مقالة منهجية

نموذج العنقوص بعد الجراحة

DOI:

10.3791/66465

⸱

يوليو 12, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1General Surgery Department, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2National Clinical Research Center for Digestive Diseases, 3State Key Lab of Digestive Health, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 4Immunology Research Center for Oral and Systemic Health, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 5Beijing Laboratory of Oral Health, Capital Medical University School of Stomatology, 6Beijing Clinical Research Institute, 7Medical Research Center, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, 8Beijing Institute of Brain Disorders, Capital Medical University, 9Department of Hernia and Abdominal Wall Surgery, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف نموذج الفئران للعلص بعد الجراحة الناتج عن التلاعب المعوي. تم تقييم وظيفة العبور المعدي المعوي والتغيرات المرضية وتنشيط الخلايا المناعية بعد 24 ساعة من الجراحة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعاني معظم المرضى من علاوة ما بعد الجراحة (POI) بعد الجراحة ، والتي ترتبط بزيادة المراضة والوفيات ووقت الإقامة في المستشفى. POI هو نتيجة للتلف الميكانيكي أثناء الجراحة ، مما يؤدي إلى اضطراب الحركة في الجهاز الهضمي. ترتبط آليات POI بالحساسية العصبية الشاذة ، وضعف وظيفة الحاجز الظهاري ، وزيادة الالتهاب الموضعي. ومع ذلك ، لا تزال التفاصيل غامضة. لذلك ، تعتبر نماذج الفئران التجريبية ضرورية لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية وآلية إصابة POI ولتطوير علاجات جديدة.

هنا ، نقدم نموذج الفئران ل POI الناتج عن طريق التلاعب المعوي (IM) الذي يشبه الجراحة السريرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التلف الميكانيكي للأمعاء الدقيقة عن طريق تدليك البطن 1-3 مرات بقطعة قطن. تأخر التدفق العضلي في العبور المعدي المعوي بعد 24 ساعة من الجراحة ، كما تم تقييمه من خلال اكتشاف تزقيم FITC-dextran والكشف الفلوري عن الجهاز الهضمي القطعي. علاوة على ذلك ، تم فحص تورم الأنسجة في تحت الغشاء المخاطي وتسلل الخلايا المناعية عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين وقياس التدفق الخلوي. يعد الضغط المناسب للعضلة العضلية وتأثير فرط الدم على الأمعاء أمرا بالغ الأهمية لهذا الإجراء. يمكن استخدام نموذج الفئران هذا من POI لدراسة آليات تلف الأمعاء والتعافي بعد جراحة البطن.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلوص بعد الجراحة (POI) هو متلازمة تشكل تحديا كبيرا في مجال صحة الإنسان ، لا سيما في إدارة المرضى الذين يخضعون لجراحة في البطن. يتميز POI بتأخر التعافي من حركة الجهاز الهضمي ، ويساهم في الإقامة الطويلة في المستشفى وزيادة تكاليف الرعاية الصحية ، ومع ذلك لا يوجد تعريف أو مسببات أو علاجمحدد 1. سلطت الأبحاث الحديثة الضوء على الدور المحوري للخلايا المناعية في تطور POI2،3،4 ، ومع ذلك هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتوضيح الآليات الأساسية المعنية.

في هذا البروتوكول ، نقدم نموذج الفئران ل POI الناجم عن الجراحة داخل البطن ، والذي يحاكي عن كثب تأثير جراحة البطن على الجهاز الهضمي. كان هدفنا هو توفير طريقة موحدة لنمذجة POI في الفئران ، مما يمكن الباحثين من التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية واستكشاف التدخلات العلاجية الجديدة.

يكمن الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية واستخدامها في الحاجة إلى نماذج ما قبل السريرية الموثوقة لدراسة POI. غالبا ما تفتقر الأساليب التقليدية لدراسة POI إلى الأهمية الانتقالية أو تفشل في التقاط التفاعل المعقد للعوامل التي تساهم في الحالة. من خلال تقديم نموذج الفئران الذي يكرر السيناريو السريري عن كثب ، يمكن للباحثين التحقيق بدقة أكبر في الآليات الكامنة وراء نقطة الاهتمام واختبار التدخلات العلاجية المحتملة في بيئة تجريبية خاضعة للرقابة.

بالمقارنة مع التقنيات البديلة ، فإن نموذج الفئران ل POI المقدم في هذا البروتوكول يوفر العديد من المزايا. في البداية ، قمنا بدمج النتائج التجريبية التي توصلنا إليها مع التطورات الحديثة لإنشاء بروتوكول موحد وقابل للتكرار لحث POI في التجارب. يسهل هذا البروتوكول التقييم المتسق لوظيفة العبور المعدي المعوي. ثانيا ، مكن استخدام التلوين النسيجي وقياس التدفق الخلوي من تقييم تورم الأنسجة وتكاثر الخلايا المناعية وتنشيطها ، مما أدى إلى رؤى قيمة حول العمليات الالتهابية الكامنة وراء POI5.

في السياق الأوسع للأدبيات ، يساهم إنشاء نموذج الفئران ل POI في توسيع مجموعة الأبحاث التي تهدف إلى فهم الفيزيولوجيا المرضية لهذه الحالة. من خلال سد الفجوة بين العلوم الأساسية والممارسة السريرية ، تلعب النماذج قبل السريرية دورا محوريا في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة ل POI6. علاوة على ذلك ، فإن توافر النماذج الحيوانية الموحدة يعزز قابلية استنساخ نتائج البحث وقابليتها للمقارنة عبر المختبرات المختلفة. ومع ذلك ، يعتمد نموذج POI هذا على التحفيز الميكانيكي أثناء العملية الجراحية. قد لا تكون الأشكال الأخرى من العلوص الناجم عن التحفيز مناسبة لهذا النموذج. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على الباحثين مراعاة عوامل مثل لوائح رعاية والاعتبارات الأخلاقية وتوافر الموارد عند التخطيط للتجارب باستخدام هذا النموذج.

باختصار ، يشير إدخال نموذج الفئران ل POI إلى تقدم جدير بالملاحظة في البحث قبل السريري حول هذه الحالة المنهكة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا تلطيخ H & E وقياس التدفق الخلوي لتقييم تورم الأنسجة وتكاثر الخلايا المناعية وتنشيطها. ومن شأن إنشاء نموذج نقطة اهتمام الفئران أن يسهل اكتشاف آليات إثبات الاهتمام وتعزيز تطوير علاجات جديدة لنقطة الاهتمام.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت رعاية والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية في رعاية واستخدامها (الصين) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات في مستشفى الصداقة في بكين (رقم 20-2056). تم استخدام C57BL / 6 فئران (8-12 أسبوعا) للدراسة.

1. التحضير للجراحة

  1. قم بتسريع جميع الفئران لمدة 12 ساعة قبل النمذجة المخطط لها لتلبية توحيد الظروف التجريبية (الشكل 1 أ).
  2. تحضير وتعقيم الأدوات الجراحية.
  3. تحضير مخدر ثلاثي بروموإيثانول ووسادة التدفئة. راقب وسادة التسخين لمنع ارتفاع درجة الحرارة واحتفظ بها عند درجة حرارة ثابتة (37.5 درجة مئوية).

2. التخدير

  1. تخدير كل فأر باستخدام ثلاثي البروم الإيثانول.
    1. تمييع ثلاثي بروموإيثانول لتحضير محلول 20 مجم / مل في محلول ملحي عادي. قم بإعطاء 0.2 مل من محلول عمل ثلاثي بروموإيثانول لكل 10 جم من وزن الجسم عن طريق الحقن داخل الصفاق. استخدم مرهم العيون على عيون الفئران لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    2. تأكد من تخدير الفئران تماما في غضون 5 دقائق والبقاء مخدرا لمدة 20 دقيقة.
  2. قم بتقييم عمق التخدير من خلال ملاحظة عدم قدرة الفأر على البقاء في وضع مستقيم والتحقق من استرخاء العضلات. لاحظ فقدان الحركة الإرادية ، وانعكاس الوميض ، والاستجابة للتحفيز الانعكاسي (قرصة إصبع القدم أو الذيل بضغط قوي).
  3. تقييم معدل التنفس ونمط الفأر من خلال مراقبة حركة جدار الصدر والبطن. تأكد من أن معدل التنفس ~ 55-65 نفسا / دقيقة تحت التخدير الأمثل.
  4. ضع الماوس المخدر على لوح وثبته بشريط لاصق.
  5. بعد تخدير الفئران تماما ، استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لإزالة الشعر من البطن. بعد الحلاقة ، امسح كل الشعر المتساقط على البطن باستخدام كرة قطنية مبللة بالمحلول الملحي.
    ملاحظة: تأكد من التهوية المناسبة واستخدام غطاء الدخان أو خزانة السلامة الحيوية عند التعامل مع ثلاثي البروم الإيثانول لتقليل مخاطر التعرض. أثناء الإجراء ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعاطف المختبر ، لمنع التلامس العرضي مع المواد الكيميائية والمواد البيولوجية.

3. الجراحة

  1. مد الأطراف بالكامل لفضح البطن. تأكد من وضع رأس الماوس للحفاظ على مجرى هواء واضح (الشكل 1 ب).
  2. تطهير جلد المنطقة الجراحية مرتين باستخدام كرة قطنية مبللة بالكحول بنسبة 75٪. بعد التطهير ، استخدم شاشا طبيا جافا ومعقما لإزالة الكحول الزائد من البطن. يتم تطبيق الليدوكائين (10 ملغ/كغ، تحت الجلد) في المكان المقصود قبل الشق.
  3. استخدم مشرطا معقما لعمل شق في الجلد ورفع العضلة المستقيمة البطنية في منتصف البطن باستخدام الملقط.
    1. قم بعمل شق صغير على طول الخط المتوسط لعضلة البطن المستقيمة ، مع الحرص على تجنب إصابة الأعضاء المختلفة في البطن.
    2. تأكد من أن النطاق التقريبي للشق هو كما يلي. تأكد من أن الهامش العلوي للشق هو 6-8 مم من عملية الخنجري للقص ، والهامش السفلي هو 6-8 مم من الأعضاء التناسلية الخارجية ، وطول الشق ~ 1 سم.
  4. ضع قطعة من الستارة الجراحية المعقمة أو الشاش المعقم على جانبي شق البطن. استخدم ملقط مرقئ لتثبيت الشاش المعقم على الحواف العلوية والسفلية للشق ، مما يؤدي إلى تعريض الشق (الشكل 1C).
    ملاحظة: في المجموعة الوهمية ، تم تغطية الشق بشاش مبلل لمدة 5 دقائق دون أي عملية جراحية.
  5. قم بتثبيت الستارة أو الشاش المعقم بشكل صحيح ، ثم استخدم مسحات قطنية مبللة مسبقا بالمحلول الملحي للضغط برفق على جانبي جدار البطن المجاور للشق. اعصر كمية صغيرة من الأنبوب المعوي من خلال الشق وقم بفضحه عن طريق وضعه على الستارة المعقمة أو الشاش (الشكل 1 د).
  6. بلل قطعتين قطنيتين معقتين تماما بمحلول ملحي عادي. أمسك أنسجة الأمعاء برفق باستخدام مسحات القطن المبللة وقم بإزالة الأمعاء الدقيقة بعناية.
    1. حدد موقع القي ثم أخرج الأمعاء بمسحات القطن المعقمة حتى 2 سم قبل المعدة لتجنب لمس البنكرياس. مد الأمعاء من الطرف القريب من رباط البنكرياس والاثني عشر إلى الطرف البعيد من المنطقة اللفائفية.
  7. استخدم ضغطا ثابتا على طول الأمعاء الدقيقة بأكملها من الأطراف القريبة إلى الأطراف البعيدة. تأكد من تطبيق قوة موحدة لمدة 5 دقائق حتى تظهر بقع نزيف صغيرة على سطح الأمعاء (الشكل 1 ه).
  8. بعد 5 دقائق ، استخدم مسحات قطنية معقمة مبللة مسبقا لوضع جميع الأمعاء الدقيقة بعناية في تجويف البطن ، باتباع الوضع التشريحي الفسيولوجي الطبيعي للأمعاء الدقيقة.
  9. قم بتدليك البطن برفق عبر الشاش المعقم وجدار البطن لمدة 3-5 ثوان لضمان استعادة الأمعاء إلى وضعها التشريحي الطبيعي ولمنع انسداد الأمعاء الميكانيكي الاصطناعي أو الالتواء المساريقي بعد الجراحة.
  10. حقن 100 ميكرولتر من المحلول الملحي في تجويف البطن لتعويض السوائل المفقودة أثناء العملية وتليين أنسجة البطن.
  11. أغلق البطن باستخدام خياطة جراحية 6-0 وقم بإغلاق طبقتين عند شق البطن. ابدأ بإغلاق طبقة العضلات بخيوط مستمرة ، مع الحرص على تجنب تلف أعضاء البطن. ارفع عضلة البطن المستقيمة أثناء الخياطة (الشكل 1F).
  12. بعد إغلاق عضلة البطن المستقيمة تماما ، قم بخياطتها بالكامل باستخدام خيوط بسيطة متقطعة باستخدام خياطة جراحية 6-0. حافظ على طول غرزة ~ 0.5 مم وتباعد إبرة ~ 2 مم.
  13. بعد إغلاق شق البطن ، امسح المنطقة القريبة من الشق برفق بشاش طبي جاف معقم لإبقائها جافة ونظيفة من الدم أو سوائل الأنسجة أو المحلول الملحي العادي.
  14. ضع كمية صغيرة من لاصق الشق الطبي على الشق وحوله لتجنب الانقسام بعد الجراحة.
  15. بعد أن يجف لاصق الشق الطبي تماما ، انقل الفئران إلى منشفة ورقية ، وضع المنشفة الورقية للقفص على بطانية ساخنة يتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37.5 درجة مئوية حتى تتعافى الفئران تماما. لا تترك دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
  16. انقل الفئران المستيقظة إلى بيئة حاجز تغذية واسمح لها بالشرب بحرية حتى وقت الكشف.

4. فحص العبور المعدي المعوي

  1. إعطاء 200 ميكرولتر من محلول FITC-dextran (5 مجم / مل في PBS) للفئران الصائمة عن طريق التزقيم بعد 22.5 ساعة من الجراحة (الشكل 1 أ).
  2. قتل الفئران رحيما باستخدام طريقة وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) ، مثل استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم.
    1. لعزل الجهاز الهضمي ، قم بعمل شق خط الوسط من الحجاب الحاجز إلى الحوض ، وإزالة الأنسجة الضامة والأعضاء المحيطة بعناية.
    2. افصل الجهاز الهضمي عن الأنسجة والأعضاء المحيطة ، مع التأكد من تضمين الجهاز بأكمله من المعدة إلى فتحة الشرج.
  3. قسم الجهاز الهضمي إلى 15 جزءا متساويا (من المعدة إلى القولون) ، مرقمة بالتتابع من 1 إلى 15 بناء على الموضع الفسيولوجي (التسلسل: St -S1: S10-Ce-L1: L3) (الشكل 2 أ).
  4. قم بتقطيع كل جزء من أنسجة الأمعاء بمحتواه إلى قطع بقياس 1-4 مم وضعها في أنابيب طرد مركزي منفصلة سعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من DPBS.
  5. دوامة أنابيب الطرد المركزي لمدة 10 ثوان لتجانس العينات.
  6. الطرد المركزي الأنابيب عند 500 × غرام لمدة 1 دقيقة. اجمع المادة الطافية لقياس كمية التألق FITC باستخدام قارئ صفيحة دقيقة متعدد الأوضاع.
  7. صف العبور المعدي المعوي عن طريق حساب المركز الهندسي (GC) ل FITC-dextran والحساب باستخدام الصيغة التالية: (Σ [٪ FITC لكل قطعة × رقم مقطع]) / 100.

5. تضمين البارافين وتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين (HE)

  1. القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم بعد 24 ساعة. قم بإجراء فحوصات تضمين البارافين والجهاز الهضمي على نفس.
  2. افتح تجويف البطن واجمع أنسجة الأمعاء الدقيقة لمزيد من التحليل.
  3. قم بإصلاح الأمعاء بأكملها بمحتوى معوي في مثبت كارنوي (60٪ ميثانول + 10٪ حمض الأسيتيك + 30٪ كلوروفورم) عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
  4. قم بإزالة حموضة الأنسجة عن طريق شطفها مرتين بالميثانول لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
  5. استبدل الميثانول بالإيثانول مرتين لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
  6. قم بإزالة حموضة الأنسجة عن طريق شطفها مرتين بالميثانول لمدة 30 دقيقة في كل مرة. لتحقيق شفافية الأنسجة باستخدام الزيلين ، اغمر الأنسجة في الزيلين واحتضن لمدة 1 ساعة.
  7. قم بتضمين الأنسجة في شمع البارافين باستخدام آلة تضمين البارافين. قطع الأنسجة المضمنة إلى شرائح بسمك 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
    ملاحظة: قسم الأمعاء الدقيقة إلى شموع مختلفة لتحسين الأداء. قم بتسمية المقاطع بشكل صحيح لتحديد موقعها.
  8. قم بإجراء تلطيخ HE باستخدام مجموعة تلطيخ HE. أغلق الشرائح وفحصها تحت المجهر لتحليلها.

6. عزل الخلايا المناعية وقياس التدفق الخلوي

  1. تحضير الحلول التالية.
    1. محلول ما قبل الهضم: قم بإعداد محلول الملح المتوازن من هانك بدون Ca2+ و Mg2+ مع 1 ملي مولار من dithiothreitol (DTT) و 10 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
    2. محلول الهضم: قم بإعداد محلول يحتوي على 200 ميكروغرام / مل DNAase I و 500 ميكروغرام / مل كولاجيناز IV و 4٪ FBS و 100 ميكرومتر عازلة HEPES في RPMI 1640.
    3. المخزن المؤقت لأعمال فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS): قم بإعداد مخزن مؤقت يحتوي على 5 جم / لتر BSA و 2 ملي مولار EDTA في PBS بدون Ca2+ أو Mg2+.
  2. قم بإزالة محتويات البراز عن طريق غسل الأمعاء بالمحلول الملحي العادي. قم بإزالة بقع باير والنسيج الضام للأمعاء الدقيقة. اقطع الأمعاء الدقيقة مفتوحة طوليا ثم قطعها إلى شرائح بحجم 1 سم في PBS مثلج.
  3. اغسل أجزاء الأمعاء بمحلول ما قبل الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر مداري. اجمع محلول ما قبل الهضم وقم بتصفيته من خلال مصافي خلايا 70 ميكرومتر للحصول على الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IELs).
  4. هضم الأجزاء الموجودة في محلول الهضم لمدة 30 دقيقة ثم قم بتصفية المعلق من خلال مصافي خلايا 70 ميكرومتر للحصول على الخلايا الليمفاوية الصفيحية المخصوصة (LPLs).
  5. قم بالطرد المركزي لخلايا LPL عند 500 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  6. اغسل الخلايا وعلقها باستخدام DPBS (أزيد الصوديوم ، تريس ، وخالي من البروتين) بتركيز 1 × 106 خلايا / 100 ميكرولتر.
  7. احتضان الخلايا بصبغة الفلورسنت للبقاء (1: 500) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.
  8. قم بتعليق الخلايا باستخدام المخزن المؤقت MACS وقم بطردها عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
  9. عد الخلايا الملطخة باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي. أعد تعليق الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا / 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. قم بتلطيخ الأجسام المضادة (1: 200-1: 400) عن طريق إضافة الحجم المناسب من الجسم المضاد إلى تعليق الخلية واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  10. اغسل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 6.8.
  11. اكتشف العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي وحلل البيانات باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي المرتبط7،8.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، تم إحداث POI جراحيا عن طريق التلاعب المعوي (IM) ، والذي يشبه تأثير الجراحة السريرية. في المجموعة الوهمية ، تم إجراء شق بدون IM. تم التضحية بفئران POI بعد 24 ساعة من جراحة POI جنبا إلى جنب مع الفئران الوهمية للتحكم في الوهم. تم الكشف عن الوظيفة الحرجة للجهاز الهضمي ، وظيفة عبور المحتوى ، عن طريق تزقيم FITC-dextran. تم اعتبار نموذج POI ناجحا لأن شدة FITC زادت في الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة (الشكل 2 ب). تم حساب متوسط GCs لتحديد الخلل الوظيفي في العبور للIM والإشارة إلى اتساق العملية (الشكل 2 ج).

أشار تلطيخ HE إلى مورفولوجيا أجزاء مختلفة من الجهاز الهضمي (الشكل 3). أصبحت طبقة العضلات الملساء تحت الغشاء المخاطي والعضلة الملساء في الاثني عشر والدقاق منتفخة بعد 24 ساعة من تحريض POI (الشكل 3 أ ، ب). بالمقارنة مع تلك الموجودة في الفئران الزائفة ، كشف تلطيخ الاثني عشر عن زيادة تسلل الخلايا المناعية في فئران POI (الشكل 3 أ).

تحليل التدفق الخلوي متعدد الألوان هو الطريقة المركزية لتحليل نسبة الخلايا المناعية وحالتها ووظيفتها. تم هضم الأنسجة المعوية بالكولاجيناز وديوكسي ريبونوكلياز وفصلها إلى معلق أحادي الخلية لقياس التدفق الخلوي. تم استخدام استراتيجية البوابات لتحديد نسب خلايا CD3 T والمجموعات الفرعية ذات الصلة بين LPLs (الشكل 4 أ). يتم تنظيم علامة التنشيط والالتصاق CD69 والتعبير عن الخلايا التائية CD4 وخلايا CD8 T وخلايا gd T في فئران POI (الشكل 4 ب) 7. وبالمثل ، أظهرت نسبة السكان الفرعيين CD44 + PD-1 + (التنشيط والتمايز الطرفي وعلامة الإنفاد) اتجاها متزايدا (الشكل 4 ج) 7. بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية ، تزداد أيضا نسب المجموعات الفرعية للخلايا النخاعية (العدلات والخلايا المتغصنة والضامة) بعد الجراحة العضلية (الشكل 4 د)8.

figure-results-1
الشكل 1: نموذج الفئران من العلوص بعد الجراحة. (أ) تخطيطي لنموذج الفئران من العلوص بعد الجراحة. (ب) تثبيت الفأر بعد التخدير والحلاقة. (ج) تم الكشف عن الشق وتغطيته بشاش طبي معقم. (د) تم ضغط الأنابيب المعوية من تجويف البطن من خلال شق البطن وكشفها عن طريق وضعها على شاش معقم. (ه) تعرضت الأمعاء الدقيقة بأكملها لقطعة قطن معقمة مبللة. (و) تم إغلاق طبقة العضلات بواسطة خياطة جراحية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: فحص العبور المعدي المعوي لتقييم وظيفة الجهاز الهضمي. في غضون 22.5 ساعة بعد الجراحة ، تم تقطيع الفئران الزائفة أو POI بمحلول FITC-dexterrn والتضحية بها بعد 90 دقيقة. (أ) تم تقسيم الجهاز الهضمي إلى 15 جزءا وترقيمها حسب الوضع الفسيولوجي. (ب) شدة FITC لكل جزء من الجهاز الهضمي للفئران الوهمية والفئران POI. (ج) تم حساب المراكز الهندسية ل FITC-dextran المدارة وتظهر على شكل قطع كمان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تلطيخ HE التمثيلي للأمعاء الدقيقة لفئران POI. تلطيخ المقاطع العرضية للاثني عشر (أ) و (ب) الدقاق من الفئران الوهمية و POI. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر أو 25 ميكرومتر (صورة مكبرة للجزء الداخلي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل التدفق الخلوي التمثيلي للخلايا المناعية المعوية الدقيقة من فئران POI. (أ) استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي لمجموعات الخلايا التائية من أنسجة الأمعاء الدقيقة لفئران POI بعد 24 ساعة من الجراحة. (ب) نسب العلامة النشطة للخلايا التائية CD69 + في الخلايا التائية CD4 وخلايا CD8 T والخلايا التائية gd من الأمعاء الدقيقة للفئران الوهمية والفئران POI. (ج) نسب العلامات النشطة CD44 + PD-1 + بين الخلايا التائية CD4 وخلايا CD8 T والخلايا التائية gd في الأمعاء الدقيقة للفئران الوهمية وPOI. (د) نسب العدلات (Ly6G + CD11b +) والخلايا المتغصنة (CD11c + MHC-II +) والضامة (CD11b + F4 / 80 +) بين CD45 + Aqua- الخلايا المناعية الحية من الأمعاء الدقيقة للفئران الوهمية و POI. يمثل الرقم الموجود في كل لوحة النسبة المئوية لأنواع الخلايا المعنية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد نجاح الجراحة على عدة خطوات حاسمة. أولا ، يعد الحفاظ على الاتساق أثناء الجراحة داخل الأمعاء (IM) أمرا ضروريا لإحداث إصابة واسعة النطاق للأمعاء الدقيقة. يعد الضغط المناسب المطبق أثناء إجراء العضل العضلي والتأثير الناتج عن فرط الدم على الأمعاء أمرا بالغ الأهمية لنجاح الجراحة. كانت ملاحظة تحول الجهاز الهضمي بأكمله إلى اللون الوردي وتظهر بقع نزفية حمراء بعد فركه بقطعة قطن بمثابة مؤشر على نجاح العملية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التأكد من بقاء متوسط قيمة GC عند حوالي 5 بعد الجراحة يشير إلى أن النموذج كان ناجحا مقارنة بالفئران التي يتم تشغيلها بشكل زائف. الفحص المجهري لتورم الأنسجة في تحت الغشاء المخاطي وتسلل الخلايا المناعية ، كما يتضح من تلطيخ HE ، يعمل أيضا كخطوة حاسمة في التحقق من شدة POI.

قد تكون التعديلات على البروتوكول ضرورية لتحسين النتائج أو استكشاف أي تحديات تمت مواجهتها وإصلاحها. على سبيل المثال ، لعرض التغيرات المورفولوجية بدقة في ظهارة الأمعاء ، يوصى بتضمين الأنسجة المعوية مع محتوياتها باستخدام مثبت كارنوي9. يضمن بروتوكول التضمين الفريد هذا التثبيت السريع ، وهو أمر ضروري للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. ومع ذلك ، إذا ركزت أهداف المحقق على الظهارة أو الصفيحة الخاصة ، فمن المستحسن استخدام تقنية الدرفلة السويسرية المحسنة لتضمين الشمع لإعداد الأنسجة المعوية10. تعمل هذه التقنية على ضغط المساحة البينية للأنسجة المعوية وتضمن اتجاها ثابتا للزغابات ، مما يسهل تضمين الأمعاء الدقيقة بأكملها في عينة واحدة مدمجة بالشمع.

على الرغم من فائدته ، فإن البروتوكول له قيود. أحد القيود هو الاعتماد على النماذج الحيوانية ، والتي قد لا تكرر بشكل كامل تعقيد الفيزيولوجيا المرضية البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤدي الاختلافات في التقنية الجراحية واستجابات الفئران الفردية إلى تباين في النتائج. وفقا لدراستنا الحديثة ، يعد استخدام مشغل متسق مبدأ مهما لتقليل التباين المعتمد على المشغل. علاوة على ذلك ، قدم Van et al. جهازا عصاميا قادرا على تطبيق وزن معين على الأمعاء ، مما يضمن ضغطا ثابتا على العضلة العضوية عبر الفئرانالمختلفة 11. يثبت هذا النهج بالفعل أنه ذو قيمة في الحفاظ على اتساق النموذج.

يمثل هذا البروتوكول مساهمة قيمة في هذا المجال من خلال توفير طريقة موحدة لحث POI من خلال جراحة المراسلة العضلية في الفئران. من خلال توضيح الخطوات الحاسمة وتقديم تعديلات لتضمين الأنسجة وعزل الخلايا المناعية ، يعزز هذا البروتوكول قابلية التكاثر والموثوقية في نمذجة POI. يسمح استخدام قياس التدفقالخلوي 7،8 لتحليل الخلايا المناعية بإجراء تحقيق شامل للاستجابة المناعية الكامنة وراء التسبب في POI ، واستكمال التقنيات الحالية وتوسيع فهمنا لهذه المتلازمة المعقدة.

يبشر البروتوكول المقدم هنا بأبحاث ما قبل السريرية المستقبلية التي تركز على فهم وعلاج POI. من خلال تحسين التقنيات الجراحية وتحسين طرق معالجة الأنسجة ، يمكن للباحثين استكشاف الآليات الكامنة وراء تطوير POI وتحديد الأهداف العلاجية الجديدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن توافق البروتوكول مع قياس التدفق الخلوي يتيح التنميط المناعي المتعمق ، مما يفتح طرقا للتحقيق في التدخلات المعدلة للمناعة التي تهدف إلى التخفيف من أعراض POI. بشكل عام ، يضع البروتوكول الأساس لتعزيز معرفتنا ب POI وتطوير استراتيجيات علاجية مستهدفة لتحسين نتائج المرضى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون لمركز المختبر ومعهد بكين للأبحاث السريرية ومستشفى بكين للصداقة لتوفير رعاية. تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير في مجال التقنيات الرئيسية (رقم 2015BAI13B09) ، ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (رقم 7232035) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82171823 ، 82374190) ، والعلماء الشباب المتميزين من مستشفى بكين للصداقة (رقم yyqcjh2022-4).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 متر HEPESThermo15630080
APC مضاد للفأر I-A / I-E (MHC-II)Biolegend107614
APC مضاد للفأر TCRbBiolegend109212
APC / Cy7 مضاد للفأر CD4Biolegend100414
APC / Cy7 مضاد للفأر Ly6GBiolegend127624
Brilliant Violet 421 مضاد للفأر CD69Biolegend104545
Brilliant Violet 421 مضاد للفأر F4 / 80Biolegend123132
Brilliant Violet 785 مضاد للماوس / الإنسان CD44Biolegend103041
BUV395 مضاد للفأر CD8aBD563786
BUV737 مضاد للفأر CD3eBD612771
كولاجيناز IVسيجما ألدريتشC5138
مجهر الثقافةCKX53أوليمبوس
ديوكسيريبونوكلياز I من البنكرياس البقري (<قوي > DNase I < / قوي >) محلولSigma-AldrichDN25-5G
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43816-10ML
EDTASigma-AldrichEDS-100G
FITC مضاد للفأر CD45Biolegend147709
FITC-dextern (70 كيلو واط)Sigma-AldrichFD70-100MGمقايسة عبور الجهاز الهضمي
HE طقم تلطيخsolarbioG1120
PE مضاد للفأر CD11bBiolegend101208
PE مضاد للفأر PD-1Biolegend114118
PE / Cy7 مضاد للفأر CD11cBiolegend117318
PercollGE (Pharmacia)17-0891-01
Symphony A5 مقياس التدفقالخلوي BD-الكشف عن الخلايا المناعية وفرزها
TribromoethanolSigma-AldrichT48402Anesthesia
Varioskan LUXThermoN16699قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع
Zombie Aqua Fixable Viability KitBiolegend423102Fluorescent صبغة الجدوى 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapman, S. J., Pericleous, A., Downey, C., Jayne, D. G. Postoperative ileus following major colorectal surgery. Br J Surg. 105 (7), 797-810 (2018).
  2. Farro, G., et al. CCR2-dependent monocyte-derived macrophages resolve inflammation and restore gut motility in postoperative ileus. Gut. 66 (12), 2098-2109 (2017).
  3. Wouters, M. M., Vicario, M., Santos, J. The role of mast cells in functional GI disorders. Gut. 65 (1), 155-168 (2016).
  4. Engel, D. R., et al. T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract. Nat Med. 16 (12), 1407-1413 (2010).
  5. Schwartz, C., Voehringer, D. Identification of murine basophils by flow cytometry and histology. Methods Mol Biol. 2163, 367-375 (2020).
  6. Funk, E. K., Weissbrod, P., Horgan, S., Orosco, R. K., Califano, J. A. Preclinical experience with a novel single-port platform for transoral surgery. Surg Endosc. 35 (8), 4857-4864 (2021).
  7. Nemoto, S., Mailloux, A. W., Kroeger, J., Mulé, J. J. OMIP-031: Immunologic checkpoint expression on murine effector and memory T-cell subsets. Cytometry A. 89 (5), 427-429 (2016).
  8. Brandi, J., Wiethe, C., Riehn, M., Jacobs, T. OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice. Cytometry A. 103 (8), 624-630 (2023).
  9. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  10. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  11. van Bree, S. H., et al. Novel method for studying postoperative ileus in mice. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 4 (4), 219-227 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Postoperative IleusMurine ModelIntestinal ManipulationGastrointestinal MotilityAbdominal SurgeryImmune Cell InfiltrationFlow CytometryHematoxylin Eosin StainingEpithelial Barrier FunctionInflammation Mechanisms

مقالات ذات صلة