Method Article

تمايز وتوصيف الخلايا الآكلة للعظم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

DOI:

10.3791/66527

⸱

March 22nd, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هذا البروتوكول تمايز الخلايا الآكلة للعظم البشري عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ويصف طرق توصيف الخلايا الآكلة للعظم وسلائف ناقضة العظم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يفصل هذا البروتوكول انتشار وتمرير iPSCs البشرية وتمايزها إلى ناقضات عظمية. أولا ، يتم فصل iPSCs إلى تعليق أحادي الخلية لمزيد من الاستخدام في تحريض الجسم الجنيني. بعد تحريض الأديم المتوسط ، تخضع الأجسام الجنينية لتمايز المكونة للدم ، مما ينتج عنه مجموعة خلايا مكونة للدم عائمة. بعد ذلك ، تخضع الخلايا المكونة للدم المحصودة لخطوة نضوج عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، وأخيرا تمايز ناقضة العظم. بعد تمايز ناقضة العظم ، تتميز الخلايا الآكلة للعظم بتلطيخ TRAP بالتزامن مع بقعة نووية خضراء ميثيل. لوحظت الخلايا الآكلة للعظم على أنها متعددة النوى ، TRAP + متعددة النوى. يمكن دعم تحديدهم بشكل أكبر من خلال تلطيخ Cathepsin K. تسمح مقايسات ارتشاف العظام والمعادن بالتوصيف الوظيفي ، مما يؤكد هوية الخلايا الآكلة للعظم حسنة النية. يوضح هذا البروتوكول طريقة قوية ومتعددة الاستخدامات للتمييز بين الخلايا الآكلة للأخطاء البشرية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية ويسمح باعتمادها بسهولة في التطبيقات التي تتطلب كميات كبيرة من ناقضات العظم البشرية الوظيفية. يمكن تصور التطبيقات في مجالات أبحاث العظام وأبحاث السرطان وهندسة الأنسجة وأبحاث الأطراف الاصطناعية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الآكلة للعظم (OCs) هي مشتقة من المكونة للدم 1,2 ، وأنواع خلايا متعددة الاستخدامات يشيع استخدامها من قبل الباحثين في مجالات مثل أبحاث أمراض العظام 3,4 ، وأبحاث السرطان 5,6 ، وهندسة الأنسجة 7,8 ، وأبحاث الأطراف الاصطناعية 9,10. ومع ذلك ، يمكن أن يكون تمايز OC أمرا صعبا لأن اندماج السلائف أحادية النواة في OCs متعددة النوى ضروري لإنشاء OCsوظيفية 11. العديد من العوامل البيولوجية ، مثل منشط مستقبلات NF-κB ligand (RANKL) وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ، ضرورية لتمايز OC. تم الإبلاغ عن أن M-CSF له تأثير إيجابي على تكاثر الخلايا وبقاء الخلايا وتعبير RANK12،13،14. من ناحية أخرى ، يرتبط RANKL ب RANK ، الذي ينشط شلالات الإشارات النهائية التي تحفز تكوين العظم. يتم التوسط في التنشيط عبر العامل المرتبط بمستقبلات TNF 6 (TRAF6) ، مما يؤدي إلى تدهور العامل النووي لمحسن جين كابا الببتيد الضوئي في مثبط الخلايا البائية ، ألفا (IκB-α) ، وهو بروتين ملزم يربط ثنائيات NF-kB16,17. ومن ثم ، فإن تحلل IκB-α يطلق ثنائيات NF-kB ، والتي تنتقل بعد ذلك إلى النواة وتحفز التعبير عن عوامل النسخ c-Fos والعامل النووي للخلايا التائية المنشطة 1 (NFATc1). وهذا بدوره يؤدي إلى نسخ العديد من البروتينات المرتبطة بالتمايز OC15,18. تتوسط البروتينات غير المنظمة مثل DC-Stamp و Atp6v0d2 اندماج الخلايا الخلوية لسلائف OC ، مما يؤدي إلى تكوين الخلايا المخلوية19،20،21.

فيما يتعلق بالخلايا الأولية البشرية ، تعد CD34 + و CD14 + PBMCs حاليا أكثر أنواع الخلايا استخداما للتمايز إلى OCs22. ومع ذلك ، فإن هذا النهج محدود بسبب عدم التجانس داخل مجموعة CD34 + للخلايا المحصودة من المتبرعين23 وقابليتها المحدودة للتوسع. تقدم iPSCs البشرية مصدرا بديلا ل OCs. نظرا لأنه يمكن نشرها إلى أجل غير مسمى24 ، فإنها تسمح بالتوسع ورفع مستوى إنتاج OC. هذا يسمح بتمييز أعداد كبيرة من OCs ، مما يسهل أبحاث OC.

تم نشر العديد من البروتوكولات للتمييز بين iPSCs إلى OCs25،26،27. يمكن تقسيم عملية التمايز بأكملها إلى جزء انتشار iPSC ، وجزء تمايز الأديم المتوسط والمكونة للدم ، وتمايز OC. يسمح انتشار iPSCs قبل عملية التمايز برفع مستوى إنتاج OC قبل التمايز. توجد عدة طرق فيما يتعلق بالتمايز بين الأديم المتوسط والمكونة للدم. تقليديا ، تم استخدام تكوين الجسم الجنيني (EB) للتمييز بين الخلايا المكونة للدم ، لكن الأساليب القائمة على أحادية الطبقة تمثل استراتيجية تمايز أخرى مكونة للدم لا تتطلب تحريض EB. ومع ذلك ، يبدو أن الأنظمة القائمة على الطبقة الواحدة تتطلب مزيدا من التحسين ، حيث وجدنا نحن وآخرون أن الأساليب القائمة على EB أكثر قوة للتمييز بين OCs.

هنا ، نصف تمايز OCs عن iPSCs البشرية باستخدام بروتوكول قائم على EB. تم تكييف هذا البروتوكول من Rössler et al.26 وتعديله لزيادة المتانة والسماح بالحفظ بالتبريد أثناء عملية التمايز. أولا ، حصدنا الخلايا المكونة للدم مرة واحدة فقط بعد 10 أيام من التمايز. ثم تم حفظ الخلايا المكونة للدم بالتبريد للسماح بمزيد من المرونة أثناء عملية التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بزيادة كثافة بذر الخلايا المكونة للدم من 1 × 105 إلى 2 × 105 خلايا / سم2 لتمايز OC. تم استخدام وسط بشري أحدث خال من مصل iPSC (hiPSC-SFM ، انظر جدول المواد) ، وتم طلاء الآبار ب 200-300 ميكروغرام / مل من مستخلص الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) بدلا من 0.1٪ جيلاتين. لم تتم إضافة البنسلين / الستربتومايسين إلى وسائل الإعلام.

تم تكييف بروتوكول Rössler et al.26 في الأصل من iPSC إلى بروتوكول تمايز البلاعم28 الذي يستخدم تكوين EB للتمايز المكونة للدم. بينما تم استخدام تكوين EB لفترة طويلة من قبل الباحثين للتمايز المكونة للدم29،30 ، تم وصف العديد من طرق تحريض EB في الأدبيات ، مثل التجميع التلقائي ، والطرد المركزي في صفيحة بئر مستديرة القاع ، وثقافة قطرة معلقة ، وثقافة المفاعل الحيوي ، وثقافة الأنبوب المخروطي ، والوعاء الجانبي البطيء الدوران ، وثقافة هلام micromold31. يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي ل iPSCs المنفصلة في لوحة بئر مستديرة القاع لتقريب خلايا iPSC المفردة من بعضها البعض وللسماح بتكوين الكرة (EB) ، كما هو موضح أدناه.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يمكن العثور على جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. ما لم ينص على خلاف ذلك ، تمت موازنة جميع الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 37 درجة مئوية وباستخدام أبطأ وضع تسارع / تباطؤ. ما لم ينص على خلاف ذلك ، تتم إزالة المادة الطافية دائما باستخدام ماصات باستور الزجاجية التي تستخدم لمرة واحدة.

1. إذابة وانتشار iPSCs البشرية

  1. قبل يوم واحد من إذابة iPSCs ، قم بتغطية بئر من صفيحة 6 آبار ب 1 مل من مستخلص الغشاء القاعدي بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. ضع صفيحة البئر على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. في اليوم التالي ، قم بإذابة الخلايا ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة P1000. بالتنقيط ، أضف 5-7 مل من DMEM / F-12 مع 15 مللي متر HEPES.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الخلايا برفق من جهاز الطرد المركزي ، وتأكد من عدم إزعاج حبيبات الخلية.
  4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة زجاجية باستور وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الخالي من مصل hiPSC (hiPSC-SFM الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من مثبط Rho kinase (ROCK) Y-27632) باستخدام P1000 مع أطراف تجويف عريضة.
  5. نضح مستخلص الغشاء القاعدي من البئر المطلي في اليوم السابق (الخطوة 1.1) ونقل 1 مل من hiPSC-SFM مع 10 ميكرومتر Y-27632 إلى البئر. أضف iPSCs المعاد تعليقها إلى البئر للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 2 مل لكل بئر.
  6. قم بتدوير اللوحة لتوزيع مجاميع iPSC بالتساوي قبل وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. قم بإجراء تغييرات متوسطة كاملة كل يوم باستخدام hiPSC-SFM (بدون إضافة مثبط ROCK Y-27632). عادة ما تصل iPSCs إلى التقاء 70-80٪ بعد 3-4 أيام من الانتشار.

2. تمرير iPSCs

  1. قبل يوم واحد من تمرير iPSCs ، قم بتغطية آبار صفيحة 6 آبار بمستخلص غشاء قاعدي بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. ضع صفيحة البئر على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: تأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى التقاء 70-80٪ تقريبا. تأكد من عدم فرط التلاقى بين iPSCs (أكثر من 80٪ من التقارب) ، لأن هذا سيعزز التمايز التلقائي.
  2. ابدأ في تمرير iPSCs عن طريق إزالة المناطق أو المناطق المتمايزة التي تحتوي على العديد من مجاميع iPSC الميتة تحت المجهر المجسم باستخدام أطراف ماصة 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر أو مكشطة خلوية. ستظهر المناطق المتباينة أكثر كثافة أو بياضا في اللون.
    ملاحظة: قد تظل مجاميع الخلايا المكشطة متصلة جزئيا بقاع البئر.
  3. اغسل قاع البئر عدة مرات باستخدام ماصة P1000 ذات تجويف عريض لإزالة أي ركام قد لا يزال متصلا جزئيا بقاع البئر.
  4. تخلص من الوسط المستهلك الذي تمت فيه زراعة iPSCs والذي يحتوي على مجاميع iPSC المنفصلة. كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  5. بعد ذلك ، أضف 1 مل من 5 U / mL Dispase لكل بئر. سوف ترتفع حواف مستعمرات iPSC من لوحة البئر ، والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر المجسم بعد 3-5 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بإزالة Dispase بعناية لتجنب إزاحة الركام المنفصل قليلا وأضف 1 مل من DMEM / F-12 مع 15 mM HEPES. استخدم رافع الخلايا القابل للتصرف لتقطيع الركام إلى أحجام صغيرة. يمكن تحسين اتساق أحجام مجاميع iPSC باستخدام أداة تمرير الخلايا الجذعية.
  7. اغسل شرائح iPSC مع الوسط في البئر وانقل الوسط مع الركام إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل أو P1000 بطرف تجويف عريض.
  8. اشطف البئر باستخدام DMEM / F-12 وانقل الوسط إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ركام iPSC.
  9. أجهزة الطرد المركزي مجاميع iPSC المقطعة عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة زجاجية باستور وأضف 2 مل من hiPSC-SFM لإزاحة وإعادة تعليق iPSCs باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل أو P1000 مع أطراف تجويف عريضة.
  10. نضح مستخلص الغشاء القاعدي المتبقي من لوحة (لوحات) البئر المطلية مسبقا وأضف 1 مل من hiPSC-SFM إلى كل بئر من لوحة 6 آبار.
  11. انقل iPSCs إلى آبار جديدة من لوحة ذات 6 آبار بحيث يكون الحجم النهائي 2 مل من hiPSC-SFM لكل بئر باستخدام P1000 مع أطراف تجويف عريضة. اعتمادا على خط iPSC ، يجب تحسين نسب الانقسام. هنا ، تم استخدام نسبة تقسيم 1: 6.
  12. افحص البئر بحثا عن الركام العائم وحجم الركام تحت المجهر المجسم. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الحجم الكلي بين 50-200 ميكرومتر.
  13. قم بتدوير صفيحة البئر لتوزيع الخلايا بالتساوي عبر اللوحة بعد نقل الركام واحتضانها عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2 حتى التقاء 70-80٪.

3. تجميد iPSCs مرة أخرى

  1. لتجميد خلايا iPSC مرة أخرى ، تمر الخلايا كما هو موضح أعلاه (انظر خطوة البروتوكول "2. تمرير iPSCs"). بعد تقطيع الخلايا إلى مستعمرات وغسلها من قاع البئر (الخطوة 2.10) ، قم بتدوير الركام المقطع إلى أسفل عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. نضح الطاف.
  2. أضف 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد الخالي من المصل لكل بئر من صفيحة 6 آبار إلى أنبوب 15 مل وأعد تعليق الركام المقطع باستخدام P1000 بطرف تجويف عريض.
  3. نقل الخلايا إلى أنابيب التبريد المسمى مسبقا. أغلق الأنابيب وأنابيب النقل في حاوية الحفظ بالتبريد المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية. قم بتخزين الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
  4. نقل cryovials إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: يوضح الشكل 1 ملخصا تخطيطيا لعملية تمايز OC.

4. تحريض الجسم الجنيني

  1. زراعة وتوسيع ما يكفي من iPSCs كما هو موضح أعلاه لتحريض EB.
    ملاحظة: يمكن زيادة إنتاج OC عن طريق زيادة عدد الأجسام الجنينية ، والتي بدورها تنتج إنتاجية أعلى بشكل عام من الخلايا المكونة للدم. ينتج بئر واحد من 70-80٪ من iPSCs المتقاربة ما يقرب من 8.4 × 105 خلايا لكل بئر من بئر 6 آبار. هناك حاجة إلى 12500 iPSCs أحادية الخلية لتشكيل جسم جنيني واحد.
  2. استنشاق الوسيط المستهلك من ثقافات iPSC وشطف مستعمرات iPSC باستخدام D-PBS.
  3. أضف 0.5 مل من كاشف تفكك الخلية أحادي الخلية المسخن مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار وقم بتدوير وعاء الاستزراع لتغطية سطح البئر بالكامل. احتضان وعاء الاستزراع على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق.
  4. قم بإزالة الوعاء من الحاضنة ، واستنشق كاشف تفكك الخلية المفردة ، وأضف 1 مل من وسط تمايز المرحلة 1 إلى الآبار ، والذي يتكون من وسط خال من مصل hiPSC مع 50 نانوغرام / مل بروتين مورفوجيني للعظام البشرية 4 (hBMP4) ، 50 نانوغرام / مل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية -165 (hVEGF) ، 20 نانوغرام / مل عامل الخلايا الجذعية البشرية (hSCF) ، و 10 ميكرومتر Y-27632.
  5. افصل الخلايا برفق عن طريق شطف البئر بوسط المرحلة 1. تجمع فصل iPSCs في أنبوب مخروطي 15 مل.
  6. أضف 1 مل من وسط تمايز المرحلة 1 إلى الآبار واغسل أي خلايا متبقية أو استخدم مكشطة الخلايا للمستعمرات التي لا تغسل بسهولة.
  7. بعد نقل جميع الخلايا إلى الأنبوب ، يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتشكيل حبيبات خلوية. نضح الخلايا وإعادة تعليقها في إجمالي 2 مل من وسط التمايز المتوازن مسبقا من المرحلة 1 باستخدام ماصة مصلية 5 مل أو P1000 مع طرف تجويف عريض.
  8. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو جهاز عد الخلايا الآلي. أضف الوسط إلى الأنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية الواحدة إلى لوحة 12500 خلية لكل بئر في لوحة 96 بئر ذات قاع دائري منخفض للغاية في 100 ميكرولتر من وسط التمايز من المرحلة 1.
    ملاحظة: تحت المجهر ، ستظهر الخلايا كتعليق خلية واحدة مع خلايا منتشرة في جميع أنحاء البئر.
  9. أجهزة الطرد المركزي لوحات 96 بئر لمدة 3 دقائق في 100 × غرام. بعد الطرد المركزي ، يجب أن تبدأ الخلايا في تشبه الأجسام الكروية عند عرضها تحت المجهر. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  10. قم بتغيير نصف الوسيط في اليوم 1 واليوم 2 باستخدام وسيط تمايز المرحلة 1. لتحسين الكفاءة ، استخدم ماصة متعددة القنوات للتخلص من 50 ميكرولتر من وسيط تمايز المرحلة 1 المستهلك في طبق بتري.
  11. بعد التخلص من الوسط من لوحة 96 بئرا ، تحقق من وجود EBs تحت المجهر المجسم الذي ربما تمت إزالته عن طريق الخطأ. انقل EBs التي تمت إزالتها عن طريق الخطأ إلى لوحة 96 بئرا باستخدام ماصة P1000 مع أطراف تجويف عريضة.
  12. أضف 50 ميكرولتر من وسط التمايز الطازج من المرحلة 1 إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا ذات قاع دائري منخفض للغاية باستخدام ماصة متعددة القنوات.

5. تمايز المكونة للدم

  1. قبل يوم واحد من بدء التمايز المكونة للدم ، قم بتغطية بئر من صفيحة 6 آبار ب 1 مل من مستخلص الغشاء القاعدي بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. ضع صفيحة البئر على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: سيتلقى كل بئر 8 EBs في وقت لاحق من هذا البروتوكول. اعتمادا على عدد EBs المعدة ، قم بتغطية الآبار في المقابل.
  2. نضح مستخلص الغشاء القاعدي الزائد وملء الآبار مسبقا للوحة المكونة من 6 آبار ب 3 مل من وسط التمايز من المرحلة 2 ، والذي يتكون من وسط قاعدي مكون للدم يضاف إليه 2 mM Ultraglutamine ، و 55 μM 2-mercaptoethanol ، و 25 ng / mL interleukin 3 (hIL-3) ، و 100 ng / mL عامل تحفيز مستعمرة البلاعم البشرية (hM-CSF).
  3. باستخدام P1000 مع أطراف تجويف عريضة ، انقل 8 EBs إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار. بعد النقل ، تأكد بالعين أو تحت المجهر المجسم من وجود 8 EBs في كل بئر.
    ملاحظة: بعد يوم 1 ، سوف تلتزم EBs العائمة بقاع البئر. في الأيام 5-7 التالية ، يجب أن تصبح مجموعة الخلايا العائمة التي تضم خلايا المكونة للدم مرئية. يمكن أن تختلف فترة تمايز المكونة للدم ، بدءا من 7 أيام. أظهر التمايز لمدة 10 أيام مجموعة مكونة للدم تتكون من مجموعات فرعية كبيرة من CD45 + و CD14 + و CD11b + .
  4. بعد 5 أيام من العلاج بوسط التمايز من المرحلة 2 ، قم بإجراء تغيير متوسط عن طريق إزالة الوسط المستهلك وتوزيعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ماصة ببطء لمحاولة إزالة أقل قدر ممكن من الخلايا العائمة والحفاظ على إجهاد القص عند أدنى مستوى ممكن. يمكن أن يساعد السحب تحت المجهر المجسم في تجنب الإزالة العرضية للخلايا.
  5. أضف على الفور 1 مل من وسط التمايز الطازج من المرحلة 2 إلى الآبار. من أجل استعادة أي خلايا مكونة للدم عائمة قد تكون موجودة بالفعل في هذه المرحلة من عملية التمايز ، لا تتخلص من الوسط المستغنى. بدلا من ذلك ، قم بتدوير الأنبوب باستخدام الوسيط المستهلك عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
  6. أضف وسيط تمايز جديد من المرحلة 2 إلى الأنبوب وأعد تعليقه لفصل الخلايا التي ربما تم نقلها باستخدام الوسط المستهلك.
  7. أضف 2 مل من وسط التمايز الجديد للمرحلة 2 مع الخلايا المستردة في كل بئر ، والذي كان مملوءا مسبقا ب 1 مل من وسط تمايز المرحلة 2.
  8. في اليوم 10 من تمايز المكونة للدم ، تحقق من وجود أعداد كبيرة من الخلايا المكونة للدم العائمة. الحصاد عن طريق جمعها في أنبوب 50 مل. يمكن تجميدها مرة أخرى في 10٪ DMSO و 50٪ FBS و 40٪ متوسطة أو استخدامها على الفور لتمييز الخلايا إلى OCs.

6. نضج M-CSF وتمايز OC

  1. خلايا البذور بتركيز 200000 خلية / سم2 على زراعة الأنسجة تعامل بشكل جيد مع لوحات وتعالج مع alpha-MEM ، مع استكمال 10 ٪ FBS و 50 نانوغرام / مل hM-CSF.
  2. لإجراء فحوصات وظيفية أو تصوير ، افصل الخلايا الناضجة M-CSF بعد 3 أيام من البذر عن طريق الغسيل باستخدام PBS المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية باستخدام P1000 بطرف تجويف عريض. قد تكون هناك حاجة إلى خطوات غسيل متكررة لفصل الخلايا بالكامل.
  3. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام P1000 بطرف تجويف عريض وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  4. إعادة تعليق وإذابة حبيبات الخلية باستخدام وسيط تمايز OC ، الذي يتكون من alpha-MEM المكمل ب 10٪ FBS و 50 نانوغرام / مل hM-CSF و 80 نانوغرام / مل hRANKL. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو جهاز عد الخلايا الآلي وأعد زرع الخلايا الناضجة M-CSF بكثافة 200,00-250,000 خلية / سم2 في أداة استزراع مناسبة للمقايسات الوظيفية أو التصوير (على سبيل المثال ، مقايسات ارتشاف العظام ، شرائح الغطاء للتصوير ، إلخ).
  5. التفريق مع وسيط تمايز OC لمدة 7-9 أيام. قم بإجراء تغيير متوسط بئر كامل باستخدام وسيط تمايز OC الطازج كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: تظهر OCs متعددة النوى عادة بعد 5-7 أيام.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مراقبة مورفولوجيا الخلية طوال عملية التمايز
تم إنشاء جميع النتائج الموضحة أدناه باستخدام خط MCND-TENS2 iPSC لتمايز OC. تم استخدام خط iPSC هذا سابقا في العديد من الدراسات 32,33. ومع ذلك ، تم أيضا استخدام خطوط iPSC الأخرى بنجاح مع بروتوكول التمايز هذا.

يكشف التقييم البصري المنتظم عن خصائص مورفولوجية مختلفة ومميزة ل iPSCs طوال عملية التمايز مع OCs (الشكل 2). تم فصل مستعمرات iPSC (الشكل 2A) إلى تعليق أحادي الخلية ، والذي يظهر كخلايا فردية في جميع أنحاء لوحة البئر السفلية المستديرة قبل الطرد المركزي (الشكل 2B). بعد الطرد المركزي (الخطوة 4.9 في البروتوكول) ، ستتجمع الخلايا في وسط صفيحة بئر المرفقة المنخفضة للغاية ذات القاع المستدير وتشكل بعد ذلك كرات (أجسام جنينية ، EBs ، الشكل 2C). سيزداد حجم EBs مرتين إلى ثلاث مرات طوال عملية تمايز الأديم المتوسط (الشكل 2D) ويصبح مرئيا بسهولة للعين في نهاية فترة التمايز التي تبلغ 4 أيام (الشكل 2E). يمكن رؤية EBs تلتصق وتندمج مع قاع صفيحة البئر بعد نقلها إلى آبار صفيحة مكونة من 6 آبار للتمايز المكونة للدم (الخطوة 5.3 في البروتوكول ، الشكل 2F). بعد 7-8 أيام ، تصبح كميات كبيرة من الخلايا المكونة للدم العائمة مرئية في وسط الاستزراع (الشكل 2G). بعد حصاد الخلايا المكونة للدم وإعادة طلائها ، تتبع مرحلة نضج M-CSF ، ويبدأ تمايز OC (الخطوة 6.4 في البروتوكول). في غضون 5-6 أيام ، تصبح الخلايا متعددة النوى ذات جسم الخلية الشفاف الكبير مرئية أولا (الشكل 2H). لا يزال عدد كبير من الخلايا أحادية النواة مرئيا في هذه المرحلة. بعد 2-3 أيام أخرى من تمايز OC ، سوف تندمج OCs مع الخلايا المجاورة لتشكيل polykarions كبيرة مع المزيد من النوى (الشكل 2I).

تقييم السكان المكونة للدم المشتقة من EB
يمكن إجراء التمايز المكونة للدم لفترة زمنية متغيرة. تم وصف الفترات الزمنية التي تبدأ من 7 أيام حتى 9 أسابيع في الأدبيات. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء تمايز المكونة للدم لمدة 10 أيام. وجدنا أن 10 أيام من التمايز المكونة للدم أسفرت عن أعداد منخفضة من CD34 + المبكر (0.53٪ ، الشكل 3A) وعدد أكبر من أسلاف المكونة للدم في المرحلة المتوسطة CD43 + (48.5٪ ، الشكل 3B). والأهم من ذلك ، تم إنشاء كميات كافية من CD45 + (96.2٪ ، الشكل 3C) و CD14 + (33٪ ، الشكل 3D) و CD11b + (35.9٪ ، الشكل 3E) HPCs بعد فترة علاج مدتها 10 أيام لتمييزها بنجاح إلى OCs. ومع ذلك ، قد تحتاج فترة علاج السيتوكين للتمايز المكونة للدم (الخطوة 5.4 في البروتوكول) إلى تعديلها وتحسينها بناء على خط iPSC لتوليد كميات كافية من خلايا CD45 + و CD14 + و CD11b + .

في المتوسط ، تم حصاد 6 ملايين خلية مكونة للدم بعد 10 أيام من التمايز عن كل بئر مع 8 EBs.

تقييم مورفولوجيا OC ونشاطها
بعد تمايز OC ، يمكن تقييم OCs شكليا ووظيفيا. يتم إعادة زرع سلائف OC على شرائح الغرفة أو شرائح الغطاء بعد خطوة نضج M-CSF لتحسين جودة الصورة عند تلطيخ TRAP أو Cathepsin K. يظهر تلطيخ TRAP الأنزيمي بعد تمايز OC OCs كبيرة ومتعددة النوى وموجبة ل TRAP (الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن رؤية الخلايا أحادية النواة الإيجابية قليلا ل TRAP تتخللها بين OCs متعددة النواة. لا تعرض عناصر التحكم السلبية بدون إضافة RANKL OC متعدد النوى المنصهر. ومع ذلك ، يمكن تصوير عدد صغير من الخلايا أحادية النواة الإيجابية قليلا ل TRAP (الشكل 4B).

تظهر صور مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) OCs ملطخة ب Cathepsin K (الفيروز) و F-actin (الأحمر) بالتزامن مع صبغة DAPI النووية (الأزرق) (الشكل 4C ، 4D). يمكن رؤية OCs الكبيرة متعددة النواة عند معالجتها باستخدام RANKL وفقا للبروتوكول ، والذي يصور بنية هيكلية خلوية واسعة النطاق F-actin وبقع إيجابية ل Cathepsin K (الشكل 4C). من ناحية أخرى ، لا تظهر الضوابط السلبية بدون إضافة RANKL خلايا متعددة النواة منصهرة.

يمكن تقييم OCs وظيفيا عن طريق قياس نشاط الارتشاف. يمكن استخدام مقايسات ارتشاف العظام أو المعادن لتحديد نشاط الارتشاف. هنا ، تم زرع سلائف OC على الآبار المغلفة بفوسفات الكالسيوم وتمييزها نهائيا. تظهر المساحات الكبيرة التي تم فيها امتصاص الطلاء المعدني بلون رمادي مزرق (الشكل 4E). يمكن تحديد حفر الارتشاف بأحجام مختلفة. غير ممتص ، طلاء فوسفات الكالسيوم المتبقي مرئي باللون البني. يؤكد وجود حفر الارتشاف هوية الخلايا متعددة النوى المتمايزة على أنها OCs. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس حفر الارتشاف من أجل تقييم ومقارنة نشاط الارتشاف. يمكن تحديد المساحة الإجمالية للمعادن المعاد امتصاصها على إجمالي مساحة سطح البئر كمقياس للنسبة المئوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد حجم وعدد حفر الارتشاف. لم تعرض الضوابط السلبية غير المعالجة حفر ارتشاف (الشكل 4F).

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لعملية تمايز ناقضة العظم عن iPSCs البشرية. رسم توضيحي من قبل هانا بلومكي باستخدام مصمم التقارب 2.1.1. يستخدم الرسم التوضيحي الرسومات المستخدمة سابقا33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الصور المجهرية خلال عملية تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية نحو الخلايا الآكلة للأسترول العظمي. (أ) مستعمرات iPSC غير المتمايزة طوال فترة الانتشار. (ب) iPSCs في الآبار القاعية المستديرة بعد تفككها إلى معلق خلية واحدة قبل الطرد المركزي. (ج) iPSCs أحادية الخلية المجمعة مركزيا بعد الطرد المركزي. (د) ينمو حجم EBs طوال فترة تمايز الأديم المتوسط التي تبلغ 4 أيام. ه: الأجسام الجنينية المرئية بعد تمايز الأديم المتوسط. (F) بعد نقل الأجسام الجنينية إلى صفائح 6 آبار مغلفة بمستخلص الغشاء القاعدي ، يمكن رؤية الأجسام الجنينية تلتصق وتندمج مع قاع البئر. (ز) بعد 5-7 أيام من تمايز المكونة للدم ، يمكن ملاحظة عدد كبير من الخلايا المكونة للدم العائمة في الوسط. (H) بعد نضوج M-CSF ، تظهر الخلايا الآكلة للعظم الأولى مع 3-4 نوى بعد 5-7 أيام من التمايز مع RANKL. (I) في نهاية تمايز ناقضة العظم، يمكن ملاحظة خلايا كبيرة متعددة النوى. قضبان المقياس: A ، D ، F ، G = 200 ميكرومتر ، B ، C ، H ، I = 50 ميكرومتر ، E = 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل الواسمات السطحية للخلايا المكونة للدم المشتقة من الجسم الجنيني باستخدام قياس التدفق الخلوي. يسمح تعبير العلامة بتحليل الخلايا المكونة للدم وتحديد المجموعات الفرعية بعد بوابات المفردات والخلايا الحية. (أ) عدد الخلايا السلفية المكونة للدم CD34+ المبكرة وراثيا قليل جدا إلى غائب بالتزامن مع هذا البروتوكول. (ب) تشكل خلايا CD43+ حوالي 50٪ من إجمالي السكان. (ج) المرحلة اللاحقة من الخلايا السلفية المكونة للدم CD45 + تشكل الجزء الأكبر من السكان المكونة للدم بنسبة 96.2٪. (د، ه) تشكل سلائف CD14 + و CD11b + OC المباشرة 33٪ و 36٪ على التوالي. باللون الأحمر: التحكم السلبي غير الملوث ، باللون الأزرق: ضوابط النمط المتماثل ، باللون الأصفر: الخلايا الملطخة بالجسم المضاد للعلامة المعنية. تستخدم المؤامرات البيانات المنشورة مسبقا33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التقييم المورفولوجي والوظيفي لناقضات العظم البشرية المتمايزة iPSC. (أ) يظهر تلطيخ TRAP بعد تمايز ناقضات الآكلة للعظم ناقضة العظم الكبيرة متعددة النوى والإيجابية ل TRAP. يمكن رؤية خلايا أحادية النواة إيجابية قليلا من TRAP تتخللها بين الخلايا الآكلة للعظم متعددة النواة. (ب) الضوابط السلبية دون إضافة RANKL الملطخة ل TRAP لا تعرض ناقضات عظمية متعددة النوى منصهرة. ومع ذلك ، يمكن تصوير عدد صغير من الخلايا أحادية النواة الإيجابية قليلا من TRAP. (C) تظهر صور الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر للخلايا المكونة للدم المتمايزة لآكلة العظم على شريحة غطاء ملطخة ب F-actin (أحمر) و Cathepsin K (فيروزي) بالتزامن مع صبغة DAPI النووية (زرقاء) ناقضات عظمية كبيرة متعددة النوى من Cathepsin K. (د) تظهر عناصر التحكم السالبة بدون إضافة RANKL مشابهة للخلايا أحادية النواة (B) عند كثافة خلية أقل. (ه) يمكن إجراء التقييم الوظيفي من خلال تقييم نشاط ارتشاف الخلايا الآكلة للعظم. لهذا ، يتم إجراء تمايز ناقضة العظم على مقايسة ارتشاف العظام أو المعادن. تصور صور الآبار المبلطة التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر واسع المجال مقلوب في وضع تباين الطور مناطق ارتشاف كبيرة للطبقة المعدنية لفوسفات الكالسيوم. يمكن قياس النشاط الامتصاصي بشكل أكبر عن طريق قياس مساحة الارتشاف على المساحة الكلية. (F) لا تظهر عناصر التحكم السلبية بدون إضافة RANKL مناطق الارتشاف. قضبان المقياس: A ، B = 100 ميكرومتر ، C ، D = 50 ميكرومتر ، E ، F = 1 مم. تم تحرير الصور من البيانات المنشورة سابقا33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة وقوية للتمييز بين iPSCs إلى OCs. ومع ذلك ، هناك العديد من المزالق التي يمكن مواجهتها خلال عملية التمايز. تم تمييز خطوط iPSC البشرية المتولدة من خلايا من أصول أنسجة مختلفة بنجاح باستخدام هذا البروتوكول33. عند تجميد iPSCs مرة أخرى (انظر خطوة البروتوكول "3. تجميد iPSCs مرة أخرى") ، تم تجميد بئر واحد عند نقطة المرور مرة أخرى في cryovial واحد. عند ذوبان الجليد (انظر خطوة البروتوكول "1. ذوبان وانتشار iPSCs البشرية") ، تم إذابة أحد المبردات في بئر واحد من صفيحة 6 آبار. ستتصرف خطوط iPSC المختلفة بشكل مختلف قليلا ، وستختلف معدلات الانتشار. يجب تعديل معدل الانقسام في المقابل.

عند تمرير iPSCs أو فصل iPSCs إلى تعليق أحادي الخلية لتحريض EB ، من المهم إزالة أي مستعمرات متمايزة تلقائيا أو تجمعات من الخلايا الميتة لتحسين فعالية وكفاءة تمايز الأديم المتوسط والمكونة للدم. يمكن القيام بذلك تحت المجهر المجسم باستخدام مكشطة الخلايا ، أو أطراف الماصة من ماصة P10 أو P20 ، أو أداة كشط مبنية من ماصة باستور35.

كما ذكر أعلاه ، يتضمن هذا البروتوكول تفكك مستعمرات iPSC إلى تعليق أحادي الخلية لتحريض EB ، بينما مع البروتوكولات الأخرى ، يتم ترك iPSCs كمجاميع ليتم طردها مركزيا لتحريض EB36. تم الإبلاغ عن حجم EB ورقم الخلية والشكل والتشكل للتأثير على التمايز37،38،39. وبالتالي ، فإننا نفترض أن التفكك إلى تعليق أحادي الخلية يسمح بتوحيد أفضل من EB-to-EB في الحجم والشكل بعد الطرد المركزي ، وبالتالي ، نتائج أكثر اتساقا لإنتاج الخلايا المكونة للدم31.

تم وصف طرق أخرى لتحريض EB. تم الإبلاغ عن أن هذه الطرق التي تستخدم معلقا أحادي الخلية جنبا إلى جنب مع مثبط ROCK لتحسين بقاء الخلية مفيدة في التحكم في حجم EB ونتائج التمايز31.

طريقة تحريض EB ذات القاع المستدير 96 بئرا الموصوفة في هذا البروتوكول مناسبة للإنتاج على نطاق واسع من EBs وتسمح برفع مستوى إنتاج OC. تم مؤخرا وصف طرق أكثر حداثة للتمايز المكونة للدم دون خطوة تحريض الجسم الجنيني مع إمكانية تسهيل عملية التمايز32. ومع ذلك ، لم يتم بعد إنشاء هذه البروتوكولات لتمايز OC33.

في البروتوكول المذكور أعلاه ، نصف التغيير المتوسط في اليوم 5 من تمايز المكونة للدم. قد يظهر عدد صغير من الخلايا العائمة بالفعل في حوالي اليوم 4-5 من التمايز. من أجل تجنب التخلص من أي خلايا عائمة ، يجب جمع الوسط في أنبوب وطرده مركزيا قبل التخلص منه. يجب بعد ذلك إزاحة حبيبات الخلية الموجودة في قاع الأنبوب بالوسط الطازج ويجب نقلها مرة أخرى إلى آبار صفيحة 6 آبار. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى تحديد أهمية مجموعة الخلايا العائمة المبكرة في تمايز OC.

يمكن تقييم إنتاج الخلايا المكونة للدم باستخدام قياس التدفق الخلوي. الغلة العالية لخلايا CD45 + و CD14 + و CD11b + مرغوبة لتمايز ناقضات العظم33. تم الإبلاغ عن أن الحفظ بالتبريد للخلايا المكونة للدم العائمة المحصودة يمثل تحديا مع معدلات استرداد محدودة بشكل عام وقابلية منخفضة لبقاء الخلية40,41. من خلال الخلايا المكونة للدم الحافظة بالتبريد في وسط الحفظ بالتبريد الذي يتكون من 50٪ من وسط تمدد الخلايا المكونة للدم الخالي من المصل (انظر جدول المواد) ، و 40٪ FBS و 10٪ DMSO ، تمكنا من استعادة الخلايا ذات صلاحية الخلية بنسبة 90.3٪ تقريبا ± 2.62 SD (n = 7) بعد الذوبان.

يتطلب تكوين الخلايا العظمية اندماج سلائف OC أحادية النواة متعددة لتشكيل ناقضات عظمية متعددة النوى قادرة على ارتشاف المعادن والعظام. في حين أن خطوط خلايا سلائف OC للفئران تحتاج ببساطة إلى إضافة RANKL للحث على تكوين OC42 ، فإن السلائف البشرية تتطلب M-CSF إضافية لبقاء الخلايا وتكاثرها43. تم اكتشاف OSCAR مؤخرا كمستقبل إضافي يشارك في تمايز OC ، على الرغم من أنه تم تحديد الكولاجين من النوع الأول فقط حتى الآن على أنه رباط. في حين أن البحث عن OSCAR مع OCs المشتقة من iPSC لا يزال محدودا ، يبدو أن تركيزات RANKL و M-CSF فوق الفسيولوجية في المختبر في خط خلايا الفئران تتجاوز ضرورة تنشيط OSCAR44 ، يبدو أن تنشيط OSCAR في الجسم الحي هو إشارة مكلفة ضرورية لتكوين العظم45. عامل إضافي يجب مراعاته هو سطح لوحة البئر. من المعروف أن الخصائص الكيميائية46 والفيزيائية47 تؤثر على تمايز ناقضة العظم ويمكن أن تعزز أو تعيق التمايز الناجح. كما يبدو أن عدم التجانس المعين داخل مجموعة السلائف أمر بالغ الأهمية لنجاح اندماج OCs ، حيث تعمل العوامل المختلفة المرتبطة بالانصهار مثل CD47 و DC-STAMP في مراحل مختلفة من اندماج ناقضة العظم48.

في الختام ، يتيح هذا البروتوكول التمييز بين OC البشري و iPSCs لتسهيل وتسريع أبحاث OC.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر Giachelli على مساعدتهم الفنية ودعمهم. نشكر مركز W. M. Keck المجهري ومدير مركز Keck ، الدكتور Nathanial Peters ، للمساعدة في الحصول على الفحص المجهري متحد البؤر والصور المجهرية واسعة المجال. كما نشكر مرفق UW Flow Core ومدير مرفق التدفق الأساسي ، Aurelio Silvestroni ، على الدعم الفني والمساعدة. أخيرا ، نشكر Hannah Blümke على الدعم في الرسم التوضيحي والتصميم الجرافيكي.

تم توفير التمويل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35 HL139602-01. نعترف أيضا بمنحة NIH S10 S10 OD016240 لتمويل الأدوات في مركز W. M. Keck بالإضافة إلى منحة NIH 1S10OD024979-01A1 لتمويل الأدوات في مرفق UW Flow الأساسي.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
الأجسام المضادة - مضاد للكاثيبسين K & nbsp ؛Abcamab19027
للإنسان CD45BD555485
- الماوس المترافق APC IgG1 ، & kappa ؛ الجسم المضاد BD555751
- BV711 مترافق ضد الإنسان CD14BD563372
- BV711 - مترافق الماوس IgG2b ، & kappa ؛ الأجسام المضادة للتحكمالنمط المتماثل BD563125
- الماعز المضادة للأرانب IgG H& L Alexa فلور & 647Abcamab150079
الأجسام المضادة - PE المترافق المضاد للإنسان CD14R & D SystemsFAB3832P-025
الأجسام المضادة - البولي إيثيلين المترافق المضاد للإنسان ألفا M / CD11bR & D SystemsFAB16991P-025
الأجسام المضادة - PE-Cy7 المترافق المضاد للإنسان CD34BD560710
الأجسام المضادة - PE-Cy7 الماوس المترافق IgG1 & kappa ؛ 557872
المتطابق - PE / Cyanine5 المترافق المضاد للإنسان CD11bBiolegend301308
- PE / Cyanine5 - الفأر المترافق IgG1 ، & kappa ؛ النمط المتماثل CtrlBiolegend400118
الجسم المضاد - PerCP-Cy5.5 الماوس المترافق IgG1 &kappa ؛ التحكم في النمط المتشاويBD550795
الأجسام المضادة - PerCpCy5.5 مترافق مضاد للإنسان CD43BD563521
مجموعة فحص ارتشاف العظامCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 عداد الخلايا الآليThermoFisher16812556
Cultrex الخلايا الجذعية المؤهلة لعامل النمو المنخفض استخراج الغشاء القاعديR & D Sytems3434-010-02مستخلص الغشاء القاعدي
DAPIR & D Systems5748/10
Dispase (5 U / mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM / F-12 مع 15 ملي مولار HEPESالخلايا الجذعية36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
بروتين مورفوجيني للعظام البشرية 4 (hBMP4)الخلية الجذعية78211
تقنياتIL-3 STEMCELL البشرية78146.1
عامل تحفيز مستعمرة البلاعم البشرية (hM-CSF)تقنيات STEMCELL78150.1
منشط المستقبلات البشرية القابلة للذوبان للعامل النووي - & كابا ؛ B Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
عامل الخلايا الجذعية البشرية (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (محلول حجب مستقبلات Fc)Biolegend422301
نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية -165 (hVEGF165) تقنياتSTEMCELL78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM & alpha ؛ ، نيوكليوسيدات ، بدون فينول أحمرThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855وسيط حفظ بالتبريد الخالي من المصل
mTeSR Plus متوسطSTEMCELL Technologies100-0276وسط بشري خال من مصل iPSC (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well ، Nunclon Sphera-Treatment ، U-Shaped-Bottom MicroplateThermo Scientific174925مرفق دائري منخفض للغاية 96 بئر
P1000 أطراف تجويفعريضة ThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650ثقافة الخلايا المكونة للدم متوسطة
TrypLE Select Enzyme (1X) ، لا يوجد فينول أحمرثيرمو فيشر12563011كاشف تفكك أحادي الخلية
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E / U1
X-VIVO 15 خلية مكونة للدم خالية من المصل متوسطةBioscience Lonza04-418Qقاعدي مكونة للدم
& micro ؛ - شريحة 8 بئر عاليةIbidi80806
الجسم المضاد - الأجسام المضادة المترافقة مع APCللتحكم في النمط المتقارن في الجسم المضاد BD للتحكم في النمط تقنيات عامل متوسط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144(2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895(2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465(2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913(2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060(2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35(2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871(2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337(2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402(2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698(2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23(2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595(2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600(2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319(2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087(2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038(2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282(2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631(2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201(2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162(2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109(2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Osteoclast DifferentiationHuman IPSCsEmbryoid Body InductionHematopoietic DifferentiationM CSF MaturationTRAP StainingCathepsin K StainingBone Resorption AssayFlow CytometryMultinucleated Osteoclasts

Related Articles