تسلسل الحمض النووي الريبي الكمي المطلق (AQRNA-seq) هو تقنية تم تطويرها لتحديد المناظر الطبيعية لجميع الحمض النووي الريبي الصغير في الخلائط البيولوجية. هنا ، يتم عرض كل من خطوات إعداد المكتبة ومعالجة البيانات الخاصة ب AQRNA-seq ، وتحديد التغيرات في تجمع الحمض النووي الريبي الناقل (tRNA) في المتفطرة البوفية BCG أثناء السكون الناجم عن الجوع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
AQRNA-seq لقياس كمية الحمض النووي الريبي الصغير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر AQRNA-seq علاقة خطية مباشرة بين تسلسل عدد قراءات وأرقام نسخ الحمض النووي الريبي الصغيرة في عينة بيولوجية ، مما يتيح القياس الكمي الدقيق لمجموعة الحمض النووي الريبي الصغير. يتضمن إجراء إعداد مكتبة AQRNA-seq الموصوف هنا استخدام روابط تسلسل مصممة خصيصا وخطوة لتقليل تعديلات الحمض النووي الريبي المثيلي التي تمنع عملية النسخ العكسي ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية cDNAs كاملة الطول. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تنفيذ مفصل لخط أنابيب المعلوماتية الحيوية المصاحب. تم إجراء هذا العرض التوضيحي ل AQRNA-seq من خلال تحليل كمي ل 45 tRNAs في المتفطرة البوفية BCG التي تم حصادها في 5 أيام مختارة عبر دورة زمنية مدتها 20 يوما من الحرمان من المغذيات و 6 أيام من الإنعاش. كما سيتم مناقشة الجهود الجارية لتحسين كفاءة ودقة AQRNA-seq هنا. يتضمن ذلك استكشاف طرق لتجنب تنقية الجل للتخفيف من مشكلات dimer التمهيدي بعد تضخيم PCR وزيادة نسبة القراءات كاملة الطول لتمكين تعيين قراءة أكثر دقة. ستركز التحسينات المستقبلية على AQRNA-seq على تسهيل الأتمتة والتنفيذ عالي الإنتاجية لهذه التكنولوجيا لتحديد جميع أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة في عينات الخلايا والأنسجة من الكائنات الحية المتنوعة.
المقدمة
تسلسل الجيل التالي (NGS) ، المعروف أيضا باسم التسلسل المتوازي على نطاق واسع ، هو تقنية تسلسل الحمض النووي التي تتضمن تجزئة الحمض النووي ، وربط قليل النيوكليوتيدات المحول ، والتضخيم القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتسلسل الحمض النووي ، وإعادة تجميع تسلسل الشظايا في الجينوم. يعد تكييف NGS مع تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) نهجا قويا لتحديد وقياس نسخ الحمض النووي الريبي ومتغيراتها1. أدت التطورات المبتكرة في سير عمل إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي وخطوط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية ، إلى جانب التقدم في الأجهزة المختبرية ، إلى توسيع ذخيرة تطبيقات RNA-seq ، والتقدم إلى ما بعد تسلسل الإكسوم إلى omics وظيفية متقدمة مثل تنميط الحمض....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يقدم الشكل 1 توضيحا بيانيا للإجراءات التي ينطوي عليها إعداد مكتبة AQRNA-seq. يمكن العثور على معلومات مفصلة بشأن الكواشف والمواد الكيميائية والأعمدة / المجموعات المستخدمة في الإجراء في جدول المواد. يوصى بإجراء تقييم شامل لنقاء وسلامة وكمية عينات الحمض النووي الريبي المدخلة باستخدام (i) 3٪ من هلام الأغاروز الكهربائي ، (ii) أدوات الرحلان الكهربائي الآلي لمراقبة جودة العينة للجزيئات الحيوية (انظر جدول المواد) ، و (iii) قياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية و / أو القياس الكمي الفلورومتري. من الضروري الاحتفاظ بجميع التفاعلات والخلطات الرئيسية على الجليد ، ما لم ينص على خلاف ذلك. نقل الكواشف (مث....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
المتفطرة البوفية خضعت سلالة BCG (عصيات كالميت وغيرين) 1173P2 التي تخضع لنمو أسي لسلسلة زمنية (0 و 4 و 10 و 20 يوما) من تجويع المغذيات ، تليها إنعاش لمدة 6 أيام في وسط غني بالمغذيات كما تم تقديمه سابقا في Hu et al.7. تم عزل الحمض النووي الريبي الصغير من الثقافة البكتيرية ، مع ثلاثة تكرارات بيولوجية ، في كل نقطة من النقاط الزمنية الخمس المحددة. تم إنشاء مكتبات Illumina باستخدام سير عمل إعداد مكتبة AQRNA-seq الموصوف أعلاه (الشكل 1) ، متبوعا بالتسلسل على جهاز الت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تصميم سير عمل إعداد مكتبة AQRNA-seq لزيادة التقاط الحمض النووي الريبي داخل العينة وتقليل سقوط البلمرة أثناء النسخ العكسي7. من خلال ربط رابط من خطوتين ، يتم ربط oligos DNA الجديد (Linker 1 و Linker 2) بشكل زائد لاستكمال الحمض النووي الريبي بالكامل داخل العينة. يمكن إزالة الروابط الزائدة بكفاءة باستخدام RecJf ، وهو إكسونوكلياز من 5 إلى 3 بوصات خاص بالحمض النووي أحادي الشريط ، مما يترك المنتجات المرتبطة سليمة. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل معالجة AlkB من تعديلات الميثيل على الحمض النووي الريبي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
P.C.D. مخترع على براءتي اختراع (PCT / US2019 / 013714 ، US 2019/0284624 A1) تتعلقان بالعمل المنشور.
شكر وتقدير
يعرب مؤلفو هذا العمل عن امتنانهم لمؤلفي الورقة الأصلية التي تصف تقنية AQRNA-seq7. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (ES002109 ، AG063341 ، ES031576 ، ES031529 ، ES026856) والمؤسسة الوطنية للبحوث في سنغافورة من خلال تحالف سنغافورة ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للبحث والتكنولوجيا مقاومة مضادات الميكروبات IRG.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-كيتوجلوتاراتي | Sigma-Aldrich | 75890 | إعداد حل عملي (1 متر) وتخزينه في -20 & ordm ؛ C |
| 2100 أداة المحلل الحيوي | Agilent | G2938C | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | يحتوي New England Biolabs | M0437M (مكون #: N0437AVIAL) NEB | M0437M على T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L) ، T4 RNA RNA Ligase Reaction Buffer (10X) ، PEG 8000 (1X) ، و ATP (100 mM) ؛ إعداد حل عمل (10 ملم) وتخزينه في -20 & ordm ؛ C |
| AGAROSE GPG / LE | AmericanBio | AB00972-00500 | يخزن في درجة حرارة محيطة |
| حديد الأمونيوم (II) كبريتات سداسي هيدرات | Sigma-Aldrich | F2262 | قم بإعداد محلول عمل (0.25 م) وتخزينه عند -20 درجة ؛ C |
| محلل حيوي تحليل الحمض النووي الريبي الصغير | Agilent | 5067-1548 ؛ | يستخدم تحليل الحمض النووي الريبي الصغير للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي المدخل وكفاءة التفاعلات الأنزيمية (على سبيل المثال ، ربط Linker 1) |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA ؛ 10 مجم / مل) ؛ | New England Biolabs | B9000 | تم إيقاف هذا المنتج في 15/12/2022 وتم استبداله بالألبومين المؤتلف ، درجة البيولوجيا الجزيئية (NEB B9200). |
| الكلوروفورم | ماكرون فاين كيماويات | 4441-10 | |
| ديميثيلاز | ArrayStar | AS-FS-004 | Demethylase مع المعالجة المسبقة rtStar tRNA & طقم تخليق (كدنا) الأول (AS-FS-004) مزيج |
| محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) | نيو إنجلاند بيولابيس | N0447L (المكون #: N0447LVIAL) يحتوي | مزيج محلول dNTP هذا على تركيزات متساوية المولار من dATP و dCTP و dGTP و dTTP (10 ملي مولار لكل منهما) كتلة |
| حرارية رقمية مزدوجة | VWR المنتجات | العلمية 13259-052 | استخدام كتلة التسخين مع QIAquick & nbsp ؛ طقم استخراج الجل |
| DyeEx 2.0 مجموعة تدور | Qiagen | 63204 | فعال في إزالة البقايا القصيرة (على سبيل المثال ، قلقلات البيض التي يقل طولها عن 10 نقاط أساس) |
| مزود طاقة الرحلان الكهربائي | Bio-Rad Labrotories | PowerPac 300 | |
| Eppendorf PCR Tubes (0.5 مل) | Eppendorf | 0030124537 | |
| Eppendorf Safe-Lock (0.5 مل) | Eppendorf | 022363611 | |
| Eppendorf Safe-Lock (1.5 مل) | Eppendorf | 022363204 | |
| Eppendorf Safe-Lock (2 مل) | Eppendorf | 022363352 | |
| الكحول الإيثيلي (الإيثانول) ، نقي | سيجما ألدريتش | E7023 ؛ | يستخدم الإيثانول النقي مع مجموعة Oligo Clean and Concentrator Kit من Zymo Research |
| نظام تصوير جل | Alpha Innotech | FluorChem 8900 | |
| تحميل جل ، أرجواني (6X) ، لا يوجد SDS | New England Biolabs | N0556S (مكون #: B7025SVIAL) NEB | N0556S يحتوي على سلم الحمض النووي الأرجواني سريع التحميل 50 نقطة أساس وصبغة تحميل الجل ، أرجواني (6X) ، لا يوجد SDS |
| GENESYS 180 UV-Vis مقياس الطيف | الضوئي Thermo Fisher Scientific | 840-309000 | يستخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيزات oligo باستخدام قانون البيرة |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | إعداد محلول عملي (1 م ؛ درجة الحموضة = 8 مع هيدروكسيد الصوديوم) وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج |
| حمض الهيدروكلوريك (HCl) | VWR المنتجات العلمية | BDH3028 | تحضير محلول عمل (5 م) وتخزينه في درجة الحرارة المحيطة |
| كحول الأيزوبروبيل (الأيزوبروبانول) ، | ماكرون النقي للكيماويات | الدقيقة 3032-16 | يستخدم الأيزوبروبانول مع QIAquick & nbsp ؛ طقم استخراج الجل |
| حمض الأسكوربيك | Sigma-Aldrich | A5960 | تحضير محلول عمل (0.5 م) وتخزينه في -20 & ordm ؛ C |
| جهاز طرد مركزي دقيق | Eppendorf | 5415D | |
| NanoDrop 2000 مقياس الطيف | الضوئي الحراري فيشر Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer 2 (10X) | New England Biolabs | M0264L (مكون #: B7002SVIAL) NEB | M0264L يحتوي على RecJf (30 U/&mu ؛ L) و NEBuffer 2 (10X) ؛ تخزين في -20 درجة ؛ C |
| مياه خالية من النوكلياز (غير معالجة) ثيرمو | فيشر العلمي | AM9938 ؛ | |
| أوليجو كلين اند طقم المكثف | Zymo Research | D4061 | يحفظ في درجة الحرارة المحيطة |
| PEG 8000 (محلول 50٪) | New England Biolabs | M0437M (مكون #: B1004SVIAL) يحتوي | NEB M0437M على T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L) ، T4 RNA RNA Ligase Reaction Buffer (10X) ، PEG 8000 (1X) ، و ATP (100 mM) ؛ إعداد حل عمل (10 ملم) وتخزينه في -20 & ordm ؛ C |
| Peltier Thermal Cycler | MJ Research | PTC-200 | |
| الفينول: كولوروفورم: isoamyl ؛ الكحول 25:24:1 الرقم الهيدروجيني = 5.2 | ثيرمو فيشر العلمي | J62336 | |
| المخزن المؤقت PrimeScript (5X) | TaKaRa | 2680A | |
| PrimeScript Reverse Transcriptase | TaKaRa | 2680A | |
| QIAquick طقم استخراج الجل | Qiagen | 28704 | تتطلب هذه المجموعة كتلة تسخين وأيزوبروبانول للعمل مع |
| سلم الحمض النووي الأرجواني سريع التحميل 100 نقطة أساس | نيو إنجلاند بيولابز | N0551S (المكون #: N0551SVIAL) سلم | |
| الحمض النووي الأرجواني سريع التحميل 50 نقطة أساس | نيو إنجلاند بيولابز | N0556S (المكون #: N0556SVIAL) NEB | N0556S يحتوي على سلم الحمض النووي الأرجواني سريع التحميل 50 نقطة أساس وصبغة تحميل الجل ، أرجواني (6X) ، بدون SDS |
| RecJf (30 U/μ L) | يحتوي New England Biolabs | M0264L (مكون #: M0264LVIAL) NEB | M0264L على RecJf (30 U/μ L) و NEBuffer 2 (10X) ؛ تخزين في -20 درجة ؛ |
| RNase (مورين ؛ 40 U/&mu ؛ L) | نيو إنجلاند بيولابس | M0314L ( المكون #: M0314LVIAL) | تخزين في -20 درجة ؛ C |
| SeqAMP بوليميراز الحمض النووي | TaKaRa | 638509 | يحتوي TaKaRa 638509 على SeqAMP بوليميراز الحمض النووي و SeqAMP PCR Buffer (2X) |
| SeqAMP عازلة PCR (2X) | TaKaRa | 638509 | يحتوي TaKaRa 638509 على SeqAMP بوليميراز الحمض النووي و SeqAMP باك بريميسيرج المتسلسل العازلة (2X) |
| الجمبري القلوي فوسفاتيز (1 وحدة | L) | نيو إنجلاند بيولابز | M0371L ( المكون #: M0371LVIAL) | |
| هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) | سيجما ألدريتش | ؛ S5881 | تحضير محلول عمل (5 أمتار) وتخزينه في درجة الحرارة المحيطة |
| T4 DNA Ligase (400 U/μ L) | نيو إنجلاند بيولابس | M0202L ( المكون #: M0202LVIAL) | NEB M0202L يحتوي على T4 DNA Ligase (400 U/μ L) و T4 DNA DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) | نيو إنجلاند بيولابس | M0202L ( المكون #: B0202SVIAL) | NEB M0202L يحتوي على T4 DNA Ligase (400 U/μ L) و T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L) | نيو إنجلاند بيولابز | M0437M (مكون #: M0437MVIAL) يحتوي | NEB M0437M على T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L) ، T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) ، PEG 8000 (1X) ، و ATP (100 mM) |
| T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) ؛ | New England Biolabs | M0437M (مكون #: B0216SVIAL) NEB | M0437M يحتوي على T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L) ، المخزن المؤقت لتفاعل T4 RNA Ligase (10X) ، PEG 8000 (1X) ، و ATP (100 ملي متر) |
المراجع
- Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
- Grillone, K., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
