طريقة التثبيت العمودي لتحليل الفحص المجهري بفاصل زمني في البكتيريا الزرقاء الخيطية

Summary

نقدم طريقة بسيطة ويمكن الوصول إليها لتصور البكتيريا الزرقاء الخيطية في المستوى XY. تم استخدام مصفوفة أغاروز منخفضة النقطة ، مما يسمح بالحصول على صور للبروتينات المشاركة في الانقسام ، في اتجاه رأسي. لذلك ، يمكن تطبيق هذه المنهجية على أي كائن خيطي وأنواع مختلفة من البروتينات.

Abstract

الحدث الرئيسي في انقسام الخلايا البكتيرية هو عملية التقسيم ، حيث يكون بروتين FtsZ هو العنصر الأساسي. بلمرة FtsZ لتشكيل بنية تشبه الحلقة (حلقة Z) في منتصف الخلية التي تعمل بمثابة سقالة لبروتينات الانقسام الأخرى. أظهر الفحص المجهري فائق الدقة في النماذج البكتيرية Escherichia coli و Bacillus subtilis أن الحلقة Z متقطعة ، بينما أظهرت دراسات تصوير الخلايا الحية أن FtsZ يتحرك على طول الحلقة بواسطة آلية تعرف باسم جهاز المشي. لدراسة ديناميات FtsZ في الجسم الحي ، يعد وضع خلية خاصة في وضع رأسي ضروريا لتصوير البنية الكاملة للحلقة في المستوى XY. في حالة تصوير FtsZ في البكتيريا الزرقاء متعددة الخلايا ، مثل Anabaena sp. PCC7120 ، فإن الحفاظ على الخيوط في وضع عمودي يمثل تحديا بسبب حجم الخلايا وطول الخيوط. في هذه المقالة ، نصف طريقة تسمح بالشلل الرأسي لخيوط Anabaena sp. PCC 7120 باستخدام أغاروز ومحاقن منخفضة نقطة الانصهار ، لتسجيل الحلقة Z في متحولة تعبر عن بروتين اندماج FtsZ-sfGFP. هذه الطريقة هي طريقة سريعة وغير مكلفة لتسجيل ديناميكيات البروتين في موقع الانقسام باستخدام المجهر متحد البؤر.

Introduction

انقسام الخلايا البكتيرية هو العملية التي تولد فيها الخلية الأم خليتين ابنتين ، في معظم الحالات بواسطة الآلية المعروفة باسم الانشطار الثنائي. أحد الأحداث المبكرة في عملية الفصل هو توطين FtsZ في منتصف الخلية¹. يتم حفظ هذا البروتين ، المتماثل هيكليا مع توبولين² ، وتوزيعه على نطاق واسع في معظم البكتيريا ، وتولد بلمرته بنية مقلصة تعرف باسم الحلقة Z³. تعمل هذه الحلقة كسقالة لبروتينات الانقسام الأخرى وتشكل معا آلية جزيئية تسمى divisome. أظهرت العديد من الدراسات أن الحلقة Z ديناميكية للغاية وأن خيوط FtsZ الأولية تتحرك عن طريق الطحن^4،5،6. لدراسة الحلقة Z في تجارب الفاصل الزمني ، ينصح بتسجيل موقع القسمة في المستوى XY للحصول على دقة أفضل وأخذ عينات سريعة. من أجل تحقيق ذلك ، من الضروري تطوير طرق تجميد الخلايا العمودية التي تشمل عادة التصنيع النانوي لمصائد الخلايا ذات الثقوب الدقيقة وأجهزة الموائع الدقيقة^{المعقدة 7}.

البكتيريا الزرقاء هي كائنات دقيقة ضوئية تصنف على أنها سالبة الجرام من خلال مورفولوجيتها الخلوية. ومع ذلك ، من الناحية التطورية فهي أقرب إلى البكتيريا إيجابية الجرام⁸. تحتوي هذه الكائنات الحية على جينات انقسام الخلايا الشائعة داخل البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام ، لكن قسمها يحتوي أيضا على عناصر فريدة⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (المشار إليها فيما يلي باسم Anabaena sp.) هي بكتيريا زرقاء خيطية ذات مستوى تقسيم واحد وهي نموذج لدراسة انقسام الخلايا في البكتيريا الزرقاء متعددة الخلايا. في هذه السلالة ، كان من الممكن تحديد موضع FtsZ في منتصف الخلايا¹⁰. ومع ذلك ، لا توجد دراسات تظهر ديناميكيات FtsZ في الجسم الحي في هذا النموذج. في مختبرنا ، من خلال التزاوج الثلاثي وإعادة التركيب المتماثل ، حصلنا على طفرة منفصلة تماما من Anabaena sp. التي تعبر عن بروتين FtsZ المنصهر في sfGFP ، والذي حل محل جين ftsZ الداخلي الكامل. لقد طورنا طريقة سريعة وبسيطة لتجميد الخلايا تفضل الاتجاه الرأسي لخيوط السلالة الطافرة لتجارب الفاصل الزمني لتصور انقسام البروتينات في البكتيريا الزرقاء الخيطية. لا تحتاج هذه الطريقة إلى أجهزة الموائع الدقيقة التي يمكن أن تكون باهظة الثمن ويصعب تطويرها. على سبيل المثال ، استخدمنا هذا البروتوكول لتصور الحلقة Z في متحولة FtsZ-sfGFP بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.

Protocol

1. اعتبارات واختيار النموذج الخلوي

ملاحظة: البكتيريا الزرقاء لها تألق ذاتي قوي بسبب وجود أصباغ التمثيل الضوئي. هذه الإشارة موجودة في الجزء الأحمر من الطيف ، وبالتالي ، فإن البروتينات الفلورية المناسبة للتصوير في البكتيريا الزرقاء هي تلك البعيدة عن الانبعاث الأحمر. على سبيل المثال ، GFP و YFP و Venus و Turquoise و BFP.

1. حدد مكونا ثنائيا موجودا في سلالة البكتيريا الزرقاء الخيطية المستهدفة. بالنسبة للتجارب ، من الضروري بناء طفرة بكتيرية زرقاء خيطية تعبر عن المكون ثنائي الانقسام المختار المنصهر في بروتين الفلورسنت. في هذا البروتوكول ، أ Anabaena sp. متحولة تعبر عن FstZ-sfGFP ، كمثال. تم الحصول على هذه السلالة عن طريق التزاوج الثلاثي مع الإشريكية القولونية¹¹.
2. تحقق من مستوى فصل المتحور الذي سيتم استخدامه. في المثال ، تم تحديد الفصل عن طريق تضخيم PCR للجين المستهدف. متحور FtsZ-sfGFP المستخدم في هذا البروتوكول هو سلالة منفصلة تماما تفتقر إلى جين ftsZ من النوع البري.

2. ظروف النمو

1. قم بعمل مزرعة فرعية جديدة من الطافرة باستخدام مزرعة 10 مل في المرحلة الثابتة (نمت لمدة 14 يوما تقريبا في ضوء ثابت ، عند 25 درجة مئوية ، ل Anabaena sp.) وإضافة إلى 90 مل من وسط BG11 المكمل بالمضادات الحيوية (سبكتينومايسين والستربتومايسين 10 ميكرولتر مل -1 لمتحولة FtsZ-sfGFP).
2. تنمو زراعة الخلايا الجديدة في ضوء ثابت وفي درجة الحرارة المثلى حتى الوصول إلى المرحلة الأسية. يزرع متحور FtsZ-sfGFP من Anabaena sp. عند 25 درجة مئوية لمدة 7 أيام قبل تحضير العينة.

3. إعداد عينة في مصفوفة أغاروز

1. خذ 2 مل من ثقافة النمو المتجانسة.
2. جهاز طرد مركزي عند 2500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. في غضون ذلك ، في دورق سعة 50 مل ، قم بتسخين 30 مل من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار بنسبة 3٪ في وسط سائل BG11. استخدم ضبط الميكروويف على مستوى الطاقة المتوسط وتحقق من المحلول كل 15 ثانية حتى يذوب تماما. توضع جانبا لتبرد إلى 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: الأوتوكلاف محلول الأغاروز لتجنب التلوث.
4. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي ، تخلص من 1.9 مل من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في الحجم المتبقي عن طريق سحب ثلاث مرات على الأقل لأعلى ولأسفل.
5. امزج الخلايا المعاد تعليقها مع 900 ميكرولتر من محلول الأغاروز 3٪ عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل.
   ملاحظة: يجب أن يكون محلول الأغاروز سائلا ولكن ليس ساخنا جدا لتجنب تلف الخلايا. يجب تنفيذ الخطوة التالية بسرعة وقبل أن يشكل محلول الأغاروز مادة هلامية مثل الاتساق =.
6. نضح مصفوفة الأغاروز في حقنة 1 مل بعناية. من المهم تجنب توليد الفقاعات أثناء استنشاق العينة باستخدام المحقنة.
   ملاحظة: قبل هذه الخطوة ، تأكد من قطع طرف المحقنة لإزالة فتحة الدخول الضيقة.
7. دع خليط عينة الأغاروز يتصلب عن طريق وضع المحقنة في الوضع الأفقي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
8. قم بإزالة مصفوفة الأغاروز بعناية باستخدام المكبس وضعه على سطح نظيف ومستو.
9. قطع العينة الصلبة إلى شرائح ، في نطاق سمك 0.5 - 1 مم ، والحفاظ على سلامة المصفوفة.
   ملاحظة: للحصول على نتائج أفضل ، قم بقص مصفوفة الأغاروز باستخدام مشرط أو شفرات حلاقة رفيعة.
10. ضع الشرائح جنبا إلى جنب على غطاء. يعتمد عدد الأقراص الموجودة على قسيمة الغطاء على أبعادها.
    ملاحظة: بالنسبة للفحص المجهري بفاصل زمني ، يوصى باستخدام حجرة خلوية مصنوعة للتحليل المجهري (على سبيل المثال ، غرف Attofluor أو Chamlide المغناطيسية). تسمح هذه الغرف بالحصول على العينة لتجنب الجفاف. في هذا المثال ، يتم تحضير العينات على أغطية مستديرة (25 مم) باستخدام غرفة Attofluor.
11. أضف 2 مل من محلول الأغاروز المذاب بنسبة 3٪ على العينة الموضوعة في الحجرة لمنع الجفاف.
12. انتظر حتى يتم ترسيخ محلول الأغاروز تماما لتشكيل هلام.

4. الحصول على الصور

1. توحيد المعلمات لتصور البروتين الفلوري محل الاهتمام في سلالة متحولة في المجهر متحد البؤر. تأكد من أن المجهر يمكنه اكتشاف كل من التألق الذاتي وعلامة الفلورسنت المحددة.
2. تصور العينة في شكل المجال الساطع بأقصى تكبير ، وابحث عن خيوط موجهة رأسيا كما هو موضح في الشكل 1.
3. ابحث عن موقع التقسيم محل الاهتمام من خلال مسح أولي باستخدام إشارة التألق الذاتي على طول المستوى Z.
4. استخدم معلمات علامة البروتين الفلوري لتصور إشارة البروتين محل الاهتمام في موقع التقسيم.
5. إجراء تجارب الفاصل الزمني وفقا للنموذج البيولوجي والبروتين محل الاهتمام. على سبيل المثال ، في هذه الحالة ، تم إجراء تجارب الفاصل الزمني لمدة 10 ثوان في 50 ثانية لتسجيل ديناميكيات FtsZ على طول الحلقة Z في Anabaena sp. (الشكل 2).

Results

تصور الحلقة Z في Anabaena sp. باستخدام طريقة الشلل الرأسي
لدراسة ديناميات مكونات الحلقة Z في البكتيريا ، من الضروري الحصول على صور في الخلايا الموجهة رأسيا. في هذا الموقف ، من الممكن تصور الحلقة Z والبروتينات الرئيسية لل divisome لمراقبة ديناميكيات البروتين عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني. لا يعمل تحضير العينة الكلاسيكي للبكتيريا مع البكتيريا الزرقاء الخيطية. في حالة Anabaena sp. ، يتم توجيه الخيوط في وضع لا يسمح بتصور الحلقة Z. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن الحفاظ على الخيوط ثابتة من ...

Discussion

لا شك أن دراسة ديناميات البروتينات ثنائية الانقسام تمثل تحديا. على وجه الخصوص ، في البكتيريا الزرقاء الخيطية ، يتمثل أحد التحديات في تصور الحلقة Z في المستوى الأفقي ، والتي يجب أن تكون الخلايا موجهة رأسيا لها. تسمح الطريقة التي وصفناها هنا بوضع الحلقة Z في المستوى XY لإجراء التحليلات المختلفة. هذه هي أول طريقة بسيطة للبكتيريا الزرقاء الخيطية التي تسمح بالتصور الكامل للحلقة Z.

على الرغم من أن هذا البروتوكول بسيط وسريع ، إلا أنه يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء خطوة تحضير العينة في مصفوفة الأغاروز...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 مل حقنة	تشينغداو أغنا التكنولوجيا الطبية المحدودة	-	المحقنة البلاستيكية الطبية التي تستخدم لمرة واحدة مع إبرة 1 مل تستخدم بشكل عام لضخ السائل أو سائل الحقن ، في هذه التجربة يتم استخدامها لامتصاص العينة وجعلها تتبلمر.
غرفة الخلية الآتوفلورية	ThermoFischer Scientific	A7816	كاميرا الخلية الآتوفلورية عبارة عن حامل غطاء متين وعملي مصمم لعرض عينات الخلايا الحية في المجاهر المستقيمة أو المقلوبة.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler مع 96 كتلة بئر	CORNING	THERM-1001	زادت MaxyGene II Thermal Cycler الجديدة من السرعة والميزات المتقدمة ، مما يوفر الأداء المتميز الذي تتوقعه من منتجات العلامة التجارية Axygen. برمجة مرنة فريدة من نوعها. أوقات تشغيل سريعة. تحسين سير العمل على الدراجات المتدرجة التقليدية. معدلات تكثيف تصل إلى 5 درجات ؛ ج / ثانية. غطاء ساخن قابل للتعديل يستوعب الشرائط والأنابيب والألواح الدقيقة.
نظارات غطاء فيشربراند: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	مصنوعة من أجود أنواع زجاج البورسليكات البصري ، بسماكة وحجم موحدين. شكل دائري. مقاومة للتآكل.
نقطة انصهار منخفضة الاغاروز	Promega	V3841	الاغاروز ، نقطة انصهار منخفضة ، درجة تحليلية ، مثالية للتطبيقات التي تتطلب استعادة شظايا الحمض النووي السليمة بعد الرحلان الكهربائي للهلام.
مجهر LSM 880 من Zeiss Airyscan	Zeiss	-	مجهر Zeiss Airyscan LSM 880 عبارة عن مجهر بؤري للمسح بالليزر يمكنه الحصول على صور تحت حد الدقة (الدقة الجانبية ~ 120 نانومتر والدقة المحورية ~ 350 نانومتر). أجهزة الكشف حساسة للغاية مما يجعل من الممكن الحصول على صور فائقة الدقة بسرعة عالية.
Microcentrí fuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	تسريع عمليات تحضير العينات الروتينية حتى 17,000 مرة مع جهاز الطرد المركزي الدقيق القياسي ، المتوفر مع التبريد. توفر أجهزة الطرد المركزي الدقيقة هذه الإنتاجية وتعدد الاستخدامات والسلامة والراحة في أداة مختبرية سهلة الاستخدام وصغيرة الحجم.
نيكون مجهر الفاصل الزمني	نيكون	-	يعد المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر C2 من نيكون مجهرا مثاليا للفاصل الزمني طويل المدى ، لأنه بفضل غرفة الحضانة الخاصة به ، من الممكن الاحتفاظ بالعينات في الظروف المثلى لأكثر من 8 ساعات.
شفرات حلاقة رفيعة Schick Super Chromium	Farmazon	رمز المنتج: 401146	تستخدم شفرات الحلاقة الرفيعة لقطع مصفوفة الاغاروز ، مما يسمح لنا بالحصول على الأقراص مع العينة مع الحفاظ على سلامة المصفوفة.