يصف البروتوكول الحالي نظام تحريض شبكية العين العصبي 3D الأمثل الذي يقلل من التصاق وانصهار عضويات الشبكية مع قابلية عالية للتكرار والكفاءة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توليد شبكية العين العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
اعتلال الشبكية هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في جميع أنحاء العالم. التحقيق في التسبب في المرض أمر ضروري للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب لاعتلال الشبكية. لسوء الحظ ، تعيق الحواجز الأخلاقية جمع الأدلة من البشر. في الآونة الأخيرة ، أظهرت العديد من الدراسات أنه يمكن تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) إلى عضويات شبكية العين (ROs) باستخدام بروتوكولات تحريض مختلفة ، والتي لديها إمكانات هائلة في اعتلال الشبكية لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. تصف هذه الدراسة بروتوكول الحث الأمثل لتوليد شبكية العين العصبية (NR) التي تقلل بشكل كبير من احتمال الحويصلة والانصهار ، مما يزيد من معدل نجاح الإنتاج حتى اليوم 60. استنادا إلى قدرة PSCs على إعادة التنظيم الذاتي بعد الانفصال ، جنبا إلى جنب مع بعض العوامل التكميلية ، يمكن لهذه الطريقة الجديدة أن تدفع على وجه التحديد تمايز NR. علاوة على ذلك ، فإن النهج غير معقد وفعال من حيث التكلفة ، ويظهر قابلية تكرار وكفاءة ملحوظة ، ويقدم آفاقا مشجعة لنماذج شخصية لأمراض الشبكية ، ويوفر خزانا وفيرا للخلايا لتطبيقات مثل العلاج بالخلايا ، وفحص الأدوية ، واختبار العلاج الجيني.
المقدمة
تعمل العين كمصدر أساسي للمعلومات بين الأعضاء الحسية البشرية ، حيث تكون شبكية العين هي النسيج الحسي البصري الرئيسي في عيون الثدييات1. يعتبر اعتلال الشبكية أحد الأسباب العالمية الرئيسية لأمراض العيون ، مما يؤدي إلى العمى2. يعاني ما يقرب من 2.85 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من درجات متفاوتة من ضعف البصر بسبب اعتلال الشبكية3. وبالتالي ، فإن التحقيق في التسبب في المرض أمر بالغ الأهمية للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب. ركزت معظم الدراسات حول اعتلال الشبكية البشري بشكل أساسي على النماذج الحيوانية4،5،6. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المؤسسية في مستشفى جيش التحرير الشعبي الصيني العام. تم الحصول على خط ESC WA09 (H9) من معهد أبحاث WiCell.
1. الإعلام الثقافي وإعداد الكاشف
- وسيط ثقافة ESC البشرية وحل المرور
- وسط الصيانة (مم): قم بإعداد 500 مل من MM الكامل (الوسط الأساسي + ملحق 5x ؛ انظر جدول المواد) بشكل معقم. قم بإذابة 5x مكمل في درجة حرارة الغرفة (RT) أو طوال الليل عند 2-8 درجة مئوية. يقلب جيدا قبل الاستخدام حتى يصبح المكمل خاليا من الغيوم.
- 1٪ مصفوفة خارج الخلية (ECM): استخدم طرف ماصة مبرد مسبقا وأنابيب معقمة لتوزيع 200 ميكرولتر من ECM (انظر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر الشكل 1 نظرة عامة رسومية على البروتوكول المعدل . تم استخدام H9-ESCs لتوليد ROs عندما نمت الخلايا بكثافة 70٪ -80٪. تم تجميع معلقات أحادية الخلية ل H9-ESCs في 96 بئرا مخروطية القاع على شكل V في اليوم 1 وشكلت EBs مستديرة محدودة جيدا بحلول اليوم 6. مع زيادة وقت الثقافة ، زاد حجم EBs تدريجيا. في اليوم 30 ، تم تشكيل الهياكل الشبيهة بالظهارة العصبية بوضوح وسمكها أثناء تمايز NR على المدى الطويل.
بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة الطريقة المعدلة بطريقتين أخريين (Kuwahara .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن ل ROs البشرية أن تلخص مكانيا وزمانيا تطور شبكية العين الجنينية ، وتظهر ROs المبكرة درجة عالية من التشابه مع شبكية العين الجنينية في مراحل مماثلة من التطور15. من حيث مورفولوجيا الأنسجة والتعبير الجزيئي ، يعكس RO البشري عن كثب حالة النمو الفعلية لأنسجة الشبكية ، مما يوفر فرصا هائلة وغير مسبوقة في مجالات نمذجة الأمراض وفحص الأدوية والطب التجديدي. حاليا ، تم إنشاء العديد من الطرق المختلفة لتوليد ROs من PSCs البشرية في المختبر ، والتعديلات والتحسينات المستمرة جارية لزيادة تحسين الكفاءة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | شرائح الغسيل |
| 4٪ Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | إصلاح عضيات الشبكية |
| 5 مل ماصة باستور | NEST التكنولوجيا الحيوية | 318516 | الماصة العضيات الشبكية |
| 96 آبار مخروطية | على شكل حرف V سوميتومو باكيليت | MS-9096VZ | |
| مجهر التصاق CITOTEST | 188105 | إصلاح شرائح | |
| AggreWell المتوسطة | STEMCELL Technologies | 5893 | متوسط |
| الإيثانول اللامائي | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | الأجسام المضادة الأولية |
| المضادة للتلاشي | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | الجسم المضاد الأساسي |
| المضاد ل NESTIN | Sigma | N5413 | الجسم المضاد الأساسي |
| المضاد للخلايا العصبية من الفئة الثالثة & بيتا توبولين (TUJ1) | Beyotime | AT809 | الجسم |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | محلول تفكك الخلايا للأجسام المضادة |
| الأولية (CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | تفكك الخلايا |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3 & alpha /&beta ؛ مثبط |
| تركيز دهون الكوليسترول | Gibco | 12531018 | 250 مرة ؛ |
| خدمة حل استرجاع مستضد السترات | Bio | G1202-250ML | 20 مرة ؛ ، درجة الحموضة 6.0 |
| CS10 | تقنيات الخلايا الجذعية | 1001061 | تجميد |
| الخلايا DAPI | Roche | 10236276001 | نواة مضادة |
| ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM / F12 | Gibco | 11330032 | متوسط |
| DMEM / F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | الحمار المتوسط |
| المضاد للفأر Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | الأجسام المضادة الثانوية |
| الحمار المضاد للأرانب Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | الجسم المضاد الثانوي |
| حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) Biosharp | BL518A | 0.5 م ، درجة الحموضة 8.0 ، تفكك الخلية | |
| مصفوفة خارج الخلية (ECM) | ألواح طلاء | 354277 Corning | |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | |
| مصل بقري متوسط الجنين | Gibco | A5669701 | |
| محلل كمي لخلايا الأنسجة الشبيهة بالتدفق | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | أقسام المسح |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 متوسط | |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | مثبطات Wnt |
| بالضربة القاضية استبدال | المصل Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | مثبط BMP |
| منخفض الالتصاق 24 بئر ألواح | Corning | 3473 | |
| ألواح منخفضة الالتصاق 6 آبار | Corning | 3471 | |
| وسط الصيانة (مم) | STEMCELL | 85850 | مكمل N2 متوسط |
| Gibco | 17502048 | ||
| مصل الحمار العادي | Solarbio | SL050 | مانع العازلة |
| Paraplast | Leica | 39601006 | تضمين الأنسجة |
| PBS درجة الحموضة الأساسية 7.4 الأساسية (1x) | Gibco | C10010500BT | بدون Ca + ، Mg + |
| Reconbinant العظام البشرية المورفوجيني البروتين -4 (rhBMP4) | R & D | 314-BP | عامل البروتين الرئيسي |
| حمض الريتينويك | مسحوق Sigma | R2625 | ، يحفظ بعيدا عن الضوء |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5 مثبط |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | مثبط التيروزين كيناز |
| سوبر قلم | عنق الرحم ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| التورين | سيجما | T0625-10G | |
| ثيوجلسرين | سيجما | M1753 | |
| تريتون X-100 | سيجما | X100 | نفاذية |
| WA09 خط الخلايا الجذعية الجنينية | أبحاث | خط الخلية | |
| زيلين | سينوفارم | 10023418 | إزالة الشمع |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | مثبط الصخور |
المراجع
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
