مقالة منهجية

مجموعة متزامنة من دماغ ومصل الفئران الجنيني لتقييم آثار النظام الغذائي للأم على التغذية والنمو العصبي في الورم العصبي الليفي من النوع 1

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66226

⸱

مايو 17, 2024

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة للجمع المتزامن لأنسجة دماغ الجنين بالإضافة إلى مصل عالي الجودة غير متحلل من نفس جنين الفأر. لقد استخدمنا هذه التقنية لاستجواب كيفية تأثير التعرض الغذائي للأم على ملامح المغذيات الكبيرة والتطور العصبي للجنين في الفئران متغايرة الزيجوت ل Nf1 (الورم العصبي الليفي من النوع 1).

الملخص

ثبت أن السمنة الناجمة عن النظام الغذائي للأمهات تغير النمو العصبي لدى النسل ، مما قد يؤدي إلى انخفاض القدرة المعرفية وفرط النشاط وضعف السلوك الاجتماعي. قد يعاني المرضى الذين يعانون من الاضطراب الوراثي غير المتجانس سريريا الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) من عجز مماثل ، ولكن من غير الواضح حاليا ما إذا كانت العوامل البيئية مثل النظام الغذائي للأم تؤثر على تطور هذه الأنماط الظاهرية ، وإذا كان الأمر كذلك ، فما هي الآلية التي سيحدث بها هذا التأثير. لتمكين تقييم كيفية تأثير التعرض للنظام الغذائي السمني للأمهات على العوامل الجهازية ذات الصلة بالنمو العصبي في NF1 ، قمنا بتطوير طريقة لجمع المصل غير المتحلل والأدمغة الكاملة أو الإقليمية التشريح الدقيق في وقت واحد من نسل الجنين من سدود الفئران التي تتغذى على نظام غذائي مراقب مقابل نظام غذائي غني بالدهون وعالي السكروز. تمت معالجة الأدمغة للاستئصال بالتبريد أو التجميد السريع لاستخدامها في الحمض النووي الريبي اللاحق أو عزل البروتين. تم التحقق من جودة الأنسجة التي تم جمعها عن طريق التلوين المناعي. تم التحقق من جودة المصل من خلال تحليل ملامح المغذيات الكبيرة. باستخدام هذه التقنية ، حددنا أن النظام الغذائي السمين للأمهات يزيد من كوليسترول الدم في مصل الجنين بالمثل بين WT و Nf1-متغاير الزيجوت.

المقدمة

يعتبر الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) من RASopathy ، وهي مجموعة من الاضطرابات التي تتميز بطفرات جينية في السلالة الجرثومية تؤدي إلى تنشيط مسار إشارات RAS / MAPK (فيروس ساركوما RAt / بروتين كيناز المنشط بالميتوجين). المرضى الذين يعانون من NF1 RASopathy معرضون لخطر الإصابة بالعديد من المظاهر المختلفة ، بما في ذلك الأورام الحميدة والخبيثة في الوسط (الورم الدبقي في المسار البصري1،2 ، الورم الدبقي عاليالدرجة 3،4) والمحيطي (الورم الليفي العصبيالضفيري 5،6 ، ورم غمد الأعصاب المحيطيالخبيث 7،8) الجهاز العصبي وكذلك خلل التنسج العظمي9 والتشوهات الصباغيةالجلدية 10 (النمش الإبطي ، اللطخات المقهى). يتم التعرف على تأثير هذا الاضطراب على الإدراك والنمو العصبي بشكل متزايد ، حيث أظهر مرضى NF1 زيادة في حدوث عجز التعلم وفرط النشاط واضطراب طيفالتوحد 11،12،13. ومع ذلك ، هناك عدم تجانس كبير في تطور هذه الأنماط الظاهرية بين المرضى13،14،15،16،17 ، ومن غير الواضح سبب ظهور بعض المرضى على ضعف إدراكي كبير بينما لا يتأثر الآخرون. ثبت أن السمنة الناجمة عن النظام الغذائي للأمهات تؤثر بالمثل على التعلم والسلوك لدى عامة السكان18،19،20،21،22،23،24،25،26،27،28، مما يشير إلى أن التعرض الغذائي التفاضلي للأمهات في NF1 يمكن أن يكون أحد مصادر هذا التغايرية السريرية. على وجه الخصوص ، يظهر أطفال الأمهات البدينات خطرا متزايدا للإصابة بفرط النشاط18،19،20،23،25،26 ، والتوحد19،24،27 ، وعجز الوظائف التنفيذية21،23 ، ولديهم درجات ذكاء أقلعلى نطاق واسع 22،28. ومع ذلك ، فإن المرضى الذين يعانون من NF1 قد غيروا الأنماط الظاهرية الأيضية مقارنة بعامة السكان ، بما في ذلك انخفاض الإصابة بالسمنة ومرض السكري29،30،31 ، مما يجعل من غير الواضح ما إذا كانوا سيستجيبون بشكل مشابه للمنبهات الغذائية.

لمعالجة هذه الأسئلة ، أردنا تحديد ما إذا كانت التغييرات التي يسببها النظام الغذائي السمين في ملف تعريف المغذيات الكبيرة في نسل الجنين مع Nf1 ساهمت في تغيرات النمو العصبي. لقد جمعنا سابقا أنسجة تشريح دقيقة كاملة وإقليمية عالية الجودة مناسبة لتطبيقات النمو العصبي من دماغالجنين 32. ومع ذلك ، فإن جمع دم الجنين يمثل تحديا بسبب صغر حجم الجسم وانخفاض حجم الدم33. أدى جمع الدم عن طريق التصريف بمساعدة الجاذبية بعد قطع الرأس إلى انخفاض أحجام التجميع وانحلال الدم الكبير في عيناتنا ، مما قد يؤثر على تفسير التطبيق النهائي. كان الجمع عن طريق الشفط من قلب الجنين أو الأوعية الصدرية ، كما تم الإبلاغ عنهسابقا 33 ، أمرا صعبا من الناحية الفنية وأدى أيضا إلى انحلال الدم المتكرر. وهكذا طورنا طريقة لجمع مصل الجنين ، والتي تستخدم أنابيب شعرية متخصصة للسماح بجمع كميات أكبر دون إجهاد قص كبير.

هنا ، نقدم هذه الطريقة لجمع الأدمغة الجنينية ومصل الجنين في وقت واحد من الجراء غير المتجانسة Nf1 المعرضة لنظام غذائي غني بالدهون وعالي السكر مقابل نظام غذائي للتحكم في الرحم (الشكل 1 والجدول التكميلي S1). تم تضمين الأدمغة بالتبريد للتحليل اللاحق عن طريق التألق المناعي أو تشريح مجهري إقليمي وتجميدها سريعا للاستخدام اللاحق في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية. تم الحصول على مصل عالي الجودة ، مناسب للتطبيقات النهائية مثل توصيف المغذيات الكبيرة. باستخدام هذه الطريقة ، حددنا أن التعرض الغذائي للأمهات عالي الدهون وعالي السكروز يؤدي إلى ارتفاع مستويات الكوليسترول في الدم في كل من الجراء WT و Nf1-متغايرة الزيجوت.

البروتوكول

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة إرشادات المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة واشنطن في سانت لويس. تم إيواء مع ضوء قياسي لمدة 12 ساعة: ركوب الدراجات الداكن والوصول المجاني إلى الطعام والماء.

1. حمية الأم

  1. ضع إناث الفئران على طعام التحكم (CD) أو النظام الغذائي المسببة للسمنة (Ob) في عمر 4 أسابيع.
  2. في عمر 8-12 أسبوعا ، قم بإعداد التزاوج الموقوت عن طريق مراقبة السدادة المخاطية للسد في الصباح الباكر لتحديد عمر التجميع الصحيح. للتحقق من السمنة الناجمة عن النظام الغذائي ، قم بوزن الإناث عند التزاوج.
    ملاحظة: تم استخدام نطاق من 8-12 أسبوعا لإعداد التزاوج الأولي للتأكد من أن الإناث اللواتي يتغذين على النظام الغذائي المسببة للسمنة يعانين من زيادة الوزن مقارنة بنظيراتهن ، وهو ما لم يحدث دائما بحلول عمر 8 أسابيع. يعتبر يوم القابس هو اليوم الجنيني 1 (E1) ، وتم جمع جميع المستخدمة في هذه الدراسة في E19. تم اختيار النقطة الزمنية المتأخرة للجنين بسبب التغيرات النمائية العصبية التي لوحظت سابقا في هذا الوقت في المعرضة للنظام الغذائي المسببة للسمنة (البيانات غير معروضة).

2. إزالة الجنين من السد

  1. أولا ، تأكد من أن السد يبدو حاملا (شكل البطن وامتلاءه ، أو ملامسة البطن ، أو حركة الجنين). إذا كنت في شك ، فقم بوزن الأنثى مرة أخرى لقياس زيادة الوزن.
    ملاحظة: يجب أن تظهر الفئران الحامل المتأخرة ما لا يقل عن 3-4 جم من زيادة الوزن. لزيادة احتمالية الحمل في الإطار الزمني المطلوب ، يمكن إضافة نشارة الخشب المتسخة (المحتوية على البول والفرمون) من قفص الذكور إلى قفص الأنثى يوميا لمدة 3 أيام قبل التزاوج للحث على الشبق34.
  2. قم بالقتل الرحيم للسد عن طريق وضعه في غرفة بمنشفة ورقية تحتوي على 3 مل من الأيزوفلوران ، مع الحرص على تجنب الاتصال المباشر بين السد والمنشفة الورقية المبللة بالتخدير. بعد تخدير ، ضعه على منشفة ورقية ، وامسكه من الذيل ، ثم ضع مقص التشريح على الرقبة ، ثم أجبر المقص لأعلى باتجاه الرأس لأداء خلع عنق الرحم. بدلا من ذلك ، قم بقطع الرأس بعد تخدير الأيزوفلوران.
    ملاحظة: يمكن جمع المصل من السد في هذه الخطوة ، باستخدام منهجية مماثلة كما هو موضح أدناه ولكن باستخدام أنابيب شعرية أكبر. إذا كان ذلك مطلوبا ، فيجب إجراء قطع الرأس بدلا من خلع عنق الرحم. يجب توخي الحذر لضمان عدم تغيير النمط الظاهري المعني بإعطاء الأيزوفلوران مباشرة قبل القتل الرحيم.
  3. ضع الجانب البطني للسد لأعلى في طبق 100 مم. اضغط على الجلد الذي يغطي البطن وقم بعمل شق خط الوسط بمقص التشريح. قم بعمل شقوق إضافية بشكل عمودي على شق خط الوسط لإنشاء سدائل جلدية لكشف الرحم الذي يحتوي على الأجنة.
  4. اسحب الرحم من تجويف البطن. باستخدام المقص ، افصل الرحم عن السد. ضع الكيس الجنيني السليم ("اللؤلؤ على خيط") الذي يحتوي على الأجنة في طبق به محلول ملحي معقم بارد 1x مخزن بالفوسفات (PBS). ضع طبق الأجنة على الثلج.
    ملاحظة: نظرا لأن كل فضلات تحتوي عادة على 6-10 صغار سيتم حصادها لكل من الأدمغة والمصل ، يتم الاحتفاظ بالأجنة على الجليد لتجنب تدهور الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يضمن وضع الجراء على الجليد القتل الرحيم الكافي للجراء ، حيث قد لا يكون القتل الرحيم للأمهات وحده كافيا دائما. إذا كنت ترغب في جمع المصل فقط ، فقد يفضل جمع درجة حرارة الغرفة.

3. جمع مصل الجنين

  1. قم بإزالة الجنين من الكيس الجنيني عن طريق تشريح بعناية باستخدام ملقط # 5. انقل الجنين إلى طبق باستخدام ملقط منحني مع معقم بارد طازج 1x PBS.
  2. امسح برفق على منشفة ورقية لإزالة السائل الأمنيوسي المتبقي و PBS من العينة.
  3. امسك من البطن. قطع رأس جزئيا بمقص دقيق عن طريق عمل شق في الرقبة البطنية. تأكد من قطع الأوعية الدموية ، لكن الجلد الذي يحافظ على الرأس لا يزال متصلا.
    ملاحظة: يجب أن يظل الرأس متصلا حتى يمكن جمع الدم من الجسم والرأس في وقت واحد.
  4. امسك الجسم بزاوية 45 درجة بحيث يكون الشق متجها لأسفل. أمسك الأنبوب الشعري (الأنبوب الشعري) سعة 50 ميكرولتر بالتوازي مع موقع شق السد حيث يشكل الدم قطرة. اترك بعناية الأنبوب الشعري سعة 50 ميكرولتر يمتلئ بالدم.
    ملاحظة: يمكن استخدام الأنبوب الشعري x2 أو 100 ميكرولتر أنبوب شعري لجمع ما يصل إلى ~ 75 ميكرولتر من الدم.
  5. ضع الرأس في طبق طازج مقاس 60 مم يحتوي على 1x PBS بارد ومعقم لمزيد من جمع الأنسجة (القسم 4).
  6. بعد أن يكون الدم داخل الأنبوب الشعري ، اضغط على المكبس بسرعة في أنبوب سعة 1.5 مل. قم بنقر الأنبوب أو تدويره بسرعة للتأكد من وجود الدم في قاع الأنبوب.
  7. كرر لبقية القمامة.
    ملاحظة: يعد إبقاء الجراء على الجليد والتنقل بسرعة بينهما أمرا ضروريا لتقليل مخاطر التخثر بعد الوفاة الذي سيحد من حجم الجمع.
  8. تخثر الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  9. الطرد المركزي لعينات الدم عند 4 درجات مئوية ، 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة.
  10. انقل المصل إلى أنابيب جديدة سعة 500 ميكرولتر باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، دون إزعاج حبيبات خلايا الدم في الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: يجب أن يكون المصل بلون القش بدون حطام أحمر. يجب أن ينتج كل جنين 15-30 ميكرولتر من المصل.
  11. قم بتخزين السيروم الذي تم جمعه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. جمع دماغ الجنين

  1. بالنظر من خلال مجهر التشريح ، أمسك الخطم باستخدام ملقط منحني واستخدم ملقط # 5 لتقشير الجلد بعناية من غطاء الجمجمة ، مع إبقائه متصلا بالأنف لسهولة الإمساك به. زاوية # 5 ملقط إلى 45 درجة بالنسبة للجمجمة ، ثقب الغشاء الشفاف الذي هو الجمجمة النامية بعناية ، وقم بتحويل الملقط بالتوازي مع الجمجمة ، وأدخله أسفل غطاء الجمجمة ، ثم قرصة وقشر إلى جانب واحد. بعد إزالة جانب واحد ، أمسك الجانب المتبقي بالملقط # 5 وقشره إلى الجانب الآخر.
  2. أخرج الدماغ برفق من الجمجمة باستخدام ملعقة صغيرة وانقل الدماغ إلى طبق طازج مقاس 60 مم يحتوي على 1x PBS بارد.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إصلاح الأدمغة بأكملها وتضمينها في التلوين المناعي. انظر المنهجية المنشورةسابقا 32.
  3. إذا كان لا بد من تجميد الأنسجة للتطبيقات الجزيئية الأخرى ، فقم بتشريح منطقة الاهتمام الفرعية. يتم وصف عزل الأنسجة المحيطة بالبطينين حول البطينين الجانبي والثالث والرابع.
    1. باستخدام الملقط المنحني ، أمسك الدماغ عند تقاطع الدماغ الخلفي والدماغ الأمامي باليد غير المهيمنة. باليد المهيمنة ، أمسك المشرط بالشفرة الموازية لسطح الدماغ. اضغط بقوة على المنطقة الوسطى القشرية (الشكل 1).
    2. لا تزال تمسك الدماغ الخلفي ، قم بعمل شق ثان أمام الدماغ الخلفي لفصله عن الدماغ الأمامي (الشكل 1). في القسم الأمامي ، ابحث عن مساحتين نصف دائريتين صغيرتين تقعان داخل المستوى الأفقي ، وهما البطينان الجانبيان. استخدم الملقط المنحني الموضوع في وسط كل بطين لتثبيت الدماغ في مكانه ، وقم بتشريح البطانة بعناية باستخدام ملقط # 5 ، ثم قم بإزالته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف 1.5 مل.
    3. في القسم الأوسط ، ابحث عن مساحة خطية صغيرة على السطح البطني ، وهو البطين الثالث. باستخدام ملقط # 5 ، قم بقرص البطانة بعناية على جانبي سطح البطين ، ثم قم بإزالته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف 1.5 مل.
    4. في القسم الخلفي ، ابحث عن مساحة خطية صغيرة مركزية داخل الدماغ الخلفي ، وهو البطين الرابع. قم بتشريح البطانة على كلا الجانبين باستخدام ملقط # 5 ، ثم قم بإزالتها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف 1.5 مل.
      ملاحظة: إذا لم يكن تقطيع الدماغ الخلفي قطعا نظيفا ، فقد يتم حجب أنسجة البطين الرابع و / أو تدميرها.
    5. بالنسبة للخطوات 4.3.2-4.3.4 ، مباشرة بعد وضع الأنسجة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، ضع الأنابيب بسرعة في حاوية آمنة للتبريد تحتوي على النيتروجين السائل.
      ملاحظة: يمكن حفظ الأنابيب في النيتروجين السائل حتى يتم تشريح العينات المتبقية. تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل قضمة الصقيع الشديدة. لا تضع يديك مباشرة في النيتروجين السائل وتجنب البقع.
    6. ضع الأنبوب (الأنابيب) المجمدة على الثلج الجاف وانقل المناديل المجمدة إلى فريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

النتائج

لتوضيح جودة أنسجة المخ التي تم الحصول عليها من خلال هذه التقنية ، نعرض عينة من أدمغة الجنين من فئران Nestin-CFPnuc35 ، ملطخة بالمناعة ل GFAP وفقا لتقنية تم الإبلاغ عنهاسابقا 32. تظهر خلايا Nestin + تبطن البطين الجانبي (الشكل 2 أ) ، مع خيوط GFAP + الممتدة من السطح. لم نلاحظ اختلافات بين تعبير Nestin أو GFAP في البطين الجانبي للقرص المضغوط مقابل الفئران المعرضة ل Ob في سلالات WT أو Nf1-متغايرة الزيجوت (الشكل 2 أ ، ب). قمنا بعد ذلك بتقييم جودة الأنسجة التشريح المجهري. أجرينا أولا النشاف الغربي36 لبروتين التدبير المنزلي β-أكتين على الأنسجة المجهرية المعزولة من البطينين الجانبيين للقرص المضغوط مقابل الفئران المعرضة للأوب. أظهرت جميع العينات تعبيرا قويا عن β-أكتين (الشكل 2C) ، كما هو متوقع. ثم قمنا بعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة المجهرية وفقا للمنهجية التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 32. أظهر الحمض النووي الريبي المعزول كلا من النقاء العالي (260/280 ≥ 2) والنزاهة (قيم RIN ≥ 9) ، مما يدل على الحمض النووي الريبي عالي النقاء وغير المتدهور (الشكل 2 د).

ثم قارنا الطرق المختلفة لعزل المصل. باستخدام طريقة minivette الخاصة بنا ، قمنا بشكل روتيني بجمع كميات أكبر من المصل غير المحلل ، بينما أدى تصريف الجاذبية والثقب الصدري إلى جمع حجم متغير للغاية وانحلال الدم في العديد من العينات (الشكل 3 أ ، ب). لتوضيح جودة المصل الذي تم الحصول عليه من خلال هذه التقنية ، قمنا بقياس مستويات الكوليسترول الكلي في الدم باستخدام كاشف الكوليسترول الكلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. كانت مستويات الكوليسترول في الجنين ضمن النطاق المتوقع للصغار المتأخرة بناء على دراسات سابقة على الأجنة البشرية37. زادت المستويات في الفئران المعرضة ل Ob مقارنة بالمصابين بالأقراص المضغوطة لكل من النوع البري (الشكل 3C ، على اليسار) والجراء غير المتجانسة Nf1 (الشكل 3C ، على اليمين). لاحظ أن اللوحة اليمنى تصور بيانات مجمعة من سلالتين مختلفتين من Nf1 متغايرة الزيجوت مع طفرات جرثومية يحددها المريض (R681X ، C383X) 32،38،39 حيث شوهدت ملفات تعريف مماثلة في كلتا السلالتين.

figure-results-1
الشكل 1: الملخص الرسومي لسير العمل. يتم عزل الجراء أولا من السدود الحامل. ثم يتم حصاد المصل من الجراء. أخيرا ، يتم عزل الأدمغة الكاملة عن الجراء ، وإذا رغبت في ذلك ، يتم تشريحها بشكل دقيق للمناطق ذات الأهمية. تم إنشاء الرسم باستخدام BioRender.com. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: النتائج التوضيحية ، أنسجة المخ. (أ) تم حصاد الأدمغة المقطوعة بالتبريد من فئران Nestin-CFPnuc ، والتي تعبر عن بروتين فلوري سماوي موضعي نوويا تحت سيطرة محفز Nestin ، بهذه الطريقة وصبغها المناعي ل GFAP (أحمر) وفقا للمنهجية التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 32. يتم تصور الخلايا الإيجابية Nestin عبر تعبير Nestin-CFPnuc الداخلي (أخضر). تم تلطيخ النوى بثنائي بنزيميد (أزرق). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين أدمغة WT المعرضة للقرص المضغوط والأدمغة المعرضة ل Ob. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) Nestin-CFPnuc; تم تقييم الجراء Nf1mut / + بالمثل. بدا توزيع GFAP و Nestin-CFP مشابها ل WT ولم يختلف باختلاف الظروف الغذائية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (C) تم عزل البروتين من الأنسجة المجهرية من LV. تم إجراء النشاف الغربي وفقا للمنهجية التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 36 مع 20 ميكروغرام من البروتين المحملة في كل حارة. كان التعبير القوي β الأكتين قابلا للكشف في جميع العينات. (د) تم عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة المجهرية وفقا للمنهجية المبلغ عنهاسابقا 32. تم تقييم جودة الحمض النووي الريبي من خلال نسب 260/280 وقيم RIN. أظهرت جميع العينات نسب ممتازة 260/280 (≥2) وقيم RIN (≥9) ، مما يشير إلى عزل جيد للحمض النووي الريبي غير المتدهور. الاختصارات: CFP = بروتين الفلورسنت السماوي ؛ GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي ؛ WT = النوع البري ؛ LV = البطين الجانبي. RIN = رقم سلامة الحمض النووي الريبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: النتائج التوضيحية والمصل. (أ) تم جمع المصل من كل طريقة من الطرق الموصوفة. أتاحت الجمع باستخدام minivette الجمع الروتيني للمصل غير المتحلل مقارنة بالتصريف بمساعدة الجاذبية والثقب الصدري. (ب) يتم عرض أحجام التجميع النموذجية للمصل. سمحت مجموعة Minivette بمجموعة أكثر قابلية للتكرار من كميات أكبر من المصل. الدلالة الإحصائية التي يتم تحديدها بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة. أشرطة الخطأ: SEM. (ج) تم قياس إجمالي الكوليسترول في الدم من مصل الجنين المجمعة CD مقابل WT المكشوف ل Ob (يسار) و Nf1-متغاير الزيجوت (يمين). أظهرت المعرضة ل ob ارتفاع نسبة الكوليسترول في الدم في كلا النمطين الجينيين. الدلالة الإحصائية التي يحددها اختبار t. أشرطة الخطأ: SEM. الاختصارات: WT = النوع البري ؛ CD = نظام التحكم في النظام الغذائي. Ob = نظام غذائي مسبني للسمنة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي S1: التراكيب الغذائية. يتم عرض تكوين الأنظمة الغذائية الضابطة والسمنة المستخدمة في هذه المخطوطة. ملاحظة: بالنسبة لنظام غذائي قليل الدسم وخالي من السكروز يتحكم بشكل أفضل في المكونات الغذائية الفردية في D12331 ، قد يفضل النظام الغذائي D12328 (researchdiets.com). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تشمل الطرق التقليدية لجمع الدم من الفئران خلف البصيلة ، ووريد الذيل ، والوريد الصافن ، والوريد الوجهي ، ونزيف الوريد الوداجي40،41،42. لسوء الحظ ، هذه الطرق ليست مثالية لجمع الدم الجنيني بسبب حجم والأوعية الدموية الصغيرة والحساسة. أدى جمع الدم عن طريق التصريف بمساعدة الجاذبية بعد قطع الرأس إلى انخفاض أحجام التجميع وانحلال الدم الكبير في عيناتنا. أبلغت البروتوكولات السابقة عن تحسين الأحجام باستخدام إبرة معدلة 20 جم لتصريف الدم من الأوعية الدموية الصدرية33. ومع ذلك ، وجدنا هذه التقنية صعبة من الناحية الفنية ولاحظنا معدلات عالية من انحلال الدم ، مما يجعلها غير مناسبة للعديد من التطبيقات النهائية. تتميز طريقتنا بالجمع عن طريق تدفق الدم السلبي ، مما يقلل من خطر انحلال الدم من الإجهاد الهائل الناجم عن الشفط. يوفر المكبس الموجود على الأنبوب الشعري أيضا طريقة سريعة وفعالة لتوصيل الدم إلى أنبوب التجميع ، مما يقلل من التعرض للهواء ويحد من تجزئة جلطات الدم. الأهم من ذلك ، يمكن لاحقا جمع أنسجة المخ الكاملة أو الإقليمية من نفس ، مما يقلل من إجمالي احتياجات التجربة.

لا يخلو هذا البروتوكول من تعديلات لتحسين جودة التجميع وكفاءته. لجمع المصل ، من الضروري إزالة السائل الجنيني وPBS الإضافي برفق من قبل جمع الدم لأن السوائل الزائدة قد تجعل زلقا ويزيد من احتمالية ضعف الوضع أو عدم الاستقرار مما يؤثر سلبا على جودة جمع الدم. بالإضافة إلى ذلك ، يعد وضع الإصبع أثناء حمل الجنين أمرا بالغ الأهمية ، حيث يلتصق الدم بإصبع القفاز أثناء التجميع إذا كان الإصبع مجاورا للأنبوب الشعري. من المهم أيضا عقد فتحة الأنبوب الشعري المجاور للدم المتدفق بدلا من غمره فيه. سيتم تعطيل مجموعة الشعيرات الدموية إذا تم غمر الأنبوب. أخيرا ، يجب على المرء أن يفكر في التطبيق النهائي بعناية لتحسين جمع الأمصال. على سبيل المثال ، يتحلل الجلوكوز بمرور الوقت في أنابيب غير معالجة في درجة حرارة الغرفة ، لذلك قد يكون التجميع في فلوريد الصوديوم أو الأنابيب المحتوية على EDTA ضروريا لتحديد مستويات الجلوكوزبدقة 43،44.

لجمع أنسجة المخ ، تعد الإزالة الدقيقة للجلد والجمجمة الشفافة على جانبي الرأس أمرا بالغ الأهمية لاستخراج نظيف. إذا تم تشريح جانب واحد فقط ، فقد يلتصق الدماغ بالجمجمة مع محاولة الإزالة ، مما يؤدي إلى تمزق الأنسجة وتشويهها. لتقسيم الدماغ ، من المهم عمل شرائح مفردة ونظيفة لفصل القشرة الأمامية عن منتصف القشرة ومنتصف القشرة من الدماغ الخلفي. يمكن أن يؤدي وجود جروح متعددة إلى تعطيل السلامة الهيكلية للأنسجة أو حجب النقطة المرجعية للتشريح المجهري اللاحق. أخيرا ، يعد الاحتفاظ بالعينات على الجليد حتى التثبيت أو التجميد المفاجئ أمرا بالغ الأهمية لمنع تدهور العينة.

بينما نفضل هذه الطريقة بسبب الجمع الروتيني للمصل ذو الحجم الأكبر وغير المتحلل ، إلا أنها لا تخلو من العيوب. على الرغم من تقليل انحلال الدم مقارنة بالتقنيات الأخرى ، إلا أن هذه الطريقة لا تقضي على المخاطر. يمكن أيضا أن ينسد الأنبوب الشعري بجلطة دموية بمجرد توقف الدم عن التدفق ، لذلك من المهم العمل بسرعة بعد قطع الرأس للتخفيف من مخاطر فشل التجميع بسبب التخثر. قد يؤثر الاحتفاظ بالعينات على الجليد ، والذي يتم إجراؤه للحفاظ على سلامة العينة في هذا البروتوكول ، سلبا على بعض الأنماط الظاهرية وقد لا يكون مناسبا لجميع التطبيقات.

في الختام ، يمكن استخدام هذه المنهجية لعزل المصل وكذلك الأدمغة الكاملة أو الإقليمية من نفس الجنين في وقت واحد. يمكن استخدام هذه التقنية لمعالجة كيفية تأثير العوامل الجهازية ، مثل التغيير الناجم عن النظام الغذائي للأم في ملف تعريف المغذيات الكبيرة ، على النمو العصبي في NF1 أو اضطرابات أخرى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يتم دعم N Brossier من قبل برنامج Francis S. Collins Scholars في البحوث السريرية والانتقالية للورم الليفي العصبي الممول من برنامج تسريع علاج الورم الليفي العصبي (NTAP ، Grant # 210112). تم دعم هذا المنشور جزئيا بتمويل من NTAP في كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز. محتوياته هي مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لكلية الطب بجامعة جونز هوبكنز. دعم إضافي من مستشفى سانت لويس للأطفال (FDN-2022-1082 إلى NMB) وجامعة واشنطن في مركز أبحاث السكري (NIH P30 DK020579). تم إجراء الفحص المجهري من خلال استخدام مركز جامعة واشنطن للتصوير الخلوي (WUCCI) ، بدعم من كلية الطب بجامعة واشنطن ، ومعهد اكتشاف الأطفال بجامعة واشنطن ، ومستشفى سانت لويس للأطفال (CDI-CORE-2015-505 و CDI-CORE-2019-813) ومؤسسة مستشفى بارنز اليهودي (3770 و 4642). تم توفير الفئران Nestin-CFPnuc35 بسخاء من قبل Grigori Enikolopov (كلية الطب في عصر النهضة ، جامعة ستوني بروك ، نيويورك) ، وفئران Nf1 غير متجانسة الزيجوت إما لطفرة السلالة الجرثومية R681X أو C383X تم توفيرها بسخاء من قبل ديفيد جوتمان (كلية الطب بجامعة واشنطن ، سانت لويس ، ميزوري). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 5/45 ملقطدومون   ;11251-35شكل طرف: بزاوية 45 درجة ؛
4200 TapestationAgilentG2991BAالتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي وجودته ، وقياس قيم RIN
النيتروجين السائل على الطاولةThermo Fisher2122أو غيرها من الحاويات الآمنة للتبريد
يمكن أيضااستخدام الأنظمة الغذائية البحثية D12328 (قليلة الدسم وقليلة السكر).
ملقط منحنيكول بارمرUX-10818-25شكل تلميح: منحني 90 درجة ؛
تشريح مقبض الشفرةCole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel-Type, # 10 إلى #15 شفرات
EMS SuperCut تشريح مقصالمجهر الإلكتروني علومالمجهر 72996-015½ " (139.7 ملم) ، الجسم
المضاد GFAPAbcamab7260مخفف 1: 350. بلوك يحتوي على مصل 10٪ يحتوي على 0.3 M جلايسين.
شفرات جراحية من الفولاذ الكربوني Glassvan ، مقاس 11MYCO الطبية2001T-11# 11 تسمح بملعقة مختبر صغيرة مستقيمة ومسطحة
ScilabA2Z-VL001من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مقص دقيق قابل للتعقيم
Rubis78180-1C3موديل 1C300
Minivette   ؛ محايد في نقطة الرعايةSarstedt17.2111.050الحجم الاسمي: 50 & micro; L ، بدون تحضير
NanoropThermo Fisher13-400-519قياس تركيز الحمض النووي الريبي ، 260/280 نسب
النظام الغذائي السمنيResearchdiets.comD12331عالي الدهون وعالي السكروز
Thermo FisherTR13421الكشف اللوني
& بيتا ؛ الأكتين إشارات الخلية للجسم المضاد8457تمييع 1: 1,000.
حاوية المستقيم شفرات Az كاشف الكوليسترول الكلي

المراجع

  1. Listernick, R., Darling, C., Greenwald, M., Strauss, L., Charrow, J. Optic pathway tumors in children: the effect of neurofibromatosis type 1 on clinical manifestations and natural history. J Pediatr. 127 (5), 718-722 (1995).
  2. Fisher, M. J., et al. Integrated molecular and clinical analysis of low-grade gliomas in children with neurofibromatosis type 1 (NF1). Acta Neuropathol. 141 (4), 605-617 (2021).
  3. Cimino, P. J., et al. Expanded analysis of high-grade astrocytoma with piloid features identifies an epigenetically and clinically distinct subtype associated with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 145 (1), 71-82 (2023).
  4. Lucas, C. -H. G., et al. Multiplatform molecular analyses refine classification of gliomas arising in patients with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 144 (4), 747-765 (2022).
  5. Fisher, M. J., et al. Management of neurofibromatosis type 1-associated plexiform neurofibromas. Neuro-Oncol. 24 (11), 1827-1844 (2022).
  6. Packer, R. J., et al. Plexiform neurofibromas in NF1. Neurology. 58 (10), 1461-1470 (2002).
  7. Evans, D. G. R., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1. J Med Genet. 39 (5), 311(2002).
  8. Prudner, B. C., Ball, T., Rathore, R., Hirbe, A. C. Diagnosis and management of malignant peripheral nerve sheath tumors: Current practice and future perspectives. Neurooncol Adv. 2, Suppl 1 i40-i49 (2020).
  9. Ma, Y., et al. A molecular basis for neurofibroma-associated skeletal manifestations in NF1. Genet Med. 22 (11), 1786-1793 (2020).
  10. Ozarslan, B., Russo, T., Argenziano, G., Santoro, C., Piccolo, V. Cutaneous findings in neurofibromatosis Type 1. Cancers. 13 (3), 463(2021).
  11. Hyman, S. L., Shores, A., North, K. N. The nature and frequency of cognitive deficits in children with neurofibromatosis type 1. Neurology. 65 (7), 1037-1044 (2005).
  12. Morris, S. M., et al. Disease burden and symptom structure of autism in neurofibromatosis type 1: a study of the International NF1-ASD Consortium Team (INFACT). JAMA Psychiatry. 73 (12), 1276-1284 (2016).
  13. Geoffray, M. -M., et al. Predictors of cognitive, behavioural and academic difficulties in NF1. J Psychiatr Res. 140, 545-550 (2021).
  14. Monroe, C. L., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Dissecting clinical heterogeneity in neurofibromatosis type 1. Ann Rev Pathol. 12 (1), 53-74 (2017).
  15. Kehrer-Sawatzki, H., Mautner, V. -F., Cooper, D. N. Emerging genotype-phenotype relationships in patients with large NF1 deletions. Hum Genet. 136 (4), 349-376 (2017).
  16. Hou, Y., et al. Predictors of cognitive development in children with neurofibromatosis type 1 and plexiform neurofibromas. Dev Med Child Neurol. 62 (8), 977-984 (2020).
  17. Biotteau, M., et al. Sporadic and familial variants in NF1: an explanation of the wide variability in neurocognitive phenotype. Front Neurol. 11, 368(2020).
  18. Rodriguez, A., et al. Maternal adiposity prior to pregnancy is associated with ADHD symptoms in offspring: evidence from three prospective pregnancy cohorts. Int J Obes (Lond). 32 (3), 550-557 (2008).
  19. Andersen, C. H., Thomsen, P. H., Nohr, E. A., Lemcke, S. Maternal body mass index before pregnancy as a risk factor for ADHD and autism in children). Eur Child Adolesc Psychiatry. 27 (2), 139-148 (2018).
  20. Pugh, S. J., et al. Gestational weight gain, prepregnancy body mass index and offspring attention-deficit hyperactivity disorder symptoms and behaviour at age 10. Bjog. 123 (13), 2094-2103 (2016).
  21. Mina, T. H., et al. Prenatal exposure to maternal very severe obesity is associated with impaired neurodevelopment and executive functioning in children. Pediatr Res. 82 (1), 47-54 (2017).
  22. Oken, E., et al. Analysis of maternal prenatal weight and offspring cognition and behavior: Results from the Promotion of Breastfeeding Intervention Trial (PROBIT) Cohort. JAMA Netw Open. 4 (8), e2121429-e2121429 (2021).
  23. Buss, C., et al. Impaired executive function mediates the association between maternal pre-pregnancy body mass index and child ADHD symptoms. PLOS ONE. 7 (6), e37758(2012).
  24. Li, Y. -M., et al. Association between maternal obesity and autism spectrum disorder in offspring: a meta-analysis. J Autism Dev Disord. 46 (1), 95-102 (2016).
  25. Dow, C., Galera, C., Charles, M. -A., Heude, B. Maternal pre-pregnancy BMI and offspring hyperactivity-inattention trajectories from 3 to 8 years in the EDEN birth cohort study. Eur Child Adolesc Psychiatry. 32 (10), 2057-2065 (2023).
  26. Fast, K., et al. Prevalence of attention-deficit/hyperactivity disorder and autism in 12-year-old children: A population-based cohort. Devl Med Child Neurol. 66 (4), 493-500 (2023).
  27. Carter, S. A., et al. Maternal obesity and diabetes during pregnancy and early autism screening score at well-child visits in standard clinical practice. Autism. 28 (4), 975-984 (2023).
  28. West, Z., et al. Relationships between maternal body mass index and child cognitive outcomes at 3 years of age are buffered by specific early environments in a prospective Canadian birth cohort. J Dev Orig Health Dis. 14 (1), 42-52 (2023).
  29. Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3, 17004(2017).
  30. Martins, A. S., et al. Lower fasting blood glucose in neurofibromatosis type 1. Endocr Connect. 5 (1), 28-33 (2016).
  31. Martins, A. S., et al. Increased insulin sensitivity in individuals with neurofibromatosis type 1. Arch Endocrinol Metab. 62 (1), 41-46 (2018).
  32. Brossier, N. M., Thondapu, S., Cobb, O. M., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Temporal, spatial, and genetic constraints contribute to the patterning and penetrance of murine Neurofibromatosis-1 optic glioma. Neuro Oncol. 23 (4), 625-637 (2020).
  33. de Lurdes Pinto, M., et al. Technical Report: Mouse fetal blood collection taking the best out of the old needle-syringe method. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science. 35 (1), 5(2008).
  34. Musillo, C., et al. Bdnf-Nrf-2 crosstalk and emotional behavior are disrupted in a sex-dependent fashion in adolescent mice exposed to maternal stress or maternal obesity. Transl Psychiatry. 13 (1), 399(2023).
  35. Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8233-8238 (2006).
  36. Anastasaki, C., et al. Human induced pluripotent stem cell engineering establishes a humanized mouse platform for pediatric low-grade glioma modeling. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 120(2022).
  37. Cai, H. -J., Xie, C. -L., Chen, Q., Chen, X. -Y., Chen, Y. -H. The relationship between hepatic low-density lipoprotein receptor activity and serum cholesterol level in the human fetus. Hepatology. 13 (5), 852-857 (1991).
  38. Toonen, J. A., et al. NF1 germline mutation differentially dictates optic glioma formation and growth in neurofibromatosis-1. Hum Mol Genet. 25 (9), 1703-1713 (2016).
  39. Guo, X., Pan, Y., Gutmann, D. H. Genetic and genomic alterations differentially dictate low-grade glioma growth through cancer stem cell-specific chemokine recruitment of T cells and microglia. Neuro Oncol. 21 (10), 1250-1262 (2019).
  40. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  41. Meyer, N., et al. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: Taking the animal's perspective. PLOS ONE. 15 (9), e0238895(2020).
  42. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  43. Jung, J., Garnett, E., Rector, K., Jariwala, P., Devaraj, S. Effect of collection tube type on glucose stability in whole blood. Ann Clin Lab Sci. 50 (4), 557-559 (2020).
  44. Bonetti, G., et al. Which sample tube should be used for routine glucose determination. Prim Care Diabetes. 10 (3), 227-232 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جمع عينات الدماغ الجنينيجمع المصلنموذج فئراننظام غذائي مسبب للسمنةتشريح الدماغتحليل العناصر الغذائية الكبرىورم دبقي في المسار البصري
مجموعة متزامنة من دماغ ومصل الفئران الجنيني لتقييم آثار النظام الغذائي للأم على التغذية والنمو العصبي في الورم العصبي الليفي من النوع 1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.