مقالة منهجية

العزل المغناطيسي المناعي للخلايا الجذعية CD34 + المقيمة في جدار الأوعية الدموية من الفئران

DOI:

10.3791/66193

⸱

ديسمبر 22, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education and Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنشأت هذه الدراسة طريقة مستقرة وفعالة للعزل والثقافة والتحديد الوظيفي للخلايا الجذعية CD34 + المقيمة في جدار الأوعية الدموية (CD34 + VW-SCs). يمكن استخدام طريقة العزل سهلة المتابعة والفعالة من قبل باحثين آخرين لدراسة الآليات المحتملة التي تنطوي عليها أمراض القلب والأوعية الدموية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التعرف بشكل متزايد على الخلايا الجذعية والسلفية المقيمة في جدار الأوعية الدموية CD34 + (VW-SCs) لدورها الحاسم في تنظيم إصابات الأوعية الدموية وإصلاحها. يعد إنشاء طريقة مستقرة وفعالة لزراعة الفئران الوظيفية CD34 + VW-SCs أمرا ضروريا لمزيد من التحقيق في الآليات التي ينطوي عليها انتشار هذه الخلايا وهجرتها وتمايزها في ظل ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. تجمع الطريقة الموصوفة بين فحص الخرزة المغناطيسية وقياس التدفق الخلوي لتنقية CD34 + VW-SCs المقيمة الأولية. ثم يتم تحديد الخلايا النقية وظيفيا من خلال تلطيخ التألق المناعي وتصوير الكالسيوم2+ . باختصار ، يتم الحصول على الخلايا الوعائية من adventitia من الشريان الأورطي الفئران والشريان المساريقي من خلال ربط كتلة الأنسجة ، تليها زراعة فرعية حتى تصل إلى عدد الخلايا على الأقل 1 × 107. بعد ذلك ، يتم تنقية CD34 + VW-SCs باستخدام فرز الخرزة المغناطيسية وقياس التدفق الخلوي. يتضمن تحديد CD34 + VW-SCs تلطيخ التألق المناعي الخلوي ، بينما يتم تحديد تعدد القدرات الوظيفية عن طريق تعريض الخلايا لوسط ثقافة معين للتمايز الموجه. علاوة على ذلك ، يتم تقييم إطلاق Ca2+ الداخلي الوظيفي وإدخال Ca2+ الخارجي باستخدام محطة عمل تصوير متاحة تجاريا في الخلايا المحملة ب Fura-2 / AM المعرضة ل ATP أو الكافيين أو thapsigargin (TG). توفر هذه الطريقة تقنية مستقرة وفعالة لعزل وزراعة وتحديد الخلايا الجذعية CD34 + المقيمة في جدار الأوعية الدموية ، مما يوفر فرصة للدراسات المختبرية حول الآليات التنظيمية ل VW-SCs وفحص الأدوية المستهدفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب جدار الأوعية الدموية دورا محوريا في نمو الأوعية الدموية ، وتنظيم الاستتباب ، وتطور أمراض الأوعية الدموية. في السنوات الأخيرة ، كشفت العديد من الدراسات عن وجود سلالات مختلفة من الخلايا الجذعية في الشرايين. في عام 2004 ، أبلغت مجموعة البروفيسور Qingbo Xu لأول مرة عن وجود خلايا جذعية / سلفية وعائية في محيط جدار الأوعية الدموية للبالغين ، معبرة عن CD34 و Sca-1 و c-kit و Flk-11. تظهر هذه الخلايا الجذعية الوعائية إمكانية التمايز والانتشار متعدد الاتجاهات. في ظل الظروف العادية ، تظل هادئة نسبيا. ومع ذلك ، عند تنشيطها بواسطة عوامل محددة ، يمكن أن تتمايز إلى خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية والخلايا الليفية. بدلا من ذلك ، يمكنهم تنظيم المصفوفة المحيطة بالأوعية الدموية وتشكيل الأوعية الدقيقة من خلال تأثيرات paracrine لتعزيز إصلاح أو إعادة تشكيل الأوعية المصابة2،3،4،5،6. في الآونة الأخيرة ، تم العثور على الخلايا الجذعية CD34 + المقيمة في جدار الأوعية الدموية للعب دور في تجديد الخلايا البطانية بعد إصابة سلك توجيه الشريان الفخذي2. وبالتالي ، فإن عزل وقياس CD34 + VW-SCs وفحص الخصائص البيولوجية الأساسية للخلايا الجذعية CD34 + أمر بالغ الأهمية لمزيد من الدراسة لمسارات الإشارة المشاركة في تنظيم CD34 + VW-SCs.

تتوفر حاليا طرق مختلفة لفصل الخلايا ، بما في ذلك التقنيات القائمة على خصائص زراعة الخلايا أو الخصائص الفيزيائية للخلايا مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، مما ينتج عنه خلايا مصنفة تحتوي على العديد من الخلايا غير المستهدفة ونقاوة منخفضة نسبيا7،8،9،10،11،12. تقنية أخرى شائعة الاستخدام هي فرز الخلايا بمساعدة الفلورة / المغناطيسية. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) هو نظام معقد ذو متطلبات تقنية عالية ، وهو مكلف نسبيا ويستغرق وقتا طويلا ويحتمل أن يؤثر على نشاط الخلايا المصنفة13,14. ومع ذلك ، فإن فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) أكثر كفاءة وملاءمة ، مع معدل استرداد مرتفع ونشاط خلية وتأثير أقل على تطبيقات المصب8. لذلك ، في هذا البروتوكول ، قمنا بتطبيق MACS لتنقية CD34 + VW-SCs وحددنا الخلايا بشكل أكبر عن طريق قياس التدفق الخلوي. إن إنشاء طرق عزل قائمة على MACS لدراسة الخلايا الجذعية لجدار الأوعية الدموية سيكون لا يقدر بثمن. أولا ، يسمح بإجراء دراسات وراثية وبيولوجية خلوية. ثانيا ، يسمح العزل الفعال وزراعة الخلايا الجذعية المقيمة في جدار الأوعية الدموية بالتقييم والفحص المنهجي لعوامل الإشارة التي تنظم وظائف الخلايا الجذعية. ثالثا ، يوفر تحديد الأنماط الظاهرية الحاسمة في الخلايا الجذعية "مراقبة جودة" مهمة في تقييم حالة الخلية. وبالتالي ، فإن تحديد طرق التنقية يمكن أن يكون مفيدا لتطبيقات مماثلة للخلايا الجذعية المماثلة المشتقة من الأوعية.

يقدم هذا التقرير عرضا مفصلا لطريقة مستقرة وموثوقة لثقافة CD34 + VW-SCs ، بما في ذلك تحديد الخلايا والتقييم الوظيفي الذي يتم إجراؤه عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتلطيخ التألق المناعي ، وقياس إشارات Ca2+ . توفر هذه الدراسة أساسا لمزيد من البحث المتعمق حول وظيفة CD34 + VW-SCs وآلياتها التنظيمية في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة ، وتم التعامل مع وفقا للمبادئ التوجيهية لإدارة واستخدام المختبر في الصين. التزم البحث التزاما صارما بالمتطلبات الأخلاقية للتجارب على ، بموافقة لجنة أخلاقيات (رقم الموافقة: SWMU2020664). تم استخدام الفئران السليمة C57BL / 6 البالغة من العمر ثمانية أسابيع من كلا الجنسين ، والتي يتراوح وزنها بين 18-20 جم ، في الدراسة الحالية. تم إيواء في مركز المختبر بجامعة ساوث ويست الطبية (SWMU).

1. زراعة كتلة الأنسجة من adventitia من الشريان الأورطي والشرايين المساريقية

  1. عزل CD34 + VW-SCs المقيم
    1. تخدير فأرين باستنشاق 3٪ إيزوفلوران (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). تأكيد التخدير الكافي عن طريق قرصة إصبع القدم. ضع الماوس مستلقيا بشريط طبي ورش 70٪ مطهر إيثانول لتطهير فراء الفأر. افتح تجاويف الصدر والبطن باستخدام مقص وملقط عيني معقم لكشف القلب والأمعاء. بعد تشريح الشريان الأورطي المعزول والشرايين المساريقية ، قم بتثبيت الشريان الأورطي والسرير المساريقي في طبق بتري يحتوي على مطاط السيليكون ومملوء بمحلول ملح فسيولوجي. باستخدام مجموعة أخرى من المقصات والملقط المعقم ، قم بتشريح الدهون حول الشريان الأورطي والشرايين المساريقية بسرعة.
    2. انقل الأنسجة المشرحة إلى طبق بتري 6 سم يحتوي على محلول بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين ب 1٪ (انظر جدول المواد). بعد الشطف مرتين ، انقل الشرايين إلى غطاء زراعة الأنسجة تحت مجهر ستيريو.
    3. قطع الشرايين طوليا واستخدام ملقط دقيق لتقشير الطبقة الخارجية من الشريان الأورطي والفرع الأول من الشرايين المساريقي. انقل الطبقات الخارجية إلى طبق بتري 3.5 سم يحتوي على 0.1-0.2 مل من وسط الاستزراع (انظر جدول المواد). قطع الطبقات الخارجية إلى قطع صغيرة (حوالي 1 مم3).
    4. انقل قطع الأنسجة إلى دورق T25 مغلف بالجيلاتين ، مما يضمن توزيعا متساويا على قاع القارورة. حافظ على مسافة معتدلة بين قطع الأنسجة لتسهيل زحف الخلايا ونموها. ضع القارورة عموديا في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 3 ساعات للسماح لكتل الأنسجة بالالتصاق بقاع القارورة.
    5. بعد 3 ساعات ، أضف 5 مل من وسط نمو الجلوكوز العالي DMEM لغمر كتل الأنسجة. قم بتوجيه قارورة T25 أفقيا. راقب هجرة الخلايا حول كتل الأنسجة من خلال المجهر كل 3 أيام.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي الوسط على 20٪ مصل بقري جنيني ، و 0.2٪ عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) ، و 0.2 مللي مول β-Mercaptoethanol ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (انظر جدول المواد). يدعم مصل الأبقار الجنينية تكاثر الخلايا ، بينما يعيق LIF و β-Mercaptoethanol تمايز الخلايا 7,8.
    6. عندما تصل الخلايا الموجودة في قارورة T25 إلى حوالي 80٪ من التقاء، قم بتمريرها واستزراعها في قارورة واحدة أو اثنتين من قارورة T75. الاستزراع الفرعي للخلايا على مدى خمسة ممرات لضمان النمو السليم والصحة.
  2. الفصل المغناطيسي للخلايا الجذعية CD34 + المقيمة
    1. عندما تصل الخلايا الموجودة في قارورة أو قارورة T75 إلى التقاء 80٪ ، قم بفصل الخلايا مع التربسين ، وأعد تعليقها في 1 مل من المخزن المؤقت للفرز (2 mM EDTA و 0.5٪ FBS). حدد رقم الخلية (107 / T75 قارورة) وأجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة).
    2. تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق حبيبات الخلية في 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز لكل 107 خلايا إجمالية. أضف 2 ميكرولتر CD34 جسم مضاد (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام مع الرج من حين لآخر.
    3. اغسل الخلايا بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت للفرز وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وبشكل كامل ، وأعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز.
    5. أضف 20 ميكروبيدات Micro Beads المضادة ل FITC (لكل 107 خلايا إجمالية ، انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت. تخلط جيدا عن طريق السحب المتكرر وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام مع اهتزاز متقطع.
    6. اغسل الخلايا مرتين بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق لطرد الخلايا. تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت.
    7. ضع عمود MS واحدا داخل المجال المغناطيسي للفاصل المناسب ، مع التأكد من وضع أنبوب تجميع (على سبيل المثال ، أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل) أسفل عمود MS لجمع المكونات المنفصلة. (انظر جدول المواد). اشطف العمود بمخزن مؤقت سعة 500 ميكرولتر وانتظر حتى يمر بالكامل.
    8. قم بتحميل معلق الخلية في العمود واجمع التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مسماة في أنبوب سعة 15 mL.
    9. قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. أدخل 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت في العمود ، ثم اغسل الخلايا ذات العلامات المغناطيسية على الفور عن طريق دفع المكبس إلى العمود.
    10. لتعزيز نقاء خلايا CD34 + ، يمكن أن يخضع الجزء المستخلص للتخصيب باستخدام عمود MS ثان. كرر عملية الفصل كما ذكر أعلاه. تقييم نقاء الخلايا التي تم فرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: عادة ، يتم الحصول على خلايا CD34 + بنسبة 10٪ -20٪ ، مع حوالي 70٪ -80٪ خلايا سلبية ، وفقدان حوالي 10٪ بسبب إجراءات التلوين والطرد المركزي.
    11. لمزيد من التأكيد على نقاء الخلايا الجذعية CD34 + جدار الأوعية الدموية ، حدد الخلايا التي تم فرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي. أظهرت الدراسة الحالية نقاء أكثر من 90٪.

2. تحديد الخلايا عن طريق التألق المناعي

  1. خلايا البذور على أغطية (قطر 8 مم) مغلفة مسبقا ب 0.04٪ جيلاتين.
  2. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 60٪ -70٪ التقاء ، شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق.
  3. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق (3 مرات) ، وتخلل الخلايا بنسبة 0.2٪ Triton X-100 (في PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق (3 مرات) ، ومنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بمصل حمار 5٪ (في PBS) لمدة 1 ساعة.
  5. قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب عن طريق تثبيت كل غطاء على حافته بالملقط وتصريفه على ورقة من المناديل الخالية من النسالة.
  6. احتضان الخلايا في الأجسام المضادة الأولية المخففة 100 مرة (CD34 ، Flk-1 ، c-kit ، Sca-1 ، Ki67 ، انظر جدول المواد) في 1٪ BSA (في PBS) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  7. صب المحلول وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق (3 مرات). احتضان الخلايا باستخدام Alexa Fluor 488 المسمى بالجسم المضاد الثانوي (1: 200 في 1٪ BSA) (انظر جدول المواد) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  8. قم بإجراء تلطيخ DAPI المضاد عن طريق تخفيف محلول مخزون DAPI إلى 0.5 ميكروغرام / مل في PBS واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق.
  9. شطف مع برنامج تلفزيوني وختم أغطية مع كاشف مضاد للبهتان. التقط الصور تحت مجهر المسح البؤري بالليزر.

3. التمايز والتوصيف المستحث ل CD34 + VW-SCs

  1. الخلايا الجذعية CD34 + البذور بكثافة مناسبة (التقاء 40٪ -50٪) على أغطية وألواح 6 آبار ، على التوالي.
  2. تحفيز التمايز الموجه لخلايا البطانة من خلايا CD34 + عن طريق زراعة الخلايا في وسط زراعة الخلايا البطانية EBM-2 (انظر جدول المواد) لمدة أسبوع واحد.
  3. تحفيز التمايز الموجه للخلايا الليفية عن خلايا CD34 + عن طريق زراعة الخلايا في وسط زراعة الخلايا الليفية FM-2 (انظر جدول المواد) لمدة 3 أيام.
  4. إخضاع الخلايا غير المتمايزة والمتمايزة للتلطيخ المناعي (كما هو مذكور في الخطوة 2) عند إثارة الليزر 488 نانومتر وهدف 40x. الكشف عن التعبير عن علامات الخلايا البطانية (CD31 ، VWF) وعلامات الخلايا الليفية (PDGFRα ، Vimentin) (انظر جدول المواد).
  5. فصل الخلايا مع التربسين والحصول على بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي (300 × غرام ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة). أعد تعليق الخلايا ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز. احتضان معلق الخلية مسبقا باستخدام CD16 / CD32 mAb المنقى المضاد للفأر (1 ميكروغرام) (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. أضف 2 ميكرولتر من PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50) ، CD31 (PECAM-1) الجسم المضاد أحادي النسيلة APC (2 ميكرولتر ، 1:50) ، و CD140a (PDGFRa) الجسم المضاد أحادي النسيلة FITC (2 ميكرولتر ، 1:50) مباشرة إلى الخلايا المحتضنة مسبقا في وجود Mouse Fc Block واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. اغسل الخلايا مرتين بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة) لإعادة تقشير الخلايا. تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت. ضع أنابيب التدفق ذات الخلايا الملطخة في صندوق ثلج جاهز لقياس التدفق الخلوي.

4. الكشف عن إشارات Ca2+ داخل الخلايا في الخلايا الجذعية CD34 + الوعائية

  1. خلايا البذور على أغطية 10 ساعات قبل التجارب بكثافة تصل إلى التقاء 70 ٪.
  2. أخرج أغطية الغطاء وألصقها في قاع غرفة مخصصة بأي هلام البترول.
  3. اغسل أغطية الغطاء مرة واحدة باستخدام PBS ، واستبدلها ب Fura-2 / AM (5 μM) في محلول Tyrode (NaCl 137 mM ، KCl 5.4 mM ، MgCl2 1.2 mM ، الجلوكوز 10 mM ، HEPES 10 mM ، CaCl2 2.4 mM) (انظر جدول المواد) ، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  4. قم بإزالة الصبغة عن طريق المعالجة بمحلول Tyrode لمدة 10 دقائق للسماح بإزالة أسترة fura-2 / AM.
  5. قم بتركيب الغرفة على مسرح مجهر مضان مقلوب مجهز بنظام تصوير واسع المجال يحتوي على أحادي اللون وكاميرا CCD (انظر جدول المواد).
  6. افتح النافذة الرئيسية ، وانتقل إلى مربع حوار إعدادات الاستيلاء وصفحة الكاميرا ، واضغط على الزر المباشر لعرض الصور الحية .
  7. اختر نوع الصورة الفلورية ، واضبط أوقات تكرار الحلقة 340 نانومتر / 380 نانومتر ، وحجم الصورة ، ووقت تعرض الكاميرا عند 380 نانومتر و 340 نانومتر لتحقيق سطوع الصورة الأمثل.
  8. التقط لقطات فردية ، وارسم عدة خطوط يدوية لوضع دائرة حول الخلايا بألوان مختلفة وتحديد منطقة الاهتمام (ROIs) مسبقا ، مع الإشارة إلى الخلفية على أنها عائد استثمار 0.
  9. أعد تحرير بروتوكول مضمن بالفعل في طريقة عرض مساحة العمل وأنشئ مساحة عمل جديدة.
  10. قم بتنفيذ البروتوكول ، وسيعرض "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" الرسم البياني الحركي عبر الإنترنت.
  11. في طريقة العرض الرقمية ، سيكون جدول البيانات مرئيا ، ويقدم أعمدة من قيم التدرج الرمادي ومعلومات الوقت المقابلة. تصدير بيانات جدول البيانات باستخدام الحافظة.
  12. احسب F340 نانومتر / F380 نانومتر مع الإشارة إلى تغييرات Ca2+ داخل الخلايا بعد طرح مضان الخلفية (ROI 0).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل وتنقية CD34+ VW-SCs
يتم الحصول على درجة نقاء عالية من CD34 + VW-SCs من عرضية الشريان الأبهري والمساريقي للفأر عن طريق ربط الأنسجة وفرز الميكروبيدات المغناطيسية. النسبة المئوية لخلايا CD34 + في جدار الوعاء الدموي بشكل عام 10٪ -30٪. يؤكد قياس التدفق الخلوي أن نقاء خلايا CD34 + التي تم الحصول عليها عن طريق فرز الخرزة المغناطيسية يزيد عن 90٪ (الشكل 1 أ). يظهر تلطيخ التألق المناعي الخلوي أن CD34 + VW-SCs تعبر في الغالب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر هذه الدراسة طريقة سريعة ومريحة للحصول على CD34 + VW-SCs الوظيفية من الشريان الأورطي والشرايين المساريقية للفئران. CD34 + VW-SCs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة لها نشاط تكاثري وخصائص تمايز متعددة الاتجاهات. مستقبلات إينوزيتول ثلاثي الفوسفات 1،4،5-ثلاثي الفوسفات (IP3Rs) ، مستقبلات ريانودين (RyRs) ، وقنوات الكالسيوم التي يتم تشغيلها في المتجر تتوسط إطلاق Ca2+ والدخول في CD34 + VW-SCs. سيضع إنشاء هذه التقنية الأساس لمزيد من التحقيق في الآليات المشاركة في CD34

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82070502 ، 31972909 ، 32171099) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (23NSFSC0576 ، 2022YFS0607). يود المؤلفون أن يشكروا Qingbo Xu من جامعة Zhejiang للمساعدة في زراعة الخلايا ، ويعترف المؤلفون بالمساعدة العلمية والتقنية لمنصة قياس التدفق الخلوي في جامعة ساوث ويست الطبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول جيلاتين 2٪سيجماG1393
الأجسام المضادة المضادة ل CD31R & DAF3628
الأجسام المضادة المضادة ل CD34Abcamab81289
الأجسام المضادة المضادة ل c-kitCST77522
المضادة للحبات الدقيقة FITCMiltenyi Biotec130-048-701   ؛
المضادة ل FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 الأجسام المضادةAbcamab24313
الأجسام المضادة المضادة ل Ki67CST34330
المضادة PDGFR & alpha الجسم المضادAbcamab131591
الأجسام المضادة المضادة ل Sca- 1Invitrogen710952
CD140a (PDGFRA) أحادي النسيلة الأجسام المضادة (APA5), FITCeBioscience   Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (390) ، APCeBioscience   ؛ Invitrogen17-0311-82
CD34 الأجسام المضادة ، المضادة للماوس ، FITC ، REAfinity Clone REA383Miltenyi Biotec130-117-775
غطاء ثقافة الخليةJIANGSU SUJING GROUP CO.، LTD   ؛SW-CJ-2FD
  CENCE   L530
CO2  حاضنات                       Thermofisher Scientific4111
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر  Zeiss Zeiss 980   
DMEM ارتفاع الجلوكوز متوسطATCC30-2002
EBM-2 وسط ثقافةLonzaCC-3162
FACSMelody   BD Biosciences
FACSMelody & trade; النظام  BD
مصل الأبقار الجنينMilliporeES-009-C
FM-2 متوسط ثقافةScienCell2331
Fura-2 / AM   ؛InvitrogenM1292
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor Plus 488& nbsp ؛ ثيرموفيشر العلمية     A32731
عامل مثبط لسرطان الدمميليبورLIF2010
المجهر أوليمبوسIX71
MiniMACS    طقم البدايةMiltenyi Biotec130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B SolutionBeyotimeC0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141
مجهر ستيريو أوليمبوسSZX10 
برنامج TILLvisION 4.0   T.I.L.Photonics GmbHpolychrome V 
VWF الجسم المضاد أحادي النسيلة (F8 / 86)Thermofisher Scientific  MA5-14029
& beta - MercaptoethanolThermofisher21985023
جهاز الطرد المركزي العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al. Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery. Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).
  3. Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells. Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).
  4. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
  5. Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. Roles of stem cells in vascular remodeling. Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).
  6. Zhang, L., et al. Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis. Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).
  7. Wu, Y., et al. Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).
  8. Tang, J. M., et al. Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).
  9. Sukumaran, P., et al. Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis. Cells. 10 (8), 2125(2021).
  10. van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. Optimizing stem cell culture. J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).
  11. Rotmans, J. I., et al. In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts. Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).
  12. Qu, R., et al. The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187(2022).
  13. Flynn, J., Gorry, P. Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells. Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).
  14. Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies. Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).
  15. Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells. Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).
  16. Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells. Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).
  17. Kumar, P., Garg, N. Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures. Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).
  18. Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes. Bio Protoc. 12 (2), e4299(2022).
  19. Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration. PLOS One. 15 (2), e0229504(2020).
  20. Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits. Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).
  21. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PLOS One. 14 (3), e0213832(2019).
  22. Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration. Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).
  23. Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).
  24. Garcia-Carlos, C. A., et al. Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures. Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).
  25. Reggiani, C. Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles. J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD34

مقالات ذات صلة