مقالة منهجية

التقاط التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة بويضة الفأر عبر المقاييس المكانية

DOI:

10.3791/65976

⸱

يناير 12, 2024

 ,  ,  , 
1Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, CNRS, 3Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق التأثير المادي للهيكل الخلوي على الشكل النووي والعضيات الداخلية الخالية من الغشاء في نظام بويضات الفأر. يمكن تكييف الإطار للاستخدام في أنواع الخلايا والسياقات الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتمثل أحد التحديات الرئيسية في فهم أسباب العقم عند النساء في توضيح الآليات التي تحكم تطور الخلايا الجرثومية الأنثوية ، والتي تسمى البويضات. يتميز تطورها بنمو الخلايا والانقسامات اللاحقة ، وهما مرحلتان حرجتان تعدان البويضة للاندماج مع المنوية لبدء التطور الجنيني. أثناء النمو ، تعيد البويضات تنظيم السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية ، وهو حدث ينبئ بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية. في بويضات الفأر ، تبين أن إعادة التنظيم السيتوبلازمي هذه مدفوعة بالهيكل الخلوي ، الذي يولد نشاطه قوى ميكانيكية تثير النواة وتعيد وضعها وتخترقها. وبالتالي ، فإن انتقال القوة السيتوبلازمية إلى النيوكليوبلازمية يضبط ديناميكيات عضيات معالجة الحمض النووي الريبي النووية المعروفة باسم المكثفات الجزيئية الحيوية. يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق تأثير الهيكل الخلوي على النواة عبر المقاييس المكانية في بويضات الفأر ، بدقة زمنية عالية. يفصل خطوات التصوير وتحليل الصور والأدوات اللازمة لتقييم أ) نشاط الهيكل الخلوي في سيتوبلازم البويضة ، ب) التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة البويضة ، و ج) تأثيراته على ديناميكيات المكثفات الجزيئية الحيوية في نوكليوبلازم البويضة. بالإضافة إلى بيولوجيا البويضات ، يمكن تكييف الطرق الموضحة هنا لاستخدامها في الخلايا الجسدية لمعالجة الضبط القائم على الهيكل الخلوي للديناميكيات النووية عبر المقاييس.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد المواقع النووية ضروري للوظائف الخلوية والتنمويةالمتعددة 1،2،3،4،5. تعيد الخلايا الجرثومية الأنثوية في الثدييات المسماة البويضات تشكيل السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية على الرغم من خضوعها لتقسيم غير متماثل في الحجم ، والذي يعتمد على الكروموسوم اللاحق خارج المركز6 (الشكل 1). يتنبأ هذا التمركز للنواة بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر 7,8 ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية (الشكل 1).

إعادة تشكيل السيتوبلازم في بويضات الفئران مدفوعة بشكل أساسي بالهيكل الخلوي للأكتوميوسين9 (الشكل 2). يولد نشاطها قوى ميكانيكية تثير النواة10 وتعيد وضعها وتخترقها (الشكل 2). وبالتالي ، فإن انتقال القوة السيتوبلازمية إلى النيوكليوبلازمية هذا يضبط ديناميكيات عضيات معالجة الحمض النووي الريبي المرسال المسمى البقع النووية11 ، وهي واحدة من عدة عضيات عديمة الغشاء في النواة تعرف باسم المكثفات الجزيئية الحيوية12،13،14،15،16 (الشكل 2).

كان التصوير الحي حاسما في فك رموز الآثار الوظيفية للتحريض النووي. ساهمت أفلام الهجرة النووية على مدار ساعات ، وكذلك أفلام الدقة الزمنية العالية لشبكة الأكتين والسيتوبلازم السائب ، إلى حد كبير في وضع نموذج نظري لتحديد المواقع النووية ، يربط بين جداول زمنية مختلفة9. أيضا ، أبرزت الأفلام ذات الدقة الزمنية العالية للسيتوبلازم والمخطط النووي والمكونات النووية مثل الكروماتين والمكثفات النووية دور التحريض القائم على الهيكل الخلوي للنواة على معالجة الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني في بويضات الفئران ، وسد المقاييس الزمانية المكانية المختلفة داخل الخلية10،11. وإجمالا، قدم هذا النهج العابر للمقياس القائم على التصوير الحي الأساس المنطقي الأول الذي يربط التحريض الخلوي الهيكلي للنواة بالنجاح التنموي للبويضات.

يوفر البروتوكول خط أنابيب التصوير وتحليل الصور المستخدم لدراسة انتقال القوى السيتوبلازمية (الناتجة بشكل أساسي عن F-actin وجزئيا عن طريق الأنابيب الدقيقة) إلى النواة ومكوناتها الداخلية في بويضات الفئران. نتيجة هذه التجارب هي التقاط سلسلة متصلة من القوى عبر المقاييس المكانية ، من الهيكل الخلوي في السيتوبلازم إلى الداخل النووي عبر أفلام عالية الدقة الزمنية كما هو موضح في دراستين حديثتين10،11 ، والتي أثبتت العلاقة بين الحركات النشطة السيتوبلازمية ، وتقلبات المخطط النووي ، وكذلك الحركة والتقلبات السطحية لنوع واحد من المكثفات الجزيئية الحيوية النووية: بقع نووية. يمكن تطبيق نفس النهج على أنظمة نموذجية أخرى حيث من المتوقع أن تتغير القوى السيتوبلازمية ، كما هو الحال في سياق الخلايا السرطانيةالخبيثة 17.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية للجماعة الأوروبية وتمت الموافقة عليها من قبل وزارة الزراعة الفرنسية (الترخيص رقم 75-1170) ومن قبل المديرية العامة للبحوث والابتكار (DGRI; رقم اتفاقية الكائنات المعدلة وراثيا DUO-5291). تم إيواء الفئران في منشأة في دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، مع درجة حرارة محيطة من 22-24 درجة مئوية ورطوبة 40٪ -50٪. تشمل الفئران المستخدمة هنا إناث OF1 (Oncins France 1 ، من 8 إلى 12 أسبوعا) وإناث C57BL / 6 (من 10 إلى 14 أسبوعا).

1. جمع البويضات وإعدادها

  1. جمع البويضات من الفئران البالغة من العمر 8 إلى 14 أسبوعا كما هو موضح في18 و19.
    1. باختصار ، قم أولا باستخراج المبايض من الفئران كما هو الحال في18 إلى وسط M2 + Bovine Serum Albumin (BSA) قبل التسخين (37 درجة مئوية) مع 1 ميكرومتر ميلرينون19 ، مما يمنع استئناف الانقسام الاختزالي في البويضات.
    2. ثقب بصيلات المبيض بالإبر الجراحية لإطلاق البويضات النامية من بصيلات الغار (نهاية نمو البويضة20).
    3. اجمع البويضات بالحجم اللازم للتجارب (البويضات النامية و / أو كاملة النمو) باستخدام ماصة دقيقة متخصصة في جمع البويضات ، قبل غسلها ونقلها إلى أطباق ذات وسط طازج تحت الزيت المعدني.
  2. فصل البويضات ميكانيكيا عن الخلايا الجريبية الغارية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وتركها لتستقر لمدة 1 ساعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية قبل الشروع في الخطوات التجريبية اللاحقة.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالبويضات عند 37 درجة مئوية خلال جميع الخطوات التجريبية. لهذا البروتوكول ، تم جمع أكبر البويضات ، وهي الخلايا كاملة النمو.

2. الحقن المجهري للبويضات

ملاحظة: لالتقاط النشاط القائم على الهيكل الخلوي في السيتوبلازم ، يتم استخدام التصوير الحي برايتفيلد. وبالتالي فإن الحقن المجهري لعلامات الفلورسنت ليس ضروريا ، ويمكن استئناف البروتوكول في الخطوة 3. لتصوير المخطط النووي ، تم استخدام رانجو ، وهو مسبار يعرض علامة YFP في محطته N وعلامة CFP في المحطة C21,22. عند تصويرها في البويضات عند 488 نانومتر ، فإنها تسمي النواة بأكملها ، باستثناء النواة23 ، وتعرض مخططا نوويا حادا للغاية. لتصور البقع النووية ، تم استخدام SRSF2-GFP (NM_011358) ، وهي علامة للبقع النووية11. يتم استخدام نفس الوسط لجمع البويضات ، والحقن المجهري ، وترجمة الحمض النووي الريبي التكميلي ، وتصوير الخلايا الحية.

  1. خطي بلازميد رانجو مع بلازميد SfiI أو SRSF2-GFP مع إنزيمات تقييد AgeI.
  2. توليف الحمض النووي الريبي المجاني المغطى (cRNA) مع مجموعة النسخ المناسبة في المختبر وفقا للمروج (T3 ل Rango و T7 ل SRSF2-GFP) وتنقيتها باستخدام مجموعة تنقية العمود ، كما هو موضح سابقا24.
    ملاحظة: بولي أدينيلات SRSF2-GFP RNA باستخدام مجموعة polyadenylation لزيادة استقرار cRNA. يتم استخدام اثنين من المروجين المختلفين بسبب الاختلافات في العمود الفقري البلازميد.
  3. قياس تركيزات cRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي microvolume.
  4. تمييع رانجو cRNA إلى 1000 نانوغرام / ميكرولتر و SRSF2-GFP cRNA إلى 600 نانوغرام / ميكرولتر في dH2O.
  5. قسامة cRNA للطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل عند 25000 × جم قبل الحقن المجهري.
  6. حقن ترميز cRNAs ل YFP-Rango أو SRSF2-GFP كما هو موضح في11،25 في سيتوبلازم البويضات في وسط 37 °C M2 + BSA + Milrinone باستخدام حاقن دقيق.
  7. احتضان البويضات لمدة 2 ساعة على الأقل في وسط الاستزراع عند 37 درجة مئوية لترجمة cRNA.
  8. قم بإيداع البويضات في قطرات متوسطة صغيرة (5 ميكرولتر) على طبق زراعة الأنسجة 35 مم مع قاع زجاجي مغطى بالزيت المعدني. ضع بويضة واحدة لكل قطرة لتجنب التبييض الضوئي للبويضات المجاورة.

3. تصوير الخلايا الحية

ملاحظة: تم فحص بويضات الفئران الحية باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مزود بهدف غمر الزيت Plan- APO 40x / 1.25 NA ، وسطح مسح آلي ، وغرفة حضانة (37 درجة مئوية) ، وكاميرا CCD مقترنة بعجلة مرشح ، وقرص دوار. يتم الحصول على صور عالية الدقة الزمنية باستخدام Metamorph (المشار إليه فيما يلي باسم برنامج التصوير) في وضع اكتساب الدفق.

  1. افتح نافذة الحصول على برنامج التصوير.
  2. اضبط وقت التعرض على 500 مللي ثانية ، ومنطقة الكاميرا على الشريحة الكاملة والتجميع على 1.
  3. في علامة التبويب اكتساب ، قم بتعيين الإضاءة للقناة المطلوبة. لتصوير النشاط السيتوبلازمي ، قم بإلقاء الضوء على البويضات بالضوء المنقول. لتصوير النواة الموسومة ب YFP-Rango أو SRSF2-GFP ، قم بإضاءة البويضات بطول موجة إثارة يبلغ 491 نانومتر.
  4. بالنسبة للتقليب السيتوبلازمي أو تجارب YFP-Rango ، ركز على نواة البويضة التي يمكن ملاحظتها بسهولة بالضوء المرسل (الشكل 3 أ). سيتم الحصول على طائرة واحدة. بالنسبة لتجارب البقع النووية ، ركز على قطرات SRSF2-GFP (الشكل 3C).
  5. في علامة التبويب خاص ، قم بتعيين المعلمات لتحسين سرعة الاستحواذ على النحو التالي.
    غالق الكاميرا: مفتوح للتعريض الضوئي
    وضع المسح: مسح التبعية
  6. افتح نافذة الحصول على الدفق لبرنامج التصوير. اضبط معلمات البث وفقا للتجربة. لكلتا الدراستين10,11 ، استخدم المعلمات الموضحة أدناه.
    1. في علامة التبويب اكتساب ، قم بتعيين المعلمات التالية.
      وضع الاستحواذ: دفق إلى ذاكرة الوصول العشوائي
      عدد الإطارات: 480 (يمكن تخفيضها إلى 240 إطارا لتقليل وقت التصوير)
      معلمات الكاميرا: التقاط الصور بمعدل الإطارات
      عدد الإطارات المراد تخطيها: 0
    2. في علامة التبويب معلمات وحدة تحكم الكاميرا الرقمية ، قم بتعيين المعلمات التالية.
      حالة الكاميرا: HALT
      وضع الغالق: فتح أبدا
      وضع المسح: مسح التبعية
      ملحوظة عدد الإطارات إلى المتوسط: 1
      ملاحظة 1: في وضع البث، بمجرد ضبط وقت التعريض الضوئي، يتم تحديد مدة الفيلم حسب عدد الإطارات. على سبيل المثال ، يولد وقت التعرض 500 مللي ثانية و 480 إطارا فيلما مدته 4 دقائق. يمكن عرض معاينة أثناء الحصول على الصورة.
  7. اضبط منطقة الاهتمام (ROI) حول الكائن. يقلل تقليل مساحة عائد الاستثمار من وقت الاستحواذ.
  8. انقر فوق اكتساب في نافذة اكتساب البث لبدء تشغيل الفيلم.
  9. احفظ الفيلم كملف .tif في نهاية الاستحواذ.
    ملاحظة: لمتابعة الهياكل النووية أثناء الأفلام عالية الدقة الزمنية ، يجب أن تحتوي المسابر النووية (YFP-Rango و SRSF2-GFP) على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية لتسهيل تجزئة الأجسام أثناء الخطوات الإضافية لتحليل الصور. يجب أن تكون ملامح تعبير SRSF2-GFP الخارجية قابلة للمقارنة مع الصبغات المناعية للبقع النووية الداخلية (الشكل 3C-D). قد تعكس التغييرات في ملامح تعبير SRSF2-GFP بالنسبة للتلطيخ الداخلي جرعات عالية من حقن cRNA والترجمة26 (الشكل 3C-D).

4. تحليل الصورة: التحريك السيتوبلازمي

ملاحظة: يتم تحديد التحريك السيتوبلازمي الذي يعكس شدة النشاط الخلوي الهيكلي القائم على الأكتين في البويضات من خلال تحليلات ارتباط الصور باستخدام برنامج من منشور سابق للمختبر9 ومتاح في27. يقيس البرنامج مقدار كثافة البكسل المحفوظة بين الصور المتتالية. الناتج هو فقدان الارتباط بين الصور في الوقت المناسب ، بدءا من 1 ويتناقص أضعافا مضاعفة مع مرور الوقت ، كما هو الحال في9.

  1. قم بمحاذاة صور الفاصل الزمني الأولية (Δt = 0.5 ثانية) باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg (Plugins>StackReg). لتثبيت المكون الإضافي StackReg28 ، قم بتمكين موقع تحديث BIG-EPFL29 للوصول إلى المكون الإضافي.
  2. احسب ارتباطات صورة المجال الساطع في 3 إلى 4 مناطق سيتوبلازمية ~ 300 ميكرومتر2 باتباع الخطوات أدناه.
    1. اقتصاص المناطق وحفظها كملفات أفلام منفصلة. افتح نافذة المحطة الطرفية.
    2. اكتب البويضة، واضغط على مفتاح المسافة ثم اضغط على مفتاح الإدخال Enter. تظهر نافذة تسمى الإشارة والفتحة. اختر ملفات الأفلام التي تم اقتصاصها والتي سيتم تحليلها.
      ملاحظة: يمكن اختيار عدة أفلام في نفس الوقت.
  3. يقوم التطبيق بإرجاع الملفات في نفس المجلد مثل الأفلام. يتم إنشاء ثلاثة ملفات مختلفة مع امتدادات .csv و .eps و .xls. يحتوي .xls الملف على البيانات لرسم مخططات الارتباط لمنطقة واحدة. متوسط قيم الارتباط من مناطق مختلفة داخل الخلية.
  4. لأغراض الوضوح البصري ، قم بتحويل قيم الارتباط النهائية عن طريق طرح قيمة كل نقطة زمنية من 1 للحصول على منحنى يشبه الأس المقلوب كما في 11.

5. تحليل الصور: خرائط ناقلات السيتوبلازم

ملاحظة: تم إنشاء خرائط ناقلات السيتوبلازم لبويضات الفأر بواسطة المكون الإضافي30 لتحليل ارتباط الصور الزمانية المكانية (STICS) الذي تم تنفيذه مسبقا للكشف عن التدفقات السيتوبلازمية في بويضات الفئران31 في فيجي 32 والمتاحة في 33. تظهر الخرائط حجم سرعة التدفق السيتوبلازمي واتجاهه ، كما في9 و11.

  1. قم بتحويل صور الفاصل الزمني ذات المجال الساطع (Δt = 0.5 ثانية) إلى تنسيق 32 بت.
  2. أعد محاذاة الصور باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg في Plugins > StackReg واختر تحويل الجسم الصلب .
  3. باستخدام مكدس المكون الإضافي ، قم بطرح المتوسط المتحرك jru v2 (في أدوات Detrend لمجموعة المكونات الإضافية STICS) ، تخلص من الهياكل الثابتة في الفيلم عن طريق طرح صورة متوسط الوقت للفيلم. خانات الاختيار اطرح المتوسط الثابت والمكدس الفرعي للإخراج، وحدد الحفاظ على المتوسط المكاني واضبط الفترة على 5.
  4. ارسم عائد استثمار حول البويضة ، باستثناء القشرة لتجنب التأثيرات الحدودية للمكون الإضافي.
  5. قم بتشغيل المكون الإضافي STICS map jru V2 (في أدوات ICS) ، بحجم منطقة فرعية 32 بكسل ، وحجم خطوة 16 بكسل ، وإزاحة STICS الزمنية ل 3 ، وإزاحة X و Y من 0 ، ومضاعف السرعة 8 ، وعتبة الحجم 0 وخانات الاختيار الخاصة بتطبيع طول المتجه ، والمتجهات المركزية ، وسرعات الإخراج ، واستخدام قناع الفيلم.
    ملاحظة: يقوم المكون الإضافي بإنشاء خريطة للبويضة بتنسيق .tif ، وعرض التدفقات السيتوبلازمية كمتجهات بألوان تشير إلى سعة التدفق ، كما في9 و11 ، وملف Excel بسرعات تدفق مقاسة.

6. تحليل الصورة: تقلبات المخطط النووي

ملاحظة: يمكن تحديد تقلبات المخطط النووي التي تعكس تحريض الغشاء النووي من أفلام النوى الموسومة ب YFP-Rango (الشكل 4A ، C). يتطلب تحليل الصور لتقلبات المخطط النووي فيجي وتثبيت المكونات الإضافية StackReg (تمكين موقع تحديث BIG-EPFL29 للوصول إلى المكون الإضافي StackReg) و PureDenoise34 و Ovocyte_nucleus. يقوم المكون الإضافي StackReg بتسجيل الصور لتصحيح الحركة العالمية المحتملة. يزيل المكون الإضافي PureDenoise ضوضاء الصور متعددة الأبعاد التي تتلفها ضوضاء Poisson-Gaussian المختلطة وينعم المخطط النووي. يقوم المكون الإضافي Ovocyte_nucleus بتعتبات الإشارة ويملأ الفتحة المقابلة للنواة من أجل إنشاء قناع نواة ثنائي ، وإعادة تنظيمه مع StackRreg وحساب المسافة r من السنترويد لقناع النواة إلى محيط القناع لجميع زوايا θ (θ ° من 0 ° إلى 360 ° بمقدار 1 ° زيادة) ، كما في الشكل 4. يمكن العثور على جميع رموز هذه المكونات الإضافية في 35.

  1. في فيجي ، في الإضافات > قائمة CIRB > Verlhac ، حدد شكل نواة الخلايا البيضوية.
  2. في مربع الحوار، قم بإجراء التحديد التالي.
    1. حدد المجلد الذي يحتوي على الأفلام المراد تحليلها.
    2. حدد زاوية θ (يمكن اختيار قيمة من 1 درجة إلى 360 درجة وتم استخدام قيمة 1 درجة للحصول على دقة مخطط تفصيلي مثالية) ، وهوامش الاقتصاص (يوصى باستخدام 5 ميكرومتر من أجل الحفاظ على النواة بأكملها).
    3. حدد معايرة XY والفاصل الزمني. انقر فوق موافق.
      ملاحظة: يتم توفير النتائج كملفات .xls في مجلد صادر في المجلد الذي يحتوي على الأفلام الأصلية. يعرض هذا الملف كل أنصاف الأقطار المقاسة r لكل مرة t وكل زاوية θ. ويرد مثال على ملف الإخراج في الجدول التكميلي 1. يحتوي المجلد الخارجي أيضا على فيلم لقناع النواة.
  3. باستخدام جدول بيانات ، احسب متوسط نصف القطر R على جميع النقاط الزمنية t لكل زاوية θ محددة. هذا يسمح برسم الشكل المتوسط بمرور الوقت (الشكل 4 ب). انظر المثال في الجدول التكميلي 2.
  4. لكل t و θ اطرح متوسط نصف القطر R بمرور الوقت من نصف القطر r. التباين (r-R)2 هو مقياس لتقلبات الغلاف النووي.
  5. احسب متوسط التقلبات لجميع النقاط الزمنية t وجميع الزوايا θ لكل نواة وفي النهاية لجميع النوى من حالة واحدة.
    ملاحظة: عندما يتغير شكل النوى بشكل كبير كما في حالة الهيكل الخلوي المتعطل، تدور النوى الموسومة ب YFP-Rango في فيجي لتوجيه الجزء الأملس لأعلى والغزو لأسفل، قبل الشروع في تحليل تقلبات المخطط النووي، كما هو الحال في10.

7. تحليل الصور: حركات البقع النووية (ديناميات الانتشار)

ملاحظة: يسمح تحليل حركة البقع النووية باستنتاج نوع الديناميكيات (المدفوعة أو المنتشرة أو المحصورة) لتلك العضيات من مساراتها.

  1. حدد صور وضع التدفق للبويضات التي تعبر عن قطرات SRSF2-GFP التي تتحرك بشكل أساسي في المحور X-Y.
  2. تصحيح لتبييض صور الفاصل الزمني للبويضات التي تعبر عن SRSF2- GFP باستخدام طريقة مطابقة الرسم البياني في فيجي (الصورة > ضبط > تصحيح التبييض).
  3. أعد محاذاة الصور باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg.
  4. تتبع مراكز قطرات SRSF2-GFP باستخدام المكون الإضافي Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). اضغط على إضافة مسار لبدء التعقب واضغط على إنهاء المسار عند الانتهاء. لا تقم بتنشيط تصحيح التوسيط.
  5. انسخ المسارات إلى ملف جدول بيانات لمتابعة حسابات متوسط الإزاحة التربيعية الزمنية (MSD) كما في 11 ، واحسب MSDs الزمنية من كل مسارات قطرات 20 ثانية.
  6. تناسب المنحنيات (msd (t) = beta x tα) مع طريقة Nelder-Mead باستخدام برنامج R لتقدير أس الانتشار ألفا (α).
  7. قم بقياس معامل الانتشار الفعال لتتمكن من مقارنة الظروف المختلفة حيث من المتوقع أن يكون الانتشار شاذا (α< 1).
  8. احسب معامل الانتشار الفعال Deff من ملاءمة خطية (alpha = 1) على 40 نقطة أولى (20 ثانية) من منحنى MSD الزمني وقم بالتطبيع حسب حجم القطرة (Deff في μm2 / s x 3/2 πr في μm).

8. تحليل الصورة: تقلبات سطح البقع النووية

ملاحظة: تم قياس تطور كفاف البقع النووية في الوقت المناسب ، وهو قراءة لانتقال القوة النشطة على هذه العضيات ، باستخدام مكون إضافي مصمم خصيصا Radioak36 للاستخدام في فيجي ومتاح في37. يستخرج المكون الإضافي قيم أنصاف أقطار تحديد معين لجميع الزوايا حول مركز التحديد. تم قياس تباين الشكل بمرور الوقت من خلال مقارنة قيمة نصف القطر بالنسبة إلى متوسط قيمته لكل زاوية. يسمح المكون الإضافي بتحديد تقلبات الشكل ويوفر خيارا لتصور هذه الديناميكيات. لتثبيته ، قم بتنزيل ملف Radioak_.jar وضعه في مجلد المكونات الإضافية في فيجي. أعد تشغيل فيجي. هذا المكون الإضافي هو نسخة محدثة من المكون الإضافي المستخدم لتحليل تقلبات المخطط النووي أعلاه وتنفيذ خط أنابيب مماثل.

  1. في أفلام البث لقطرات SRSF2-GFP ، حدد قطرات أكبر ذات أحجام مماثلة (نصف القطر ~ 2.5 ميكرومتر).
    ملاحظة: إذا كانت القطرات صغيرة جدا ، فسيؤدي عدم كفاية الدقة إلى قياسات تذبذب السطح الشاذة.
  2. قم بقص صور الفاصل الزمني للقطرات التي تمتد لمسافة 15 ثانية (Δt = 0.5 ثانية) عن طريق رسم مستطيل حول القطرة وتحديد Image > Crop (الشكل 5).
  3. أعد محاذاة الصور باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg في Plugins > StackReg واختر تحويل الجسم الصلب .
  4. قم بتنعيم الصورة لإزالة التشويش حول القطرة باستخدام خيار تنعيم فيجي ضمن معالجة.
  5. قم بإنشاء قناع ثنائي للقطرات باستخدام خيار التحويل إلى قناع في فيجي ضمن العملية > ثنائي. استخدم الطريقة الافتراضية والظلام للخلفية (الشكل 5).
  6. قم بتحليل قناع القطرة الثنائية الذي تم إنشاؤه باستخدام خيار تحليل الجسيمات في فيجي ضمن تحليل ، وحدد خيارات مسح النتائج وإضافة إلى المدير واحفظ منطقة المصالح (ROIs) في RoiManager (المزيد > حفظ) بتنسيق zip ليتم قراءتها بواسطة Radioak. يجب حفظ عائد الاستثمار في مجلد يسمى الخطوط في نفس مجلد الأفلام ، في ملفات تسمى اسم الصورة _UnetCortex.zip لكل فيلم يتم العثور عليه بواسطة Radioak.
  7. في قائمة > مكونات فيجي الإضافية CIRB > Radioak ، حدد إما الحصول على Radii لمعالجة فيلم واحد فقط أو Do One Folder لتحليل جميع الأفلام من نفس المجلد.
    ملاحظة: تنبثق نافذة لتحديد رقم الزاوية والمقياس. تم إطلاق Radioak بزيادات زاوية 1 درجة من 0 درجة إلى 360 درجة (إدخال 360) وتم استخراج قيم أنصاف الأقطار .
  8. حدد الفيلم أو المجلد الذي يحتوي على الأفلام المراد تحليلها. يتم توفير النتائج كملفات .xls (ملف واحد لكل فيلم) في دليل radioakres في المجلد الذي يحتوي على الأفلام الأصلية. يعرض كل ملف كل أنصاف الأقطار المقاسة r (بالميكرومتر إذا تم ملء معلمة المقياس) لكل مرة t (في شريحة) وكل زاوية (بالراديان ؛ الشكل 5 ؛ انظر مثال الناتج .xls في الجدول التكميلي 3).
  9. في جدول البيانات ، احسب متوسط نصف القطر R على جميع النقاط الزمنية t لكل زاوية محددة (انظر المثال في الجدول التكميلي 4). هذا يسمح لرسم الشكل المتوسط مع مرور الوقت.
  10. ارسم التباين (r-R)2 في ميكرومتر2 والذي يتوافق مع قياس تقلبات سطح القطرة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر لوحات الصور في الشكل 3 أمثلة على بويضة نموذجية كاملة النمو (الشكل 3 أ) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن YFP-Rango (الشكل 3B) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن صحيح (اللوحة اليسرى ؛ الشكل 3 ج) أو مفرط (اللوحة اليمنى ؛ الشكل 3 ج) جرعة من SRSF2-GFP cRNA ، وتلطيخ مناعي للبقع النووية في بويضة كاملة النمو باستخدام الجسم المضاد SC35 (الشكل 3D). تم تحديد الجرعة الصحيحة من SRSF2-GFP cRNA للحقن الدقيق بناء على مقارنات بصرية بين ملامح التعبير ل SRSF2-GFP مع الملامح الداخلية للبقع النووية.

يمكن تقليل قوى التحريك السيتوبلازمي في البويضات ، كما هو موضح في العمل السابق من المختبر باستخدام خرائط متجه STICS وتحليل ارتباط الصور (انظر9 و11) ، عن طريق الاضطرابات الهيكلية الخلوية ، سواء الوراثية (على سبيل المثال ، الفأر الطافر FMN2) والكيميائية (على سبيل المثال ، Cytochalasin D). تعرض خرائط STICS للبويضات الضابطة العديد من المتجهات ، حيث تشير الألوان إلى سرعات تدفق عالية ، بينما تعرض خرائط البويضات ذات القوى الهيكلية الخلوية المعطلة متجهات أقل ، مع ألوان تشير إلى سرعات تدفق منخفضة. وبالمثل ، يتم فقدان ارتباط الصورة بسرعة كبيرة في البويضات الضابطة مقارنة بالبويضات ذات القوى الهيكلية الخلوية المعطلة. يمكن ملاحظة ذلك في منحنيات الارتباط ، مع انخفاض أسرع في منحنى البويضات الضابطة مقارنة بالبويضات ذات القوى الهيكلية الخلويةالمعطلة 9 أو زيادة أسرع عندما يكون المنحنى مقلوبا11.

تعمل قوى الهيكل الخلوي على تحريك النواة وعضياتها الداخلية ، ولا سيما المكثفات النووية مثل البقع النووية10,11. في الشكل 4 أ ، تتعرض نواة بويضات التحكم لتقلبات طرفية مهمة ، والتي يمكن رؤيتها باستخدام المسبار النووي YFP-Rango. شكل النواة في البويضات ذات القوى الهيكلية الخلوية المتعطلة مستقر خلال الوقت (الشكل 4C). يعد تحليل تقلبات المخطط النووي أمرا أساسيا لتحديد التحريض بدقة. من خلال تحديد تباين المسافة من النواة المركزية إلى محيطها ، (r-R) 2 (الشكل 4B) ، يمكن قياس التقلبات ، مما يدل على أن التحريض النووي أعلى 6 مرات في البويضات الضابطة منه في البويضات ذات القوى الهيكلية الخلويةالمعطلة 10. في الشكل 5A-B ، تظهر البقع النووية (قطرات SRSF2-GFP +) في سياقات التحكم والاضطراب للقوى السيتوبلازمية بدقة زمنية عالية. في عناصر التحكم ، يتقلب سطح القطيرات بشكل ملحوظ أكثر من أسطح القطيرات في البويضات ذات القوى السيتوبلازمية المعطلة ، والتي يمكن تصورها وقياسها باستخدام المكون الإضافي Radioak32. بصريا ، تشير الألوان الخضراء والحمراء (إخراج Radioak الذي يظهر في الصور السفلية للشكل 5A-B) إلى الزوايا التي اكتشف فيها المكون الإضافي تغيرات السطح بين الصور المتتالية ويشير اللون الأبيض إلى نقص التغييرات السطحية.

figure-results-1
الشكل 1: رسم توضيحي لتكوين البويضة المتأخر للفأر والتطور الجنيني المبكر. رسم توضيحي لتمركز النواة الذي يحدث في نمو البويضة المتأخر ، وتمركز الكروموسوم الذي يحدث أثناء انقسام البويضة ، والخطوات المبكرة (مراحل 1 خلية و 2 خلية) من التطور الجنيني. الجينومات الأنثوية (نواة البويضة والنواة الأنثوية) باللون الوردي ، والنواة الذكرية باللون الأزرق. نوى الجنين (بعد اندماج الجينومات الأبوية) أرجوانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: رسم توضيحي لإعادة تشكيل السيتوبلازم والنووي عبر المقاييس في بويضات الفأر النامية. يلخص هذا الرقم النتائج الرئيسية من9،10،11. رسم توضيحي لإعادة تشكيل السيتوبلازم القائم على الأكتوميوسين ، والإثارة النووية ، وإعادة تشكيل المكثفات الجزيئية الحيوية النووية الوظيفية عبر المقاييس الزمانية المكانية. إن إعادة تشكيل البقع النووية المتقاطعة على نطاق واسع تعزز التفاعلات الجزيئية الحيوية المرتبطة بوظيفتها (أي ربط ما قبل mRNA). لاحظ أن هذا البروتوكول يسمح بتقييم التحريض النووي فقط عبر المقاييس المكانية ولكن ليس المقاييس الزمنية ، حيث يتم إجراء جميع الصور بنفس الدقة الزمنية البالغة 0.5 ثانية بين إطارات الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: صور نموذجية للخلية البيضية كاملة النمو وبلازما النواة. (أ) صورة المجال الساطع لخلية بيضوية كاملة النمو تظهر الكروماتين (سماوي) الذي يحيط بالنواة. دائرة بيضاء منقطة تحدد النواة. (ب) نواة بويضات حية تعبر عن YFP-رانغو؛ لاحظ عدم وجود مضان في النواة. (ج) مثال على نواة البويضة الحية التي تعبر عن SRSF2-GFP بعد الحقن المجهري للجرعات الصحيحة من cRNA (اللوحة اليسرى) أو جرعات عالية من cRNA (اللوحة اليمنى) ؛ لاحظ المراحل المكثفة (القطرة) والمذابة على اليسار وغيابها في الحالة على اليمين. د: تلطيخ منااعي للبقع النووية في خلية بيضية ثابتة؛ لاحظ ملف تعريف التعبير الداخلي الذي يمكن مقارنته بالشكل الموجود في C (اللوحة اليمنى). قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: مخرجات البرنامج المساعد للتحكم وتقلبات المخطط النووي المعطلة. (أ) الفاصل الزمني لنواة بويضة التحكم التي تعبر عن YFP-Rango (أعلى) والقناع الثنائي المقابل لها الناتج عن المكون الإضافي Ovocyte_nucleus (أسفل). (ب) مبدأ قياسات تقلبات المخطط النووي بمرور الزمن وفي اتجاه معين. يتم تحديد الاتجاهات بزاوية دوارة θ بزيادة 1 درجة من 0 درجة إلى 360 درجة. يتم تمثيل شكلين تمثيليين عند t = 0 s (أصفر) و t = 135 s (أرجواني). يتوافق الشكل الأزرق مع الشكل المتوسط بمرور الوقت. (ج) تقلبات المخطط النووي للنواة في الخلية البيضية مع انخفاض قوى الهيكل الخلوي بسبب اضطراب كل من F-actin (الفأر الطافر FMN2) والأنابيب الدقيقة (علاج Nocodazole ؛ كما في10). قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: مخرجات البرنامج المساعد للتحكم وتقلبات سطح القطيرات المعطلة. (أ) محصول قطرة نووية SRSF2-GFP للتحكم تم تصويرها بسرعة 500 مللي ثانية لكل إطار وتظهر في جدول البحث عن الجليد (LUT) (أعلى) ؛ قناع ثنائي من نفس القطرة الناتجة عن فيجي (وسط) ؛ ومخرجات البرنامج المساعد Radioak بعد تحليل التقلبات السطحية للقطرة (أسفل) ، مع زوايا تشير إلى اللون الأخضر والأحمر حيث اكتشف المكون الإضافي تغيرات السطح بين الصور المتتالية والأبيض يشير إلى عدم وجود تغييرات سطحية. (ب) التقلبات السطحية للقطرة النووية في البويضات ذات القوى الهيكلية الخلوية المنخفضة بسبب اضطراب كل من F-actin والأنابيب الدقيقة (كما في11). قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: مثال على مخرجات تحليل المكون الإضافي Ovocyte_nucleus. تم تحليل النواة نفسها كما هو موضح في الشكل 4 أ. ثيتا (θ) هي الزاوية بالدرجات و t1 إلى t600 تتوافق مع رقم الإطار ، والذي يمكن تحويله في الوقت المناسب. أنصاف الأقطار بالميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: نموذج جدول البيانات المستخدم لحساب تقلبات المخطط النووي. تم تحليل النواة نفسها كما هو موضح في الشكل 4 أ. ثيتا (θ) هي الزاوية بالدرجات و t1 إلى t600 تتوافق مع رقم الإطار ، والذي يمكن تحويله في الوقت المناسب. علامة التبويب الخام والمتوسط: أنصاف الأقطار بالميكرومتر. علامة التبويب r-R: مسافات r-R بالميكرومتر. الجدول (r-R) 2: قيم التذبذب بالميكرومتر2. تتوافق علامات التبويب x و y مع الإحداثيات الديكارتية لأنصاف الأقطار من علامة التبويب الخام والمتوسط. إنها تسمح برسم الشكل المتوسط للنواة بمرور الوقت في علامة تبويب الشكل المتوسط. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: مثال على إخراج تحليل البرنامج المساعد Radioak. تم تحليل نفس القطرة كما هو موضح في الشكل 5 أ. يتم عرض أنصاف الأقطار المقيسة عند نقاط زمنية وزوايا مميزة. أنصاف الأقطار بالميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: نموذج جدول البيانات المستخدم لحساب تقلبات سطح القطيرات النووية. تم تحليل نفس القطرة كما هو موضح في الشكل 5 أ. ثيتا (θ) هي الزاوية بالدرجات و t1 إلى t600 تتوافق مع رقم الإطار ، والذي يمكن تحويله في الوقت المناسب. علامة التبويب الخام والمتوسط: أنصاف الأقطار بالميكرومتر. علامة التبويب r-R: مسافات r-R بالميكرومتر. الجدول (r-R) 2: قيم التذبذب بالميكرومتر2. تتوافق علامات التبويب x و y مع الإحداثيات الديكارتية لأنصاف الأقطار من علامة التبويب الخام والمتوسط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشمل الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول الحقن المجهري المناسب للبويضات دون التأثير على بقائها أو وظيفتها الطبيعية9،10،11 ، بالإضافة إلى الحقن الدقيق لكميات محددة مسبقا من cRNA التي من شأنها أن تسمح بالتصور الصحيح للهياكل ذات الصلة ، مثل البقع النووية.

يعد إنشاء العلاقة بين الديناميات السيتوبلازمية والديناميكيات (الداخلية) النووية أمرا ضروريا عند دراسة كيفية تحريك الهيكل الخلوي للنواة أو داخلها. يسمح هذا البروتوكول ، مع تعديلات طفيفة ، بذلك من خلال ربط شدة التحريك السيتوبلازمي بديناميكيات قطرات YFP-Rango النووية أو SRSF2-GFP (كما في11). للمضي قدما ، يجب أولا تصوير البويضات لمدة 120 ثانية في وضع المجال الساطع لالتقاط التقليب السيتوبلازمي ، قبل تصويرها على الفور لمدة 120 ثانية باستخدام ليزر 491 نانومتر لالتقاط المخطط النووي أو ديناميكيات القطرات. في حالة قطرات SRSF2-GFP النووية ، يمكن ببساطة تقييم الارتباط من خلال مقارنة معاملات انتشارها الفعالة (انظر الخطوة 7 في هذا البروتوكول) بقيم الكثافة القصوى المقلوبة للتقليب السيتوبلازمي الذي تم الحصول عليه باستخدام تحليلات ارتباط الصور (انظر الخطوة 4 في هذا البروتوكول). نقطة أخرى مهمة هي حجم المكثفات المختارة لتحليل تقلبات سطح القطيرات. يجب اختيار قطرات ذات قطر مماثل لإجراء تحليلات مقارنة لمنع التحيز ، حيث يعدل الحجم شدة تقلبات السطح.

هناك بعض القيود لهذا البروتوكول. تعتمد تحليلات تقلبات المخطط النووي على تلطيخ كامل داخل النواة ، مثل YFP-Rango أو NLS-GFP. بالنسبة للتحليلات على البقع النووية ، يمكن أن يؤدي الحقن الدقيق لكميات مفرطة من SRSF2-GFP cRNA إلى تغييرات واضحة في خصائص فصل الطور لعلامة المكثفات هذه (الشكل 3C) ، كما استعرضها آخرون سابقا26. لذلك فإن التحقق من أن ملامح تعبير البروتين الخارجي قابلة للمقارنة مع تلك الداخلية أمر بالغ الأهمية. علاوة على ذلك ، يجب استبعاد قطرات صغيرة نسبيا (نصف قطر <2 ميكرومتر) من خطوط أنابيب تحليل تقلب السطح بسبب قيود الدقة المكانية باستخدام الأدوات المحددة هنا. يمكن حل مشكلة الدقة هذه عادة عن طريق استخدام مجاهر أكثر حلية والتي ، على سبيل المثال ، قد تكون ضرورية لاستكشاف التقلبات السطحية للمكثفات الأصغر في نواة البويضة أو في النواة الأصغر بكثير للخلايا الجسدية.

بشكل عام ، يسمح هذا البروتوكول بالتقاط التحريض القائم على الأكتين والهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة لنواة بويضة الفأر عبر المقاييس. على وجه التحديد ، يسمح بتوثيق تعبئة السيتوبلازم القائمة على الهيكل الخلوي ، وتقلبات المخطط النووي ، جنبا إلى جنب مع إزاحة البقع النووية الشبيهة بالسائل والتقلبات السطحية. على الرغم من أن بعض الدراسات في أنواع الخلايا الأخرى تتناول بعض هذه الأمور38،39،40 عبر بروتوكولات متميزة متفاوتة التعقيد على النطاقات المكانية الفردية ، فإن هذا البروتوكول البسيط يوفر الأدوات اللازمة لمعالجة الديناميات الخلوية المذكورة عبر مقاييس متعددة في خط أنابيب عمل واحد لأول مرة. وعلاوة على ذلك، فإن البيانات المستمدة من هذا النهج، عند استكمالها بالنمذجة الفيزيائية الأحيائية كما في10،11، تمكن من إجراء تقييم طفيف التوغل لما يلي: (أ) التغيرات في الميكانيكا النووية 10؛ (ب) التغيرات في الميكانيكا النووية 10؛ (ب) التغيرات في الميكانيكا النووية 10؛ (ج) التغيرات في الميكانيكا النووية10؛ (ج) التغيرات في الميكانيكا النووية. ب) انتقال القوى النشطة القائمة على الهيكل الخلوي في السيتوبلازم إلى المكثفات في النواة11 ؛ و iii) تبديد هذه الطاقة النشطة عبر مقصورات خلوية مختلفة10,11. الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات ، حيث يمكن تكييفه ليس فقط مع المكثفات النووية الأخرى مثل النواة23 ، ولكن أيضا مع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا السرطانية ، حيث تم توثيق التغييرات في كل من سلوكيات الهيكل الخلوي والمكثفات النووية17,41.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شارك أ.أ.ج. و م. أ. في كتابة المخطوطة جميع المؤلفين المشاركين على المخطوطة. يتم دعم MA من قبل CNRS و "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322) .A.A.J. مدعوم من قبل Fondation des Treilles و Fonds Saint-Michel و Fondation du Collège de France.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma A3311
CSU-X1-M1 قرص الغزليوكوجاوا
DMI6000B المجهر Leica
Femtojet microinjectorEppendorf
Fiji
عجلة تصفيةSutter Instruments Roper Scientific
FluorodishWorld Precision InstrumentsFD35-100
Metamorph software التصوير العالمي, الإصدار 7.7.9.0
الزيوت المعدنيةSigma AldrichM8410-1L
NanoDrop 2000   ؛Thermo Scientific
OF1 و C57BL / 6 فئران  تشارلز ريفر مختبرات
بولي (أ) مجموعة المخلفات  Thermo FisherAM1350
Retiga 3 CCD QImaging
RNAeasy Qiagen74104
SC35 الجسم المضادAbcamab11826الأجسام المضادة للبقع النووية; الماوس IgG1 المضاد SRSF2 / SC35 (1: 400)
SRSF2-GFP البلازميد   OriGene TechnologiesMG202528NM_011358
متجرد Micropipette  ؛ حلولمتخصصة في جمع البويضات
T3 mMessage mMachineThermo FisherAM1384   ؛
T7 mMessage mMachine Thermo FisherAM13344
غرفة ثرموستاتيخدمة تصوير
Windows ExcelWindows
كاميرا مجموعة XLAB الحياة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
  2. Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).
  3. Gundersen, G. G., Worman, H. J. Nuclear positioning. Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).
  4. Metzger, T. MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function. Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).
  5. Roman, W. Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction. Science. 374 (6565), 355-359 (2021).
  6. Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Control of nucleus positioning in mouse oocytes. Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).
  7. Brunet, S., Maro, B. Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).
  8. Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).
  9. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).
  10. Almonacid, M., et al. Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes. Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).
  11. Al Jord, A., et al. Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes. Nat Commun. 13 (1), 5070(2022).
  12. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), eaaf4382(2017).
  13. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  14. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  15. Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision. Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).
  16. Barutcu, A. R. Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns. Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).
  17. Guo, M. Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
  18. Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).
  19. Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).
  20. El-Hayek, S., Clarke, H. J. Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche. Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).
  21. Dumont, J. A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes. J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).
  22. Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  23. Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).
  24. Terret, M. E., et al. DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes. Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).
  25. Dumont, J., Verlhac, M. H. Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).
  26. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  27. OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).
  28. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  29. ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).
  30. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  31. Yi, K., et al. Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  33. Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).
  34. Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images. Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).
  35. Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).
  36. Letort, G. gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).
  37. ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).
  38. Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).
  39. Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus. Phys Rev Lett. 121 (14), 148101(2018).
  40. Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase. Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).
  41. Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. Biomolecular condensates and cancer. Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة