مقالة منهجية

استكشاف العمل الدوائي والآلية الجزيئية للساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها

DOI:

10.3791/65634

⸱

يونيو 9, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استراتيجية شاملة لتقييم العمل الدوائي وآلية الساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي Salidroside (Sal) على أنشطة دوائية مضادة للسرطان ومضادة لنقص الأكسجين ومضادة للالتهابات. ومع ذلك ، فقد تم توضيح آلياته الأساسية المضادة لسرطان الثدي بشكل غير كامل. ومن ثم ، يهدف هذا البروتوكول إلى فك تشفير إمكانات Sal في تنظيم مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 في الانتشار الخبيث لخلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. أولا ، تم تقييم النشاط الدوائي ل Sal ضد MCF-7 بواسطة CCK-8 ومقايسات خدش الخلية. علاوة على ذلك ، تم قياس مقاومة خلايا MCF-7 عن طريق مقايسات الهجرة وغزو Matrigel. بالنسبة لموت الخلايا المبرمج ومقايسات الدورة ، تمت معالجة خلايا MCF-7 في خطوات مع الملحق V-FITC / PI ومجموعات الكشف عن تلطيخ دورة الخلية لتحليلات قياس التدفق الخلوي ، على التوالي. تم فحص مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) و Ca2+ بواسطة DCFH-DA و Fluo-4 AM تلطيخ المناعي. تم تحديد أنشطة Na + -K + -ATPase و Ca2 + -ATPase باستخدام المجموعات التجارية المقابلة. تم تحديد مستويات البروتين والتعبير الجيني في موت الخلايا المبرمج ومسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 باستخدام تحليلات اللطخة الغربية و qRT-PCR ، على التوالي. وجدنا أن علاج سال حد بشكل كبير من انتشار وهجرة وغزو خلايا MCF-7 ذات التأثيرات المعتمدة على الجرعة. وفي الوقت نفسه ، أجبرت إدارة سال أيضا خلايا MCF-7 بشكل كبير على الخضوع لموت الخلايا المبرمج وإيقاف دورة الخلية. أظهرت اختبارات التألق المناعي أن سال حفز بشكل ملحوظ إنتاج ROS و Ca2+ في خلايا MCF-7. أكدت بيانات أخرى أن سال عزز مستويات التعبير عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج ، باكس ، بيم ، كاسباز المشقوق -9/7/3 ، والجينات المقابلة لها. باستمرار ، قلل تدخل سال بشكل بارز من التعبير عن بروتينات Bcl-2 و p-PI3K / PI3K و p-AKT / AKT و mTOR و HIF-1α و FoxO1 والجينات المقابلة لها. في الختام ، يمكن استخدام Sal كمركب مشتق من الأعشاب لعلاج سرطان الثدي ، لأنه قد يقلل من الانتشار الخبيث والهجرة وغزو خلايا MCF-7 عن طريق تثبيط مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كواحد من أكثر أنواع السرطان التي يتم تشخيصها شيوعا والأورام الخبيثة الأكثر شيوعا ، تشير أحدث الإحصاءات إلى ظهور 2.3 مليون حالة من سرطان الثدي حول العالم بحلول عام 2020 ، وهو ما يمثل 11.7٪ من جميع حالات السرطان1. تشمل الأعراض الشائعة لسرطان الثدي إيلام الثدي وخزه ، وكتل الثدي والألم ، وإفرازات الحلمة ، وتآكل الجلد أو غائرته ، وتضخم الغدد الليمفاوية الإبطية 1,2. والأمر الأكثر إثارة للقلق هو أن عدد الحالات الجديدة ومعدل الإصابة الإجمالي بسرطان الثدي مستمران في الزيادة بمعدل هائل كل عام ، وهو ما يمثل 6.9٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان1. في الوقت الحاضر ، لا يزال التدخل في سرطان الثدي ينطوي بشكل أساسي على العلاج الكيميائي والجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الشامل. على الرغم من أن العلاج يمكن أن يقلل بشكل فعال من معدل التكرار ومعدل وفيات المرضى ، إلا أن تطبيق العلاج على المدى الطويل غالبا ما يسبب مقاومة للأدوية المتعددة ، وتساقط الشعر في منطقة كبيرة ، والغثيان والقيء ، وعبء عقلي خطير 2,3. والجدير بالذكر أن الخطر المحتمل لنقائل الأعضاء المتعددة من سرطان الثدي يجبر الناس أيضا على البحث عن مصادر عشبية جديدة للعلاج الدوائي 4,5.

الإشارات بوساطة فوسفوينوسيتيد 3 كيناز (PI3K) متورطة في نمو سرطان الثدي وتكاثره وبقائه على قيد الحياة من خلال الربط الذي يؤثر على التعبير عن جينات متعددة6. كبروتين استشعار إشارة المصب من PI3K ، تشير العديد من الأدلة إلى أن بروتين كيناز B (AKT) يمكن أن يقترن بهدف الثدييات لبروتين rapamycin (mTOR) لزيادة سرطان الثدي7،8،9. علاوة على ذلك ، زعم أيضا أن إلغاء تنشيط إشارات PI3K / AKT / mTOR هو عنصر رئيسي في الأدوية التي تثبط الانتشار الخبيث وتحفز موت الخلايا المبرمج في سرطان الثدي10،11،12. من المعروف أن نقص الأكسجة الشديد في البيئة المكروية للورم يفرض زيادة هائلة في العامل 1 ألفا المحرض على نقص الأكسجة (HIF-1α) ، مما يزيد من تفاقم تطور سرطان الثدي13،14،15. في موازاة ذلك ، يؤدي تحفيز AKT أيضا إلى تراكم مفرط ل HIF-1α ، مما يحد من موت الخلايا المبرمج في عينات سرطان الثدي16,17. ومن المثير للاهتمام ، أن تنشيط إشارات PI3K-AKT-HIF-1α قد تم تأكيده للمشاركة في التقدم المرضي وورم خبيث في مجموعة متنوعة من السرطانات ، بما في ذلك سرطان الرئة18 وسرطان القولون والمستقيم19 وسرطان المبيض20 وسرطان البروستاتا21. بالإضافة إلى تنسيقه بواسطة HIF-1α ، يتم أيضا تشغيل التعبير المفرط لعامل نسخ الرأس المتشعب 1 (FoxO1) عن طريق تحفيز إشارات AKT ، مما يعزز توقف الدورة وتثبيط موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الثدي22,23. معا ، تشير الأدلة القوية المذكورة أعلاه إلى أن تثبيط سلسلة إشارات PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 قد يكون هدفا جديدا محتملا للعلاج الدوائي في سرطان الثدي.

ثبت على نطاق واسع أن Salidroside (Sal) يمارس أنشطة مضادة للسرطان24،25 ، ومضاد لنقص الأكسجة 26،27،28،29 ، والأنشطة الدوائية المعززة للمناعة30. إنه مسحوق بني فاتح أو بني قابل للذوبان في الماء بسهولة ، وهو نوع من جليكوسيد phenylethanoid ، وله صيغة بنية كيميائية من C14H 20 O7 ووزن جزيئي300.331,32. أظهرت التحقيقات الدوائية الحديثة أن Sal يمكن أن يعزز موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان المعدة عن طريق تقييد إشارات PI3K-AKT-mTOR24. تشير أدلة أخرى أيضا إلى أن قمع إشارات PI3K-AKT-HIF-1α بواسطة علاج Sal قد يساهم في موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية من خلال تعزيز حساسيتها لعوامل العلاج الكيميائي25. تشير الدلائل أيضا إلى أن Sal يقيد هجرة الخلايا وغزوها ويسبب توقف الدورة من خلال تعزيز موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الثدي البشري MCF-733,34. ومع ذلك ، يبقى أن نرى ما إذا كان بإمكان Sal تنظيم إشارات PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 وتمنع الانتشار الخبيث لخلايا MCF-7. لذلك ، يهدف هذا البروتوكول إلى استكشاف تأثيرات Sal على هجرة خلايا MCF-7 ، والغزو ، ودورة الخلية ، وموت الخلايا المبرمج عبر مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. يمكن أن توفر استراتيجيات البحث المتكاملة التي تضم تجارب تقليدية ومنخفضة التكلفة ومستقلة ، مثل تقييمات هجرة الخلايا والغزو ، وموت الخلايا المبرمج واكتشاف دورة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وتحديد مضان الكالسيوم2+ ، وما إلى ذلك ، مرجعا للتصميم العام لتجارب أبحاث مكافحة السرطان مع الأدوية العشبية التقليدية. العملية التجريبية لهذه الدراسة موضحة في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على خلايا MCF-7 المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. ثقافة الخلية

  1. قم بزراعة خلايا MCF-7في جو CO 2 مرطب بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية مع DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين (10000 وحدة / مل) / ستربتومايسين (10000 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تم استخدام الخلايا التي تغطي 90٪ من قاع الطبق للتجربة وتم تعيينها في المجموعات التالية: مجموعة التحكم ، مجموعة دوكسوروبيسين هيدروكلوريد (DXR ، 5 ميكرومتر) ، ومجموعات سال (20 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر ، و 80 ميكرومتر) ، أو مجموعة التحكم ، LY294002 (10 ميكرومتر ، مثبط ل PI3K) ، مجموعة Sal (80 ميكرومتر) ، ومجموعة LY294002 (10 ميكرومتر) + سال (80 ميكرومتر) (انظر جدول المواد).

2. فحص صلاحية الخلية

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق27.

  1. خلايا البذور MCF-7 بكثافة 8 × 104 خلايا / بئر في 96 لوحة بئر ، واحتضانها مع Sal (10 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، 160 ميكرومتر ، و 320 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة أو سال (20 ، 40 ، 80 ميكرومتر) لمدة 12 ساعة / 24 ساعة / 36 ساعة / 48 ساعة طوال الليل حتى تلتصق الخلايا.
  2. بعد العلاج ، شارك في احتضان خلايا MCF-7 ب 10 ميكرولتر / بئر من محلول CCK-8 (انظر جدول المواد) لمدة 2 ساعة. بعد ذلك ، قم بقياس الكثافة الضوئية عند 450 نانومتر (OD450) باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة التلقائي.

3. هجرة الخلايا والغزو

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق35.

  1. احتضان 2 مل من 5 × 106 خلايا / مل خلايا مصنفة في 6 آبار لتغطية 90٪ من قاع الطبق.
  2. قم بإجراء جرح خدش خطي على طول مركز الطبقة الأحادية للخلية باستخدام طرف ماصة معقم. التقط الصور باستخدام المجهر الضوئي عند 0 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة.
  3. استخدم برنامج Image J لقياس عرض جروح الخدش.
  4. بالنسبة لمقايسة السيرسويل ، قم بتعليق خلايا MCF-7 بدون وسط مصل ، والبذور في غرفة الإرسال العلوية المطلية مسبقا ب Matrigel أو بدونه (انظر جدول المواد).
  5. في الجزء السفلي من غرفة transwell ، استخدم وسط DMEM الكامل كمحفز كيميائي. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الخلايا الموجودة في الغرفة العلوية ، وقم بإصلاح الخلايا الغازية والمهاجرة المتبقية في الميثانول35.
  6. قم بتلطيخ خلايا MCF-7 بمحلول بنفسجي بلوري (انظر جدول المواد). التقط الصور باستخدام المجهر الضوئي.

4. تقييم نشاط Na + -K + -ATPase و Ca 2 + -Mg 2 + -ATPase

  1. استخدم مجموعة حمض البيسينتشونينيك (BCA) لقياس تركيز البروتين في خلايا MCF-7 المحللة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    1. أضف عينات من الخلايا المحللة في مجموعاتها المقابلة في لوحات 96 بئرا. بعد ذلك ، أضف محلول العمل لمزيد من الاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أخيرا ، قم بقياس قيم OD636 باستخدام قارئ microplate متعدد الوظائف.

5. تحليل التدفق الخلوي لموت الخلايا المبرمج ودورة الخلية

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق31.

  1. هضم الخلايا ، والحصاد لإعادة تعليقها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 20 دقيقة تلطيخ مع الملحق V-FITC ويوديد البروبيديوم (PI) (انظر جدول المواد) ، ثم حدد عدد الخلايا المبرمج باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
  2. امزج محلول العينة المعاد تعليقه مع محلول PI لمدة 30 دقيقة حضانة ، متبوعا بالكشف باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

6. DCFH-DA و Fluo-4 AM تلطيخ مضان

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى تقرير سابق29.

  1. احتضان خلايا MCF-7 لمدة 20 دقيقة باستخدام مسبار مضان DCFH-DA 10 ميكرومتر (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة الفائض DCFH-DA تماما عن طريق الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS ، اختبر شدة التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث البالغة 488 نانومتر و 525 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام مجهر مضان.
  2. احتضان خلايا MCF-7 بمحلول مسبار فلوري 5 ميكرومتر Fluo-4 AM (انظر جدول المواد) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الغسيل باستخدام PBS ثلاث مرات ، حدد قيم شدة التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث البالغة 488 نانومتر و 516 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام مجهر مضان.

7. لطخة الغربية

  1. أضف 2 مل من 5 × 106 خلايا / معلقات خلايا مل تحتوي على أدوية مختلفة في ألواح 6 آبار ، واستزراع في حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تم تحديد مجموعات تحليل اللطخة الغربية على النحو التالي: مجموعة التحكم ، مجموعة LY294002 (10 ميكرومتر) ، مجموعة سال (80 ميكرومتر) ، ومجموعة LY294002 (10 ميكرومتر) + سال (80 ميكرومتر) (انظر جدول المواد).
  2. جمع الخلايا والطافات ، وأجهزة الطرد المركزي في 560 × غرام في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا. بعد كل غسلة ، قم بطرد الخلايا عند 560 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  3. أضف 50 ميكرولتر من محلول التحلل إلى عينة الخلية من الخطوة 7.2 لحمام جليدي لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لجمع عينة البروتين الطافية.
  4. بعد اكتشاف تركيز البروتين باستخدام طريقة BCA ، امزج عينة البروتين في الخطوة 7.3 مع مخزن التحميل بنسبة 4: 1 ، وتشوه عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام معدني ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. أضف 20 ميكروغرام من عينة البروتين من الخطوة 7.4 ، وافصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة35باستخدام 10٪ SDS-PAGE (انظر جدول المواد) ، ثم انقلها إلى أغشية PVDF 0.22 ميكرومتر. بعد الانسداد باستخدام 5٪ BSA ، احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الأولية المقابلة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: التركيز المخفف للأجسام المضادة الأولية التالية هو 1: 1000: كاسباز مشقوق -9/7/3 (CC-9/7/3) ، بيم ، باكس ، Bcl-2 ، p-PI3K / PI3K ، p-AKT / AKT ، mTOR ، HIF-1α ، FoxO1 ، و β-actin (انظر جدول المواد).
  6. في اليوم التالي ، احتضان الأغشية بالجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. تطوير الأغشية باستخدام محلول ECL كيميائي ، والتقاط الصور باستخدام نظام تصوير اللطخة الغربية الكمية بدون تلامس (انظر جدول المواد).

8. qRT-PCR

  1. قم بإجراء الطرد المركزي لجمع خلايا MCF-7 عند 560 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ، وإضافة 500 ميكرولتر عازلة RL1 إلى 5 × 106 خلايا. تهب وتخلط بشكل متكرر مع ماصة حتى لا تكون كتل الخلايا مرئية.
    ملاحظة: يعد Buffer RL1 أحد المكونات الموجودة في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).
  2. انقل متجانسات الخلايا في الخطوة 8.1 إلى عمود تنظيف الحمض النووي المضمن في أنبوب التجميع ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. قم بإزالة عمود تنظيف الحمض النووي ، واحتفظ بالمادة الطافية في أنبوب التجميع.
    ملاحظة: عمود تنظيف الحمض النووي وأنبوب التجميع هما مكونان في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلية (انظر جدول المواد).
  3. أضف 800 ميكرولتر عازلة RL2 إلى 500 ميكرولتر من المادة الطافية من الخطوة 8.2 ، واخلطها برفق.
    ملاحظة: يعد Buffer RL2 أحد المكونات الموجودة في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد). أضف 120 مل من الإيثانول اللامائي إلى 60 مل من المخزن المؤقت RL2 قبل الاستخدام.
  4. انقل 700 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 8.3 إلى عمود الحمض النووي الريبي فقط المضمن في أنبوب التجميع ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة. تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
    ملاحظة: عمود الحمض النووي الريبي فقط هو أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).
  5. كرر الخطوة 8.4 لمعالجة الخليط المتبقي من الخطوة 8.3.
  6. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW1 إلى عمود الحمض النووي الريبي فقط ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
    ملاحظة: المخزن المؤقت RW1 هو أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).
  7. أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW2 إلى عمود الحمض النووي الريبي فقط ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع. كرر الخطوة 8.7 مرة واحدة.
    ملاحظة: يعد Buffer RW2 أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).
  8. ضع عمود الحمض النووي الريبي فقط مرة أخرى في أنبوب التجميع ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين لإزالة المخزن المؤقت المتبقي RW2.
  9. انقل عمود الحمض النووي الريبي فقط إلى أنبوب تجميع جديد ، وقم بتقطير 100 ميكرولتر من ddH2O الخالي من RNase المسخن مسبقا عند 65 درجة مئوية في مركز الغشاء لعمود الحمض النووي الريبي فقط. ضع في 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، وجمع محلول الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي عند 8550 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: DDH2O الخالي من RNase هو أحد المكونات في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد).
  10. أضف 4 ميكرولتر من محلول تفاعل 5x ، و 1 ميكرولتر من أوليجو (dT) 18 التمهيدي ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي السداسي العشوائي ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي الخاص بالجينات (انظر الجدول 1) ، و 1 ميكرولتر من مزيج الإنزيم ، و 5 ميكروغرام من محلول الحمض النووي الريبي من الخطوة 8.9 إلى شريط 100 ميكرولتر 8 أنابيب. استكمل نظام التفاعل بالماء الخالي من RNase إلى 20 ميكرولتر.
  11. اضبط شروط تفاعل النظام على النحو التالي: (1): 95 °C ، 30 ثانية ، دورة واحدة ؛ (2): 95 درجة مئوية ، 5 ثوان ، 50 دورة ، 60 درجة مئوية ، 34 ثانية ؛ (3): 95 °C ، 5 s ، 1 دورة ، 65 °C ، 60 ثانية ، 97 °C ، 1 ثانية ؛ و (4): 42 درجة مئوية ، 30 ثانية ، 1 دورة. تنفيذ إجراء qRT-PCR.
    ملاحظة: تم تحليل مستويات التعبير النسبية للجينات المستهدفة كميا بواسطة طريقة 2−ΔΔCT 36,37. يتم سرد المعلومات الأولية لكل جين مستخدم لتحليل qRT-PCR في الجدول 1.

9. التحليل الإحصائي

  1. التعبير عن البيانات في صورة متوسط الانحراف المعياري ± لثلاث تجارب مستقلة.
  2. قم بتحليل المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام برنامج الرسوم البيانية والتحليل (انظر جدول المواد) مع تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعا باختبار Tukey. في هذا العمل ، تم تعريف P < 0.05 على أنه ذو دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

آثار سال على تثبيط الانتشار الزائد وتأخير التئام الجروح في خلايا MCF-7
للتحقق من إمكانات Sal ضد سرطان الثدي ، اختبرنا أولا خصائصه المضادة للسرطان باستخدام سمية تكاثر الخلايا وفحوصات الخدش لخط خلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. تم تحضين هذه الخلايا بشكل مشترك مع سلسلة تركيز من Sal (5-320 μM) لمدة 24 ساعة ، وتم تقييم تكاثر الخلايا باستخدام مقايسة CCK-8. لوحظ تأثير مثبط يعتمد على الجرعة ل Sal على تكاثر الخلايا ، مع انخفاض بنسبة 50٪ في حيوية الخلية عند 40 ميكرومتر (الشكل 2 أ). ث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصيب سرطان الثدي الأفراد من جميع الأعمار ويسبب عبئا جسديا وعقليا لا يحصى وضغطا اقتصاديا كبيرا1. كما اجتذب سرطان الثدي ، مع زيادة معدلات المراضة والوفيات كل عام ، اهتماما عالميا من حيث البحث عن علاجات مركبة عشبية فعالة تتجاوز العلاجات التقليدية 4,5. بشكل واعد ، كشفت مجموعة كبيرة من الأدلة عن التأثيرات المضادة للسرطان ل Sal24،25،38. لسوء الحظ ، لا ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل لجنة الصحة في مقاطعة سيتشوان (120025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ البنسلين / الستربتومايسينHyCloneSV30010
AKT الأجسام المضادةImmunoWay شركة التكنولوجيا الحيويةYT0185
Annexin V-FITC / PI kitMultiSciences Biotech Co.، Ltd.AP101
قارئ الألواح الدقيقة الأوتوماتيكيالأجهزة الجزيئيةSpectraMax iD5
Bax الأجسام المضادةلتكنولوجيا إشارات الخلايا ، Inc.# 5023
مجموعة BCABiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 الأجسام المضادةلتقنية إشارات الخلايا ، Inc.# 15071
Bim الأجسام المضادةلتكنولوجيا إشارات الخلايا ، Inc.# 2933
Ca2 + < / sup> &ndash ؛ طقم فحص ATPaseنانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيويةA070-4-2
طقم عد الخلايا-8طقم تلطيخ دورة الخلايا BiosharpLife Sciences BS350B
MultiSciences Biotech Co.، Ltd.CCS012
caspase-3خلية إشارات التكنولوجيا، Inc.# 9661
كاسباز -7لتكنولوجيا إشارات الخلية المشقوقة# 8438
Caspase-9Cell Signaling Technology، Inc.# 20750
محلول البنفسجي الكريستاليBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM ثقافة الجلوكوز العالية المتوسطةServicebio Technology Co.، Ltd.G4510
دوكسوروبيكسين هيدروكلوريدMedChemExpressHY-15142
ECL محلول كيميائيBiosharp Life SciencesBL520B
مصل الأبقار الجنينيProcell Life Science & التكنولوجيا المحدودة164210
مقياس التدفق الخلويBDFACSCanto figure-materials-1
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 الأجسام المضادةImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
الماعز المضادة للأرانب IgG الأجسام المضادة الثانويةMultiSciences Biotech Co.، Ltd.70-GAR0072
برنامج GraphPad PrismLa Jollaالإصدار 6.0
HIF-1 & alpha الأجسام المضادةAffinity BiosciencesBF8002
خط خلايا سرطان الثدي البشري MCF-7Procell Life Science & التكنولوجيا المحدودةCL-0149
تحميل العازلةBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo  356234
الأجسام المضادة mTORServicebio Technology Co.، Ltd.GB11405
Na+– K+– طقم فحص ATPaseنانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيويةA070-2-2
مجهر بصريأوليمبوسIX71PH
p-AKT الأجسام المضادةشركة التكنولوجيا الحيوية المناعيةYP0006
PI3K الأجسام المضادةServicebio Technology Co.، Ltd.GB11525
الجسم المضاد p-PI3KAffinity BiosciencesAF3241
نظام التصوير الكمي للبقعة الغربيةTouch Image ProeBlot
النسخ العكسي لأول حبلا (كدنا) مجموعة أدوات تخليق الحبلا (كدناServicebio Technology Co.، Ltd.G3330-100
ROS مجموعة الفحصBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA يتم تضمين مسبار التألق
هنا SalidrosideChengdu Herbpurify Co.، Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co.، Ltd.G2003-50T
طقم عزل الحمض النووي الريبي الكليForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
& beta ؛ -actinAffinity BiosciencesAF7018
معهد شق شركة شركة معهد )

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285(2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717(2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748(2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544(2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191(2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081(2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940(2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730(2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726(2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801(2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617(2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015(2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278(2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458(2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847(2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426(2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988(2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088(2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188(2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MCF 7 PI3K AKT qRT PCR

مقالات ذات صلة