يمكن استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة لتحليل وظائف واضطرابات المناعة أو أمراض التمثيل الغذائي أو وظائف الميتوكوندريا. في هذا العمل ، وصفنا طريقة موحدة لإعداد PBMCs من الدم الكامل والحفظ بالتبريد اللاحق. الحفظ بالتبريد يجعل هذا الوقت والمكان مستقلين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الحفظ بالتبريد وتقييم الطاقة الحيوية لخلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعتمد الوظائف الفسيولوجية للخلايا حقيقية النواة على الطاقة التي توفرها الميتوكوندريا بشكل أساسي. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بأمراض التمثيل الغذائي والشيخوخة. تلعب الفسفرة التأكسدية دورا حاسما؛ لأنها ضرورية للحفاظ على الاتزان الداخلي النشط. تم تحديد PBMCs كعينة طفيفة التوغل لقياس وظيفة الميتوكوندريا وقد ثبت أنها تعكس ظروف المرض. ومع ذلك ، يمكن أن يكون قياس وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا محدودا بعدة عوامل في العينات البشرية. القيود هي كمية العينات المأخوذة ، ووقت أخذ العينات ، والذي غالبا ما ينتشر على مدى عدة أيام ، والمواقع. يمكن أن يضمن الحفظ بالتبريد للعينات المجمعة جمع العينات وقياسها بشكل متسق. يجب توخي الحذر للتأكد من أن المعلمات المقاسة قابلة للمقارنة بين الخلايا المحفوظة بالتبريد والخلايا المحضرة حديثا. هنا ، نصف طرق عزل وحفظ PBMCs بالتبريد من عينات الدم البشري لتحليل وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في هذه الخلايا. يظهر PBMC المحفوظ بالتبريد وفقا للبروتوكول الموصوف هنا اختلافات طفيفة فقط في عدد الخلايا وصلاحيتها ، ومستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ونشاط السلسلة التنفسية المقاسة مقارنة بالخلايا التي تم حصادها حديثا. هناك حاجة فقط إلى 8-24 مل من دم الإنسان للمستحضرات الموصوفة ، مما يجعل من الممكن جمع العينات أثناء الدراسات السريرية متعددة المراكز وتحديد الطاقة الحيوية في الموقع.
المقدمة
تستخدم خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية (PBMCs) في تطبيقات مختلفة في العديد من المجالات العلمية ، بما في ذلك دراسة القضايا المناعية والطاقة الحيوية ، مثل تلك المتعلقة بعمليات الشيخوخة أو الأمراض التنكسية 1,2. PBMCs غير متجانسة في التركيب وتتكون من الخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية والخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية) والوحيدات والخلايا المتغصنة. تظهر الخلايا أحيانا اختلافات واختلافات فردية كبيرة داخل الموضوع ، لذلك يلزم اتخاذ إجراءات موحدة للتعامل مع هذه الخلايا. المعلمات الهامة مثل صلاحية ونقاء العزلة هي المتطلبات الأساسية للتعامل معها وتتأثر بالإضافة إلى ذلك بالعوامل البيئية مثل وقت الجمع ،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة جميع البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة لجمع الدم وعزله وتحليله والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة غيسن بألمانيا. تم الحصول على موافقة المرضى على تضمين عيناتهم في الدراسة. يتم تنفيذ جميع خطوات العزل وزراعة الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.
1. بزل الوريد
- قم بإعداد جميع المعدات اللازمة لجمع الدم بما في ذلك رذاذ التطهير ، والمسحة المعقمة ، وقنية جمع الدم مع أنبوب 80 مم ومحول متعدد ، وعاصبة / سوار ضغط الدم ، و Monovette 9 مل ليثيوم هيبارين.
ملاحظة: EDTA كمضاد للتخثر فعال أيضا. - جمع الدم من وريد الذراع الأنسب، وعادة ما يكون الوريد الوسطي أو الوريد الرأسي.
- ضع سو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
صلاحية الخلية وعددها
لتحقيق العزل الناجح والحفظ بالتبريد ، يجب أن يكون عدد الخلايا وصلاحيتها عالية قدر الإمكان. قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، يتم عد الخلايا ، ويتم تحديد صلاحيتها لضمان صحة وجودة الخلايا. الشكل 3 هو توضيح تمثيلي ل PBMCs قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، بالكاد يختلف عدد الخلايا وصلاحيتها. يشير هذا إلى نجاح عزل PBMCs والحفاظ عليها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول وسيلة لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) وحفظها بالتبريد من دم الإنسان بطريقة مناسبة لتحليلات الطاقة الحيوية. توفر الطريقة الموصوفة إمكانية عزل PBMCs بلطف وبكميات كبيرة ، مع قابلية عالية للبقاء وخلايا كافية لقياسات الطاقة الحيوية. من عيوبه أنه حتى مع الحد الأدنى من الانقطاعات ، تحدث عزلات طويلة ، لكن الحفظ بالتبريد اللاحق يسمح بقياس مستقل عن الوقت للطاقة الحيوية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن جمع العينات وقياسها في نقاط زمنية لاحقة. كما أنها مناسبة لجمع العينات في تجارب متعددة المراكز وقياس .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نشكر الفريق السريري في مستشفى جامعة غيسن ماربورغ على جمع الدم. تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جوستوس ليبيغ.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.1 م ثلاثي إيثانول أمين - حمض الهيدروكلوريك - عازلة (درجة الحموضة = 8،0) | معد ذاتيا | - | |
| 0.5 م ثلاثي إيثانول أمين - حمض الهيدروكلوريك - مخزن | ذاتي الإعداد - | ||
| 1.0 م Tris-HCl-Buffer (درجة الحموضة = 8،1) | معد ذاتيا | - | |
| 1.01 ملي مولار DTBB | معد ذاتيا | - | |
| 10٪ Triton X-100 | معد ذاتيا | - | |
| 10 ملي مولار Oxalacetat | أعد | ذاتيا - | |
| 14 &- ndash ؛ 20 جرام إبر سحب الدم المعقمة متعددة المحولات Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37٪ HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70٪ إيثانول (EtOH) | |||
| بنكرياس Applichem | A3753 | ||
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| مناديل كحولية مبللة | ( 70٪ كحول الأيزوبروبيل) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | مع MilliQ Academic (عصامي) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| خزانة السلامة البيولوجية MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| الكربونيل سيانيد - ف - ثلاثي فلورو الميثوكسي - فينيل هيدرازون (FCCP) عداد | الخلايا سيجما ألدريتش | C2920 | |
| عداد الخلايا الآلي TC20 | مركزي Bio-Rad | ||
| Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| العد ، غرفة مزدوجة لعداد الخلايا | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| رذاذ | |||
| قفازات لاتكس يمكن التخلص منها ، المطاط أو الفينيل. | |||
| ديستريس (12.5 مل) DistriTips | جيلسون | F164150 | |
| Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS ؛ 10x) | جيبكو (علمي حراري) | 15217168 | |
| إيثانول (EtOH 100٪) Carl | ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| مصل بقري الجنين (FBS) | سيجما ألدريتش | F9665 | |
| فريزر (-80 درجة ؛ ج) | شركة ثيرمو فيشر العلمية. | ||
| الغلوتامات | سيجما - ألدريتش | G1626 | |
| حامل / محول | |||
| حاضنة ميدي 40 CO2< / sub> | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| حقنة حقن | هاميلتون | ||
| مالات | سيجما ألدريتش | M-1000 | |
| MIR05 | |||
| Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | ||
| متعدد القراء CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| محدد خزان النيتروجين 6 بالإضافة إلى | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| أوليغومايسين | سيجما-ألدريتش | O4876 | |
| أوكساليسيتات | سيجما-ألدريتش-أوكسيغراف-2 | ||
| كيلو | أوروبوروروس | ||
| البنسلين-ستربتومايسين | PAA | 15140122 | |
| ماصات الأداء ماصة 10 & mu; لتر ، 100 مو ؛ لتر ، 1000 مو ؛ إل | في دبليو آر | ||
| روزويل بارك. المعهد التذكاري المتوسط (RPMI-1640) | جيبكو (علمي حراري) | 11530586 | |
| روتينون | سيجما ألدريتش | R8875 | |
| ساكاروز | كارل روث جي إم بي إتش وشركاه KG | 9286.2 | |
| أزيد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S2002 | |
| سكسينات | سيجما ألدريتش | S2378 | |
| رباعي ميثيل فينيلينديامين (TMPD) | سيجما ألدريتش | T3134 | |
| عاصبة / صفعة | |||
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينو ميثان | سيجما ألدريتش | 108382 | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | 108643 | |
| تريبانبلاو | بيوكروم | T6146 | |
| فراغ | فاكبراند GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| حمام مائي WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
المراجع
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48(2019).
- Kleiveland, C. R. Peripher....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
