مقالة منهجية

تطوير مسبار مجهري للقوة الذرية قائم على البعوض الحيوي الهجين القائم على ستينغر

DOI:

10.3791/66675

⸱

أبريل 26, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, McGill University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد التحقيقات الكمية والخاضعة للرقابة في سلوكيات لدغات الحشرات ضرورية لوضع استراتيجيات فعالة لمكافحة الأمراض المنقولة بالنواقل. في هذا السياق ، يتم تقديم طريقة لتصنيع مجهر القوة الذرية الهجين الحيوي (AFM).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل البعوض ، الذي يشتهر بأنه أكثر فتكا بالبشر بسبب قدرته على نقل الأمراض ، تحديا مستمرا للصحة العامة. وتنطوي استراتيجية الوقاية الأولية المستخدمة حاليا على المواد الطاردة الكيميائية، التي غالبا ما تثبت عدم فعاليتها لأن البعوض يطور مقاومة بسرعة. وبالتالي ، فإن اختراع طرق وقائية جديدة أمر بالغ الأهمية. يتوقف هذا التطور على فهم شامل لسلوكيات لدغ البعوض ، مما يستلزم إعدادا تجريبيا يكرر بدقة سيناريوهات العض الفعلية مع معلمات اختبار يمكن التحكم فيها وقياسات كمية. لسد هذه الفجوة ، تم تصميم مجهر القوة الذرية الهجين الحيوي (AFM) ، والذي يتميز بستينغر بيولوجي - على وجه التحديد ، شفا البعوض - كطرف له. يتيح هذا المسبار الحيوي الهجين ، المتوافق مع أنظمة AFM القياسية ، محاكاة شبه حقيقية لسلوكيات اختراق البعوض. وتمثل هذه الطريقة خطوة إلى الأمام في الدراسة الكمية لآليات العض، مما قد يؤدي إلى إنشاء حواجز فعالة ضد الأمراض المنقولة بالنواقل (VBDs) وفتح سبل جديدة في مكافحة الأمراض التي ينقلها البعوض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أفادت منظمة الصحة العالمية (WHO) أن الأمراض المنقولة بالنواقل (VBDs) تمثل أكثر من 17٪ من جميع الأمراض المعدية ، والتي تسبب أكثر من 7،00،000 حالة وفاة سنويا على مستوى العالم. على سبيل المثال ، باعتباره الأكثر فتكا في العالم ، ينشر البعوض العديد من مسببات الأمراض ، مثل حمى الضنك والملاريا وزيكا ، من خلال المفصليات التي تتغذى على الدم ، مما يؤدي إلى 700 مليون إصابة كل عام1. تعتبر الاستكشافات نحو تطوير تدابير فعالة لمنع VBDs ذات أهمية حاسمة ، بما في ذلك محاكاة سلوكيات اختراق البعوض للتحقيق في آليات العض ودراسات الحواجز المحتملة لإثبات فعاليتها في منع الاختراق. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في وضع نهج مناسبة لإجراء مثل هذه التحقيقات. وقد بذلت جهود في الأدبيات ، بما في ذلك تطوير إبر صغيرة الحجم تشبه هندسة لدغة البعوض. ومع ذلك ، فإن العديد من المواد المستخدمة في صنع هذه الإبر الدقيقة (أي المواد اللزجةالمرنة 2 ، والسيليكون (Si) ، والزجاج ، والسيراميك3 ، وما إلى ذلك) لها خصائص ميكانيكية مختلفة عن المواد البيولوجية لخرطوم البعوض. يمكن أن تكون المواد الهندسية هشة وعرضة للكسر والالتواء 3,4 ، في حين أن خرطوم البعوض يمكن أن يتحمل الكسر أو التواء بشكل أفضل4. تتمثل فائدة وجود مسبار هجين حيوي يستخدم شفا البعوض بدلا من المواد الهندسية في أنه يمكن أن يكون تمثيلا أكثر دقة لآلية ثقب البعوض. أيضا ، يجب دمج الأدوات المتخصصة مع الإبر الدقيقة لإجراء دراسات كمية ، مثل القياس الدقيق للقوة5 ، والذي لا يمكن تحقيقه بسهولة باستخدام الإعدادات المخصصة باستخدام الإبر الدقيقة الهندسية.

يعد النهج القائم على مجهر القوة الذرية (AFM) واعدا من حيث أنه يعمل من خلال استخدام ناتئ بطرف فائق الدقة يتم وضعه بعناية بالقرب من سطح العينة. يمكن للطرف إما أن يمسح عبر أو يضغط باتجاه / إلى سطح ، ويواجه قوى جذب أو تنافر متفاوتة بسبب تفاعلاته مع العينة6. تؤدي هذه التفاعلات إلى انحراف الكابولي ، والذي يتم تتبعه من خلال انعكاس شعاع الليزر من أعلى الكابولي على كاشف ضوئي6. تمكن الحساسية الاستثنائية لحركة النظام AFM من إجراء مجموعة متنوعة من القياسات ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر رسم الخرائط المورفولوجية بدقة picometer ، وقياسات القوة التي تتراوح من piconewtons إلى micronewtons ، والتحقيقات الشاملة متعددةالفيزياء 7. على سبيل المثال ، يمكن إجراء المسافات البادئة AFM لتقييم الاستجابة بدقة للقوة المطبقة للعينة وأيضا لقياس الصلابة والمرونة والخصائص الميكانيكية الأخرى للعينة عن طريق الاقتران بالنماذج التحليلية المناسبة8. يتكون مسبار AFM بشكل شائع من السيليكون (Si) أو نيتريد السيليكون (Si3N4)8 بطول 20-300 ميكرومتر9 ونصف قطر طرف بترتيب عدة إلى عشرات النانومتر10. يمكن أن يكون نصف قطر طرف مقياس النانومتر مثاليا لتطبيقات مثل التصوير عالي الدقة. ومع ذلك ، فإنه لا يمتلك خصائص اللسعات البيولوجية للدراسات التي تحاول تقليد سلوكيات الاختراق من حيث الصلابة ونصف القطر والشكل ونسبة العرض إلى الارتفاع. على سبيل المثال ، بنية الإبرة الدقيقة للبعوض هي الكراسة ، التي لها نسبة عرض إلى ارتفاع ~ 6011 (الطول ~ 1.5 مم إلى 2 مم ؛ القطر ~ 30 ميكرومتر) 12. في حين يمكن افتراض أن مسبار AFM التقليدي يشبه اللدغة البيولوجية مثل الشفا ، فإن خصائصه وأبعاده المادية المميزة لن تعكس الوضع الحقيقي أثناء اللدغة.

لتمكين التحقيقات الكمية لسلوكيات الاختراق التي تحاكي اللدغات البيولوجية للحشرات أو الأخرى مع اللاسعات ، هنا ، عملية لتصنيع ناتئ AFM الهجين الحيوي مع ستينغر بيولوجي حيث يتم تطوير طرفه. كدراسة حالة ، تم بنجاح عرض ناتئ AFM مع طرف شفا البعوض المرفقة. من خلال تسخير المعلومات الموجودة من الأدبيات حول قوى الإدخال النموذجية التي تستخدمها البعوضة لاختراق جلد الضحية12,13 ، يمكن أن يسمح ناتئ AFM الهجين الحيوي هذا بتقليد شبه حقيقي لدغات البعوض تحت AFM العادي. يمكن أيضا تطبيق بروتوكول الاستفادة من اللاسعات البيولوجية الدقيقة لتصنيع ناتئات AFM الهجينة بيولوجيا لتطوير ناتئ AFM الحيوي الهجين الحاد الآخر القائم على ستينغر لإجراء تحقيقات كمية لمجموعة متنوعة من آليات العض.

المصطلحات
يظهر الشكل 1 مخططا للخرطوم ومكوناته ذات الأهمية ، وتعريفاتها هي (1) خرطوم: جزء من الجسم من فم البعوض يسمح للبعوض بإطعام نفسه ، مع بنية قشرة أساسية تتكون من الكراسة (النواة) والشفة (القشرة) ، (2) الشفرين: الغطاء الخارجي الداكن وغير الحاد للخرطوم2، (3) الكراسة: مجموعة من الإبر النحيلة الموجودة داخل الشفرين ، بما في ذلك اثنين من الفك العلوي ، واثنين من الفك السفلي ، والبلعوم السفلي ، والشفا2 ، (4) Hypopharynx: المسؤول عن إفراز اللعاب في مجرى دم المضيف2 ، (5) الفك العلوي: عضو مسنن يساعد في آلية التغذية2 ، (5) الفك السفلي: على غرار الفك العلوي ، فهي تساعد البعوض في آلية التغذية ولها طرف حاد2، (6) الشفا: العضو الرئيسي لاختراق جلد الضحية ، وهو أكبر بكثير من الفك العلوي والفك السفلي والبلعوم السفلي. كما أن لديها هياكل حسية تسمح لها بالعثور على الأوعية الدموية والقنوات الداخلية تحت الجلد2 ، (7) مناول: تجميع بثلاث درجات من الحرية ودقة مقياس ميكرون لتحديد المواقع ، مما يسمح بالحركة في اتجاهات XYZ ، (8) تجميع المشبك: مشبك مكون من جزأين مصنوع خصيصا مثبت على المناور المستخدم لربط ناتئ AFM بدون طرف أثناء التجربة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنواع البعوض المستخدمة في هذا البروتوكول هي أنثى الزاعجة المصرية البالغة غير المصابة (A. aegypti) ، التي يتم تجميدها وتخزينها في مجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية. تم توفير هذا النوع من قبل مركز موارد كاشف أبحاث داء الفيلاريات التابع للمعاهد الوطنية للصحة / NIAID للتوزيع من خلال موارد BEI ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة: الزاعجة المصرية غير المصابة ، سلالة العين السوداء ليفربول (المجمدة) ، NR-48920. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. تشريح الشفرين من خرطوم

  1. باستخدام الملقط ، ضع بعوضة ميتة على شريحة زجاجية تحت المجهر وتأكد من وجود طرف مدبب في نهاية خرطوم (الشكل 2 أ).
  2. مع إبقاء البعوضة على الشريحة الزجاجية ، ضع شفرة مشرط برفق فوق الشفرين بالقرب من رأس البعوضة (الشكل 2 ب).
  3. المضي قدما في إجراء شق عبر النصف العلوي بأكمله من الشفرين (قطع حوالي 80 ميكرومتر) مع عمق اختراق ضحل من خلال سمك الشفرين. تأكد من الضغط برفق على الشفرة لقطع الشفرين فقط ولكن ليس الملزمة التي تقع تحتها.
  4. باستخدام زوج من الملقط ، أمسك رأس البعوضة بإحكام ، ومع زوج آخر من الملقط الدقيق ، قم بقرص الشفة برفق في أي موضع بين الطرف المدبب وموقع الشق (الشكل 2 ب).
    1. اسحب الملقط الذي يحمل الشفرين في اتجاه الطرف المدبب (الشكل 2C). استمر في سحب الملقط حتى يتمزق الشفرين وتتم إزالته تماما من الكراسة.
  5. ضع البعوضة تحت المجهر وتحقق مما إذا كان طرف الشفا موجودا. يمكن التعرف على ذلك من خلال وجود طرف مدبب على الكراسة (الشكل 2 د).

2. فصل طرف الشفا عن أعضاء الكراسة الأخرى

  1. قم بتثبيت وإغلاق أطراف مجموعة من الملقط الدقيق وضع طرف الملقط بجوار الشفا بالقرب من طرفه.
  2. استخدم طرف الملقط لتطبيق قوة لطيفة على الشفا في الاتجاه العمودي على طول الملزمة (الشكل 3 أ).
  3. استمر في دفع الشفا عبر الشريحة الزجاجية حتى يتم تحقيق فصل الشفا عن أعضاء الكراسة الأخرى.
  4. افحص العينة تحت المجهر للتحقق من تحقيق الفصل المناسب بين الشفا وأعضاء الكراسة الأخرى (الشكل 3 ، على اليسار). إذا لم ينجح الفصل ، فارجع إلى الخطوة 2.1.

3. قطع طرف الشفا

  1. بينما لا يزال الشفا على الشريحة الزجاجية ، ضع شفرة مشرط فوق الشفا على مسافة ~ 200 ميكرومتر تقريبا من طرف الشفا (الشكل 4 أ). ضع ضغطا كافيا برفق واقطع طرف الشفا بالكامل. في حين أن طرف الشفا يجب أن يكون قصيرا قدر الإمكان ، فإن ~ 200 ميكرومتر هو أفضل ما يمكن للنهج الحالي التعامل معه.
  2. قم بقياس طول الشفا المقطوعة للتأكد من أنها لا تزيد عن 300 ميكرومتر (الشكل 4 ب) باستخدام أي برنامج قياس رقمي. في هذا البروتوكول ، تم استخدام ImageJ14.

4. الاستيلاء على طرف الشفا

  1. باستخدام زوج من الملقط الدقيق ، حدد موقع طرف الشفا على الشريحة الزجاجية واعزله. تخلص من كل جزء متبقي على الشريحة الزجاجية بخلاف طرف الشفا.
  2. بنفس الملقط الدقيق ، قم بقرص الشفا ببطء وبرفق بحيث تكون نهاية القطع خالية ولا تعيقها الملقط. تأكد أيضا من أن اتجاه الشفا مواز لاتجاه طول الملقط وأن الطرف المقطوع للشفا يشير بعيدا عن جسم الملقط.
  3. بمجرد أن يتم ضغط العينة بإحكام ، قم بإزالة قوة التثبيت التي تربط أطراف الملقط معا. سوف يلتصق طرف الشفا بأحد أطراف الملقط.
  4. تحت المجهر ، افحص أطراف الملقط وتأكد من وجود طرف الشفا على أحد أطراف الملقط (الشكل 5). إذا لم يكن طرف الشفا على الملقط ، فارجع إلى الخطوة 4.2 ، وإذا لم يكن طرف الشفا على الملقط ولا على الشريحة الزجاجية ، فارجع إلى الخطوة 1.

5. تطبيق الايبوكسي على شعاع الكابولي بلا أطراف

  1. ضع قطرة (~ 0.05 مل) من الإيبوكسي على حافة شريحة زجاجية جديدة عن طريق صب المادة اللاصقة مباشرة من الزجاجة / الحاوية الأصلية. ضع الشريحة الزجاجية المحتوية على الإيبوكسي أسفل محطة المسبار وركز عليها.
  2. قم بتركيب ناتئ AFM بدون طرف على مجموعة المشبك عن طريق تأمين القاعدة (أي الطرف الأكبر) ، وترك الطرف الكابولي خاليا ومعلقا في الفضاء. تأكد من أن الجزء السفلي من ناتئ AFM متجها لأسفل.
  3. قم بتركيب المناور على محطة المسبار.
  4. ارفع المحور Z للمناور إلى موضع يكون فيه الكابولي بدون طرف على بعد بضعة ملليمترات فوق الشريحة الزجاجية المحتوية على الإيبوكسي.
  5. حرك المعالج يدويا بحيث يكون الكابولي بدون طرف مرئيا في العرض الميداني للكاميرا على محطة المسبار.
  6. باستخدام المعالج ، حرك ناتئ AFM على طول الاتجاهين X و Y حتى يستقر طرف الكابولي مباشرة فوق الإيبوكسي على حافة الشريحة الزجاجية.
  7. باستخدام المعالج مرة أخرى ، قم بخفض الكابولي بدون طرف ببطء في الاتجاه Z على حافة الشريحة الزجاجية.
  8. عندما يتم إنزال الكابولي ويقترب من الشريحة الزجاجية ، استمر في خفض الكابولي ببطء شديد حتى يلامس الإيبوكسي لأول مرة. لا تخفض الكابولي أكثر من ذلك.
  9. بحذر ، قم بإشراك المعالج لتحريك الكابولي ببطء في الاتجاه X أو Y وإزالة الكابولي من مجموعة الإيبوكسي عن طريق تحريك الكابولي باستمرار في الاتجاه المحدد حتى يتم فصل الكابولي تماما عن الإيبوكسي على الشريحة الزجاجية. يجب أن يحتوي الكابولي عديم الأطراف على فقاعة مصغرة من الإيبوكسي عند طرفه ، مرئية تحت محطة التحقيق.
  10. ارفع الكابولي في الاتجاه Z باستخدام المعالج.

6. ربط طرف الشفا بشعاع الكابولي بدون طرف

  1. قم بتدوير المعالج حول المحور الطويل للناتئ بمقدار 90 درجة وإراحة المناور على محطة المسبار على جانبه. في هذا التكوين ، تكون السماكة على طول ناتئ AFM في الاتجاه الرأسي.
  2. ضع الملقط الدقيق الذي يحتوي على طرف الشفا أسفل كاميرا محطة المسبار بحيث يكون طول طرف الشفا مرئيا بالكامل على شاشة الكمبيوتر.
  3. ضع مجموعة المناور التي تحمل المشبك والكابولي بدون طرف أسفل كاميرا محطة المسبار بحيث يكون الطول الكامل للناتئ بدون طرف مرئيا على شاشة الكمبيوتر.
  4. ركز مجهر محطة المسبار على طرف الشفا والكابولي بدون إكرامية.
  5. قم بتوجيه الكابولي بشكل عمودي على طرف الشفا عن طريق تدوير المعالج بعناية ويدويا (الشكل 6 أ).
  6. باستخدام درجات حرية المعالج ، حرك الكابولي الذي لا طرف له ببطء في اتجاهات XY بحيث يلامس الغراء الموجود على الكابولي الطرف المقطوع لطرف الشفا (الشكل 6 ب).
  7. علاج الايبوكسي ، وترسيخ التقاطع بين الكابولي والشفا البعوض.
  8. بمجرد أن يعالج الإيبوكسي ، قم بإشراك المعالج برفق في اتجاهات XY وحرك الكابولي بعيدا عن الملقط ، وتحقق من أن طرف الشفا يقف الآن على شعاع الكابولي بدون طرف (الشكل 6C).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن العثور على صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لمسبار AFM الحيوي الهجين المصنع في الشكل 7. تم لصق نهاية الشفا بنجاح على شعاع الكابولي بدون طرف. بسبب الانحناء الطبيعي للدغات البعوض والتشغيل اليدوي للبروتوكول المقدم ، من الصعب للغاية الحصول على ناتئ مع طرف ستينغر عمودي تماما على الكابولي. عادة ما تكون الزاوية خارج المركز بين اللدغة وخط الوسط الوهمي العمودي على الكابولي ~ 10 درجات. في حين أنها تبدو مشكلة شائعة عند تركيب مسبار على ناتئ AFM15 ، يجب مراعاة الميل غير المقصود عند إجراء تحليل القوة / الإجهاد. سيكون من المثير للاهتمام أن تركز الدراسات المستقبلية على تحسين بروتوكول التصنيع وإجراء الدراسات باستخدام المسبار الحيوي الهجين. هذه هي المحاولة الأولى لصنع مسبار AFM هجين حيوي باستخدام ستينغر الحشرة.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لخرطوم البعوض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: إزالة شفة خرطوم البعوض. أ: بعوضة ذات خرطوم كامل يظهر وجود طرف مدبب سليم. ب: موقع شق الشفرين ووضع الملقط على الشفرين أثناء عملية إزالة الشفرين. ج: اتجاه سحب الملقط أثناء إزالة الشفرين. (د) الكراسة النهائية المقطعة ذات طرف سليم بعد إزالة الشفرين، مع بقاء طرف الشفا المدبب موجودا وسليما. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: فصل الشفا عن أعضاء الكراسات غير المرغوب فيها. (أ) موقع وضع الملقط واتجاه دفع الملقط كأسلوب لفصل أعضاء ملزمة خرطوم. (ب) خرطوم بعد التلاعب لفصل الشفا عن أعضاء الكراسة الأخرى. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: عزل طرف الشفا المطلوب للتركيب على الكابولي AFM. أ: موقع شق الشفا لإزالة طرف الشفا. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. (ب) يبلغ طول طرف الشفا ، بمجرد قطعه من جسم الشفا ، حوالي 200-300 ميكرومتر. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تركيب طرف الشفا على ملقط قبل عملية اللصق. التصق طرف الشفا بطرف أحد الملقط ، مع تحرير الطرف غير المصقول من الشفا وتوجيهه بعيدا عن جسم الملقط. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: تسلسل تركيب طرف الشفا على الكابولي عديم الأطراف. أ: توجيه الكابولي عديم الأطراف في وضع عمودي بالنسبة إلى الشفا. (ب) دمج الكابولي بدون طرف مع الشفا ومعالجة مادة الإيبوكسي اللاصقة المستخدمة لتصلب المفصل بين المكونين. (C) مسبار AFM الهجين الحيوي المعالج النهائي دون دعم الشفا بواسطة الملقط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: صور SEM لمسبار AFM الحيوي الهجين. (أ) منظر شامل لطرف الشفا والكابولي عديم الأطراف. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. (ب) منظر مكبرة لقمة الشفا. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تهدف الخطوة 1 من البروتوكول إلى تنظيف العينة البيولوجية من الشفرين غير المرغوب فيهما. لتحقيق ذلك ، يتم إجراء شق على الشفرين ، ولكن ليس على الكراسة ، التي تقع مباشرة تحت الشفرين (الشكل 1). نظرا لأن الملزمة والشفرين لا يتم ربطهما معا عند واجهتهما (أي أن الشفرين حر في الانزلاق على طول الكراسة ولا يتم الاحتفاظ به في مكانه إلا من خلال ارتباطه برأس البعوضة) ، فإن الشق الذي يتم إجراؤه يهدف إلى فصل جزء من الشفة عن رأس البعوضة ، وبالتالي تسهيل إزالة الغطاء الخارجي. أثناء سحب الشفرين من العينة ، يجب أن يواجه الفني مقاومة طفيفة ناتجة عن النصف السفلي من الشفرين الذي لا يزال ملتصقا بالبعوضة. من المتوقع أن تتحرر هذه القوة المقاومة بسهولة نسبية لأن الشق سيعزز انتشار الشقوق للمادة البيولوجية ، مما يؤدي إلى تمزق الجزء غير المصقول من الشفرين ويتسبب في انزلاق الشفرين بالكامل من الكراسة أثناء عملية السحب. إذا تم إجراء شق غير كاف ، فقد يواجه الفني مقاومة مفرطة أثناء السحب ويتم تشجيعه على محاولة شق آخر قبل الاستمرار في البروتوكول.

من المهم ممارسة لمسة ناعمة وصبر في الخطوة 1 والخطوة 4 عند التلاعب بالشفا عن طريق القرص بالملاقط. على الرغم من أن الشفا مرنة نسبيا ، إلا أنها قد لا تزال تتعرض للتلف إذا تم ضغطها بواسطة الملقط بقوة شديدة. يتم توجيه الفني لقرص الشفرين / الشفا برفق ، مما يعني أنه يجب عليهم تنفيذ الحد الأدنى من القوة اللازمة على الملقط لتثبيت الشفرين / الشفا. يمكن إجراء تقييم لوجود الضرر في نهاية الخطوة 1 والخطوة 4 عند فحص العينة تحت المجهر. ينصح بفحص خرطوم أي تشوهات على طوله (أي الخدوش ، التمزق ، الانفصال في شرائح). إذا اشتبه في تلف عينة في طرف الشفا ، فتخلص منها وأعد تشغيل البروتوكول.

تتطلب خطوات العملية الرئيسية للبروتوكول ، مثل الخطوة 3 والخطوة 6 ، عناية خاصة. لإنجاز الخطوة 3 ، يجب قطع طرف الشفا يدويا بمشرط. سيؤدي الاختصار الشديد إلى جعل بقية التجربة أكثر صعوبة لأنه يمكن أن يكون صغيرا جدا بحيث لا يمكن التلاعب به. على العكس من ذلك ، إذا تجاوز طول الطرف 300 ميكرومتر ، يصبح طويلا جدا بحيث لا يمكن تركيبه على ناتئ AFM بسبب الإزاحة العمودية المفرطة التي يتم إدخالها بين طرف الشفا والكابولي AFM. هذا الإزاحة مدفوع بعيوب في عملية التركيب و / أو انحناء قد يكون موجودا في العينة ، وكلاهما يصبح مشكلة عند أطوال الشفا الأكبر. أيضا ، سيكون من الصعب جدا استخدام الكابوليات ذات النصائح الطويلة جدا تحت AFM أيضا. خلال الخطوة 3 ، من المهم ملاحظة أنه من المحتمل أن يتم قطع جميع أنماط الكراسات (الشفا ، والفك العلوي ، والفك السفلي ، والبلعوم السفلي) في هذا الإجراء. سيتم تحديد موقع الشفا بسهولة وعزله عن الأنماط المتبقية في الخطوة 4 بسبب الفصل اليدوي الذي تم إجراؤه أثناء الخطوة 2. في الخطوة 6 ، على الرغم من أنه يكاد يكون من المستحيل التأكد من أن الطرف طبيعي تماما للناتئ تحت المجهر الضوئي ، إلا أنه لا يزال من الضروري تقليل زاوية الميل لتجنب ظروف التحميل غير المرغوب فيها في الاستخدام المستقبلي.

من المهم أيضا اختيار الإيبوكسي المناسب لربط اللدغة بالكابولي AFM. تم اختبار العديد من الإيبوكسي البطيء المكون من جزأين ، والذي ثبت لاحقا أنه ليس مثاليا لأن أي اهتزاز صغير لأرضية المختبر أثناء عملية المعالجة يمكن أن يتسبب في فشل التجربة. وهكذا ، تم اعتماد الايبوكسي القابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية في نهاية المطاف. المادة اللاصقة المستخدمة عبارة عن إيبوكسي منخفض اللزوجة وسريع المعالجة قادر على المعالجة في غضون 5 ثوان من التعرض للأشعة فوق البنفسجية. عند التصلب ، يصبح الغراء صلبا جدا وله قوة ممتازة ، مما يتسبب في تصرف مسبار الشفا الكابولي المصنع كجسم واحد ولا يفشل أو يتشوه في موقع الالتصاق. يوفر هذا الخيار وقتا كافيا قبل المعالجة لتكوين الإعداد في الموضع المناسب للالتصاق ستينغر بناتئ AFM (الخطوة 6.3) مع التخلص من أي مشكلات تتعلق بالاهتزازات البيئية بسبب سلوك المعالجة عند القيادة.

المعدات الحاسمة المتبقية في هذا البروتوكول هي محطة المسبار ، والملاقط الحادة ، والكابولي. تم تجهيز محطة المسبار المستخدمة بعدسة 5x مثبتة على الكاميرا ؛ ومع ذلك ، ليس من الضروري استخدام نموذج محطة التحقيق الدقيق هذا لهذا البروتوكول. عند اختيار محطة المسبار ، فإن الأولوية الوحيدة هي ضمان رؤية واضحة وسهلة لناتئ AFM والشفا. كانت الملقط الحادة المستخدمة بحجم طرف 0.5 مم × 0.1 مم. من الضروري استخدام ملاقط من هذا البعد الطرف أو ما شابه ذلك لأن استخدام ملقط مع دقة أقل قد يؤدي إلى صعوبة أثناء التلاعب بالشفا. يتم الحصول على الكابولي المستخدم في هذا البروتوكول من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم اختيار هذا النموذج الكابولي بسبب صلابته العالية حيث يجب نقل قوة كبيرة إلى طرف مسبار البعوض من أجل محاكاة اختراق الجلد الواقعي. بشكل عام ، بالنسبة لجميع المجسات القائمة على ستينغر ، لا يمكن أن يكون ناتئ AFM ناعما جدا لأن نقص الصلابة سيؤدي إلى ثني الكابولي أثناء اختبار AFM ، مما يؤدي بدوره إلى نقص تطور الضغط عند طرف مسبار ستينجر. سيؤدي ذلك إلى أن يحاكي المسبار عملية اللدغة بشكل غير دقيق ، مما يجعل ناتئات AFM شديدة الصلابة شرطا لهذا البروتوكول.

باختصار ، لها فوائد فريدة لاستخدام مسبار AFM الهجين الحيوي القائم على ستينغر لدراسات الاختراق / العض الميكانيكية الكمية مقارنة بالطرق الأخرى التي تتطلب البعوض الحي والمتطوعين البشريين4،11،12لإجراء دراسات مماثلة. يمكن لدقة الاستشعار الفائقة ل AFM تمكين القياس بدقة غير مسبوقة ، ويتيح المسبار الحيوي الهجين محاكاة قريبة من واقعية لسيناريوهات العض الفعلية ، ودمج عدد كبير إحصائيا من القياسات دون الحاجة إلى متطوعين بشريين4،11،12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المواد المستخدمة في تصنيع الإبر الدقيقة المهندسة عادة ما تكون عرضة للكسر أو التواء 3,4 ، وهو ما لا يمثل خرطوم البعوض. استخدام أجزاء البعوض نفسها يشبه بشكل أفضل سيناريو العض الحقيقي. يمكن تطوير هذا البروتوكول وأتمتته بشكل أكبر للإنتاج عالي الإنتاجية. أخيرا ، يمكن استخدام البروتوكول المطور لإنتاج مجسات AFM هجينة حيوية أخرى باستخدام لسعات مختلفة لإجراء دراسات كمية لمختلف سلوكيات العض / الاختراق.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بالدعم التمويلي المقدم من صندوق الحدود الجديدة في الأبحاث (NFRF) في كندا ، وبرنامج اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) ، ومنح تدريب الماجستير في Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT). يود المؤلفون أيضا أن يشكروا مجموعة البروفيسور Yaoyao Zhao في McGill على دعمهم الفني في طباعة 3D لبعض المكونات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  5-SA-SE ملاقط مدببة مدببة فائقة الدقةمستقيمة ExceltaN / Aلمعالجة / تشريح خرطوم.
محطة مسبار C-4DEverbeing Int ل كورب غير متاحيستخدم لتجميع AFM.
وضع التنصت بدون تيش ناتئNanoAndMore الولايات المتحدة الأمريكيةtl-NCHAFM ناتئ يستخدم لتركيب الشفا.
المواصفات هنا:

Shape < / strong>: Beam
Force Constant< / قوي>: 42 نيوتن / م (10 - 130 نيوتن / م)
<قوي >تردد الرنين < / قوي>: 330 كيلو هرتز (204 - 497 كيلو هرتز)
<قوي>الطول< / قوي>: 125 & micro; م (115 - 135 وميكرو ؛ م) < / > <قوي > العرض < / قوي >: 30 وميكرو ؛ م (22.5 - 37.5 وميكرو ؛ م)
<قوي > سمك < / قوي >: 4 وميكرو ؛ م ( 3 - 5 & micro ؛ م)
الأشعة فوق البنفسجية Expoxyدعونا ALR00146 الراتنجلمرفق اللدغة.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Global vector control response 2017–2030. World Health Organization. , (2017).
  2. Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. Lessons from mosquitoes’ painless piercing. J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).
  3. Ma, G., Wu, C. Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review. Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).
  4. Kong, X., Wu, C. Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design. Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).
  5. Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement. Sci Rep. 10 (1), 12248(2020).
  6. Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. Introduction to Scanning Probe Microscopy. Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).
  7. García, R., Peréz, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  8. Thurner, P. J. Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone. WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).
  9. Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).
  10. Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology. Meas Sci Technol. 28 (1), 012001(2017).
  11. Kong, X. Q., Wu, C. W. Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system. Phys Rev E. 82 (1), 011910(2010).
  12. Kong, X. Q., Wu, C. W. Measurement and prediction of insertion force for the mosquito. J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).
  13. Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design. Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001(2008).
  14. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide (2012).
  15. Dai, G., et al. Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures. Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة