزيئات فيروس العدس. يوصى باستخدام مرشحات بولي إيثر سلفون أو فلوريد البولي فينيليدين منخفضة البروتين²⁹. يتم تنفيذ خطوة التنقية الثانية على طبقة السكروز المفردة بنسبة 20٪ في جهاز طرد مركزي فائق لإزالة الشوائب المتبقية ، وهو أمر مهم بشكل خاص لما يترتب على ذلك من إدارة مستحضر فيروس العدس في الجسم الحي . في المؤسسات التي لا يتوفر فيها جهاز طرد مركزي فائق ، وصف³⁰ آخرون تنقية فيروس العدس القائم على السكروز باستخدام جهاز طرد مركزي قياسي في المختبر. ويمكن تنفيذ ذلك في هذا البروتوكول كبديل. تتم معايرة تحضير فيروس Lentivirus في خلايا Jurkat T على تعبير إشارة العلامة (على سبيل المثال ، GFP المستخدم في هذا البروتوكول). بالنسبة للتركيبات التي لا تحتوي على علامات ، يمكن تقييم جزيئات الفيروس الجسدي عن طريق القياس الكمي لبروتين HIV-1 p24gag بواسطة مجموعة ELISA³¹ ، أو تحليل قياس التدفق الخلوي للمستضد الأساسي لفيروس نقص المناعة البشرية^{-1 18} ، أو قياس التغييرات في الجين المستهدف (بشكل تفضيلي باستخدام الطرق التي تسمح بقياس التغيرات في الخلايا الفردية ، على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي أو الفحص المجهري). إذا اختلفت معايرة المجموعة الضابطة والفيروس العدسي اختلافا كبيرا في خلايا Jurkat T ، فيمكن تعديل الأحجام المستخدمة في الدراسات في الجسم الحي للوصول إلى العدوى الأكثر قابلية للمقارنة بين مستحضرات فيروس lentivirus.

يتمثل القيد الرئيسي للبروتوكول في الاختفاء الملحوظ ل GFP ⁺ البريتوني المقيم Mφ في غضون 14 يوما من حقن الفيروس العدسي i.p. بالنسبة للدراسات طويلة الأجل ، يجب اعتبار خطوط الماوس ذات التغيير الجيني المستقر في نوع معين من الخلايا أو الأنسجة³². على سبيل المثال ، نظرا لأن البلاعم البريتونية لا تعبر عن Foxp3 (بروتين T-Reg) ، فقد استخدمنا الفئران Foxp3-DTR-eGFP³³ وأكدنا أن التعبير عن GFP يتم الحفاظ عليه في Mφ البريتوني في 21 يوما بعد الإصابة (الشكل 3F). ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن الفيروسات العدسية تحتوي على مكونات غريبة أخرى ، وهذا الامتداد في استمرار الخلايا المصابة في الفئران Foxp3-DTR-GFP قد لا يكون دائما. نقطة ضعف إضافية في هذه الطريقة هي انخفاض مستوى الالتهاب الذي يمكن ملاحظته في التجويف البريتوني بعد حقن فيروس العدس ، كما يتضح من تدفق العدلات في 4 ساعات بعد الحقن (الشكل 5D) ، مما قد يعني أن العدوى المتكررة من شأنها أن تسرع من فقدان الالتهاب المرتبط ب GFP البريتوني المقيم Mφ. على الرغم من أننا لم نكتشف الإنترفيرون من النوع الأول (IFNs) في التجويف البريتوني ، فقد ثبت سابقا أن جزيئات الفيروس العدسي ذات النمط الكاذب VSV-G تحفز بعض الجينات المحفزة ب IFN في Mφ البشري في غياب IFNs³⁴ القابلة للاكتشاف. يجب مراعاة ذلك عند استخدام هذا البروتوكول لإجراء تجارب تبحث في الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات. قد يشير حدوث التهاب حاد ومستمر بعد حقن i.p من مستحضر فيروس العدس إلى تلوث المستحضر.

تشمل مجالات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ما يلي: 1) بالنسبة لعيار فيروس العدس المنخفض ، تأكد من صحة الخلايا HEK293T والنقل الفعال (على سبيل المثال ، تعبير العلامة ، إن وجد ، في خلايا HEK293T). إذا ظل معدل الإصابة منخفضا ، ففكر في حجم البناء. يمكن أن تؤثر التركيبات ذات الإدخالات الأكبر أو الهياكل الثانوية الأكثر تعقيدا على عيار فيروس العدس النهائي والعدوى²⁴. لذلك ، يجب اختبار كل بنية بشكل مستقل وبالتوازي مع ناقل التحكم الخاص بها ؛ 2) إذا كانت هناك حاجة إلى كمية كبيرة من فيروس العدس ، فمن المستحسن إعداد قوارير T175 متعددة من الخلايا HEK293T وزيادة الإنتاج وفقا لذلك. لتجنب الاختلاف في مستحضرات فيروس العدس ، من أفضل الممارسات دمج المجموعات النهائية قبل الاقتباس والتخزين. لمثل هذا الإنتاج الأكبر ، يجب تحضير مزيج البلازميدات (القسم 2) في أنابيب سعة 50 مل لضمان الخلط الفعال للمكونات.

على الرغم من الانتحاء الواسع ، فإن جزيئات VSV-G ذات النمط الكاذب من الفيروسات العدسية تستهدف في الغالب بلاعم الأنسجة كما هو موضح سابقا للسنخية³⁵ ، وهنا¹⁸ ل pMФ عندما تدار من قبل الطرق المعنية. يمكن أن تؤدي التعديلات في الغلاف على جزيئات الفيروس العدسي ، في بعض الحالات ، إلى تقليل نقل البلاعم في الجسم الحي³⁶ وهي غير ضرورية لهذا البروتوكول. بالمقارنة مع الأساليب الفيروسية الأخرى لمعالجة الجينات في الجسم الحي في الضامة (تمت مراجعتها في³⁷) ، فإن استخدام ناقلات الفيروسات العدسية يوفر تكاملا مستقرا لجين التحوير في بلاعم^{الأنسجة 35} ، وتعبير فعال لجين التحوير ، وأكبر حد لحجم الناقل (حوالي 8 كيلو بايت).

يلعب البريتوني Mφ دورا مهما في الوقاية من الأمراض المختلفة وظهورها وتطورها وحلها ، بما في ذلك سرطانات البطن والتهاب البنكرياس والتهاب الصفاق³⁸. يصف هذا البروتوكول أداة فعالة لتعديل الجينات في الفئران pMφ ، مما يسمح بالتحقيق في العمليات البيولوجية وراء هذه الأمراض داخل بيئة دقيقة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. في حين أن النواقل الفيروسية العدسية نفسها أصبحت أداة اهتمام للتدخلات السريرية³⁹ ، بسبب الأصل من فيروس نقص المناعة وتكامل الجينوم المستقر ، فإن مخاوف السلامة تعيق تنفيذها العلاجي. يمكن أن يؤدي الفهم الإضافي لاستجابات البلاعم لتعديل الجينات الفيروسية العدسية إلى تعزيز تطبيق هذه الأداة الفعالة للغاية في بيئة سريرية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.05٪ Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 مجم / لتر أو 0.02 ملليمتر) Thermo	Fisher Scientific	25300054
0.22 & mu ؛ م مرشح معقم millex GP	Merck	SLGS033SS
0.45 & mu ؛ مرشح m معقم millex GP	Merck	SLHP033RS
0.5 مل U-100 حقنة أنسولين مع إبرة ، 0.33 مم × 12.7 مم (29 جم) BD		324892
حاوية أدوات حادة 1 لتر	N / A	N / A
2.4G2 (TruStain FcX مضاد للفأر CD16 / 32) Biolegend		101320
40 & mu ؛ مصفاة m	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV المتوسطة (درجة البحث) ، مكمل AlbuMax	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	المحضر في المنزل
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	محلول مخزون 4٪ محضر في الماء ، معقم ومحفوظ مجمدا.
CD11b	Biolegend	101222	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD11b	BD	550993	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD11c	Biolegend	117317	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD11c	Biolegend	117333	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD19	BD	560375	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD19	Biolegend	152410	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD226	Biolegend	128808	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD3e	BD	560527	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD3e	Biolegend	152313	ارجع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD4	Biolegend	100412	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD73	eBioscience	16-0731-82	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
CD8a	eBioscience	48-0081-82	الرجوع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
قارورة زراعة الخلية (برميل T175 ، 175 سم 2< / sup> ، 550 مل)	Greiner Bio One	658175
، أنابيب سفلية مخروطية 25 مم × 89 مم	بيكمان كولتر	358126
	Beckman Coulter		Ultra Sentrifuge وأجهزة الطرد المركزي TC
Collagenase Type IV	Sigma-Aldrich	C5138
الطرد المركزي المخروطية الشكل (15 مل و 50 مل)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	أو cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5 جم / لتر D-glucose ، 400 & micro ؛ M L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
كاشف تعداء Effectene	Qiagen	301425
F4 / 80	Biolegend	123123	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
F4 / 80	Biolegend	123133	ارجع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
F4 / 80	Biolegend	123147	الرجوع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
FceR1	eBioscience	48-5898-80	الرجوع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	معطلة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة ؛ C ومعقم مرشح من خلال 0.22 & mu; م مرشح
مقياس التدفق	الخلوي Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow Cellular Circuit Buffer (FACS)	محضر في المنزل
مجهر زراعة الأنسجة الفلورية	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Compps	N / A	N /	A تفضيل المستخدم
محلول الملح المتوازن Hank (HBSS)	Gibco ، Life Technologies	14175-053
HEK293T خط		الخلايا	نمت لمدة أسبوع على الأقل قبل التعداد. مستضد فيروس نقص المناعة البشرية 1 الأساسي الخالي من الميكوبلازما
	بيكمان كولتر	6604667
هيالورونيداز	سيجما ألدريتش	H3506
مقشر جراحي هيدركس ، كلورهيكسيد غلوكونات 4٪ وزن / حجم منظف للبشرة	Ecolab	3037170
I-A / I-E	Biolegend	107625	الرجوع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
ICAM1	Becton Dickinson	554970	راجع الجدول 1 للاطلاع على
		الخلايا التائية Jurkat	المزروع لمدة أسبوع على الأقل قبل الاستخدام. طقم بقع الخلايا الميتة القريبة من الأشعة تحت الحمراء الخالية من الميكوبلازما
الخالية من الميكوبلازما	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	راجع الجدول 1 للتخفيف والتركيز
الفئران			هنا C57BL / 6 إناث ، تتراوح أعمارهن بين 8-12 أسبوعا (تشارلز ريفرز) ، ما لم يتم تحديدها بشكل مختلف
الماصات الشعرية الدقيقة (نطاق الحجم 0.5-1,000 & mu ؛ ل)	فيشر ساینتيفيك & أمبير ستارلاب	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	الرجوع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	المحضر إلى 2٪ وزن / حجم في PBS
pCMV- & Delta ؛ R8.91 التعبئة والتغليف بلازميد		Zuffrey، R.، et al. 1997	يشفر بروتين فيروس نقص المناعة البشرية Gag-Pol المدفوع بواسطة محفز الفيروس المضخم للخلايا. مقاومة الأمبيسيلين.
البنسلين / الستربتومايسين (100x ، 10,000 وحدة / مل)	Thermo Fisher Scientific	15140122
طبق بتري	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW البلازميد		Rosas، M. et al. 2014	تم تعديله لدراسات تعبير shRNA و miR. يشفر علامة EGFP في اتجاه مجرى النهر SFFV المروج والمنبع لمحسن فيروس الكبد Woodchuck. مقاومة الأمبيسيلين.
pMD2.G البلازميد		Naldini، L. et al. 1996	يشفر مغلف فيروس الفم الحويصلي g-glycoprotein (VSV-G). مقاومة الأمبيسيلين.
Rat IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط النظيري	Becton Dickinson	550617	الرجوع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
مصل الفئران	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
عازلة تحلل ACK للدم الأحمر	المحضرة في المنزل
RPMI 1640 متوسط (1x) + 400 ميكرومتر L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	ارجع إلى الجدول 1 للتخفيف والتركيز
أقراص هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض ، 2,000 جزء في المليون)	لوحة زراعة الخلايا المعقمة	H8818
	Greiner Bio One	662160
Dulbecco's PBS المعقمة (DPBS) (1x) Mg++< / sup> و Ca2 + < / sup> - مجاني	14190144 Thermo Fisher Scientific
	Fisher Scientific	10084450 & amp 768160
Tim4	Biolegend	130007	راجع الجدول 1 للحصول على التخفيف والتركيز
على شكل حرف U-bottom 96 بئر لوحة زراعة الخلايا	Greiner Bio One	650180