يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة لدراسة المكونات الكيميائية ل Gynura ثنائي اللون DC

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66612

⸱

فبراير 2, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2General Surgery, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نصف بروتوكولا عاما يدمج تحليل قياس الطيف الكتلي عالي الدقة والالتحام الجزيئي في أبحاث الطب الصيني التقليدي.

الملخص

يعد فصل وتحليل المكونات الكيميائية المرغوبة من الموضوعات المهمة للبحث الأساسي للطب الصيني التقليدي (TCM). أصبح قياس الطيف الكتلي الترادفي لوقت الرحلة رباعي الأقطاب الكروماتوغرافيا السائل فائق الأداء تدريجيا تقنية رائدة لتحديد مكونات الطب الصيني التقليدي. جينورا ثنائية اللون DC. (BFH) ، عشب معمر بدون جذع يستخدم في الطب والغذاء في الصين له تأثيرات طبية مثل إزالة الحرارة وترطيب الرئة وتخفيف السعال وتشتيت الركود وتخفيف التورم. تحتوي البوليفينول والفلافونويد على العديد من الأيزومرات التي تعيق تحديد المركبات المعقدة في BFH. تقدم هذه الورقة بروتوكولا منهجيا لدراسة المكونات الكيميائية ل BFH بناء على استخراج المذيبات والبيانات المتكاملة عبر UPLC-Q-TOF-MS.

تتضمن الطريقة الموضحة هنا بروتوكولات منهجية للمعالجة المسبقة للعينات، ومعايرة التصلب المتعدد، واكتساب التصلب المتعدد، ومعالجة البيانات، وتحليل النتائج. تشمل المعالجة المسبقة للعينات الجمع والتنظيف والتجفيف والتكسير والاستخراج. تتكون معايرة MS من تصحيح متعدد النقاط ونقطة واحدة. تتضمن معالجة البيانات استيراد البيانات وإنشاء الطريقة ومعالجة التحليل وعرض النتائج. النتائج التمثيلية لنمط التجزئة النموذجي للأحماض الفينولية والإسترات والجليكوسيدات في Gynura bicolor DC. (BFH) معروضة في هذه الورقة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة اختيار المذيبات العضوية ، والاستخراج ، وتكامل البيانات ، واختيار طاقة التصادم ، وتحسين الطريقة بالتفصيل. يمكن استخدام هذا البروتوكول العالمي على نطاق واسع لتحديد المركبات المعقدة في الطب الصيني التقليدي.

المقدمة

يمارس الطب الصيني التقليدي (TCM) سريريا في الصين منذ آلاف السنين ، ويلعب دورا حيويا في الحفاظ على صحة الشعبالصيني 1. تكوين الطب الصيني التقليدي متنوع ومعقد ، وقد تم الإبلاغ عن الطب الصيني التقليدي على نطاق واسع في العديد من الدراسات النوعية التي تركز على التركيب الكيميائي2. يمكن تقسيم المكونات الكيميائية في الطب الصيني التقليدي تقريبا إلى الفئات التالية مثل القلويدات, الأحماض العضوية, فينيل بروبانويد, الكومارين, قشور, الكينونات, الفلافونويد, التربينويدات, الصابونين triterpenoid, الصابونين الستيرويد, جليكوسيدات القلب, والعفص3. نظرا للأعداد الكبيرة من المكونات غير المعروفة والأيزومرات التي لا يمكن تمييزها في الطب الصيني التقليدي ، فإن فصل المكونات الكيميائية المرغوبة وتحليلها من الموضوعات المهمة للبحث الأساسي للطب الصينيالتقليدي 4.

تم تطبيق قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة رباعي الأقطاب للكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء لتحليل المواد في الطب الصيني التقليدي (TCM) ، والتي يمكن فصلها عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء5،6. يمكن أن توفر الدقة العالية ل MS معلومات أيونية شاملة ، والتي تستخدم لتحليل قاعدة البيانات مع خطأ أقل من 5 جزء في المليون7. بعد تشغيل طاقة الاصطدام ، يمكن لوضع MS الثانوي الحصول على أيونات شظية ثانوية ، تتأثر شدتها وعددها بحجم الطاقة8.

جينورا ثنائية اللون DC. (BFH) ، عشب معمر بدون جذع يستخدم على نطاق واسع في الطب والغذاء (الشكل 1 أ) ، هو نبات نادر ومهدد بالانقراض فريد من نوعه في الصين9. يحتوي BFH على وفير من الأنثوسيانين والبوليفينول والفلافونويد وقدرة قوية مضادةللأكسدة 10. BFH له تأثيرات طبية بما في ذلك إزالة الحرارة ، وتبريد الدم ، وترطيب الرئة ، وتخفيف السعال ، وتشتيت الركود ، وتخفيف التورم ، وتخفيف حرارة الصيف ، والقضاء على الحرارة. ركزت دراسات قليلة على التركيب الكيميائي ل BFH11. تحتوي البوليفينول والفلافونويد على العديد من الأيزومرات ، مما يجعل تحديد المركبات المعقدة في BFH أمرا صعبا. يجب تطوير طريقة عالمية لتحديد المكونات الكيميائية ، والتي يمكن تطبيقها على جميع أنواع الطب الصيني التقليدي. هدفت هذه الدراسة إلى الإبلاغ عن بروتوكول منهجي لدراسة المكونات الكيميائية ل BFH بناء على استخراج المذيبات والبيانات المتكاملة عبر UPLC-Q-TOF-MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. معالجة عينة

  1. اغسل عشب BFH بالكامل بالماء النقي حتى لا تكون هناك رواسب وشوائب مرئية. ضع BFH النظيف في طبق ثم ضعه في الفرن (الشكل 1 ب). اضبطي الفرن على 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تم جمع مصنع BFH بالكامل في مقاطعة سيتشوان ، الصين.
  2. سحق BFH المجفف في كسارة متعددة الوظائف عالية السرعة. انقل المسحوق الخشن إلى منخل 50 شبكة (الشكل 1 ج). اجمع المسحوق الناعم في كيس محكم الغلق ، وقم بتخزينه في برج تجفيف.
  3. قم بوزن ست عينات BFH بدقة بوزن 0.25 جم لكل منها ، وضعها في ست قوارير مخروطية الشكل. أضف 30 مل من المذيبات العضوية (50٪ ماء الإيثانول ، 70٪ ماء الإيثانول ، الكلوروفورم ، الأثير البترولي ، أسيتات الإيثيل ، وكحول n-butyl) إلى كل زجاجة مخروطية الشكل (الشكل 1 د).
  4. انقل الخليط إلى جهاز صوتي للحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة من الاستخراج عند 25 درجة مئوية. جهاز الطرد المركزي للعينة عند 14,000 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإعداد حقنة حقن وفلتر غشاء عضوي صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر. قم بتصفية جميع المواد الطافية في زجاجات عينات سعة 2 مل.

2. معايرة MS

  1. باستخدام ماصة نطاق 1,000 ميكرولتر ، انقل 500 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ثم انقل 450 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات أو فائق النقاء إلى قارورة حجمية سعة 100 مل (الشكل 2).
  2. باستخدام ماصة ذات نطاق 200 ميكرولتر، أضف 50 ميكرولتر من حمض الفورميك إلى القارورة الحجمية سعة 100 مل. اصنع حجما إجماليا قدره 100 مل مع 90:10 2-بروبانول: ماء ، وصوتنة المحلول لمدة 5 دقائق. قم بتسمية القارورة بمحلول فورمات الصوديوم 0.5 ملي مولار في 90:10 2-بروبانول: ماء وقم بتخزينها في الثلاجة.
    ملاحظة: ينتهي محلول فورمات الصوديوم في غضون أسبوع واحد في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بتشغيل برنامج التحكم UPLC-Q-TOF-MS ثم افتح نافذة MS tune . في لوحة التحكم في تدفق العينة ، اضبط 25 ميكرولتر/دقيقة في خيار معدل تدفق التسريب وحدد C في خيار الخزان . انتظر حوالي 1 دقيقة حتى التطهير التلقائي حتى النهاية.
  4. انقر فوق الزر Flow لبدء تقديم محلول فورمات الصوديوم. انقر فوق الزر إيجابي للتبديل إلى وضع الأيونات الموجب ، وانقر فوق الزر "حساسية " للتبديل إلى وضع الحساسية.
    ملاحظة: انتقل إلى الخطوة التالية حتى تظهر القمم المميزة لفورمات الصوديوم في نافذة الطيف في الوقت الفعلي.
  5. في برنامج التحكم UPLC-Q-TOF-MS، افتح نافذة وحدة تحكم MS . في الموضع الأيسر، حدد خيارات SYNAPT XS وIntellistart بالتسلسل.
  6. ضع علامة على إنشاء معايرة ، وانقر فوق الزر "ابدأ". انقر فوق الزر "التالي" ، وحدد ملف تعريف المعايرة في القائمة المنسدلة. انقر فوق الزر "التالي" ، وحدد وضع الحساسية في القطبية الإيجابية . انقر فوق الأزرار التالي وضبط الصفحة والتالي والبدء بدورها.
  7. قم بالتبديل إلى نافذة ضبط MS ، وانقر فوق الزر "سلبي" للتبديل إلى وضع الأيونات السالبة. ارجع إلى نافذة وحدة تحكم MS .
  8. ضع علامة على إنشاء معايرة ، وانقر فوق الزر "ابدأ". انقر فوق الزر "التالي" ، وحدد ملف تعريف المعايرة في القائمة المنسدلة. انقر فوق الزر "التالي" ، وحدد وضع الحساسية في القطبية السلبية . انقر فوق الأزرار التالي وضبط الصفحة والتالي والبدء بدورها.
  9. في لوحة التحكم في تدفق LockSpray ، اضبط معدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة وانقر فوق الزر Flow للسماح لمحلول LE بالدخول إلى مطياف الكتلة. قم بالتبديل إلى نافذة ضبط MS ، وحدد إعداد مصدر LockSpray ، وانقر فوق الزر "ابدأ" لبدء المعايرة.

3. الاستحواذ على MS

  1. قم بالتبديل إلى الواجهة الرئيسية ، وانقر بزر الماوس الأيمن على عمود ملف المدخل لفتح طريقة الكروماتوغرافيا السائلة.
  2. انقر فوق الزر " المدخل" ثم قم بتعيين المعلمات بما في ذلك وقت التشغيل والتدرج. انقر فوق الزر Autosampler ثم قم بتعيين المعلمات بما في ذلك وقت التشغيل والعمود والعينة. انقر فوق الزر حفظ .
  3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق عمود طريقة MS لفتح طريقة قياس الطيف الكتلي.
  4. انقر فوق الزر "معلومات" ثم قم بتعيين المعلمات بما في ذلك وقت الانتهاء ، والقطبية ، ووضع المحلل ، والكتلة المنخفضة ، والكتلة العالية ، وطاقة تصادم نقل المنحدر. انقر فوق الزر "موافق" ثم " حفظ " زر.
  5. املأ جدول التسلسل بما في ذلك اسم الملف والقارورة والمجلد انقر فوق الزر "حفظ ".
  6. حدد الصف في جدول التسلسل للنموذج الذي تريد تشغيله. انقر فوق الزر " تشغيل " ، وانقر فوق الزر "موافق " في النافذة المنبثقة للتو.

4. معالجة البيانات

  1. قم بتشغيل برنامج تحليل البيانات. في عمود عملي ، انقر فوق الزر استيراد بيانات MassLynx لفتح نافذة جديدة.
  2. انقر فوق زر علامة الجمع ، وتحقق من جميع الملفات الأولية الخمسة من الوضع الإيجابي. أدخل اسم المجموعة، وانقر على الزر إنشاء مجموعة نماذج UNIFI لبدء استيراد البيانات (الشكل 3 أ).
  3. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف طريقة التحليل في الوضع الإيجابي. انقر فوق ملصق المعالجة ، وانقر فوق الزر "الهدف حسب الكتلة ". أدخل رقم 5 صفحات في الدقيقة في مربع الإدخال بعد تفاوت مطابقة الهدف وتفاوت مطابقة الجزء.
  4. انقر فوق الزر "الصفحة الرئيسية " ، وانقر على زر " المقارقات ". حدد صفوف + H و + Na ، وانقر على الزر الأيمن على شكل سهم . انقر فوق الزر حفظ (الشكل 3 ب).
  5. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف طريقة التحليل في الوضع السلبي. انقر فوق ملصق المعالجة ، وانقر فوق الزر "الهدف حسب الكتلة ". أدخل رقم 5 صفحات في الدقيقة في مربع الإدخال بعد تفاوت مطابقة الهدف وتفاوت مطابقة الجزء.
  6. انقر فوق الزر "الصفحة الرئيسية" ثم انقر فوق الزر " المقارقات ". حدد صفوف -H و + HCOO وانقر على الزر الأيمن على شكل سهم . انقر فوق الزر "حفظ ".
  7. في عمود عملي ، انقر فوق الزر تحليل لفتح نافذة جديدة. اختر البيانات التي تم استيرادها للتو والطريقة التي تم إنشاؤها للتو ثم انقر فوق الزر التالي . أدخل اسم الملف. حدد المجلد الذي يتم تخزين بيانات التحليل فيه ثم انقر فوق الزر "إنهاء "
  8. انقر فوق الزر " معالجة " وانتظر بضع دقائق حتى تظهر النتائج (الشكل 3C).
  9. انسخ جدول النتائج إلى نموذج فارغ (الشكل 3 د).

5. تحليل النتائج

  1. حدد مركبا في جدول النتائج. سيتم عرض الطيف الكتلي الثانوي المقابل في الزاوية اليمنى السفلية (الشكل 4 أ).
  2. انقر فوق الزر على شكل جدول ، وحدد خيار شظايا الطاقة العالية لعرض جدول أيونات الشظايا الثانوية (الشكل 4 ب).
  3. حدد أيون جزء ثانوي في الجدول. حرك الماوس فوق ذروة الأيونات المقابلة للطيف الكتلي الثانوي ، وسيتم عرض الكسر الهيكلي المقابل على الشاشة (الشكل 4C).
    ملاحظة: قم يدويا بتقييم معقولية التكسير الذي يقدمه البرنامج ، وتمييز الأيزومرات بناء على أيونات الشظايا الثانوية.
  4. ارسم نمط التجزئة يدويا في برنامج الرسم.
    ملاحظة: يتم وصف أمثلة أنماط التجزئة بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام تحديد التركيب الكيميائي ل BFH كنموذج لعرض النتائج التمثيلية. كروماتوغرامات ذروة القاعدة من Gynura ثنائي اللون المستخرج بالمذيبات. في الملف التكميلي 1-الشكل التكميلي S1-S6 ، ووقت الاستبقاء المرصود (RT) ، واسم المكون ، والصيغة ، ونسبة الكتلة إلى الشحنة (m / z) ، والخطأ الكتلي مذكورة في الجداول S1-S6. في ZBTK ، تم تحديد جميع أنواع المركبات البالغ عددها 35 نوعا من القمم المنفصلة في UPLC-TOF-MS. كما هو موضح في الملف التكميلي 1-الجدول التكميلي S1 ، احتوت المواد الكيميائية ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إلى جانب مغلي الماء12 ، يعد استخراج المذيبات العضوية طريقة شائعة أخرى للمعالجة المسبقة للطب الصينيالتقليدي 13. وفقا لمبدأ انحلال الطور المماثل ، تم استخراج العديد من المكونات عن طريق الجمع بين المذيبات العضويةالمختلفة 14. يعد الاستخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتية أحد الطرق الرئيسية المستخدمة للحصول على المكونات في TCM15. يعد استخراج ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج مفيدا لاستخراج أنواع معينة من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82104881) ، وفريق الميراث والابتكار التابع لعلاج الطب الصيني التقليدي للأمراض المناعية ، ومشروع تشونغتشينغ للبحث العلمي الطبي (المشروع المشترك بين لجنة الصحة في تشونغتشينغ ومكتب العلوم والتكنولوجيا) (2022DBXM007) ، مشروع خاص لتحفيز الأداء وتوجيه معهد تشونغتشينغ للبحوث العلمية (cstc2022jxjl120005) ، مشروع خاص لمؤسسة تشونغتشينغ لعلوم ما بعد الدكتوراه (2022CQBSHTB3035) ، برنامج المواهب الطبية العليا في تشونغتشينغ ليونغ ومنتصف العمر ، برنامج المؤسسات العلمية في تشونغتشينغ (مشروع بحثي مستقل رقم 2022GDRC015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكلوروفورمSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودةCAS 67-66-3
الإيثانولChuandongالكيميائيةCAS 64-17-5
أسيتات الإيثيلChuandongالكيميائيةCAS 141-78-6
الكروماتوجراف السائلWatersACQUITY Class 1 بالإضافة إلى
برنامج
التحكم MassLynx Waters V4.2 MSن-بوتيل كحولChuandongالكيميائيةCAS 71-36-3
الأثير البتروليChuandongالكيميائيةCAS 8032-32-4
رباعي الأقطاب قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلةالمياهSYNAPT XS
UNIFIبرنامجتحليل البيانات

المراجع

  1. Lin, P., et al. Qualitative and quantitative analysis of the chemical profile for gualou-xiebai-banxia decoction, a classical traditional chinese medicine formula for the treatment of coronary heart disease, by uplc-q/tof-ms combined with chemometric analysis. J Pharm Biomed Anal. 197, 113950(2021).
  2. Hui, D., et al. Uplc-q-tof/ms-based metabolomic studies on the toxicity mechanisms of traditional chinese medicine chuanwu and the detoxification mechanisms of gancao, baishao, and ganjiang. Chinese J Nat Med. 13 (9), 687-698 (2015).
  3. Newman, D. J. Modern traditional chinese medicine: Identifying, defining and usage of tcm components. Adv Pharmacol. 87, 113-158 (2020).
  4. Liu, S., Yi, L. Z., Liang, Y. Z. Traditional chinese medicine and separation science. J Sep Sci. 31 (11), 2113-2137 (2008).
  5. Yuan, L., et al. Rapid classification and identification of complex chemical compositions in traditional chinese medicine based on uplc-q-tof/ms coupled with data processing techniques using the kudiezi injection as an example. Anal Methods. 7 (12), 5210-5217 (2015).
  6. Wang, F., et al. Hplc coupled with chemical fingerprinting for multi-pattern recognition for identifying the authenticity of clematidis armandii caulis. JoVE. (189), e64690(2022).
  7. Gao, Y., et al. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry and self-established database analysis of chinese herbal medicine components. JoVE. (201), e66091(2023).
  8. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE. (193), e65054(2023).
  9. Wang, Y., et al. Comparison of morphological and physiological characteristics in two phenotypes of a rare and endangered plant, begonia fimbristipula hance. Photosynthetica. 54, 381-389 (2016).
  10. Zhang, P., et al. Response of population canopy color gradation skewed distribution parameters of the rgb model to micrometeorology environment in begonia fimbristipula hance. Atmosphere. 13 (6), 890(2022).
  11. Yu, L., Ning, L., Youzhen, D. Studies on microwave extraction of the pigment from begonia fimbristipula hance. Guangdong Trace Elements Science. 11 (10), 60-63 (2004).
  12. Xiao, Q., et al. Novel fusion protein consisting of metallothionein, cellulose binding module, and superfolder gfp for lead removal from the water decoction of traditional chinese medicine. ACS Omega. 5 (6), 2893-2898 (2020).
  13. Huang, H., et al. Using multiple light scattering to examine the stability of phyllanthus emblica l. Extracts obtained with different extraction methods. JoVE. (194), e65130(2023).
  14. Miao, W. G., Tang, C., Ye, Y., Quinn, R. J., Feng, Y. Traditional chinese medicine extraction method by ethanol delivers drug-like molecules. Chin J Nat Med. 17 (9), 713-720 (2019).
  15. Olejar, K. J., et al. Ultrasonic-assisted extraction of cannabidiolic acid from cannabis biomass. JoVE. (183), e63076(2022).
  16. Zhu, H. Y., et al. Sedative and hypnotic effects of supercritical carbon dioxide fluid extraction from schisandra chinensis in mice. J Food Drug Anal. 24 (4), 831-838 (2016).
  17. Lin, X., Wang, Y., Liu, X., Huang, S., Zeng, Q. Ils-based microwave-assisted extraction coupled with aqueous two-phase for the extraction of useful compounds from chinese medicine. Analyst. 137 (17), 4076-4085 (2012).
  18. Wu, T., Lv, H., Wang, F., Wang, Y. Characterization of polyphenols from lycium ruthenicum fruit by uplc-q-tof/mse and their antioxidant activity in caco-2 cells. J Agric Food Chem. 64 (11), 2280-2288 (2016).
  19. Distler, U., et al. Drift time-specific collision energies enable deep-coverage data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 11 (2), 167-170 (2014).
  20. Sawada, Y., et al. Widely targeted metabolomics based on large-scale ms/ms data for elucidating metabolite accumulation patterns in plants. Plant Cell Physiol. 50 (1), 37-47 (2009).
  21. Zhang, X. M., et al. Data-dependent acquisition based high-resolution mass spectrum for trace alternaria mycotoxin analysis and sulfated metabolites identification. Food Chem. 364, 130450(2021).
  22. Downard, K. M. Indirect study of non-covalent protein complexes by maldi mass spectrometry: Origins, advantages, and applications of the "intensity-fading" approach. Mass Spectrom Rev. 35 (5), 559-573 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداءكتلية رباعية الأقطاب - زمن الطيرانمعالجة مسبقة للعينةاستخلاص بالمذيباتأحماض فينوليةمتصاوغات الفلافونويدالطب الصيني التقليدي
قياس الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة لدراسة المكونات الكيميائية ل Gynura ثنائي اللون DC
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.