يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد نماذج إصابة الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus

2.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65771

⸱

أكتوبر 13, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

لقد قمنا بتطوير العديد من البروتوكولات للحث على تلف الشبكية أو تنكس الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis . توفر هذه النماذج إمكانية دراسة آليات تجديد الشبكية.

الملخص

الأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين هي الأسباب الرئيسية للعمى. من بين العديد من الاستراتيجيات العلاجية التي يتم استكشافها ، ظهر تحفيز الإصلاح الذاتي مؤخرا على أنه جذاب بشكل خاص. المصدر الخلوي المهم لإصلاح الشبكية هو خلية مولر الدبقية ، التي تؤوي إمكانات الخلايا الجذعية وقدرة تجددية غير عادية في anamniotes. ومع ذلك ، فإن هذه الإمكانات محدودة للغاية في الثدييات. يجب أن توفر دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد الشبكية في النماذج الحيوانية ذات القدرات التجديدية نظرة ثاقبة حول كيفية إطلاق العنان للقدرة الكامنة لخلايا مولر الثديية على تجديد شبكية العين. هذه خطوة أساسية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية في الطب التجديدي. لتحقيق هذا الهدف ، قمنا بتطوير العديد من نماذج إصابة الشبكية في Xenopus: إصابة ميكانيكية في الشبكية ، وخط معدل وراثيا يسمح بالاستئصال الشرطي لمستقبلات الضوء بوساطة النيتروريدوكتاز ، ونموذج التهاب الشبكية الصباغي القائم على خروج المغلوب رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9 ، ونموذج سام للخلايا مدفوع بحقن CoCl2 داخل العين. تسليط الضوء على مزاياها وعيوبها ، وصفنا هنا هذه السلسلة من البروتوكولات التي تولد حالات تنكسية مختلفة وتسمح بدراسة تجديد الشبكية في Xenopus.

المقدمة

يعاني ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم من أمراض تنكسية مختلفة في شبكية العين تؤدي إلى العمى ، مثل التهاب الشبكية الصباغي أو اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). حتى الآن ، لا تزال هذه الحالات غير قابلة للعلاج إلى حد كبير. تشمل الأساليب العلاجية الحالية قيد التقييم العلاج الجيني ، وزرع الخلايا أو الأنسجة ، والعلاجات الوقائية العصبية ، وعلم البصريات الوراثي ، والأجهزة التعويضية. وتستند استراتيجية ناشئة أخرى إلى التجديد الذاتي من خلال تنشيط الخلايا الداخلية ذات إمكانات الخلايا الجذعية. خلايا مولر الدبقية ، نوع الخلايا الدبقية الرئيسي في شبكية العين ، هي من بين المصادر الخلوية ذات الأهمية في هذا السياق. عند الإصابة ، يمكنهم إلغاء التمايز والتكاثر وتوليد الخلايا العصبية1،2،3. على الرغم من أن هذه العملية فعالة جدا في الزرد أو Xenopus ، إلا أنها غير فعالة إلى حد كبير في الثدييات.

ومع ذلك ، فقد ثبت أن العلاجات المناسبة بالبروتينات الانقسامية أو الإفراط في التعبير عن عوامل مختلفة يمكن أن تحفز عودة دورة الخلايا الدبقية في الثدييات مولر ، وفي بعض الحالات ، تؤدي إلى التزامها اللاحق بتكوين الخلايا العصبية1،2،3،4،5. ومع ذلك ، لا يزال هذا غير كاف إلى حد كبير للعلاجات. ومن ثم ، فإن زيادة معرفتنا بالآليات الجزيئية الكامنة وراء التجديد أمر ضروري لتحديد الجزيئات القادرة على تحويل خصائص الخلايا الجذعية مولر بكفاءة إلى استراتيجيات علاجية خلوية جديدة.

مع هذا الهدف ، قمنا بتطوير العديد من نماذج الإصابة في Xenopus التي تؤدي إلى تنكس خلايا الشبكية. هنا ، نقدم (1) إصابة ميكانيكية في شبكية العين ليست خاصة بنوع الخلية ، (2) نموذج استئصال الخلايا المشروط والقابل للانعكاس باستخدام نظام NTR-MTZ الذي يستهدف الخلايا القضيبية ، (3) ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9 ، نموذج التهاب الشبكية الصباغي الذي يؤدي إلى تنكس خلايا القضيب التدريجي ، و (4) CoCl2- نموذج سام للخلايا مستحث يمكن أن يستهدف المخاريط على وجه التحديد أو يؤدي إلى تنكس خلايا الشبكية على نطاق أوسع. نسلط الضوء على خصوصيات ومزايا وعيوب كل نموذج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء رعاية وتجربتها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ، بموجب A91272108 الترخيص المؤسسي. تمت الموافقة على بروتوكولات الدراسة من قبل لجنة رعاية المؤسسية CEEA # 59 وحصلت على إذن من الإدارة الإدارية لحماية السكان تحت الرقم المرجعي APAFIS # 32589-2021072719047904 v4 و APAFIS # 21474-2019071210549691 v2. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذه البروتوكولات.

1. إصابة الشبكية الميكانيكية

ملاحظة: يتكون بروتوكول نموذج الإصابة الموصوف هنا من ثقب ميكانيكي في شبكية الشرغوف من المرحلة 45 فصاعدا. لذلك ، لا يستهدف أي نوع معين من خلايا الشبكية ولكنه يدمر سمك الشبكية بالكامل في موقع البزل.

  1. تحضير مخدر الضفادع الصغيرة
    1. إعداد حل الأسهم 10 ٪ من البنزوكائين. للحصول على حجم إجمالي قدره 10 مل ، أضف 1 جم من البنزوكائين ، و 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و 8 مل من البروبيلين جليكول. حافظ على محلول المخزون لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء بورق الألمنيوم.
    2. تحضير محلول بنزوكائين 0.005٪ في وقت الاستخدام بإضافة 25 ميكرولتر من محلول مخزون البنزوكائين 10٪ إلى 50 مل من ماء تربية الشرغوف (ماء الصنبور المصفى والمكلور). تخلط جيدا.
      ملاحظة: تركيز البنزوكائين منخفض بشكل خاص لأن الضفادع الصغيرة حساسة للغاية للتخدير مقارنة بالبالغين.
  2. إعداد دبوس
    1. قم بتوصيل دبوس معقم بقطر 0.2 مم بحامل دبوس معقم (الشكل 1 أ).
  3. تخدير الشرغوف
    1. استخدم شبكة غمس للقبض على الضفادع الصغيرة في خزاناتها. انقلها إلى خزان جديد يحتوي على محلول البنزوكائين 0.005٪. انتظر بضع دقائق حتى تتوقف الضفادع الصغيرة عن التفاعل مع المنبهات (النقر على الخزان أو الاتصال المباشر).
      ملاحظة: قد يتم تخدير العديد من الضفادع الصغيرة في وقت واحد ، ولكن يجب أن يكون الوقت المستغرق في محلول التخدير أقل من 30 دقيقة.
  4. ثقب الشبكية
    1. استخدم ملعقة لالتقاط الشرغوف واحد ووضعه بعناية على طبق بتري صغير (قطره 55 مم) يحتوي على منديل مبلل. ضع الجانب الظهري للشرغوف لأعلى في منتصف طبق بتري.
    2. تحت المجهر المجسم ، ثقب الشبكية عن طريق إدخال الدبوس برفق على الجانب الظهري من العين ، حتى يمر عبر الشبكية (الشكل 1 أ). إذا كانت هناك حاجة إلى عدة وخزات ، كرر هذا الإجراء في أماكن مختلفة. بعد ثقب العين اليمنى ، أدر طبق بتري 180 درجة لثقب العين اليسرى.
    3. انقل الشرغوف المصاب إلى خزان كبير يحتوي على 1 لتر من مياه التربية عن طريق غمر طبق بتري بعناية. راقب الضفادع الصغيرة حتى تستيقظ تماما.

2. الاجتثاث الشرطي لخلية القضيب باستخدام نظام NTR-MTZ

يهدف البروتوكول إلى إحداث استئصال محدد لخلايا القضيبفي الخط المعدل وراثيا Xenopus Tg (rho: GFP-NTR) 6 ، المتاح في خدمة TEFOR Paris-Saclays zootechnics ، التي تستضيف مركز موارد Xenopus الفرنسي. يستخدم هذا النظام الكيميائي الوراثي قدرة إنزيم النيتروريدوكتاز (NTR) على تحويل الميترونيدازول (MTZ) إلى عامل ربط الحمض النووي السام للخلايا ، على وجه التحديد لاستئصال قضبان التعبير عن NTR (الشكل 1 ب). تم نشر بروتوكولين مفصلين لجعل Tg (rho: GFP-NTR) أو Tg (rho: NTR) معدلة وراثيا وتحفيز التنكس سابقا 7,8. هنا ، نقوم ببساطة بتفصيل تحريض تنكس الشبكية وكيفية مراقبة عملية التنكس في الجسم الحي.

  1. تحضير محلول ميترونيدازول
    1. تحضير محلول 10 mM MTZ في وقت الاستخدام عن طريق إذابة 1.67 جم من مسحوق MTZ في زجاجة داكنة في 1 لتر من ماء تربية الشرغوف يحتوي على 0.1٪ DMSO ، باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي ومحرض مغناطيسي.
      ملاحظة: MTZ حساس للضوء. قد يستغرق الذوبان الكامل ما يصل إلى 10 دقائق.
  2. توليد الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا عن طريق التزاوج الطبيعي من خط Tg (rho: GFP-NTR)
    ملاحظة: نظرا لأن الذكور المعدلة وراثيا تمثل مخزونا ثمينا ، فإننا نفضل توليد الأجنة عن طريق التزاوج الطبيعي لعدم التضحية بالذكر واستخدامه بشكل متكرر.
    1. إعطاء الهرمونات
      1. حقن 600 وحدة دولية من هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) مع إبر 25G في الكيس الليمفاوي الظهري للإناث من النوع البري Xenopus laevis . حقن الذكور المعدلة وراثيا مع 100-200 وحدة دولية من قوات حرس السواحل الهايتية في الكيس الليمفاوي الظهري. للمراقبة الحية لتنكس القضيب (الخطوة 2.4) ، استخدم ألبينو زينوبوس بدلا من تلك المصطبغة ، لتصور الاختلافات الفلورية بشكل أفضل عبر عين الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا المتولدة.
        ملاحظة: يمكن تحضير إناث Xenopus ب 50 وحدة دولية من قوات حرس السواحل الهايتية قبل 1 إلى 7 أيام من الإباضة المخطط لها ، ولكن هذا اختياري.
    2. التزاوج وجمع البيض
      1. مباشرة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية ، ضع في خزان واحد Tg (rho: GFP-NTR) ذكر معدل وراثيا مع أنثى واحدة محقونة من قوات حرس السواحل الهايتية عند 20 درجة مئوية حتى اليوم التالي. استخدم كمية كبيرة (10 لتر على الأقل) وأضف أشياء صغيرة حتى يلتصق البيض بها ، حتى لا يتضرر البيض من حركات البالغين. في اليوم التالي ، عندما لم تعد الضفادع في amplexus ، قم بإزالة البالغين من الخزان وجمع الأجنة.
    3. تربية الأجنة والضفادع الصغيرة
      1. مرحلة الأجنة والضفادع الصغيرة وفقا للجدول الطبيعي لتطور Xenopus 9.
      2. تربية الأجنة في خزان مملوء بماء تربية الشرغوف. من المرحلة 45 ، قم بتغذية الضفادع الصغيرة بمسحوق البطاطس المقلية وأكسجة الماء باستخدام فقاعات. أضف الماء يوميا إذا لزم الأمر لتعويض التبخر وتغيير ماء الخزان بالكامل أسبوعيا.
        ملاحظة: بدلا من ذلك ، من الممكن أيضا استبدال 50٪ من الحجم مرتين في الأسبوع. يمكن العثور على بروتوكول مفصل في10.
    4. فرز الأجنة المعدلة وراثيا
      1. من المرحلة 37/38 ، قم بفرز واختيار الأجنة المعدلة وراثيا تحت المجهر المجسم الفلوري عن طريق تصور GFP مباشرة (الشكل 1C).
  3. علاج الشرغوف MTZ
    1. نقل الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا Tg (rho: GFP-NTR) إلى خزان يحتوي على محلول MTZ 10 mM وخلفها عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة أسبوع واحد. استخدم الأشقاء المحورين وراثيا الذين يتم تربيتهم في مياه تربية الشرغوف التي تحتوي على 0.1٪ DMSO كعناصر تحكم.
    2. قم بتغيير MTZ ومحلول التحكم كل يوم خلال فترة العلاج. إطعام الضفادع الصغيرة كالمعتاد أثناء علاج MTZ.
    3. لمراقبة التألق الفردي (الخطوة 2.4) ، ضع كل شرغوف في وعاءه الصغير مع 30 مل من MTZ أو محلول التحكم من الخطوة 2.3.1 فصاعدا.
      ملاحظة: يمكن إجراء علاج MTZ في أي وقت من المرحلة 45 فصاعدا.
  4. المراقبة الحية لتنكس القضيب
    ملاحظة: يمكن مراقبة الانحطاط التدريجي للقضبان في الوقت الفعلي. لذلك، قم بتنفيذ الخطوات 2.4.1. إلى 2.4.4. قبل علاج MTZ ثم بانتظام بعد العلاج.
    1. اتبع الخطوتين 1.1 و 1.3 لإعداد التخدير وتخدير الشرغوف ، على التوالي.
    2. استخدم ملعقة لالتقاط الشرغوف واحد ووضعه بعناية على منديل مبلل في طبق بتري صغير (قطره 55 مم). راقب مضان GFP تحت مجهر مجسم فلوري (الطول الموجي للإثارة = 488 نانومتر وطول موجة الانبعاث = 509 نانومتر) والتقط صورا للعين. يعكس انخفاض شدة التألق تدهور القضبان.
      ملاحظة: لإجراء مقارنات كمية ، يجب الحفاظ على نفس الإعدادات لتصوير جميع الضفادع الصغيرة.
    3. انقل الشرغوف المصور إلى خزان كبير يحتوي على 1 لتر من مياه التربية عن طريق غمر طبق بتري بعناية. راقب الضفادع الصغيرة حتى تستيقظ تماما.
    4. قارن شدة التألق بين عيون الشرغوف المعالجة ب MTZ والتحكم لمراقبة وتقييم فعالية عملية التنكس.

3. تنكس خلايا القضيب بواسطة ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9

ملاحظة: تم إنشاء هذا البروتوكول لتوليد نموذج لالتهاب الشبكية الصباغي في Xenopus laevis عن طريق إحداث تنكس معين لخلايا القضيب باستخدام ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9. يتم توفير النسبة المئوية لحذف الإدراج (indels) في F0 في11 وهي ~ 75٪. يمكن أيضا إجراء مثل هذه الضربة القاضية بوساطة رودوبسين CRISPR / Cas9 في الضفادع الصغيرة Xenopus tropicalis 11.

  1. إعداد المحاليل والكواشف
    1. طلب crRNA و tracrRNA
      1. اشتر الحمض النووي الريبي الاصطناعي كريسبر (crRNA) الذي يستهدف جين رودوبسين (rho) والحمض النووي الريبي المنشط القياسي (tracrRNA). يتكون crRNA من منطقة محددة الهدف (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) ومنطقة أخرى (GUUUAAGAGCUAUGCU) تهجن إلى tracrRNA.
    2. crRNA:tracrRNA دوبلكس (رو gRNA دوبلكس)
      1. أعد تعليق crRNA و tracrRNA عند 100 ميكرومتر في المخزن المؤقت المزدوج الخالي من النيوكلياز.
      2. قم بإعداد gRNA duplex عن طريق خلط 3 ميكرولتر من 100 ميكرومتر rho crRNA ، و 3 ميكرولتر من 100 ميكرومتر tracrRNA ، و 94 ميكرولتر من المخزن المؤقت المزدوج. التركيزات النهائية هي 36 نانوغرام / ميكرولتر rho crRNA ، و 67 نانوغرام / ميكرولتر tracrRNA.
      3. قم بتلدين الأوليجوس عن طريق تسخينها على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتبريدها ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. اصنع القسمة وقم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    3. مركب البروتين النووي الريبي كريسبر-كاس9 (أي بروتين gRNA المزدوج / بروتين Cas9)
      1. في وقت الاستخدام ، تحضير خليط من رو gRNA دوبلكس وبروتين Cas9. بالنسبة إلى 20 ميكرولتر ، أضف 10 ميكرولتر من محلول rho gRNA المزدوج ، و 2 ميكرولتر من بروتين Cas9 (مخزون عند 5 مجم / مل) ، و 2 ميكرولتر من فلوريسئين ليسين ديكستران (مخزون عند 10 مجم / مل) ، و 6 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
      2. لتشكيل مركب البروتين النووي الريبي ، احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية واترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
      3. للحصول على 20 ميكرولتر من محلول التحكم ، امزج 2 ميكرولتر من بروتين Cas9 ، و 2 ميكرولتر من فلوريسئين ليسين ديكستران ، و 16 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
    4. إعداد حلول 10x و 1x و 0.1x MBS
      1. تحضير محلول بارث الملحي المعدل (10x MBS) بإضافة 11.92 جم من HEPES ، و 51.43 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.75 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 2.1 جم من بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، و 2.46 جم من كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتي (MgSO4 ، 7 H2O) في 800 مل من الماء من النوع الثاني. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام 30٪ هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). أضف الماء من النوع الثاني حتى يصبح الحجم 1 لتر وقم بتعقيمه عن طريق التعقيم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
      2. تحضير 1 لتر من محلول 1x MBS عن طريق تخفيف 100 مل من محلول ملح 10x MBS و 7 مل من 0.1 M ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2 ، 2H2O) في الماء من النوع الثاني. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
      3. تحضير محلول 0.1x MBS عن طريق تخفيف محلول 1x MBS في الماء من النوع الثاني. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    5. حل البنزوكائين للبالغين
      1. تحضير محلول بنزوكائين 0.05٪ بإضافة 5 مل من محلول مخزون البنزوكائين 10٪ (انظر الخطوة 1-1-1) إلى 1 لتر من ماء تربية الشرغوف. تخلط جيدا.
        ملاحظة: احفظ هذا المحلول لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء بورق الألمنيوم. أحضر المحلول إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه على.
    6. محلول ل-سيستين
      1. تحضير محلول dejellying في وقت الاستخدام عن طريق إضافة 2 غرام من مونوهيدرات الهيدروكلوريك L-cysteine إلى 100 مل من محلول 0.1x MBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 مع 30٪ هيدروكسيد الصوديوم.
    7. محلول بوليسكروز
      1. تحضير محلول السكروز الكثيف بإضافة 3 جم من بوليسكروز إلى 100 مل من محلول 0.1x MBS. قم بتخزين هذا المحلول لبضعة أسابيع عند 4 درجات مئوية.
  2. الإخصاب في المختبر وإزالة الهلام
    ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول الإخصاب في المختبر Xenopus في بروتوكول مخصص مفصل في12.
    1. إعطاء هرمون لإناث Xenopus laevis للحث على الإباضة
      1. قبل 15 ساعة تقريبا من حصاد البويضة ، قم بحقن 600 وحدة دولية من قوات حرس السواحل الهايتية في الكيس الليمفاوي الظهري للإناث واحتفظ بها طوال الليل عند 18 درجة مئوية.
    2. تشريح الخصية
      1. القتل الرحيم للذكور Xenopus بجرعة مميتة من محلول البنزوكائين 0.05٪ لمدة 10-15 دقيقة. كطريقة تكميلية للقتل الرحيم ، قم بقطع العمود الفقري مباشرة خلف الجمجمة بمقص حاد وقوي. افتح تجويف البطن بمقص التشريح ، واقطع الخصيتين ، وقم بإزالة أي دهون وشعيرات دموية متصلة. ضع كل خصية على الفور على الثلج في 1 مل من 1x MBS.
    3. إعداد المنوية
      1. سحق خصية واحدة باستخدام مدقة لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتخفيف التعليق في أنبوب 15 مل يحتوي على 9 مل من 1x MBS. أضف 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين إلى أنبوب الخصية الثاني واحتفظ به عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام لمزيد من تجارب الإخصاب.
    4. الإخصاب في المختبر
      1. قم بتدليك الجزء الخلفي من الأنثى المحقونة بالهرمونات بلطف وجمع البويضات في طبق بتري (قطره 100 مم). انشر بضع قطرات من محلول المنوية على البويضات. انتظر 5 دقائق وقم بتغطيتها ب 0.1x MBS. انتظر 10 دقائق قبل الشروع في إزالة الجيلينج.
    5. إزالة هلام البيض المخصب
      1. استبدل محلول 0.1x MBS بمحلول إزالة الهلام لإزالة طبقة الهلام من البيض المخصب (~ 5 دقائق). شطف الأجنة جيدا 5-6 مرات مع 0.1x MBS ونقلها إلى طبق بتري جديد 100 ملم مليئة 0.1x MBS.
  3. تحضير نظام الحقن المجهري
    1. شحذ الشعيرات الدموية الزجاجية مع مجتذب micropipette13.
    2. املأ الشعيرات الدموية الحادة ب 2-10 ميكرولتر من مركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 أو محلول التحكم باستخدام طرف محمل دقيق وضع الشعيرات الدموية في معالج الحاقن الدقيق.
    3. عند أعلى تكبير للمجهر المجسم ، قم بقطع الطرف الشعري بالملقط الدقيق ، واضبط وقت الحقن (~ 400 مللي ثانية) للحصول على حجم طرد يبلغ 10 نانولتر لكل نبضة. اضبط ضغط الطرد على حوالي 40 رطل لكل بوصة مربعة.
  4. الحقن المجهري للجنين أحادي الخلية مع مركب البروتين النووي الريبي كريسبر-كاس9
    1. ضع أجنة ذات مرحلة خلية واحدة على شبكة (نسيج نايلون 1 مم) ملتصقة في طبق بتري 100 مم مملوء بمحلول بوليسكروز 3٪ (الشكل 1 د).
    2. باستخدام الحاقن الدقيق وتحت المجهر المجسم ، قم بحقن 10 nL من مركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 (الذي يتوافق مع 500 بيكوغرام من gRNA duplex + 5 نانوغرام من بروتين Cas9 لكل جنين) أو محلول التحكم على مستوى القطب الحيواني ، في المنطقة القشرية ، أسفل الغشاء السيتوبلازمي مباشرة.
      ملاحظة: يسمح فلوريسئين ليسين ديكستران الموجود في المحلول بالفرز اللاحق للأجنة المحقونة.
    3. انقل الأجنة المحقونة إلى طبق بتري جديد 100 مم يحتوي على محلول بوليسكروز نظيف وضعه على حرارة 21 درجة مئوية.
    4. في اليوم الأول ، قم بفرز الأجنة المتطورة بانتظام واستبدل محلول السكروز ب 0.1x MBS حوالي 5 ساعات بعد الحقن المجهري.
    5. انتظر لمدة 24 ساعة بعد الحقن لفرز واختيار أجنة rho المقرمشة المحقونة جيدا تحت مجهر مجسم فلوري عن طريق تصور فلوريسئين ليسين ديكستران (الشكل 1E).
      ملاحظة: كلما كان الحقن المجهري مبكرا بعد الإخصاب ، زادت فعالية الضربة القاضية.
  5. تربية الأجنة والضفادع الصغيرة
    1. رفع أجنة rho crispant في 0.1x MBS في أطباق بتري حتى المرحلة 37/38. قم بإزالة الأجنة الميتة يوميا وقم بتغيير محلول 0.1x MBS. من المرحلة 37/38 ، قم بتربية الأجنة في خزان مملوء بمياه تربية الشرغوف ، ومن المرحلة 45 تابع كما في الخطوة 2.2.3.

4. تنكس خلايا الشبكية عن طريق حقن CoCl 2 السامة للخلايا داخل العين

ملاحظة: تم إنشاء هذا البروتوكول للحث على تنكس خلايا الشبكية عن طريق الحقن داخل العين من كلوريد الكوبالت (CoCl2) في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis . وفقا للجرعة ، يمكن أن يؤدي إلى انحطاط مخروطي أو انحطاط أوسع14. نستخدم هذا البروتوكول في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis التي تتراوح أعمارها بين المرحلة 48 فصاعدا. ويمكن أيضا أن تستخدم في الضفادع الصغيرة Xenopus tropicalis .

  1. إعداد العازلة والكواشف
    1. تحضير محلول البنزوكائين 0.005٪ في وقت الاستخدام كما في الخطوة 1.1.
    2. قم بإعداد محلول مخزون CoCl2 100 mM بإضافة 118.5 مجم إلى 5 مل من 0.1x MBS (انظر الخطوة 3.1.4 لتحضير 0.1x MBS). حافظ على محلول المخزون هذا لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء بورق الألمنيوم.
      تنبيه: يصنف CoCl2 على أنه مركب سام لحياة الإنسان. اتبع بعناية التعليمات الخاصة بالمناولة والتخزين والتخلص من النفايات في ورقة بيانات السلامة.
    3. بالنسبة للتنكس المخروطي النوعي ، قم بإعداد محلول CoCl2 10 mM في وقت الاستخدام من محلول مخزون 100 mM المخفف في 0.1x MBS. لتنكس خلايا الشبكية على نطاق أوسع ، قم بإعداد محلول CoCl2 25 mM.
  2. تحضير نظام الحقن
    1. شحذ الشعيرات الدموية الزجاجية مع مجتذب micropipette 13.
    2. املأ الشعيرات الدموية الحادة بمحلول 2-10 ميكرولتر من محلول CoCl2 10 أو 25 mM أو محلول التحكم (0.1x MBS) باستخدام طرف محمل دقيق وضع الشعيرات الدموية في معالج الحاقن الدقيق.
    3. عند أعلى تكبير للمجهر المجسم ، قم بقطع الطرف الشعري بالملقط الدقيق ، واضبط وقت الحقن (حوالي 100 مللي ثانية) للحصول على حجم طرد يتراوح بين 15 و 40 نانولتر لكل نبضة. اضبط ضغط الطرد على ~ 40 رطل لكل بوصة مربعة.
      ملاحظة: يجب تكييف حجم القطرة مع مرحلة الضفادع الصغيرة وحجم عينها. على سبيل المثال ، في المراحل 48-49 ، يكون حجم السقوط ~ 15-20 nL ، بينما يكون 30-40 nL في المراحل 52-56. بصريا ، حجم القطرة أكبر قليلا من حجم العدسة.
  3. حقن CoCl2 داخل العين
    1. استخدم شبكة غمس للقبض على الضفادع الصغيرة في خزاناتها. نقلها إلى 50 مل من محلول البنزوكائين 0.005 ٪. انتظر بضع دقائق حتى تتوقف الضفادع الصغيرة عن التفاعل مع المنبهات.
      ملاحظة: قد يتم تخدير العديد من الضفادع الصغيرة في نفس الوقت ، ولكن يجب أن يكون الوقت المستغرق في التخدير أقل من 30 دقيقة.
    2. استخدم ملعقة لالتقاط الشرغوف واحد ووضعه بعناية في طبق بتري صغير (قطره 55 مم) يحتوي على منديل مبلل. ضع الجانب الظهري للشرغوف لأعلى في منتصف طبق بتري (الشكل 1F ، G).
    3. استخدم الحاقن الدقيق تحت المجهر المجسم لحقن محلول CoCl2 داخل العين. أدخل الشعيرات الدموية برفق في العين فوق العدسة. عندما يكون الطرف الشعري داخل العين ، أخرج قطرتين لكل عين. بعد حقن العين اليمنى ، اقلب طبق بتري يدويا 180 درجة لحقن العين اليسرى.
      ملاحظة: تأكد من أن الحقن يتم داخل العين ، لذلك يجب رؤية تورم طفيف في العين بعد كل طرد للمحلول. يجب أن يبقى الشرغوف خارج الماء بأقل قدر ممكن. يجب أن يستغرق حقن كلتا العينين أقل من 1 دقيقة.
    4. انقل الشرغوف المحقون إلى خزان كبير يحتوي على 1 لتر من ماء التربية عن طريق غمره بعناية في طبق بتري (الشكل 1H). راقب الضفادع الصغيرة حتى تستيقظ تماما.

5. تلطيخ لتقييم تلف الشبكية أو تنكس الشبكية

  1. تثبيت الشرغوف والجفاف
    1. تحضير محلول بارافورمالدهايد 4٪ (PFA) عن طريق تخفيف 100 مل من محلول PFA 32٪ إلى 700 مل من 1x PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام NaOH. قم بقسمة محلول المخزون هذا وحفظه لعدة أشهر عند -20 درجة مئوية.
    2. القتل الرحيم للضفادع الصغيرة في 0.01٪ بنزوكائين ونقلها إلى قنينة تحتوي على 4٪ PFA لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. شطف 3 × 5 دقائق في 1x PBS.
    3. تجفيف الضفادع الصغيرة تدريجيا عن طريق حضانات متتالية لمدة 30 دقيقة في 70٪ و 95٪ إيثانول (مخفف في الماء من النوع الثاني) ، تليها ثلاث حضانات أخرى لمدة 1 ساعة في الإيثانول بنسبة 100٪. قم بتخزين رؤوس الشرغوف في هذه الخطوة عند -20 درجة مئوية أو انقلها مباشرة إلى 100٪ بيوتانول طوال الليل لمزيد من الخطوات.
  2. تقسيم البارافين
    1. استبدل 100٪ بيوتانول بالبارافين المذاب لمدة 2 ساعة عند 62 درجة مئوية. استبدل البارافين لمدة 2 × 2 ساعة من الحضانات الإضافية عند 62 درجة مئوية.
    2. انقل رؤوس الشرغوف في قوالب تضمين البارافين التي تستخدم لمرة واحدة وقم بتوجيهها بحيث تكون عيونها محاذاة جيدا ، ثم اترك البارافين يتصلب. تخزين الكتل في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بقص البارافين الزائد وقم بتركيب الكتلة باستخدام الشرغوف (الشرغوف) المضمن على دعامة الميكروتوم.
    4. قسم الكتلة مع microtome بسمك مناسب (10-12 ميكرومتر). انقل الشرائط بأقسام على شريحة مغطاة مسبقا ب 3٪ من الجلسرين الزلالي (المخفف في الماء).
    5. ضع الشريحة على جهاز تدفئة منزلق على حرارة 42 درجة مئوية لبضع دقائق ثم أزل فائض الجلسرين الزلالي. اترك الشرائح تجف طوال الليل في فرن على حرارة 37 درجة مئوية.
    6. قم بإزالة الشمع عن طريق غمر الشرائح لمدة 2 × 15 دقيقة في وعاء كوبلين مملوء بالزيلين بنسبة 100٪. أعد ترطيب الأقسام بسلسلة إيثانول متدرجة: 100٪ مرتين ، 70٪ ، 50٪ (مخففة في الماء من النوع الثاني) ، ~ 5 دقائق لكل منهما ، متبوعة ب 2 × 5 دقائق في الماء.
  3. وضع العلامات المناعية
    1. تحضير محلول مخزون سترات الصوديوم (CiNa) 100 مللي متر بإضافة 29.4 جم من ثنائي هيدرات ملح الصوديوم ثلاثي الصوديوم (C6H5Na3O7 ، 2H2O) إلى 1 لتر من الماء من النوع الثاني ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك (HCl). تعقيم عن طريق التعقيم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. قم بإعداد محلول إزالة القناع في وقت الاستخدام عن طريق إضافة 25 مل من محلول مخزون CiNa 100 مللي متر إلى 225 مل من الماء من النوع الثاني. أضف 125 ميكرولتر من Tween-20 واخلطه جيدا (التركيز النهائي هو 10 mM CiNa ، 0.05٪ Tween-20).
    2. قم بإعداد محلول مخزون Hoechst عند 10 مجم / مل بإضافة 100 مجم من bisBenzimide H 33258 إلى 10 مل من الماء من النوع الأول. حافظ على محلول المخزون هذا لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء بورق الألمنيوم. قم بإعداد محلول Hoechst عند 7.5 ميكروغرام / مل بإضافة 300 ميكرولتر من محلول مخزون Hoechst إلى 400 مل من 1x PBS.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا المحلول حتى 10 مرات وحفظه لمدة 6 أشهر تقريبا عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء بورق الألمنيوم.
    3. بعد إزالة الشمع من المقاطع ، قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق غلي الأقسام في محلول إزالة القناع لمدة 9 دقائق. دع المحلول يبرد لمدة 20 دقيقة.
    4. شطف مرة واحدة في الماء من النوع الثاني ومرة واحدة في 1x PBS. ضع الشرائح بشكل مسطح في غرفة رطبة وأضف 400-600 ميكرولتر من محلول الحجب لكل شريحة (مخفف الأجسام المضادة + 0.2٪ Triton X100) لمدة 30 دقيقة.
    5. استبدل محلول الحجب ب 200 ميكرولتر لكل شريحة من الجسم المضاد الأساسي المخفف في محلول الحظر. استخدم غطاء لنشر المحلول على الأقسام ، وتجنب تكوين الفقاعة. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة رطبة.
    6. انقل الشرائح إلى جرة كوبلين واشطفها لمدة 3 × 10 دقائق في 1x PBS مع 0.1٪ Triton X100. ضع الشرائح مسطحة ، أضف 400 ميكرولتر لكل شريحة من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول مانع ، واتركه لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
    7. انقل الشرائح إلى برطمان كوبلين واشطفها لمدة 3 × 5 دقائق مع 1x PBS مكمل ب 0.1٪ Triton X100.
    8. نوى الخلايا المضادة مع محلول Hoechst لمدة 10 دقائق وشطف 3 × 5 دقائق مع 1x PBS.
    9. ضع أغطية الأغطية فوق الشرائح في وسط تثبيت مائي مصمم خصيصا للحفاظ على التألق. اترك الشرائح تجف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    10. تخيل الشرائح بمجهر مضان.
  4. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) لتقييم تلف الشبكية
    ملاحظة: بدلا من تسمية نوع معين من الخلايا عن طريق التلوين المناعي ، يمكن تقييم أنسجة الشبكية العامة باستخدام تلوين H&E.
    1. بعد إزالة الشمع من المقاطع ، قم بإجراء وضع العلامات على الحمض النووي عن طريق غمر الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة. شطف جيدا بماء الصنبور.
    2. قم بوضع العلامات على السيتوبلازم عن طريق غمر الشرائح في محلول eosin بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة. شطف بسرعة بالماء.
      ملاحظة: Eosin قابل للذوبان جدا. إذا تركت الشرائح لفترة طويلة في الماء ، تختفي كل الصبغة.
    3. شطف 2 × 5 دقائق في 100٪ الإيثانول و 2 × 5 دقيقة في الزيلين.
    4. تحت الغطاء ، ضع أغطية فوق الشرائح في 4-5 قطرات من وسيط التثبيت. دع الشرائح تجف تحت غطاء محرك السيارة وصورها في اليوم التالي باستخدام المجهر.
  5. الكشف عن خلايا موت الخلايا المبرمج
    1. بعد إزالة الشمع من الأقسام (انظر القسم 5.2.6) ، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للمجموعة للكشف عن تجزئة الحمض النووي المبرمج.
    2. قم بإجراء تلطيخ النوى عن طريق غمر الشرائح في محلول Hoechst (انظر القسم 5.3.8) وقم بالتركيب باستخدام وسيط تركيب مائي مصمم خصيصا للحفاظ على التألق. اترك الشرائح تجف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. تخيل الشرائح بمجهر مضان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إصابة الشبكية الميكانيكية
تظهر أقسام شبكية العين من الضفادع الصغيرة المعرضة للإصابة الميكانيكية الموصوفة في قسم البروتوكول 1 أن آفة الشبكية تشمل جميع طبقات الأنسجة بينما تظل محدودة بموقع البزل (الشكل 2 أ ، ب).

الاجتثاث الشرطي لخلية القضيب باستخدام نظام NTR-MTZ
تم تحليل عيون الضفادع الصغيرة المعدلة وراثيا Tg (rho: GFP-NTR) المعالجة بمعالجة MTZ ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 2 ، تحت المجهر المجسم (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مزايا وعيوب نماذج إصابة الشبكية المختلفة في الضفادع الصغيرة Xenopus

إصابة الشبكية الميكانيكية
تم تطوير إصابات جراحية مختلفة في شبكية العين العصبية في الضفادع الصغيرة Xenopus. قد تتم إزالة الشبكية العصبية بالكامل 15,16 أو استئصالها جزئيافقط 16,17. لا تنطوي الإصابة الميكانيكية المعروضة هنا على أي استئصال للشبكية ولكن ثقب بسيط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من خلال منح إلى M.P. من جمعية شبكية العين في فرنسا ، ومؤسسة فرنسا ، ونشرة الهجرة القسرية (مؤسسة الأمراض الراديوية) ، و BBS (جمعية متلازمة بارديه بيدل) ، و UNADEV (الاتحاد الوطني للعلماء و Déficients Visuels) بالشراكة مع ITMO NNP (المعهد المسرحي متعدد الكائنات الحية ، العلوم المعرفية ، علم الأعصاب ، الطب النفسي) / AVIESAN (التحالف الوطني لعلوم الحياة والصحة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-البروبانديول (بروبيل & إيغريف; ني جليكول)سيجما ألدريتش398039
الإيثانول المطلق & 99.8٪كيماويات VWR20821-365
الجسم المضاد للكاسباز 3 المضاد (أرنب)إشارات الخلية9661Sالتخفيف 1/300
الجسم المضاد المضاد ل GFP (الدجاج)AveslabsGFP-1020التخفيف 1/500
الجسم المضاد ل M-Opsin (أرنب)Sigma-AldrichAB5405التخفيف 1/500
الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر ، Alexa Fluor 594 (الماعز)Invitrogen Thermo ScientificA11005التخفيف 1/1,000
الجسم المضاد ل Otx2 (أرنب)AbcamAb183951التخفيف 1/100
الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب ، Alexa Fluor 488 (الماعز)Invitrogen Thermo ScientificA11008التخفيف 1/1,000
الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب ، Alexa Fluor 594 (الماعز)Invitrogen Thermo ScientificA11012التخفيف 1/1,000
الجسم المضاد المضاد للريكوبرفين (أرنب)Sigma-AldrichAB5585التخفيف 1/500
الجسم المضاد للرودوبسين (الفأر)Sigma-AldrichMABN15التخفيف 1/1,000
الجسم المضاد ل S-Opsin (أرنب)Sigma-AldrichAB5407التخفيف 1/500
طقم الكشف عن Apoptotis (نظام TUNEL الفلوري المسدود الطرف)PromegaG3250
البنزوكائين مخزون Sigma-AldrichE150110٪
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) محلولمخزون Sigma-AldrichB288310 مجم / مل
Butanol-1 & ge ؛ 99.5٪كيماويات VWR20810.298
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub> ، 2H 2< / sub>O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382الاستخدام عند 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) NewEngland BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass Model GC100TF-10Warner Instruments (جهاز هارفارد)30-0038
سداسي هيدرات كلوريد الكوبالت (II) (CoCl 2< / sub> ، 6H 2< / sub>O)Sigma-AldrichC8661محلول مخزون 100 ملي ملم
Coverslip 24 × 60 ممVWR631-1575
Dako REAL ab مخفف   ؛AgilentS202230-2
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-AldrichD8418
إلكتروني دوار ميكروتومحراري علميميكروم HM 340E & nbsp ؛
الإيوزين 1٪ تشخيص RAL المائي312740
فلورسين ليسين ديكستران    Invitrogen Thermo ScientificD1822
المجهر المجسم الفلوريأوليمبوسSZX 200
جنتاميسينيوروميدكسEU0410-B
ألبومين الجلسرين acc. مالوريدياباثE0012استخدم بنسبة 3٪ في الماء
هيماتوكسيلين (مايرز هيمالون)RAL Diagnostics320550
هيبس ملحالبوتاسيومSigma-AldrichH0527
هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشريةMSD كورولون صحة1500
دخان حمض الهيدروكلوريك ، 37٪ (HCl)سيجما ألدريتش (SAFC)1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC7880استخدم بنسبة 2٪ في 0.1x MBS (درجة الحموضة 7.8 - 8.0)
كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات (MgSO4< / sub> ، 7H< sub>2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M3761استخدم عند
أطراف محمل دقيقمتر مجتذب ماصةدقيقة 5242956003
(P-97 Flaming / Brown) شركةSutter Instrument Co.نموذج P-97البرنامج: الحرارة 700 / سحب 100 / Vel 75 / الوقت 90 / مفتوح p = 500
وسيط التركيب للحفاظ على التألق ، كاشف FluorSaveMillipore345789
وسيط التركيب ، EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome شفرةEpredia3053835
إبرة Agani 25 جم × 5/8 بوصةTerumoAN * 2516R1
دبوس مطلي بالنيكلأدوات العلومالدقيقة 26016-12
أنسجة ترشيح من النايلون (نسيج غربلة) NITEX ، فتحة شبكية 1,000 ومايكرو ؛ mSefar06-1000 / 44
شمع البارافين النسيجي بدون DMSOHistolab00403
محلول بارافورمالدهيد (32٪)علوم المجهر الإلكترونيEM-15714-Sاستخدم بنسبة 4٪ في 1x PBS pH 7.4
قوالب التضمين التي يمكن التخلص منها Peel-A-WayEpredia2219
PestleVWR431-0094
طبق بتري 100 ممCorning GosselinSB93-101
Petri Dish 55 ممCorning GosselinBP53-06
محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer نظام الحقن الدقيقمنتجات أجهزة باركرPicoSpritzer
III Pins أدوات العلوم الدقيقة26002-20
عديد السكروز (Ficoll PM 400)Sigma-AldrichF4375استخدم بنسبة 3٪ في 0.1x MBS
كلوريد البوتاسيوم (KCl)Sigma-AldrichP3911
مسحوق طعام القلي: مصل Micron Naturesera45475 (00720)
مقص تشريحأدوات العلومالدقيقة 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL الزجاجVS11171076FKA 
كونز لتسخين الشرائحHP-3
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيجما ألدريتشS7653
سترات الصوديوم ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدرات الملح (C6< / sub>H5< / sub>Na3O7 ، 2H2< / sub>O)كيماويات VWR27833.294
كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO3< / sub>)سيجما ألدريتش (سوبيلكو)1.06329
هيدروكسيد الصوديوم 30٪ محلول مائي (هيدروكسيد الصوديوم)كيماويات VWR28217-292
مجهر مجسمزايسستيمي 2000
محاقن Omnifix-F Solo تستخدم مرة واحدة 1 مل لترB-BRUN9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)تقنياتالحمض النووي المتكاملة1072533
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC FluorescenceIlluminator X-Cite   ؛200DC
الزيلين & ge 98.5٪ كيماويات VWR28975-325
محلول 10 ملي Eppendorf حامل دبابيس أدوات

المراجع

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807(2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CRISPR
توليد نماذج إصابة الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.