مقالة منهجية

الحفظ بالتبريد وتقييم الطاقة الحيوية لخلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية

DOI:

10.3791/65730

⸱

أكتوبر 20, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Institute of Nutritional Sciences, Justus-Liebig-University of Giessen

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة لتحليل وظائف واضطرابات المناعة أو أمراض التمثيل الغذائي أو وظائف الميتوكوندريا. في هذا العمل ، وصفنا طريقة موحدة لإعداد PBMCs من الدم الكامل والحفظ بالتبريد اللاحق. الحفظ بالتبريد يجعل هذا الوقت والمكان مستقلين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد الوظائف الفسيولوجية للخلايا حقيقية النواة على الطاقة التي توفرها الميتوكوندريا بشكل أساسي. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بأمراض التمثيل الغذائي والشيخوخة. تلعب الفسفرة التأكسدية دورا حاسما؛ لأنها ضرورية للحفاظ على الاتزان الداخلي النشط. تم تحديد PBMCs كعينة طفيفة التوغل لقياس وظيفة الميتوكوندريا وقد ثبت أنها تعكس ظروف المرض. ومع ذلك ، يمكن أن يكون قياس وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا محدودا بعدة عوامل في العينات البشرية. القيود هي كمية العينات المأخوذة ، ووقت أخذ العينات ، والذي غالبا ما ينتشر على مدى عدة أيام ، والمواقع. يمكن أن يضمن الحفظ بالتبريد للعينات المجمعة جمع العينات وقياسها بشكل متسق. يجب توخي الحذر للتأكد من أن المعلمات المقاسة قابلة للمقارنة بين الخلايا المحفوظة بالتبريد والخلايا المحضرة حديثا. هنا ، نصف طرق عزل وحفظ PBMCs بالتبريد من عينات الدم البشري لتحليل وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في هذه الخلايا. يظهر PBMC المحفوظ بالتبريد وفقا للبروتوكول الموصوف هنا اختلافات طفيفة فقط في عدد الخلايا وصلاحيتها ، ومستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ونشاط السلسلة التنفسية المقاسة مقارنة بالخلايا التي تم حصادها حديثا. هناك حاجة فقط إلى 8-24 مل من دم الإنسان للمستحضرات الموصوفة ، مما يجعل من الممكن جمع العينات أثناء الدراسات السريرية متعددة المراكز وتحديد الطاقة الحيوية في الموقع.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية (PBMCs) في تطبيقات مختلفة في العديد من المجالات العلمية ، بما في ذلك دراسة القضايا المناعية والطاقة الحيوية ، مثل تلك المتعلقة بعمليات الشيخوخة أو الأمراض التنكسية 1,2. PBMCs غير متجانسة في التركيب وتتكون من الخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية والخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية) والوحيدات والخلايا المتغصنة. تظهر الخلايا أحيانا اختلافات واختلافات فردية كبيرة داخل الموضوع ، لذلك يلزم اتخاذ إجراءات موحدة للتعامل مع هذه الخلايا. المعلمات الهامة مثل صلاحية ونقاء العزلة هي المتطلبات الأساسية للتعامل معها وتتأثر بالإضافة إلى ذلك بالعوامل البيئية مثل وقت الجمع ، ومستوى الميلاتونين ، وما إذا كان الموضوع صائما ، وغيرها 3,4.

استنادا إلى الدراسات التي أجريت على الطاقة الحيوية ل PBMCs ، نصف هنا طريقة لعزل PBMCs وحفظها بالتبريد وزراعتها مناسبة للطرق الأخرى أيضا. بينما تعتبر خزعة العضلات المعيار الذهبي لاستقلاب طاقة الميتوكوندريا5 ، فإن فحص خلايا الدم هو إجراء سريع وطفيف التوغل. بالإضافة إلى ذلك ، تشير المزيد والمزيد من الدراسات إلى أن التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا في الشيخوخة ومرض الزهايمر (AD) تحدث ليس فقط في الدماغ ولكن أيضا في المحيط6،7،8،9،10. تسمح الطريقة أيضا بالتحقيق في الحالات والأمراض الأخرى ، بما في ذلك داء السكري والسمنة11،12،13. يمكن تحليل أنماط التعبير الجيني لدى مرضى التصلب المتعدد ، أو وظيفة المناعة والتأثيرات عليها بشكل عام14،15،16.

تعتمد PBMCs بشكل عام على الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) لتوليد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)17,18. لذلك ، تغطي PBMCs مجموعة واسعة من التطبيقات كبدائل. في التقارير السابقة ، تم استخدام استقلاب الطاقة في PBMCs لمعالجة اختلالات الأعضاء ، كما هو الحال في قصور القلب المبكر19 ، أو الصدمة الإنتانية20 أو الاختلافات المرتبطة بالجنس4 في وظيفة الميتوكوندريا. ومن شأن طريقة معممة لعزل الحفظ بالتبريد وزراعة PBMCs أن يكون لها مزايا في إمكانية مقارنة النتائج التي يتم الحصول عليها في مختلف المعاهد. هناك قدر كبير من الاختلاف في البروتوكولات لكل خطوة21,22 ، والهدف من هذه الطريقة هو توفير إرشادات لقياسات الطاقة الحيوية في PBMCs.

في هذه المقالة نصف طريقة لقياس معلمات الطاقة الحيوية في PBMCs. نفسر طرق عزل وحفظ وقياس الطاقة الحيوية ل PBMCs من دم الإنسان. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد معلمات الطاقة الحيوية في المرضى وتقييمها في سياق سريري. لتطبيق هذه القياسات ، يحتاج الباحثون إلى الوصول إلى مجموعة من المرضى يمكن الحصول منها على عينات دم جديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة لجمع الدم وعزله وتحليله والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة غيسن بألمانيا. تم الحصول على موافقة المرضى على تضمين عيناتهم في الدراسة. يتم تنفيذ جميع خطوات العزل وزراعة الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.

1. بزل الوريد

  1. قم بإعداد جميع المعدات اللازمة لجمع الدم بما في ذلك رذاذ التطهير ، والمسحة المعقمة ، وقنية جمع الدم مع أنبوب 80 مم ومحول متعدد ، وعاصبة / سوار ضغط الدم ، و Monovette 9 مل ليثيوم هيبارين.
    ملاحظة: EDTA كمضاد للتخثر فعال أيضا.
  2. جمع الدم من وريد الذراع الأنسب، وعادة ما يكون الوريد الوسطي أو الوريد الرأسي.
  3. ضع سوار عاصبة / ضغط الدم بضغط خفيف ، حوالي 80 مم / زئبق.
  4. تطهير القفازات وموقع ثقب مع رذاذ مطهر يحتوي على الكحول. اترك موقع البزل المطهر يجف في الهواء.
  5. تبرز الأوردة بسبب ضغط صفعة الضغط. أدخل الإبرة (قطر القنية (الخارجي) 21 جم / 0.8 مم ، الطول 19 مم) بزاوية 15 درجة -20 درجة من الوريد في محاولة لتجنب الصدمة وتقليل الفحص.
  6. خذ الدم مع النظام المناسب ، 4 أنابيب تحتوي على 9 مل من الدم (أكثر من 7-8 أنابيب هي مشكلة لتجربة واحدة لعزل بشكل صحيح).
  7. بعد جمع الدم ، ضع أنابيب التجميع في الظلام لمدة 5 دقائق لضمان منع تخثر الدم بشكل موحد.

2. عزل PBMC

  1. قم بإعداد جميع الحلول اللازمة كما هو موضح أدناه.
  2. أحضر محلول الملح المتوازن من Dulbecco (DPBS ؛ التركيز 1x) ووسط عزل الخلايا الليمفاوية (1.077 جم / مل) إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).
  3. حضري مصل الجنين البقري (FBS) في درجة حرارة الغرفة واحتفظي بأنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل مع FBS على الثلج. لكل عينة دم ، مطلوب 2 مل من FBS.
  4. قم بتخزين حاوية التجميد عند 4 درجات مئوية وأنابيب التبريد المسبق عند 4 درجات مئوية.
  5. متوسط زراعة الخلايا الدافئة إلى 37 درجة مئوية ، يتكون الوسط من RPMI 1640 مع 50 مل من FBS والبنسلين 50 وحدة / مل من الستربتومايسين 50 وحدة / مل. يمكن تخزين هذا المحلول عند 3 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  6. أضف 8 مل من DPBS في أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل. أضف 15 مل من وسط عزل الخلايا الليمفاوية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل (متوسط حساس للضوء ، أضفه قبل بدء العزل).
  7. أضف 8 مل من الدم إلى 8 مل من DPBS ، واخلطها بعناية مع ماصة باستور بلاستيكية سعة 3 مل.
  8. ضع طبقة من الدم / DPBS برفق مع ماصة باستور بلاستيكية سعة 3 مل فوق وسط عزل الخلايا الليمفاوية. لتطبيق الطبقة الأولى على الوسط ، قم بإمالة الأنبوب 20 درجة -30 درجة ، مما يؤدي إلى تغلغل أقل لخليط الدم - PBS في الطبقة المتوسطة.
  9. ضع خليط الدم - PBS بعناية على الجدار الجانبي للأنبوب على وسط عزل الخلايا الليمفاوية. استخدم سرعة ثابتة للحفاظ على تدفق الدم ثابتا.
  10. في الخطوة التالية ، ضع الأنبوب ببطء في وضع رأسي ، ويتم وضع الدم المتبقي بعناية فوق الجدار الجانبي للأنبوب على طبقة الدم.
  11. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح مع إيقاف تشغيل الفرامل. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل مزيج الدم / PBMC إلى أربع طبقات. تتكون الطبقة العليا من البلازما والصفائح الدموية ، والطبقة الثانية هي طبقة PBMC ، تليها طبقة متوسطة لعزل الخلايا الليمفاوية ، وأخيرا كريات الدم الحمراء والخلايا المحببة في الطبقة السفلية. يتم عرض الطبقات المختلفة في الشكل 1.
  12. قم بإزالة 2/3من طبقة البلازما باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.
  13. باستخدام ماصة 1 مل ، اجمع PBMCs على الطبقة المتوسطة لعزل الخلايا الليمفاوية مع الحرص على عدم وجود أي وسيط في العينة.
  14. ضع الطرف 1 مم فوق طبقة PBMC. لا ينبغي ثقب طبقة PBMC ، وإلا فسوف يتدفق الوسيط فوق الخلايا. يؤدي شفط الماصة إلى سحب PBMCs إلى هذه النقطة بحيث يمكن جمعها عدة مرات في هذه المرحلة.
    ملاحظة: لزيادة عدد PBMCs التي تم جمعها ، في نهاية الإجراء ، ابحث عن الباقي على السطح وحاول جمع الخلايا هناك أيضا. لتحقيق الاستقرار في الإجراء ، يمكن وضع الأنبوب على السطح.
  15. انقل PBMCs خطوة بخطوة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل حتى يتم حصاد الطبقة بالكامل. أضف DPBS حتى علامة 25 مل ، واغسل وسط عزل الخلايا اللمفاوية والمخلفات الأخرى.
  16. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 100 × جم في درجة حرارة الغرفة مع تشغيل الفرامل. قم بإزالة المادة الطافية بمضخة تفريغ أو ما شابه ذلك ، احرص على عدم إتلاف حبيبات الخلية.
  17. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من DPBS وأضف DPBS إلى علامة 25 مل. كرر الغسيل مرة أخرى ثم أعد التعليق في وسط مناسب للخطوات التالية.

figure-protocol-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لجهاز طرد مركزي متدرج الكثافة لتوضيح الطبقات المختلفة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. الحفظ بالتبريد

  1. قم بتبريد وعاء التجميد إلى 4 درجات مئوية ، وقم بتبريد FBS على الثلج.
  2. أعد تعليق حبيبات PBMC في 1 مل من FBS باستخدام ماصة 1 مل ، يجب أن يكون FBS في درجة حرارة الغرفة.
  3. امزج DMSO مع FBS المبرد مسبقا على الثلج 1: 5 ، التركيز النهائي 20٪ DMSO ثم ضع خليط FBS: DMSO مرة أخرى على الثلج. دائما إعداد الحل الطازج.
  4. انقل معلق خلية PBMC في FBS إلى أنابيب تبريد سعة 2 مل موسومة جيدا. استخدم أنبوب تبريد واحد لكل أنبوب تجميع. اضبط عدد الخلايا بين 1 × 107 و 5 × 107 لكل مل. استخدم عداد خلايا آلي لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للتطبيق.
  5. أضف 1 مل من FBS: خليط DMSO بالتنقيط مع ماصة 1 مل ، حوالي 1-2 قطرات في الثانية ، في الأنبوب. تؤدي الإضافة بالتنقيط إلى خلط مستمر ومتسق.
  6. ضع الأنابيب في حاوية التجميد المبردة مسبقا. ضع وعاء التجميد في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. توفر حاوية التجميد تبريدا متحكما يبلغ -1 درجة مئوية في الدقيقة.
  7. قم بإزالة الأنابيب من الفريزر -80 درجة مئوية. بعد الإزالة من الثلاجة تخزين الأنابيب في المرحلة الغازية من النيتروجين السائل. توثيق مكان كل عينة.

4. ذوبان الجليد

  1. تحضير جميع الحلول اللازمة: وسط زراعة الخلايا RPMI 1640 مع 50 مل من FBS والبنسلين 50 وحدة / مل ، الستربتومايسين 50 وحدة / مل. يمكن تخزين هذا الحل في 3 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. قبل تسخين زراعة الخلايا المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. أضف 3 مل من وسط زراعة الخلايا قبل التسخين إلى أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل.
  3. إزالة العينة من خزان النيتروجين السائل. قم بإذابة العينات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 3.5 دقيقة تقريبا ، ثم أخرجها من الحمام المائي بمجرد ذوبان الجليد الأخير. يجب أن تظل قطعة الجليد بحجم رأس الدبوس مرئية في الأنبوب.
    ملاحظة: DMSO ضار بعمل PBMCs في أسرع وقت ممكن.
  4. قم بإزالة الخلية: FBS: DMSO مزيج مع ماصة 1 مل من أنبوب التبريد. امزج عينات PBMC مع وسط زراعة الخلايا في أنابيب سعة 50 مل المحضرة. اغسل الأنابيب ب 5 مل من وسط الاستزراع في ثلاث خطوات من 2 مل و 2 مل و 1 مل.
  5. نقل الوسط إلى الأنابيب. يتم تنفيذ ذلك لنقل بقايا الخلايا المحتملة. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 100 × جرام في درجة حرارة الغرفة.
  6. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من الوسط المناسب للاستخدام المخطط له. الخلايا جاهزة للتجارب اللاحقة.
    ملاحظة: ومع ذلك ، مع الاختبارات الوظيفية على الخلايا الطازجة أو المجمدة ، غالبا ما يوصى بفترة راحة في الحاضنة (عادة بين عشية وضحاها) بعد عزل الخلايا الليمفاوية المتوسطة أو ذوبان الخلايا.

5. ثقافة الخلية

  1. بعد العزلة أو إذابة خلايا الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2/95٪ هواء.
  2. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط RPMI المكمل ب 10٪ FBS ، البنسلين 50 وحدة / مل ، الستربتومايسين 50 وحدة / مل. لمزيد من الاستخدام هناك العديد من الاحتمالات ، علاج الخلايا حسب الحاجة للمقايسات.
  3. للتخزين العام ، استخدم 6 ألواح معقمة لزراعة خلايا البئر وخلايا الحصاد بعد فترة الراحة. انقل 1 مل من معلق الخلية مع ماصة 1 مل إلى بئر وأضف 4 مل من وسط زراعة الخلايا.
    ملاحظة: تختلف كمية PBMCs المعزولة اختلافا كبيرا بين الأفراد ، حيث يكفي بئر واحد يحتوي على 5 مل من وسط زراعة الخلايا لكل 8 مل من الدم المعزول. ومع ذلك ، عند عزل PBMCs من المعاطف المنتفخة ، تكون كمية PBMCs أعلى بكثير من عينات الدم الكاملة ، وبالتالي يجب تقسيم الخلايا إلى عدة آبار.
  4. اترك الخلايا ترتاح لمدة 24 ساعة في جو مرطب مكمل ب 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. يتم إجراء هذه الحضانة للخلايا المعزولة حديثا ، وكذلك للخلايا المحفوظة بالتبريد.

6. مقايسة ATP

  1. إعادة تعليق PBMCs المذابة في 1 مل من وسط RPMI المكمل ب 10٪ FBS ، البنسلين 50 وحدة / مل ، الستربتومايسين 50 وحدة / مل.
  2. خذ عينة وحدد عدد الخلايا ، ثم قم بإجراء تمييز حي ميت باستخدام التريبان الأزرق. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها واخلطها مع وسط زراعة الخلايا 90 ميكرولتر. ثم تأخذ 10 ميكرولتر وتخلط مع 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق. ضع الخلايا إما في غرفة عد الخلايا أو عداد الخلايا التلقائي وحدد عدد الخلايا الحية / الميتة.
  3. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا بكثافة 1 × 105 خلايا / 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة بوليسترين بيضاء 96 بئرا.
  4. اترك الخلايا ترتاح لمدة 24 ساعة في جو مرطب مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
  5. أوجد تركيزات الأدينوسين الثلاثي الفوسفات باستخدام فحص الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP).
    1. استخدم انبعاث الضوء الذي يحدث عند دمج ATP مع لوسيفيرين. يمكن تقييم الضوء المنبعث باستخدام قارئ اللوحة. قم بإزالة الألواح حتى تبرد الحاضنة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تحلل الخلايا واتركها لمدة 5 دقائق. ثم قم بتطبيق كاشف المراقبة على الخلايا وقم بالقياس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم استخدام معيار داخلي لتحديد مستوى ATP.

7. قياس التنفس عالي الدقة

  1. قم بتشغيل جهاز oxygraph عالي الدقة واتركه يسخن لمدة 30 دقيقة.
  2. عالج الخلايا وفقا لبروتوكول موضح في الشكل 1. قم بإعداد جميع المخزونات اللازمة كما في الجدول 1.
  3. ماصة 2.1 مل من مخزن التنفس المؤقت (الجدول 1) في كل من غرف أوكسيجراف عالية الدقة وحرك المخزن المؤقت باستمرار باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي موجود في الغرف (750 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يتم الحصول على إشارة تدفق أكسجين مستقرة لمستشعر الأكسجين البولاروغرافي.
    ملاحظة: في غرف الأوكسيجراف ، يتم قياس استهلاك الأكسجين في الوقت الفعلي (التدفق) وتشبع الأكسجين في الغرفة بمساعدة أقطاب الأكسجين البولاروغرافية. يجب إجراء معايرة الخلفية لتجنب ضوضاء الخلفية ولضمان نتائج موثوقة.
  4. قم بإجراء معايرة الهواء لمستشعر الأكسجين البولاروجرافي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة23.
  5. إعادة تعليق PBMCs المعزولة في 1 مل من وسط تنفس الميتوكوندريا (MIR05 يظهر التكوين في الجدول 1) وتخفيفه إلى 8 × 106 خلايا / مل.
  6. بعد معايرة الهواء ، قم بشفط وسط التنفس من غرفة الأوكسيجراف وأضف 2.1 mL من تعليق الخلية في كل حدبة من مقياس التنفس. إذا لزم الأمر أثناء القياس إعادة أكسجة الغرف (انظر فتح عند النقطة h في الشكل 2) ، يجب ألا يقل تشبع الأكسجين في الغرف عن 100 ميكرومتر.
  7. أغلق الغرف عن طريق إدخال السدادات ، تم تصميم الغرف لاستيعاب حجم 2.0 مل. نضح تعليق الخلية الناشئة.
  8. امزج تعليق الخلية باستمرار عند 37 درجة مئوية مع محرك مغناطيسي (750 دورة في الدقيقة) موجود في الغرفة. انتظر لمدة 20 دقيقة تقريبا حتى يتم الحصول على إشارة مستقرة. حدد التنفس الداخلي ((أ) في الشكل 2).
  9. لتحديد الأنشطة المعقدة المختلفة للسلسلة التنفسية ، قم بحقن الركائز ومثبطات التنفس الميتوكوندريا من خلال منافذ حقن التيتانيوم للسدادات. استخدم التركيز النهائي التالي في الغرفة.
  10. لتعطيل أغشية الخلايا ، أضف 5 ميكرولتر من 8.1 mM digitonin ، من خلال منفذ حقن التيتانيوم لسدادة الغرفة ، لإزالة الركائز الساذجة (ب) في الشكل 2 بينما تظل أغشية الميتوكوندريا سليمة.
  11. أضف ركائز 2 M الغلوتامات و 800 mM malate من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق.
    ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام ركائز إضافية مثل البيروفات.
  12. أضف 8 ميكرولتر من 500 mM adenosine diphosphate (ADP) من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق (د) في الشكل 2.
  13. أضف 20 ميكرولتر من سكسينات 1 M من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق (ه) في الشكل 2.
  14. معايرة 1 M سيانيد الكربونيل p-trifluoromethoxy phenylhydrazone (FCCP) تدريجيا عند 0.5 ميكرولتر حتى النقطة التي لا تحدث فيها زيادة أخرى. انتظر 2-4 دقائق حتى تستقر الإشارة (f) في الشكل 2. عندما لا تكون هناك زيادة أخرى في التنفس ، استمر في الخطوة التالية.
    تنبيه: كن حذرا عند التعامل مع FCCP لأنه ينطوي على مخاطر صحية على البشر.
  15. أضف 5 ميكرولتر من 0.1 مللي متر روتينون من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق (جم) في الشكل 2.
    تنبيه: كن حذرا عند التعامل مع الروتينون لأنه ينطوي على مخاطر صحية على البشر.
  16. أضف 1 ميكرولتر من 4 ملغ / مل oligomycin من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق (ساعة) في الشكل 2.
    تنبيه: كن حذرا عند التعامل مع oligomycin لأنه سم يشكل مخاطر صحية على البشر.
  17. أضف 1 ميكرولتر من 5 mM antimycin A من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق (i) في الشكل 2.
    تنبيه: كن حذرا عند التعامل مع مضاد الميسين أ لأنه سم يشكل مخاطر صحية على البشر.
  18. عند تقييم المدى لاستبعاد استهلاك الأكسجين للإنزيمات غير المشاركة في الفسفرة التأكسدية ، اطرح قيم مضاد الميسين A من جميع القيم المقاسة الأخرى.
  19. أضف 200 mM N,N,N',N'-رباعي ميثيل-p-فينيلين ديامين ثنائي هيدروكلوريد (TMPD؛ مانح للإلكترون) و800 mM ascorbate للحفاظ على TMPD في حالة مخفضة. حقن الركائز من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق (ي) في الشكل 2.
  20. يخضع TMPD للأكسدة الذاتية ، لذا اطرح استهلاك الأكسجين الناتج من القيمة المقاسة في المجمع الرابع.
  21. أضف NaN3 ≥ 100 mM من خلال منفذ الحقن لسدادة الغرفة وسجل التنفس حتى يتم تحقيق إشارة مستقرة. تستقر الإشارة بعد 2-4 دقائق لمنع نشاط IV المعقد ، يبقى فقط الأكسدة الذاتية TMPD.
    تنبيه: كن حذرا عند التعامل مع أزيد الصوديوم لأنه سم يشكل مخاطر صحية على البشر.

figure-protocol-2
الشكل 2: المسار التخطيطي لتدفق O2 . يظهر المسار التخطيطي لتدفق الأكسجين. ينقسم المنحنى إلى مراحل مختلفة بعد إضافة مثبطات وركائز من a-k. ج: التنفس الداخلي. ب: الخلايا المتخللة ؛ ج: التنفس المركب الأول غير المقترن ؛ د: اقتران التنفس المركب الأول ؛ ه: أوكسفوس ؛ f: أقصى نشاط غير مقترن ل CI و CII ؛ ز: التنفس غير المنفصل للمجمع الثاني ؛ ح: تسرب التنفس. I: التنفس المتبقي. ي: التنفس غير المقترن CIV (U) والأكسدة الذاتية ل TMPD ؛ k: الأكسدة الذاتية ل TMPD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

8. نشاط سيترات سينسيز

  1. قم بقياس نشاط سينسيز السيترات كمعلمة منفصلة واستخدمه لتطبيع قياسات أوكسيجراف عالي الدقة.
  2. إعادة تعليق PBMC المعزول في 1 مل من وسط تنفس الميتوكوندريا (MIR05) وتخفيفه إلى 8 × 106 خلايا / مل.
  3. تجمد في النيتروجين السائل وتخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء التجارب أو لقياس الخلايا الطازجة.
  4. قم بإعداد جميع الحلول اللازمة: 0.1 M ثلاثي إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك العازلة درجة الحموضة 8.0 ، 1.0 M Tris-HCl العازلة درجة الحموضة = 8.1 ، 10٪ Triton X-100 ، 10 mM Oxalacetate في 0.1 M ثلاثي إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك العازلة درجة الحموضة 8.0 ، 1.01 mM DTNB في 1.0 M Tris-HCl buffer pH = 8.1 ، Acetyl-CoA 12.2 mM في H2O المقطر المزدوج.
  5. تحضير وسط التفاعل (الجدول 1) الذي يحتوي على 5،5'-dithio-bis- (2-nitrobezoic acid) (DTNB ؛ 0.1 mM) ، أنزيم acetyl A (0.31 mM) ، EDTA (50 μM) ، ثلاثي إيثانولامين HCl (5 mM) و Tris HCl (0.1 M).
  6. تحضير كاشف البدء (الجدول 1) مع 0.5 mM oxaloacetate المذاب في H2O المقطر المزدوج.
  7. قم بإذابة العينات على الجليد لأن سينسيز السيترات غير مستقر إذا تم إذابته بسرعة كبيرة.
  8. أضف 40 ميكرولتر من العينات إلى صفيحة 96 بئرا على الجليد قبل إضافة 110 ميكرولتر من وسط التفاعل باستخدام ماصة متعددة.
  9. وسط تفاعل دافئ وعينة في حاضنة إلى 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كاشف بدء دافئ في حمام مائي إلى 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. أضف 50 ميكرولتر من كاشف البدء باستخدام ماصة متعددة لكل بئر. قم بقياس الامتصاص عند 30 درجة مئوية بطول موجي 412 نانومتر لمدة 20 دقيقة عبر قارئ اللوحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صلاحية الخلية وعددها
لتحقيق العزل الناجح والحفظ بالتبريد ، يجب أن يكون عدد الخلايا وصلاحيتها عالية قدر الإمكان. قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، يتم عد الخلايا ، ويتم تحديد صلاحيتها لضمان صحة وجودة الخلايا. الشكل 3 هو توضيح تمثيلي ل PBMCs قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، بالكاد يختلف عدد الخلايا وصلاحيتها. يشير هذا إلى نجاح عزل PBMCs والحفاظ عليها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول وسيلة لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) وحفظها بالتبريد من دم الإنسان بطريقة مناسبة لتحليلات الطاقة الحيوية. توفر الطريقة الموصوفة إمكانية عزل PBMCs بلطف وبكميات كبيرة ، مع قابلية عالية للبقاء وخلايا كافية لقياسات الطاقة الحيوية. من عيوبه أنه حتى مع الحد الأدنى من الانقطاعات ، تحدث عزلات طويلة ، لكن الحفظ بالتبريد اللاحق يسمح بقياس مستقل عن الوقت للطاقة الحيوية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن جمع العينات وقياسها في نقاط زمنية لاحقة. كما أنها مناسبة لجمع العينات في تجارب متعددة المراكز وقياس ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر الفريق السريري في مستشفى جامعة غيسن ماربورغ على جمع الدم. تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جوستوس ليبيغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1 م ثلاثي إيثانول أمين - حمض الهيدروكلوريك - عازلة (درجة الحموضة = 8،0)معد ذاتيا-
0.5 م ثلاثي إيثانول أمين - حمض الهيدروكلوريك - مخزنذاتي الإعداد -
1.0 م Tris-HCl-Buffer (درجة الحموضة = 8،1)معد ذاتيا-
1.01 ملي مولار DTBBمعد ذاتيا-
10٪ Triton X-100معد ذاتيا-
10 ملي مولار Oxalacetatأعدذاتيا -
14 &- ndash ؛ 20 جرام إبر سحب الدم المعقمة متعددة المحولات Sarstedt Safety-MultiflySarstedt156353_v
37٪ HClCarl Roth GmbH & Co. KG-
70٪ إيثانول (EtOH)
بنكرياس ApplichemA3753
ADPSigma-AldrichA5285
مناديل كحولية مبللة ( 70٪ كحول الأيزوبروبيل)
Antimycin ASigma-AldrichA8674
Aqua (bidest.)مع MilliQ Academic (عصامي)-
AscorbateSigma-AldrichA4034
ATP-StandardSigma-Aldrich6016949
Biocoll Seperating SolutionBiochrom6115
خزانة السلامة البيولوجية MSC AdvantageThermo Fisher Scientific Inc.
الكربونيل سيانيد - ف - ثلاثي فلورو الميثوكسي - فينيل هيدرازون (FCCP) عدادالخلايا سيجما ألدريتشC2920
عداد الخلايا الآلي TC20مركزي Bio-Rad
Heraeus Megafuge 16 RThermo Fisher Scientific Inc.
العد ، غرفة مزدوجة لعداد الخلاياBio-Rad1450016
Cryotube Cryo.SGrainer Bio-One126263-2DG
DigitoninSigma-Aldrich37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck102952
رذاذ
قفازات لاتكس يمكن التخلص منها ، المطاط أو الفينيل.
ديستريس (12.5 مل) DistriTipsجيلسونF164150
Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS ؛ 10x)جيبكو (علمي حراري)15217168
إيثانول (EtOH 100٪) CarlROTH GmbH & Co. KG9065.3
مصل بقري الجنين (FBS)سيجما ألدريتشF9665
فريزر (-80 درجة ؛ ج)شركة ثيرمو فيشر العلمية.
الغلوتاماتسيجما - ألدريتشG1626
حامل / محول  
حاضنة ميدي 40 CO2< / sub>Thermo Fisher Scientific Inc.
حقنة حقنهاميلتون
مالاتسيجما ألدريتشM-1000
MIR05
Thermo Fisher Scientific Inc.10110051
متعدد القراء CLARIOstarBMG Labtech
محدد خزان النيتروجين 6 بالإضافة إلىThermo Fisher Scientific Inc.
أوليغومايسينسيجما-ألدريتشO4876
أوكساليسيتاتسيجما-ألدريتش-أوكسيغراف-2
كيلوأوروبوروروس
البنسلين-ستربتومايسينPAA15140122
ماصات الأداء ماصة 10 & mu; لتر ، 100 مو ؛ لتر ، 1000 مو ؛ إلفي دبليو آر
روزويل بارك. المعهد التذكاري المتوسط (RPMI-1640)جيبكو (علمي حراري)11530586
روتينونسيجما ألدريتشR8875
ساكاروزكارل روث جي إم بي إتش وشركاه KG9286.2
أزيد الصوديومسيجما ألدريتشS2002
سكسيناتسيجما ألدريتشS2378
رباعي ميثيل فينيلينديامين (TMPD)سيجما ألدريتشT3134
عاصبة / صفعة
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينو ميثانسيجما ألدريتش108382
تريتون X-100سيجما ألدريتش108643
تريبانبلاوبيوكرومT6146
فراغفاكبراند GmbH & Co.
ViewPlate-96Perkin Elmer6005181
حمام مائي WNB22Memmert GmbH & Co. KG
مؤقت أسيتيل-CoA جهاز طرد شرائح التطهير حاوية تجميد السيد فروستي ذاتية الإعداد أدوات ضغط الدم مضخة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48(2019).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
  4. Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34(2018).
  5. Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949(2021).
  6. Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
  7. Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
  8. Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
  9. Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
  10. Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
  11. Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236(2020).
  12. Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
  13. Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
  14. Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
  15. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
  16. Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309(2009).
  17. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  18. Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
  19. Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229(2015).
  20. Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
  21. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  22. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
  23. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  24. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985(2017).
  25. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30(2020).
  26. Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DMSO

مقالات ذات صلة