Method Article

مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة تجميع الخلايا للتحقيق في تكوين أنسجة طحال الفئران

DOI:

10.3791/66682

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clem Jones Centre for Regenerative Medicine, Faculty of Health Sciences and Medicine, Bond University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة بروتوكولا لتجميع خلايا الطحال وتغليفها داخل مصفوفة غشاء قاعدي شبه صلب. يمكن استخدام تركيبات مصفوفة الغشاء القاعدي في الثقافة ثلاثية الأبعاد لدراسة تطور الأعضاء ، أو لدراسات زرع الجسم الحي وتجديد الأنسجة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطحال هو عضو مناعي يلعب دورا رئيسيا في الاستجابات المناعية المنقولة بالدم. يزيد الفقدان التشريحي أو الوظيفي لهذا النسيج من التعرض لالتهابات الدم الحادة والإنتان. تم استخدام الزرع التلقائي لشرائح الطحال سريريا لاستبدال الأنسجة المفقودة واستعادة وظيفة المناعة. ومع ذلك ، فإن الآلية التي تقود تجديد أنسجة الطحال القوية والوظيفية مناعيا لم يتم توضيحها بشكل كامل. هنا ، نهدف إلى تطوير طريقة لتجميع وتغليف خلايا الطحال داخل مصفوفة شبه صلبة من أجل التحقيق في المتطلبات الخلوية لتشكيل أنسجة الطحال. تكون تركيبات الخلايا المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي قابلة لكل من زراعة الأنسجة في المختبر من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد وكذلك الزرع تحت كبسولة الكلى لتقييم تكوين الأنسجة الحية مباشرة. من خلال معالجة خلايا الإدخال للتجميع والتغليف ، أثبتنا أن خلايا انسجة الأطفال حديثي الولادة المشتقة من الكسب غير المشروع PDGFRβ + MAdCAM-1- مطلوبة لتجديد أنسجة الطحال في إطار نماذج زراعة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان تمزق الطحال الرضحي وظهور عقيدات طحالية متعددة في الجسم أحد المؤشرات الأولى على أن أنسجة الطحال لديها قدرة متجددة 1,2. تم إدخال عمليات زرع الطحال في وقت لاحق إلى العيادة للحفاظ على أنسجة الطحال في المرضى الذين يحتاجون إلى استئصال الطحال في حالات الطوارئ3. ومع ذلك ، على الرغم من كونها جزءا من الممارسة السريرية لعقود من الزمن ، لا يعرف سوى القليل جدا عن كيفية تجدد الطحال. قدمت نماذج زراعة نظرة ثاقبة على معايير متعددة لتجديد الطحال ووظيفة المناعة 4,5. على وجه الخصوص ، سمحت التعديلات التجريبية على طريقة تحضير الكسب غير المشروع بدراسة تجديد الأنسجة بمزيد من التفصيل على المستوى الخلوي والجزيئي.

تخضع عمليات الزرع التي تتضمن شرائح طحال كاملة لمرحلة من النخر الجماعي قبل إعادة بناء هيكل الطحال الجديد6. تشير المرحلة الأولية من نخر الكسب غير المشروع إلى أن الجزء الأكبر من الأنسجة المزروعة يتكون إلى حد كبير من خلايا الدم الحمراء والبيضاء وغير ضروري لتجديد الطحال. تم التحقيق في ذلك تجريبيا عن طريق استبعاد الخلايا المكونة للدم من ترقيع الطحال قبل الزرع تحت كبسولة الكلى الفأر. هنا ، تبين أن الجزء غير الكريات البيض / غير كريات الدم الحمراء من الطحال ، والذي يتضمن الخلايا اللحمية والبطانية ، كاف للحث على تكوين أنسجة دي نوفو 7. يمكن معالجة أنسجة انسجة الطحال بشكل أكبر في تعليق أحادي الخلية ، مما يتيح استخدام تقنيات فرز الخلايا لمعالجة تكوين الكسب غير المشروع الخلوي. من خلال إزالة أنواع الخلايا المرشحة بشكل انتقائي ، تم تحديد مجموعتين من الخلايا اللحمية CD45-TER-119 التي لا غنى عنها لتطوير الكسب غير المشروع: مجموعة خلايا CD31 + CD105 + MAdCAM-1 + تشبه البطانة ومجموعة خلايا اللحمة المتوسطة PDGFRβ + المحددة على نطاق أوسع8.

يختلف بناء الطعوم من خلايا الطحال من حيث مواد الدعم وعمليات تحميل الخلايا. تم تحضير الطحال المصمم بالأنسجة مسبقا عن طريق تحميل وحدات الطحال على سقالة بوليمر حمض اللاكتيك polyglycolic / poly-L 5,9. ومن المثير للاهتمام أن خلايا انسجة الطحال التي تم امتصاصها في إسفنجة الكولاجين فشلت في التطعيم ، في حين أن الخلايا اللحمية المجمعة والمحملة على ورقة الكولاجين سهلت تجديد الطحال8. كما ثبت أن إعادة تعليق خلايا انسجة الطحال داخل مصفوفة Matrigel تحفز تراكم الخلايا في ظل ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد10. ومع ذلك ، لم يتم اختبار هذه الطريقة لاستخدامها في نماذج الزرع. الهدف العام من البروتوكول الحالي هو تجميع وتغليف خلايا انسجة الطحال بالقوة مباشرة داخل مصفوفة الغشاء القاعدي ، والتي يمكن نقلها لاحقا إلى نظام زراعة الأنسجة ثلاثي الأبعاد في المختبر أو استخدامها كوسيلة لزراعة النماذج الحيوانية (الشكل التكميلي 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات التجريبية المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة كوينزلاند (UQBR / 079/19).

1. جمع الأنسجة وإعداد الخلايا اللحمية

  1. القتل الرحيم 0.5-1.5 يوم من الذكور و / أو الإناث BALB / c الفئران المانحة حديثي الولادة عن طريق تحريض انخفاض حرارة الجسم عن طريق لف داخل المناديل الورقية ووضعها تحت الثلج المجروش لمدة >10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول مع سلالات الفئران المختلفة والأعمار وعدد.
  2. تحضير الأدوات الجراحية المعقمة.
  3. ضع الماوس في الموضع الجانبي الأيمن. امسح الجلد بنسبة 80٪ من الإيثانول وقم بعمل شق 1 سم بمقص جراحي قزحية لكشف الجدار البريتوني.
  4. قم بعمل شق ثان بطول 0.5 سم فوق الطحال واستخدم زوجا من الملقط الدقيق لرفع الأنسجة برفق. استخدم مقصا جراحيا لقطع الأوعية الدموية واستئصال الأنسجة. انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على محلول ملحي مقسم بالفوسفات المثلج (PBS). قم بإزالة أي نسيج ضام متبقي متصل بالطحال.
    ملاحظة: يمكن أن يساعد المجهر المجسم في الحركات الحركية الدقيقة اللازمة لمعالجة الأدوات الجراحية.
  5. لفصل الأنسجة الكاملة ، انقل الطحال الوليدي (برك من 10 أو أقل) إلى الحافة الداخلية لغطاء أنبوب مخروطي مقلوب سعة 14 مل. قم بتعطيل الأنسجة ميكانيكيا بحركة ضغط باستخدام الطرف الخلفي البلاستيكي لمكبس حقنة سعة 1 مل.
  6. ضع الغطاء وثبته بإحكام فوق أنبوب مخروطي سعة 14 مل يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني بارد. اقلب الأنبوب 5x لغسل جميع الأنسجة المعطلة من الغطاء إلى الأنبوب.
  7. كرر الخطوة 1.6 لأي أنسجة متبقية.
  8. اترك الأنبوب على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للأنسجة بالاستقرار في قاع الأنبوب.
  9. تخلص بعناية من المادة الطافية (التي تحتوي على خلايا مكونة للدم) عن طريق تمرير المحلول من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر قابلة للعكس.
  10. استعادة الجزء اللحمي غير القابل للذوبان عن طريق عكس المصفاة وغسل الأنسجة اللحمية مرة أخرى في الأنبوب المخروطي سعة 14 مل باستخدام 2 مل محضرة حديثا من وسط النسر المعدل (sDMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 1 مجم / مل كولاجيناز IV و 40 ميكروغرام / مل DNase I و 2٪ مصل بقري جنيني (FBS).
    تنبيه: كولاجيناز IV وكولاجيناز D من المواد الخطرة ويجب التعامل معها داخل خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  11. لتحضير معلق خلية واحدة ، هضم الأنسجة المجمعة إنزيميا (حتى 20) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
  12. أضف 4 مل من sDMEM المحضر حديثا الذي يحتوي على 1 مجم / مل كولاجيناز D و 40 ميكروغرام / مل DNase I و 2٪ FBS مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة اللحمية. احتضان لمدة 10 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
  13. أوقف عملية الهضم بإضافة 8 مل من برنامج تلفزيوني بارد. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  14. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا مرتين عن طريق تعليق 1 مل من PBS البارد والطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. الحفاظ على الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: يمكن عد الخلايا وتعديلها حسب التركيز المطلوب. قد يتطلب ذلك تحسينا لمجموعات الخلايا المختلفة. باستخدام هذا البروتوكول ، عادة ما يتم استرداد 0.5 × 106- 1 × 106 خلايا انسجة / طحال ، اعتمادا على عمر الفئران المانحة. يمكن اختياريا تلطيخ الخلايا وفرز FACS في هذه المرحلة لتحديد تكوين الخلية.

2. تغليف مصفوفة مجاميع الخلايا

  1. قم بتبريد أطراف ماصة P200 المعقمة مسبقا داخل فريزر -20 درجة مئوية.
  2. قطع فيلم المختبر المرن (على سبيل المثال ، Parafilm) إلى قطع 1 سم × 2 سم وتعقيمها عن طريق غمرها في 80٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، تليها PBS لمدة 10 دقائق. يمكن تحضير فيلم المختبر مقدما وتخزينه معقما.
  3. تحضير 0.5 × 10 6-2.5 × 106 خلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشاق بعناية طاف ، وترك ما يقرب من 20 ميكرولتر من حجم PBS المتبقي. الحفاظ على بيليه الخلية على الجليد.
    ملاحظة: يمكن سحب PBS المتبقي برفق دون إزعاج حبيبات الخلية لتأكيد الحجم.
  4. نضح 2 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاعد البارد إلى طرف ماصة P200 مبرد مسبقا ، باستخدام ماصة P20.
    ملاحظة: تساعد مصفوفة الغشاء القاعدي عالية التركيز (على سبيل المثال ، Corning Matrigel Matrix عالية التركيز) في تكوين سدادة صلبة قوية.
  5. قم بتحريف بلطف لإخراج طرف الماصة. قم بتمديد شريط معقم مسبقا من فيلم المختبر وضعه على نهاية طرف الماصة ، مع الحرص على عدم اختراق الفيلم. استمر في لف الطرف في الفيلم لإغلاق طرف الماصة. ضع الطرف المختوم بعناية مباشرة على الجليد ، مع الحرص على عدم تمزق الفيلم.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS المتبقية وقم بوضع المحلول برفق فوق مصفوفة الغشاء القاعدي. الحفاظ على البناء على الجليد.
  7. تحضير أنبوب الطرد المركزي عن طريق وضع أنبوب عنقودي 1.2 مل داخل أنبوب مخروطي 14 مل.
  8. ضع طرف الماصة داخل تكوين الأنبوب المتداخل وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. ضع الأنبوب المخروطي سعة 14 مل في اتجاه رأسي واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالتصلب داخل طرف الماصة.
    ملاحظة: يمكن وضع الأنبوب المخروطي سعة 14 مل على الجليد حتى يكون مطلوبا للتطبيق النهائي.

3. ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد

  1. قم بإزالة فيلم المختبر بعناية من طرف الماصة.
  2. أدخل مكبس رفيع من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ من خلال الفتحة الأكبر لطرف الماصة.
  3. اطرد سدادة المصفوفة حتى يتم إطلاقها من خلال الطرف في بئر واحدة من صفيحة زراعة الأنسجة غير المعالجة المكونة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من sDMEM المكمل ب 10٪ FBS ، 1x الجلوتاماكس ، 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، مثبط الصخور 10 ميكرومتر ، 10 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 50 ميكرومتر β-ميركابتوإيثانول.
    ملاحظة: يمكن ضبط وعاء زراعة الأنسجة وحجم الوسائط المقابل حسب الحاجة.
    تنبيه: NEAA والبنسلين / الستربتومايسين و β-mercaptoethanol هي مواد خطرة ويجب التعامل معها داخل خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  4. استزراع المواد العضوية عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 95٪ رطوبة لمدة 4-12 أسبوعا.
  5. استبدل نصف الوسط كل 5 أيام.
    ملاحظة: إذا بدأت المواد العضوية في الالتصاق بلوحة زراعة الأنسجة ، فنقلها إلى بئر جديدة.

4. زرع كبسولة الكلى

  1. تحضير الأدوات الجراحية المعقمة.
  2. إجراء عملية زرع الكلى تحت المحفظة من المكونات مصفوفة الغشاء القاعدي:
    1. تخدير الفأر المتلقي BALB / c البالغ من العمر 8 أسابيع باستخدام الأيزوفلوران باتباع إرشادات أخلاقيات المؤسسية.
      تنبيه: الإيزوفلوران مادة خطرة. يجب تنظيف غاز النفايات لمنع الدخول إلى بيئة مساحة العمل.
    2. ضع الماوس في الموضع الجانبي الأيمن.
    3. حلق الشعر من موقع الجراحة وتطهير الجلد باتباع الإرشادات المؤسسية.
      ملاحظة: يوصى بتطهير موقع الجراحة ثلاث مرات بحركة دائرية باستخدام فرك بالتناوب القائم على اليود أو الكلورهيكسيدين والكحول.
    4. قم بعمل شق 2 سم في الجلد عموديا على العمود الفقري لكشف الجدار البريتوني.
      ملاحظة: يمكن استخدام مقص جراحي دقيق أو شفرة مشرط لشق الجلد. يجب على المستخدمين اتباع إرشادات أخلاقيات المؤسسية أو إجراءات التشغيل القياسية.
    5. قم بعمل شق أصغر بمقدار 0.5 سم في الجدار البريتوني فوق الكلى.
      ملاحظة: يجب أن يقترب الشق من عرض الكلى لضمان بقاء الكلية خارجية أثناء الزرع.
    6. قم بإضفاء الطابع الخارجي على الكلى من خلال الفتحة البريتونية عن طريق الضغط لأسفل باستخدام الإبهام والسبابة. يمكن استخدام زوج من الملقط الدائري للمساعدة في المظهر الخارجي. تأكد من أن الكلى رطبة طوال العملية عن طريق تطبيق برنامج تلفزيوني معقم بانتظام باستخدام قطعة قطن.
    7. تحت المجهر المجسم ، قرصة الدهون المحيطة بالكلى من كبسولة الكلى مع زوج من ملقط دقيق للغاية عازمة في قطب واحد من الكلى. استخدم زوجا ثانيا من الملقط الناعم للغاية المثني لتمزيق غشاء كبسولة الكلى برفق لأعلى في اتجاه معاكس ، مما يخلق فتحة صغيرة.
    8. أدخل بعناية شق ملقط واحد تحت غشاء الكبسولة. استخدم حركة كنس بطيئة لفصل الغشاء الكبسولي عن حمة الكلى.
    9. قم بإعداد قابس مصفوفة الغشاء القاعدي للزرع عن طريق إزالة فيلم المختبر من طرف الماصة.
    10. ارفع كبسولة الكلى باستخدام شق واحد من الملقط وأدخل طرف الماصة من خلال الفتحة ، وادفعها نحو القطب المقابل للكلية.
    11. أدخل مكبس سلكي في طرف الماصة واطرد قابس المصفوفة مع سحب طرف الماصة في نفس الوقت من الكلى.
    12. بلل الكلى مع برنامج تلفزيوني وإعادة استيعاب.
    13. أغلق الجدار البريتوني بخياطة Vicryl واحدة 5-0 وأغلق الجلد بمشبكين تلقائيين.
    14. تطبيق مسكن (البوبرينورفين بمعدل 0.05-0.1 ملغم/كغ تحت الجلد أو باتباع الإرشادات المؤسسية لأخلاقيات).
      تنبيه: البوبرينورفين مادة خطرة ويجب التعامل معها بمعدات الحماية الشخصية المناسبة.
  3. قم بإيقاف تدفق الأيزوفلوران ولكن استمر في تدفق الأكسجين للسماح للفأر بتنفس الأكسجين النقي حتى يبدأ في اكتساب الوعي.
  4. أعد الماوس إلى قفصه. حافظ على دفء أثناء الشفاء عن طريق وضع القفص جزئيا فوق وسادة التدفئة أو تحت مصباح حراري ، ومراقبته حتى يتعافى الفأر تماما من التخدير.
  5. راقب التعافي بعد الجراحة خلال الأسبوعين الأولين أو كما هو مطلوب بموجب الإرشادات المؤسسية.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجميع الخلايا مهم لتعزيز الاتصال والإشارات من خلية إلى خلية. دعم تغليف مجاميع الخلايا داخل مصفوفة الغشاء القاعدي كلا من الثقافات ثلاثية الأبعاد لتشكيل الأنسجة العضوية في المختبر وسهل التسليم الميكانيكي للخلايا في كبسولة الكلى لزرع الكسب غير المشروع. لإنشاء هذه التركيبات ، تم الحفاظ على مصفوفة الغشاء القاعدي لأول مرة في حالة سائلة في ظل ظروف الجليد الباردة. تم تحقيق تجميع الخلايا لاحقا عن طريق وضع طبقات من معلق الخلية المركز أعلاه واستخدام قوة الطرد المركزي لدفع الخلايا عبر المصفوفة عالية الكثافة. كان مطلوبا تحسين سرعة الطرد المركزي (200-2000 × جم) لتحقيق وضع خلية الطبقة الوسطى (الشكل 1 أ) ، والذي كان يعتمد أيضا على رقم الخلية. دفعت قوى الطرد المركزي الأعلى (>500 × جم) الخلايا إلى طرف الماصة (الشكل 1 ب) ، والحذر مطلوب لأرقام الخلايا الأصغر (أي <5 × 105) التي قد تضيع أثناء إزالة غطاء فيلم المختبر المرن. على العكس من ذلك ، قد لا تنتقل الخلايا بشكل كاف عبر مصفوفة الغشاء القاعدي إذا كانت قوى G منخفضة جدا (≤200 × جم) (الشكل 1C). قد تحتاج سرعة الطرد المركزي لأرقام الخلايا <1 × 105 أو >2.5 × 106 إلى مزيد من التحسين. بعد الطرد المركزي ، تم وضع الخلايا داخل مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق تسخين البناء عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. مكنت عملية التصلب هذه من إخراج "قابس" المصفوفة بالكامل (الشكل 1 د) باستخدام مكبس سلك رفيع.

في تشكيل عضوي الطحال في المختبر
سدادات مصفوفة الغشاء القاعدي المقذوفة في وعاء زراعة الأنسجة المناسب شكلت بشكل متكرر هياكل شبيهة بالعضوية ثلاثية الأبعاد والتي يمكن الحفاظ عليها باتباع تقنيات وظروف زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة) 11. في الثقافة ، تبددت ركيزة مصفوفة الغشاء القاعدي الداعمة تدريجيا بين اليومين 0 و 14 (الشكل 2A ، i-iii) ولم يعد من الممكن ملاحظتها بحلول اليوم 21 ، تاركة كتلة خلية كروية شبيهة بالعضوية سليمة (الشكل 2A ، السادس) يبلغ قطرها حوالي 545 ميكرومتر (s.d. = 120 μm ، n = 6) 11 في القطر. تم دعم هذه الهياكل العضوية في الثقافة بعد 30 يوما ولكنها لم تزد في الحجم بمرور الوقت (الشكل 2 ب). تتكون عضويات الطحال من CD45-TER-119- اللحمية ، CD45-TER-119+ كريات الدم الحمراء ، و CD45 + TER-119- الخلايا اللمفاوية (الشكل 2C) ، ومع ذلك ، كان تواتر كل مجموعة متغيرة عبر الكائنات العضوية الفردية (n = 4; الجدول 1). لتقييم الهيكل العام لعضويات الطحال ، تم تحضير وتصور عمليات تجميد الأنسجة بسمك 50 ميكرومتر. كانت الكائنات العضوية تتكون من بنية غير مجوفة ، مع وجود خلايا عبر قطر الأنسجة بالكامل (الشكل 2 د). كشف تقييم المقاطع العضوية عند سمك طبقة خلية واحدة 7 ميكرومتر أن الخلايا مرتبة في هياكل تشبه الحبل دون اتجاه مكاني واضح (الشكل 2D) ، مع مناطق خالية من النوى بين سلاسل الخلايا. تحقق تلطيخ الأجسام المضادة CD45 من وجود خلايا المكونة للدم النواة التي أحاطت بكثافة بالمناطق المحيطية من العضو العضوي (الشكل 2E). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت خلايا CD45 + ذات مورفولوجيا متميزة على شكل مغزل في مناطق عضوية أكثر مركزية. أظهر الغياب العام لتلطيخ الأجسام المضادة CD90.2 (الخلايا التائية) و CD19 (الخلية البائية) ، ولكن تلطيخ CD11b الإيجابي ، الوجود المحدد للخلايا النخاعية (الشكل 2F). كما تم الكشف عن الخلايا البطانية CD105 + و CD31 + غير المكونة للدم في العديد من الكائنات العضوية11.

زرع الطحال في الجسم الحي
إن تغليف الخلايا اللحمية الطحالية المجمعة داخل مصفوفة شبه صلبة يسهل دراسات زرع. تم استخدام هذه التقنية لتضمين مستحضرات الخلايا اللحمية الطحال غير المجزأة أو CD45-TER-119- FACS المصنفة داخل سدادة مصفوفة الغشاء القاعدي ، والتي تعمل كوسيلة للزرع تحت كبسولة الكلى الفأر. تماشيا مع بروتوكولات تجميع الخلاياالمماثلة 8 ، نجحت تركيبات الخلايا المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي (MECCs) في تجديد أنسجة الطحال في 4/5 عمليات زرع مستقلة ، مما يؤكد جدوى تقنية بناء الكسب غير المشروع هذه. لاختبار فائدة MECCs في تحديد أنواع الخلايا المطلوبة لتجديد الطحال ، تم بناء ترقيع MECC من خلايا الطحال الوليدية التي تم استنفادها على وجه التحديد من PDGFRβ + MAdCAM-1 + أو PDGFRβ + MAdCAM-1- الخلايا اللحمية (CD45-)11. احتفظت الطعوم التي تفتقر إلى خلايا PDGFRβ + MAdCAM-1 + بالقدرة على تجديد الأنسجة الإجمالي (4/4 الطعوم ؛ الشكل 3 أ) 11. أظهرت ثلاثة من أصل أربعة أنسجة مجددة تكوين وبنية طبيعية لخلايا الطحال ، حيث عرضت الشرايين المركزية ، وبصيلات اللب الأبيض ، ومقصورات الخلايا التائية والبائية المنفصلة ، والخلايا المتغصنة المسامية ، والخلايا الشبكية في المنطقة الهامشية ، والبلاعم المعدنية الهامشية ، والجيوب الأنفية ذات اللب الأحمر ، والخلايا النخاعية والبلاعم (الشكل 3 ب)11. في المقابل ، فشلت الطعوم التي تفتقر إلى خلايا PDGFRβ + MAdCAM-1- إلى حد كبير في تجديد أنسجة الطحال (1/4 الطعوم) 11. تدعم هذه البيانات أهمية خلايا PDGFRβ + المشتقة من الكسب غير المشروع في تجديد أنسجة الطحال8 ، وتحدد متطلبات محددة للخلايا اللحمية PDGFRβ + MAdCAM-1.

figure-results-1
الشكل 1. تغليف مصفوفة الغشاء القاعدي لخلايا انسجة الطحال المجمعة. يتم استخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر لتسهيل تجميع الخلايا داخل مصفوفة الغشاء القاعدي. يتم إنشاء طبقة مصفوفة سائلة أولا عن طريق استنشاق 2 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاعد البارد إلى طرف ماصة مبرد مسبقا. يتم ترسيب تعليق الخلية فوق طبقة المصفوفة ، ويتم تطبيق قوة الطرد المركزي لتعبئة وتجميع الخلايا داخل مصفوفة الغشاء القاعدي. (أ) تم تحسين إعدادات سرعة أجهزة الطرد المركزي لوضع مجاميع الخلايا في منتصف الطريق على طول طبقة المصفوفة. (ب) تؤدي سرعة الطرد المركزي المفرطة إلى تجمع الخلايا في نهاية الماصة. (ج) السرعة غير الكافية تمنع حركة الخلية عبر المصفوفة. (د) يتم إخراج سدادة مصفوفة شبه صلبة من طرف الماصة بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تشير رؤوس الأسهم إلى وضع مجاميع الخلايا داخل المصفوفة. شريط مقياس ، 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. في الثقافة المختبرية لمجاميع الطحال المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي وتشكيل هياكل عضوية 3 أبعاد. (أ) تطور عضويات الطحال خلال دورة زمنية مدتها 35 يوما. تتوافق اللوحات (i-vi) مع الأيام 0 و 7 و 14 و 21 و 28 و 35 في الثقافة. تم التقاط الصور على مجهر تباين الطور المقلوب TS2 من نيكون. شريط مقياس ، 500 ميكرومتر. (ب) قطر الطحال العضوي خلال فترات الاستزراع الممتدة. يمثل كل سطر عضويا فرديا. (ج) توصيف قياس التدفق الخلوي لمجموعات الخلايا اللحمية (CD45-TER-119-) واللمفاوية (CD45 + TER-119-) والإريثرويد (CD45-TER-119+) بعد 53 يوما في الثقافة. اللوحة العلوية: أنسجة التحكم المحضرة من سدى الطحال الوليدي. اللوحة السفلية: الطحال العضوي ، اليوم 52. (د) مورفولوجيا إجمالية للأنسجة العضوية عند 50 ميكرومتر (الألواح العلوية) و 7 ميكرومتر (الألواح السفلية) سمك المقطع بعد 22 يوما في الثقافة. (ه) توطين وتشكل الخلايا المكونة للدم CD45 + بعد 34 يوما في الثقافة. تظهر المنطقة المكبرة في اللوحات اليمنى. المقاطع 7 ميكرومتر. (F) تقييم الخلايا النخاعية (CD11b) و T (CD90.2) و B (CD19) بعد 34 يوما في الثقافة. تظهر المنطقة المكبرة في أقحم. المقاطع 7 ميكرومتر. تم التقاط الصور باستخدام مجهر الخلية الحية Nikon Eclipse Ti2-E. قضبان المقياس (D ، E ، F) ، 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. تحليل أنسجة الكسب غير المشروع لمصفوفة الغشاء القاعدي. تم بناء الطعوم من سدى الطحال الوليدي المستنفد لخلايا PDGFRβ + MAdCAM-1 + (n = 4). بيانات إضافية متاحة على الإنترنت11. (أ) المظهر العياني لطعم الطحال المتجدد في 4 أسابيع بعد الزرع تحت كبسولة الكلى. تشير المنطقة الصفراء المعبأة إلى أنسجة الطحال المجددة. تم التقاط الصورة باستخدام مجهر مجسم Leica M60 مزود بمحول تكبير Snap و Apple iPhone 6S. شريط مقياس ، 1000 ميكرومتر. (ب) صور مضان مناعي مركب متعدد الألوان لأنسجة طعم بسمك 30 ميكرومتر مجزأة بالتبريد على المستوى الإكليلي. تم إجراء تلطيخ الأجسام المضادة بعلامات محددة لتصور العمارة الدقيقة لأنسجة الطحال. تم التقاط الصور باستخدام مجهر الخلية الحية Nikon Eclipse Ti2-E. تظهر المساحات المعبأة مناطق ذات تكبير أعلى. شريط مقياس ، 1000 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

رقم عضويالخلايا اللحميةكريات الدم الحمراءاللمفاويات
1627.731
2222455
33.60.196
4107612

الجدول 1. النسبة المئوية لمجموعات الخلايا اللحمية والحمراء واللمفاوية بين عضويات الطحال الفردية.

الشكل التكميلي 1. نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول تسلط الضوء على الخطوات الرئيسية في إنشاء تركيبات الخلايا المدمجة في المصفوفة للدراسات في المختبر وفي الجسم الحي . الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل تجميع خلايا الطحال الوليدي داخل وسط شبه صلب طريقة قابلة للتطبيق لتوليد تركيبات الطحال. تم استخدام بروتوكولات مماثلة قائمة على مصفوفة الغشاء القاعدي لبدء مزارع الطحال ثلاثية الأبعاد10. هنا ، نوضح أن تركيبات الطحال قابلة بنفس القدر لأنظمة الاستزراع العضوي في المختبر وكذلك لنماذج زرع الأعضاء في الجسم الحي . وتجدر الإشارة إلى أن زرع عضويات الطحال المستزرعة في المختبر لم يتم اختباره بعد ولكن سيكون من المهم تحديد القدرة على تجديد أنسجة الطحال بالكامل أو جزئيا. يرث هذا البروتوكول أيضا تقنيات تجميع الخلايا الموصوفة في دراسات زرع الطحال السابقة8. تضمنت هذه الدراسات تحميل مجاميع الخلايا على ورقة الكولاجين متبوعة بالزرع تحت كبسولة الكلى. يوفر تغليف مجاميع الخلايا داخل مصفوفة الغشاء القاعدي ميزة واضحة من حيث اتجاه الكسب غير المشروع ، حيث يتم التخلص من الاختلاف المرتبط بالجانب السفلي من ورقة الكولاجين مقابل زرع الجانب السفلي من جانب الخلية الكلي.

منهجية إعداد تركيبات مصفوفة الغشاء القاعدي واضحة نسبيا. يضمن استخدام مصفوفة الغشاء القاعدي عالية التركيز دعم الخلايا في البداية في حالة مجمعة ، قبل أن تتبدد المصفوفة على مدار عدة أيام. في تجربتنا ، هناك حد أدنى من الخلط والتخفيف لمصفوفة الغشاء القاعدي بعد طبقات دقيقة (الخطوة 2.6) والطرد المركزي (الخطوة 2.8) لمحلول الخلية المعلقة PBS. تتمحور معظم التحسينات حول وضع حبيبات الخلية داخل قابس المصفوفة (الشكل 1). يمكن معالجة ذلك عن طريق اختبار العديد من المتغيرات مثل سرعة الطرد المركزي ، والوقت ، وتكوين حجم مصفوفة الغشاء القاعدي ، وحجم محلول الخلية المعلقة PBS ، وحجم طرف الماصة. قد يؤثر رقم الخلية وخصائصها (الحجم والكثافة) أيضا على الإعدادات ، ويجب تحسين كل إعداد خلية على حدة.

هناك العديد من القيود المهمة لتسليط الضوء عليها. يمكن أن تكون مصفوفة الغشاء القاعدي منتجا حساسا لدرجة الحرارة ، ويجب توخي الحذر للعمل بسرعة للحفاظ على برودة الكواشف. هذا يمنع تصلب المصفوفة المبكر ويضمن التغليف المناسب للخلايا. بينما يتم تخزين جميع المواد ذات الصلة أو تحضيرها أو صيانتها في بيئة باردة ، فإن خطوات المناولة اليدوية (على سبيل المثال ، إخراج طرف الماصة ، والختم بغشاء مختبري مرن [الخطوة 2.5]) قد تؤدي بشكل مختلف إلى إدخال حرارة خارجية من المستخدم ، وتغيير لزوجة المصفوفة والتأثير على خصائص هجرة الخلايا أثناء الطرد المركزي. لذلك ، قد يكون من الصعب تحقيق قابلية التكاثر داخل التجارب وفيما بينها باستمرار.

القيد الثاني هو شرط تجربة المستخدم والكفاءة. قد تتطلب بعض التقنيات اليدوية تدريبا موسعا لأداء بكفاءة ونجاح. على سبيل المثال ، قد يؤدي إغلاق طرف الماصة بفيلم المختبر (الخطوة 2.5) في البداية إلى انخفاض معدلات النجاح ، ولكن هذا سيتحسن حتما مع الممارسة. كما يتم الحصول على الكفاءة مع تقنيات الجراحة الدقيقة الحيوانية من خلال التكرار. بالنسبة لعمليات الزرع ، يجب توخي الحذر ، خاصة عند إدخال طرف الماصة أسفل كبسولة الكلى (الخطوة 4.2.10) ، وإدخال مكبس السلك لإخراج القابس (الخطوة 4.2.11) ، وسحب الطرف من الكلى. من المهم أن يتم إخراج القابس برفق وثبات بينما يتم سحب طرف الماصة في نفس الوقت. قد تؤدي الحركة الزائدة إلى ثقب كبسولة الكلى أو تلف الحمة ، مما يؤدي إلى نزيف مفرط.

باختصار ، تم وصف عملية تغليف الخلايا داخل مصفوفة شبه صلبة هنا مع التركيز على فهم تكوين أنسجة الطحال. يمكن تطبيق هذا النظام بالتساوي على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا مع إمكانية تطبيقات متعددة في المختبر أو في الجسم الحي في المصب.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (#GNT1078247).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 بئر البولي بروبيلين 1.2 مل أنابيب العنقوديةكورنينجCLS4401لوضعها داخل أنبوب مخروطي 14 مل
B-mercaptoethanolGibco21985023مخزون 55 ملي مولار ، استخدم في 50 ميكرومتر
كولاجيناز DRoche11088858001
كولاجيناز IVسيجما-ألدريتشC5138من كلوستريديوم الأنسجة
ديوكسيربونوكلياز I (DNase I)Sigma-AldrichD4513Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقري ، النوع II-S ، مسحوق مجفف بالتجميد ، بروتين & ge ؛ 80 ٪ ، & ge ؛ 2,000 وحدة / ملغ بروتين
Dulbecco s النسر المعدل s متوسط (DMEM)سيجما ألدريتشD57964500 مجم / لتر جلوكوز ، L-جلوتامين ، وبيكربونات الصوديوم ، بدون بيروفات الصوديوم ، سائل. معقمة مفلترة.
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم ،
Eclipse 200 & mu ل نصائح الماصةLabcon1030-260-000الجنينية المخروطية
(FBS)Gibco26140-079Lot # 1382243
GlutaMAXGibco35050061Stock 100X ، استخدم في 1X
MatrigelCorning354263غشاء قاعدي مصفوفة Matrigel تركيز عال ، Lot # 7330186
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140076مخزون 100X ، استخدم في 1X
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122مخزون 10,000 وحدة / مل البنسلين ، 10,000 ميكروغرام / مل مصفاة الخلايا القابلة للانعكاس الستربتومايسين
STEMCELL Technologies2721670 & mu ؛ m
الملقط الدائريNAPOXA-26حجم الحلقة: 3 مم
مثبط الصخور (Y-27632)MedChemExpresHY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R الطرد المركزيتمضبط سرعات التسارع والتباطؤ على 8
ملاقط فائقة الدقةEMS78340-51Sالطراز 51S. ملاقط فولاذية أوستنيتي منخفضة الكربون مضادة للمغناطيسية / مضادة للأحماض SA مقاومة للتآكل. لمسة نهائية من الساتان المضادة للوهج.
Vicryl 5/0 خياطة Ligapak بكرةEthiconJ283G
Wiretrol II مكبس سلك طويلDrummond5-000-2002-Lمكبس من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 25 و 50 & L / WRTL II ، LONG &NBSP ؛
مشبك الجرحMikRon427630
مقاطع الجرحMikRon4276319 مم
محلول مصل الأبقار

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
  2. Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
  3. Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863(1989).
  4. Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
  5. Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
  6. Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
  7. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
  8. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401(2017).
  9. Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
  10. Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408(2019).
  11. Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. H. Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation. , Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Basement Membrane MatrixCell AggregationSpleen Tissue FormationMurine SpleenOrganoid CultureKidney Capsule TransplantationStromal Cell AggregationMatrigel EncapsulationTissue RegenerationPDGFR Beta Cells

Related Articles