Method Article

تجميع معياري قائم على كريسبر لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF

DOI:

10.3791/66581

⸱

May 17th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا للتجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) ، وهي طريقة لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF في ذبابة الفاكهة باستخدام موارد cDNA / ORF المتاحة للجمهور. يمكن تطبيق CRISPRmass لتحرير مكتبات البلازميد المختلفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر فحص الجينوم الوظيفي نهجا قويا لفحص وظيفة الجينات ويعتمد على بناء مكتبات البلازميد على مستوى الجينوم. الأساليب التقليدية لبناء مكتبة البلازميد تستغرق وقتا طويلا وشاقة. لذلك ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة ، التجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) ، لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد على مستوى الجينوم على مستوى المنبع لتنشيط تسلسل الحمض النووي / إطار القراءة المفتوحة (UAS-cDNA / ORF). هنا ، نقدم بروتوكولا ل CRISPRmass ، مع الأخذ على سبيل المثال إنشاء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF قائمة على GAL4 / UAS. يتضمن البروتوكول تفاعلات أنبوب اختبار متوازية على نطاق واسع من خطوتين يتبعها تحول بكتيري. تتمثل الخطوة الأولى في خطي الحمض النووي التكميلي الحالي (cDNA) أو إطار القراءة المفتوح (ORF) cDNA أو بلازميدات مكتبة ORF عن طريق قطع تسلسلات متجهات المنبع المشتركة المجاورة لنهاية 5 'من cDNAs أو ORFs باستخدام CRISPR / Cas9 جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) ، والخطوة الثانية هي إدخال وحدة UAS في بلازميدات cDNA أو ORF الخطية باستخدام تفاعل خطوة واحدة. يسمح CRISPRmass ببناء بسيط وسريع وفعال وفعال من حيث التكلفة لمكتبات البلازميد المختلفة. يمكن استخدام مكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF لفحص اكتساب الوظيفة في الخلايا المستزرعة ولبناء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الفحص الجيني الكامل غير المتحيز نهجا قويا لتحديد الجينات المشاركة في عملية بيولوجية معينة وتوضيح آليتها. لذلك ، يستخدم على نطاق واسع في مختلف مجالات البحوث البيولوجية. يتم حفظ ما يقرب من 60 ٪ من جينات ذبابة الفاكهة في البشر1،2 ، و ~ 75 ٪ من جينات الأمراض البشرية لها متجانسات في ذبابة الفاكهة3. ينقسم الفحص الجيني بشكل أساسي إلى نوعين: فقدان الوظيفة (LOF) واكتساب الوظيفة (GOF). لعبت الفحوصات الجينية LOF في ذبابة الفاكهة دورا حاسما في توضيح الآليات التي تحكم كل جانب من جوانب علم الأحياء تقريبا. ومع ذلك ، فإن غالبية جينات ذبابة الفاكهة لا تحتوي على أنماط ظاهرية واضحة ل LOF4 ، وبالتالي ، فإن فحص GOF هو طريقة مهمة لدراسة وظيفة تلك الجينات 4,5.

يستخدم نظام GAL4 / UAS الثنائي بشكل شائع للتعبير الجيني الخاص بالأنسجة في ذبابة الفاكهة6. في هذا النظام ، يعبر النسيج على وجه التحديد عن منشط نسخ الخميرة GAL4 الذي يرتبط بالعنصر المستجيب GAL4 (UAS) وبالتالي ينشط نسخ المكونات الجينية النهائية (على سبيل المثال ، cDNA و ORF) 6. لإجراء شاشات GOF على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة ، نحتاج إلى إنشاء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF على مستوى الجينوم ، وبالتالي مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا في ذبابة الفاكهة.

إن بناء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF على مستوى الجينوم بالطرق التقليدية من استنساخ cDNA / ORF المتاحة للجمهور يستغرق وقتا طويلا وشاقا ، حيث يتطلب كل جين تصميمات فردية ، بما في ذلك تصميم التمهيدي والتوليف ، تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، وتنقية الهلام ، والتسلسل ، وتقييد الهضم ، وما إلى ذلك 7,8. لذلك ، فإن بناء مكتبة البلازميد هذه هو خطوة تحد من المعدل في إنشاء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة. في الآونة الأخيرة ، نجحنا في حل هذه المشكلة من خلال تطوير طريقة جديدة ، التجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) 9. يتمثل جوهر CRISPRmass في معالجة تسلسل المتجهات المشتركة لمكتبة البلازميد من خلال مزيج من تقنية تحرير الجينات وتقنية الاستنساخ السلس.

هنا ، نقدم بروتوكولا ل CRISPRmass ، والذي يتضمن تفاعلات أنبوب اختبار متوازية بشكل كبير من خطوتين متبوعة بالتحول البكتيري. CRISPRmass هي طريقة بسيطة وسريعة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة ، والتي ، من حيث المبدأ ، يمكن استخدامها لبناء عالي الإنتاجية لمكتبات البلازميد المختلفة.

استراتيجية كريسبر ماس
يبدأ إجراء CRISPRmass بتفاعلات أنبوب اختبار متوازية من خطوتين قبل تحول الإشريكية القولونية (E. coli) (الشكل 1). الخطوة 1 هي انشقاق العمود الفقري المتجه المطابق لبلازميدات cDNA / ORF بواسطة Cas9 / sgRNA. موقع الانقسام المثالي مجاور لنهاية 5 من cDNA / ORF. لا يلزم تنقية منتجات الانقسام. الخطوة 2 هي إدخال وحدة UAS خاصة بالمتجهات في بلازميدات cDNA / ORF الخطية Cas9 / sgRNA بواسطة تجميع جيبسون (يشار إليها فيما يلي باسم تفاعل الخطوة الواحدة) ، مما ينتج عنه بلازميدات UAS-cDNA / ORF. تتداخل التسلسلات الطرفية 5 و 3 لوحدة UAS مع تلك الخاصة ببلازميدات cDNA / ORF الخطية ، مما يتيح تفاعل الخطوة الواحدة.

تخضع منتجات التفاعل أحادية الخطوة مباشرة لتحول الإشريكية القولونية . من الناحية النظرية ، يمكن فقط لمستعمرات UAS-cDNA / ORF المرغوبة أن تنمو على ألواح Luria-Bertani (LB) التي تحتوي على مضادات حيوية مختارة تتوافق مع جين مقاومة المضادات الحيوية لوحدة UAS. تتكون وحدة UAS من وحدة UAS الأساسية ، وجين مقاوم للمضادات الحيوية يختلف عن بلازميدات cDNA أو ORF ، والتسلسلات الطرفية 5 و 3. تتكون وحدة UAS الأساسية من 10 نسخ من UAS ، ومروج الحد الأدنى Hsp70 ، وتسلسل attB للتكامل الجيني بوساطة phiC31 ، وعلامة تحويل بيضاء مصغرة لذبابة الفاكهة7.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحديد موقع الانقسام الأمثل Cas9 / sgRNA في المنبع من cDNA / ORF

  1. تحضير بلازميدات cDNA أو ORF مع العمود الفقري المتجه المتطابقة
    1. قم بشراء استنساخ cDNA / ORF المتوفرة في الموارد العامة ، مثل مركز موارد جينوم ذبابة الفاكهة (DGRC ، https://dgrc.bio.indiana.edu/) المجموعة الذهبية10,11 ، ومجموعة جينات الثدييات الفأرية (MGC ، https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) ، ومكتبة التعبير البشري على نطاق CCSB12. في هذا البروتوكول ، نأخذ كمثال استنساخ cDNA / ORF القائم على المتجهات pOT2 ، والذي يتوفر في مجموعة DGRC الذهبية.
    2. استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة البلازميد مصغرة الإعدادية. قياس تركيز البلازميدات باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  2. تصميم sgRNAs
    1. قم بزيارة موقع CHOPCHOP الإلكتروني (https://chopchop.cbu.uib.no/). انقر فوق الزر لصق الهدف ثم أدخل تسلسل الحمض النووي محل الاهتمام. تسلسل الاهتمام هو منطقة 20-100 bp تقع في العمود الفقري المتجه pOT2 المنبع من نهاية cDNA / ORF 5.
    2. اختيار الأنواع ذبابة الفاكهة melanogaster. انقر فوق الزر البحث عن المواقع المستهدفة. اختر مرشحي sgRNA بكفاءة متوقعة أعلى من 80٪.
  3. تحضير sgRNAs
    1. اطلب أوليغوس منقى بالصفحة ، وهو برايمر أمامي (5 ′ -TAATACGACTCACTATAGG (N) 20GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′) حيث (N) 20 هو التسلسل المستهدف ل sgRNA ، والتمهيدي العكسي لسقالة sgRNA sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      ملاحظة: نوصي باستخدام قليل النوكليوتيدات عالي الجودة المنقى من PAGE.
    2. قم بإعداد قالب الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ في المختبر (IVT) ل sgRNA. قم بإعداد تفاعل تفاعل PCR 100 ميكرولتر على النحو التالي: 5 ميكرولتر من القالب pX330 (Addgene plasmid 42230 ، هدية من Feng Zhang ؛ 0.1 نانوغرام / ميكرولتر) ، 5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر) ، 5 ميكرولتر من sgRNA-REV (10 ميكرومتر) ، 50 ميكرولتر من 2x مزيج رئيسي عالي الدقة PCR ، و 35 ميكرولتر من المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) في أنبوب PCR.
    3. إجراء PCR باستخدام ظروف التدوير الحراري التالية: 1 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 51 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 72 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ؛ 30 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ؛ 1 دورة من 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. احتضان ردود الفعل في دورة حرارية.
    4. منتجات PCR منفصلة بنسبة 0.8 ٪ هلام الاغاروز الكهربائي. يجب أن يكون جزء الحمض النووي ~ 120-bp مرئيا على الجل تحت الأشعة فوق البنفسجية. تنقية جزء الحمض النووي ~ 120-bp باستخدام مجموعة استخراج هلام. يعمل جزء الحمض النووي المنقى كقالب ل IVT من sgRNA.
    5. قم بإعداد تفاعل IVT 5 ميكرولتر على النحو التالي: 165 نانوغرام من جزء الحمض النووي للهلام المنقى ~ 120-bp ، و 1.65 ميكرولتر من مزيج المخزن المؤقت NTP ، و 0.33 ميكرولتر من مزيج بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ، والمياه المعالجة ب DEPC. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. اتبع التعليمات اليدوية لمجموعة النسخ في المختبر .
    6. أضف 45 ميكرولتر من المياه المعالجة ب DEPC إلى منتج تفاعل IVT. تعامل مع منتجات تفاعل IVT على أنها RNA واستخدم المياه المعالجة بواسطة DEPC كعنصر تحكم فارغ. قياس تركيز sgRNA باستخدام مقياس الطيف. يبلغ تركيز sgRNA المخفف حوالي 870 نانوغرام / ميكرولتر.
    7. قم بتخفيف منتج تفاعل IVT إلى 20 نانوغرام / ميكرولتر بالماء المعالج ب DEPC. القسمة وتخزين sgRNA مباشرة في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: بعد تفاعل IVT ، لا تكون إزالة قالب الحمض النووي عن طريق هضم DNase ضرورية لقياس التركيز الدقيق ل sgRNA ، حيث أن كمية قالب الحمض النووي أقل من 0.4٪ من sgRNA ولا يؤثر قالب الحمض النووي على تفاعل CRISPRmass اللاحق. لذلك ، تنقية sgRNA ليست ضرورية.
  4. تقييم sgRNAs
    1. هضم العمود الفقري ناقل pOT2 المحمل بالبلازميد cDNA / ORF مع إنزيم التقييد. افصل شظايا الحمض النووي الناتجة بنسبة 0.8٪ من هلام الأغاروز الرحلان الكهربائي. تنقية الركيزة الحمض النووي مع مجموعة استخراج هلام.
      ملاحظة: جزء الحمض النووي الناتج الذي يحتوي على تسلسلات استهداف sgRNA للعمود الفقري المتجه pOT2 بمثابة ركيزة الحمض النووي ل Cas9 / sgRNAs. تقع مواقع انشقاق Cas9 / sgRNAs بشكل غير متماثل في ركيزة الحمض النووي ، وبالتالي ، فإن انشقاق ركيزة الحمض النووي بواسطة Cas9 / sgRNAs ينتج شظيتين من الحمض النووي بأحجام مختلفة ، مما يسهل تمييزهما عن ركيزة الحمض النووي غير المشقوقة في تفاعل الهضم.
    2. قم بإعداد تفاعل انشقاق 5 ميكرولتر Cas9 على النحو التالي: 0.2 ميكرولتر من 1.22 ميكرومتر S. pyogenes Cas9 ، 0.5 ميكرولتر من 20 نانوغرام / ميكرولتر sgRNA ، 0.015 pmol من ركيزة الحمض النووي ، 0.5 ميكرولتر من 10x Cas9 Buffer ، والمياه المعالجة DEPC. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. افصل منتجات الانقسام بنسبة 0.8٪ هلام الأغاروز الكهربائي. قم بتحميل ركيزة الحمض النووي السليمة كعنصر تحكم سلبي لركيزة الحمض النووي المهضومة.
      ملاحظة: هنا ، تشير ركيزة الحمض النووي السليمة إلى ركيزة الحمض النووي التي لا تخضع لتفاعلات الهضم بواسطة Cas9 / sgRNAs. ينتج عن انشقاق ركيزة الحمض النووي بواسطة Cas9 / sgRNAs شظيتين من الحمض النووي بأحجام مختلفة ، مما يسهل تمييزهما عن ركيزة الحمض النووي غير المشقوقة في تفاعل الهضم.
    4. تحليل أنماط الانقسام بواسطة نظام التصوير الرقمي (الشكل 2). حدد sgRNA الأكثر كفاءة لتجارب CRISPRmass اللاحقة. يوضح الشكل 2 أن جميع sgRNAs الأربعة تظهر كفاءة انقسام عالية ويمكن استخدامها ل CRISPRmass. حدد sgRNA الذي تحته خط للتجارب اللاحقة.
      ملاحظة: كلما قلت ركيزة الحمض النووي غير المشقوقة ، زادت كفاءة sgRNA لهضم Cas9 / sgRNA لركيزة الحمض النووي.

2. بناء وحدة UAS

ملاحظة: تشتمل وحدة UAS على UAS أساسي بدون طيار وحوالي 20-40 نقطة أساس من التسلسلات الطرفية 5 و 3 متداخلة مع نهايات 5 و 3 من موقع الانقسام الأساسي ، على التوالي (الشكل 1). يتم تحديد التسلسلات الطرفية 5 ′ و 3 لوحدة UAS بواسطة موقع الانقسام الأساسي لمتجه pOT2.

  1. استنساخ وحدة UAS الخاصة بناقل pOT2 في موقع EcoRI لمتجه pCR8GW ، مما ينتج عنه بلازميد pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (الملف التكميلي 1). حرر وحدة UAS الخاصة بناقل pOT2 عن طريق هضم بلازميد pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 مع EcoRI عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. افصل منتجات الانقسام بنسبة 0.7٪ من هلام الأغاروز الكهربائي. قم بتنقية وحدة UAS 6178-bp باستخدام مجموعة استخراج الهلام. قم بتخفيف وحدة UAS إلى 23 نانوغرام / ميكرولتر للتجارب اللاحقة. يعمل هذا الجزء 6178-bp كوحدة UAS لبناء بلازميدات UAS-cDNA / ORF من استنساخ cDNA / ORF القائم على ناقلات pOT2.

3. البناء على نطاق واسع لبلازميدات UAS-cDNA / ORF بواسطة CRISPRmass

ملاحظة: تم توحيد CRISPRmass كتفاعلات أنبوب اختبار متوازية بشكل كبير من خطوتين قبل تحويل الإشريكية القولونية (الشكل 1).

  1. خطوة تفاعل أنبوب الاختبار 1
    1. شق العمود الفقري المتجه المطابق لبلازميدات cDNA / ORF بواسطة Cas9 / sgRNA. رتب أنابيب 0.2 مل في كتلة تبريد من الألومنيوم على الثلج وقم بتسمية الأنابيب بعناية. تحضير المزيج الرئيسي على النحو التالي.
      1. لتفاعل واحد ، أضف 0.16 ميكرولتر من 1.22 ميكرومتر S. pyogenes Cas9 ، 0.4 ميكرولتر من 20 نانوغرام / ميكرولتر sgRNA ، 0.24 ميكرولتر من 10x Cas9 buffer ، 1.2 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. بالنسبة لتفاعلات N ، أضف (N + 1) × 0.16 ميكرولتر من 1.22 ميكرومتر S. pyogenes Cas9 ، (N + 1) × 0.4 ميكرولتر من 20 نانوغرام / ميكرولتر sgRNA ، (N + 1) × 0.24 ميكرولتر من 10x Cas9 buffer ، (N + 1) × 1.2 ميكرولتر من المياه المعالجة ب DEPC.
    2. دوامة ، تخلط جيدا ، وتدور. Aliquot 2 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب. أضف 0.4 ميكرولتر من 0.019 ميكرومتر من بلازميد cDNA / ORF إلى كل أنبوب. احتضان تفاعلات الانقسام عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: قم بتخفيف كل بلازميد إلى 0.019 ميكرومتر بالماء المعالج ب DEPC. إذا كان تركيز البلازميد أقل من 0.019 ميكرومتر، فأضف الحمض النووي البلازميد مباشرة إلى تفاعل الانقسام. استخدم الأنابيب الخالية من RNase والمياه المعالجة ب DEPC. سيستغرق تنفيذ هذه الخطوات على نطاق واسع عدة ساعات. ما لم ينص على خلاف ذلك ، احتفظ بالكواشف والتفاعلات على الجليد.
  2. خطوة رد فعل أنبوب الاختبار 2
    1. أدخل وحدة UAS خاصة بالمتجهات من الخطوة 2 في بلازميدات cDNA / ORF الخطية Cas9 عن طريق تجميع تفاعل أحادي الخطوة. قم بإعداد تفاعل خطوة واحدة 1.4 ميكرولتر لكل عينة. رتب الأنابيب سعة 0.2 مل في كتلة تبريد من الألومنيوم على الثلج وقم بتسمية الأنابيب بعناية.
      1. تحضير المزيج الرئيسي على النحو التالي. لتفاعل واحد ، أضف 0.07 ميكرولتر من وحدة UAS 0.006 ميكرومتر و 0.7 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتجميع التفاعل أحادي الخطوة. بالنسبة لتفاعلات N ، أضف (N + 1) × 0.07 ميكرولتر من وحدة UAS 0.006 ميكرومتر و (N + 1) × 0.7 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتجميع التفاعل أحادي الخطوة.
    2. دوامة ، تخلط جيدا ، وتدور. Aliquot 0.77 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب. أضف 0.7 ميكرولتر من بلازميد cDNA / ORF الخطي Cas9 إلى كل أنبوب. احتضان التفاعلات عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: تنقية منتجات تفاعل التجميع أحادية الخطوة ليست ضرورية. يستغرق تنفيذ هذه الخطوات على نطاق واسع عدة ساعات. ما لم ينص على خلاف ذلك ، احتفظ بالكواشف والتفاعلات على الجليد.
  3. تحويل منتجات تفاعل التجميع أحادية الخطوة إلى الإشريكية القولونية على نطاق واسع.
    1. قم بتبريد أطراف 10 ميكرولتر عند 4 درجات مئوية. قم بتبريد أنابيب سعة 1.5 مل في كتلة تبريد من الألومنيوم على الجليد.
    2. قم بإذابة خلايا الإشريكية القولونية المختصة على الثلج لمدة 5 دقائق. قسمة 10 ميكرولتر من الخلايا المختصة لكل أنبوب 1.5 مل مبرد.
      ملاحظة: استخدم خلايا الإشريكية القولونية المختصة المتاحة تجاريا بكفاءة تحويل لا تقل عن 1 × 108 CFU / ميكروغرام من الحمض النووي pUC19.
    3. أضف 1 ميكرولتر من منتج تفاعل التجميع أحادي الخطوة إلى 10 ميكرولتر من الخلايا المختصة ، وقم بتحريكه برفق للخلط ، وضعه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    4. احتضان الأنابيب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، ثم تبرد على الفور على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    5. أضف 100 ميكرولتر من وسط SOC (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) في كل أنبوب في درجة حرارة الغرفة ، واحتضانه في حاضنة اهتزاز (250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. قم بتسخين ما يصل إلى 37 درجة مئوية على ألواح LB التي تحتوي على مضاد حيوي يتوافق مع جين مقاومة المضادات الحيوية لوحدة UAS. انشر الخلايا على الألواح واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: يستغرق تنفيذ هذه الخطوات على نطاق واسع عدة ساعات. ما لم ينص على خلاف ذلك ، احتفظ بالكواشف والتفاعلات على الجليد.
  4. تحقق من بلازميدات UAS-cDNA / ORF التي تم إنشاؤها بواسطة CRISPRmass
    1. اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في 4.5 مل من الوسط السائل LB المكمل بالاختيار المناسب للمضادات الحيوية المقابلة لجين مقاومة المضادات الحيوية لوحدة UAS. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية بينما تهتز عند 250 دورة في الدقيقة.
    2. استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة تحضير البلازميد المصغرة. قم بإعداد تفاعل هضم تقييد 20 ميكرولتر على النحو التالي: 300-500 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد ، وإنزيم (إنزيمات) تقييد مناسب ، ومخزن هضم تقييد ، وماء عالي النقاء. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. فصل شظايا الحمض النووي بنسبة 0.8٪ من هلام الأغاروز الكهربائي وتحليلها بواسطة نظام التصوير الرقمي (الشكل 3).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطبيق CRISPRmass لإنشاء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF على مستوى الجينوم باستخدام 3402 نسخة cDNA / ORF تحمل العمود الفقري المتجه pOT2 من مجموعة DGRC الذهبية. قمنا بتحليل مستعمرة واحدة فقط بشكل عشوائي لكل بنية UAS-cDNA / ORF ، وأشار تحليل التقييد اللاحق باستخدام PstI إلى أن 98.6٪ من تركيبات UAS-cDNA / ORF تم إنشاؤها بنجاح9. الأساس المنطقي لاستخدام PstI لتحليل تقييد تركيبات UAS-cDNA / ORF التي تحمل العمود الفقري لناقل pOT2 هو كما يلي. يوجد موقعان PstI في وحدة UAS لاستنساخ cDNA / ORF القائم على المتجهات pOT2 ، وهناك موقع PstI في العمود الفقري المتجه pOT2. وبالتالي ، فإن هضم بنية UAS-cDNA / ORF القائمة على ناقلات pOT2 مع PstI ينتج عنها جزء خاص بوحدة UAS 408 bp وجزء خاص بتجميع وحدة UAS 5649 bp. تشير شظايا 408 bp و 5649 bp PstI إلى أن تركيبات UAS-cDNA / ORF لاستنساخ cDNA / ORF القائمة على متجه pOT2 يتم إنشاؤها بنجاح ، وتظهر النتائج التمثيلية في الشكل 3.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط انسيابي لبناء مكتبة UAS-cDNA / ORF باستخدام CRISPRmass. خط أنابيب كريسبر ماس لبناء مكتبة UAS-cDNA / ORF. (1) رد فعل أنبوب اختبار الخطوة الأولى. يتم شق العمود الفقري المتجه المطابق لبلازميدات cDNA / ORF بواسطة Cas9 / sgRNA. يقع موقع الانقسام في العمود الفقري المتجه المجاور لمنبع نهاية cDNA / ORF 5. تخضع منتجات الانقسام ، بدون تنقية ، مباشرة للخطوة الثانية من تفاعل أنبوب الاختبار. يتم تحضير sgRNAs المستخدمة في تفاعلات الانقسام عن طريق النسخ في المختبر ويمكن استخدامها مباشرة دون تنقية. بعد ذلك ، يتم تعريف 28-40 نقطة أساس من نهاية 5 ′ لموقع الانقسام (الصندوق الأصفر) على أنها تداخل نهاية 5 و 28-40 نقطة أساس من نهاية 3 ′ لموقع الانقسام (المربع الأحمر) يتم تعريفه على أنه تداخل نهاية 3. يحمل العمود الفقري للناقل جين مقاومة المضادات الحيوية A (الصندوق الأخضر). (2) الخطوة الثانية هي تفاعل أنبوب الاختبار. يتم ربط وحدة UAS الخاصة بالمتجه في بلازميدات cDNA / ORF الخطية Cas9 مباشرة في المنبع من نهاية cDNA / ORF5 ′ من خلال مجموعة تفاعل أحادية الخطوة ، مما ينتج عنه تركيبات UAS-cDNA / ORF. تخضع منتجات تجميع التفاعل أحادية الخطوة مباشرة لتحويل الإشريكية القولونية . يتم اختيار المحولات على ألواح أجار LB التي تحتوي على مضاد حيوي B يتوافق مع جين مقاومة المضادات الحيوية B (الصندوق البني) لوحدة UAS الخاصة بالمتجه. فقط مستعمرات UAS-cDNA / ORF المرغوبة يمكن أن تنمو. تتكون وحدة UAS من 10 نسخ من UAS ، ومروج الحد الأدنى Hsp70 ، وتسلسل attB للتكامل الجيني بوساطة phiC31 ، وعلامة تحويل بيضاء مصغرة لجين ذبابة الفاكهة ، وجين مقاومة مضاد حيوي B قابل للاختيار الإيجابي ، وتداخل الطرف 5 و 3 ′ تداخل النهاية مما يتيح تجميع تفاعل أحادي الخطوة. تقوم مجموعة التفاعل أحادية الخطوة بتصفية أي انقسامات محتملة خارج الهدف في الحمض النووي ناتجة عن CRISPR / Cas9. تم تعديل هذا الرقم من9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تقييم sgRNAs التي تستهدف مناطق معينة من العمود الفقري لناقل pOT2 عن طريق تحليل الانقسام Cas9 في المختبر . يتم اختيار sgRNAs التي تحتها خط ل CRISPRmass. M هي علامة الحمض النووي. تم تعديل هذا الرقم من9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل القيود ل 20 بنية UAS-cDNA / ORF الناتجة عن CRISPRmass. تم تحليل التركيبات بواسطة هضم PstI. ولوحظت أنماط التقييد المتوقعة لجميع تركيبات UAS-cDNA/ORF. M هي علامة الحمض النووي. تم تعديل هذا الرقم من9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: بناء بلازميد pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70. تم إنشاء وحدة UAS الخاصة بناقل pOT2 التي تحتوي على البلازميد pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 بناء على ثلاثة بلازميدات ، pMartini-Amp ، pBS-attB-UAS-Hsp70 ، و pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أهم خطوات كريسبر ماس هي تصميم sgRNAs وتقييم sgRNAs. يعد اختيار sgRNAs عالية الكفاءة ل Cas9 أمرا أساسيا لنجاح CRISPRmass. إذا لوحظت مستعمرات قليلة جدا أو معدومة على غالبية ألواح LB المحتوية على المضادات الحيوية بعد تحول الإشريكية القولونية مع منتجات تجميع التفاعل أحادية الخطوة ، تحقق من هضم البلازميد عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. إذا لم يتم هضم البلازميدات بشكل جيد ، تحقق من نشاط Cas9 وتدهور sgRNA وجودة البلازميد ؛ إذا تم هضم البلازميدات جيدا ، فتحقق من كواشف تجميع التفاعل أحادية الخطوة وتأكد من أن كفاءة تحويل الخلايا المختصة لا تقل عن 1 × 108 CFU / ميكروغرام من الحمض النووي pUC19. والجدير بالذكر أن استخدام كتلة تبريد من الألومنيوم يمكن أن يسهل التحول البكتيري على نطاق واسع.

تنشأ قيود CRISPRmass من التلاعب بها ودمجها لتسلسلات العمود الفقري المتجه ، مما يحد من إمكانية وضع علامات على cDNAs و ORFs إما في نهاية 5 'أو 3'.

على عكس جميع الطرق الأخرى الموجودة 7,8 ، تتلاعب CRISPRmass وتدمج تسلسلات العمود الفقري المتجه9. وهكذا، بمجرد تصميم وحدات UAS وإعدادها، لا تحتاج CRISPRmass إلى تصميم فردي أو معالجة لكل بلازميد واحد ولكن تفاعلات أنبوب اختبار متوازية بشكل كبير من خطوتين قبل التحول البكتيري، وتجنب تفاعل البوليميراز المتسلسل، والتلاعب المرتبط به. علاوة على ذلك ، لا تحتاج كل من sgRNAs المنسوخة في المختبر ومنتجات تجميع التفاعل أحادية الخطوة إلى التنقية للتجارب اللاحقة. بالمقارنة مع تقنية استنساخ البوابة ، فإن CRISPRmass أكثر ملاءمة لتوليد تركيبات UAS-cDNA / ORF ، خاصة من cDNAs / ORFs الطويلة أو الغنية ب GC ، حيث لا يقوم CRISPRmass بتضخيم cDNA أو ORFs نفسها9.

يمكن استخدام CRISPRmass لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF وكذلك لتحرير مكتبات البلازميد المختلفة على مستوى الجينوم. يمكن تطبيق CRISPRmass على بناء مكتبة بلازميد تعبير عن طريق إدخال مروج CMV في تسلسلات المتجهات المشتركة المجاورة لنهاية 5 'من cDNAs أو ORFs. تعد كريسبر ماس بتسريع تطوير علم الجينوم الوظيفي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم رعاية هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32071135 و 31471010) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (14PJ1405900) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (19ZR1446400).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كتلة تبريد الألومنيومAikbbioADMK-0296لإجراء التحول البكتيري
بالمياه المعالجة DEPCInvitrogenAM9906
Gel ExtractionKit OmegaD2500لتنقية الحمض النووي من هلام الاغاروز
نظام التصويرالجل Tanon2500B
HiScribe T7 طقم تخليق الحمض النووي الريبي السريع عالي الإنتاجيةNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621
Plasmid Mini KitOmegaD6943لعزل الحمض النووي البلازميد من الخلايا البكتيرية
Q5 Hot Start عالي الدقة 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
حاضنة اهتزازShanghai Zhichu & nbsp ؛ZQLY-180V
T سلسلة متعددة الكتل الحرارية CyclerLongGeneT20لأداء تفاعل البوليميراز المتسلسل & nbsp ؛
Trans10 خلية مختصة كيميائياTranGen BioTechCD101
مقياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجيةShimadzuBioSpec-nanoلقياس تركيز الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).">Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  2. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).">Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  3. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).">Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  4. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).">Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
  5. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).">St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).">Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  7. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).">Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  8. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).">Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
  9. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).">Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  10. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).">Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
  11. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).">Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
  12. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).">Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Modular AssemblyPlasmid Library ConstructionUAS cDNA ORF LibraryFunctional Genomics ScreeningCRISPR Cas9 EditingHigh Throughput CloningBacterial TransformationSingle Guide RNAGenome Wide LibraryGain Of Function Screening

Related Articles