مقالة منهجية

هندسة الخلايا الدبقية الصغيرة المستحثة بالدم البشري لأبحاث الدماغ العكسية

DOI:

10.3791/66819

⸱

سبتمبر 6, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 2Department of Functional Anatomy and Neuroscience, Asahikawa Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدد هذه الدراسة نهجا جديدا لإنشاء خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية (iMG) والتي تمكن من التقييم غير المباشر لالتهاب الدماغ. يقدم هذا نموذجا خلويا قد يكون مفيدا للبحث الذي يركز على الالتهاب المحتمل للدماغ والاضطرابات العصبية والنفسية المرتبطة به.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أبرزت التحقيقات الحديثة التي تستخدم النماذج الحيوانية أهمية الخلايا الدبقية الصغيرة كمعدلات مناعية حاسمة في مختلف الأمراض العصبية والنفسية والجسدية. تحليل الدماغ بعد الوفاة والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني هي طرق بحث تمثيلية تقيم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى من البشر. كشفت النتائج عن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في أدمغة المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية نفسية مختلفة وألم مزمن. ومع ذلك ، فإن التقنية المذكورة أعلاه تسهل فقط تقييم الجوانب المحدودة لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة.

بدلا من خزعة الدماغ وتقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، ابتكرنا في البداية تقنية لتوليد خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة (iMG) المستحثة مباشرة من وحيدات الدم المحيطية البشرية المشتقة حديثا عن طريق استكمالها بعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم والإنترلوكين 34 لمدة 2 أسابيع. يمكن استخدام خلايا iMG هذه لإجراء تحليلات مورفولوجية وجزيئية ديناميكية تتعلق بقدرة البلعمة وإطلاق السيتوكين بعد تحفيز الإجهاد على المستوى الخلوي. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحليل شامل للنسخ للتحقق من التشابه بين خلايا iMG البشرية والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في الدماغ.

قد تكون خلايا iMG المشتقة من المريض بمثابة علامات بديلة رئيسية للتنبؤ بالتنشيط الدبقي الصغير في أدمغة البشر وقد ساعدت في الكشف عن الفيزيولوجيا المرضية الديناميكية غير المعروفة سابقا للخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى الذين يعانون من مرض ناسو هاكولا ، والألم العضلي الليفي ، والاضطراب ثنائي القطب ، ومرض مويامويا. لذلك ، تعمل التقنية القائمة على iMG كأداة قيمة للترجمة العكسية وتوفر رؤى جديدة في توضيح ديناميكية الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة في مجموعة متنوعة من الأمراض العقلية والجسدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، اقترح أن يؤدي التهاب الدماغ أدوارا محورية في الفيزيولوجيا المرضية لمختلف اضطرابات الدماغ والاضطرابات العصبية والنفسية. تم تسليط الضوء على الخلايا الدبقية الصغيرة كخلايا مناعية رئيسية من خلال تحليل الدماغ البشري بعد الوفاة وتقنيات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)1،2،3،4. تكشف تحليلات تصوير الدماغ والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني بعد الوفاة عن نتائج مهمة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير فعالة من حيث التقاط الأنشطة الجزيئية الديناميكية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في الدماغ بالكامل. لذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجيات جديدة لتمكين التقييم الشامل لوظائف الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية والاختلالات الوظيفية على المستويين الجزيئي والخلوي.

في عام 2014 ، قمنا في الأصل بتصميم تقنية جديدة لإنتاج خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة (iMG) المستحثة مباشرة 5,6 ، قبل النشر الأول للخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (iPSC) الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الإنسان في عام 20167. في أسابيع 2 فقط ، نجحنا في تحويل وحيدات الدم المحيطية البشرية إلى خلايا iMG عن طريق تحسين السيتوكينات ، عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) والإنترلوكين 34 (IL-34). عندما طورنا هذه التقنية ، كانت طريقة إعادة البرمجة المبتكرة لتحفيز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو الخلايا الليفية قد بدأت للتو في الانتشار فيالعالم 8،9،10،11. ومع ذلك ، في ذلك الوقت ، لم يتم الإبلاغ عن طريقة لتحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPS ، وكان من المرغوب فيه إنشاء نموذج الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجسدية البشرية. نظرا لأن السيتوكينات مثل GM-CSF و IL-34 ، عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، تم الإبلاغ عن أنها ضرورية لتطوير وصيانة الخلايا الدبقية الصغيرة12،13،14،15 ، افترضنا أنه يمكن تطبيق مزيج من هذه السيتوكينات مباشرة لتوليد نموذج خلوي دبقي صغير من وحيدات الدم. أخيرا ، نجحنا في تطوير نموذج للخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الوحيدة من خلال الجمع بين GM-CSF و IL-345. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام بعض هذه المجموعات من السيتوكينات أيضا للحث على الخلايا الدبقية الصغيرة من خلايا iPS 7,16 ويفترض أنها عامل مهم في اكتساب خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة.

على عكس طرق iPSC ، لا تتطلب خلايا iMG أي تعديل وراثي ويمكن توليدها في وقت قصير جدا عن طريق الحث الكيميائي البسيط ، مما يؤدي إلى انخفاض الوقت والتكاليف المالية. علاوة على ذلك ، لا تتطلب خلايا iMG إعادة برمجة جينية ، لذلك نعتقد أن خلايا iMG هي خلايا بديلة قوية لتقييم ليس فقط السمات ولكن أيضا حالات الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية. في الورقة الأولية حول تقنية iMG في عام 2014 ، أكدنا أن خلايا iMG تظهر نمطا ظاهريا من الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، والتي يمكن أن تكون متميزة عن الخلايا الوحيدة والبلاعم. على سبيل المثال ، أظهرت خلايا iMG نسبة تعبير مفرطة لمستقبلات CX3C chemokine 1 (CX3CR1) ومستقبلات C-C chemokine من النوع 2 (CCR2) من الخلايا الوحيدة وعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة النموذجية ، بما في ذلك البروتين عبر الغشاء 119 (TMEM 119) ومستقبلات البيورينرجيك P2RY12 5,17. في الآونة الأخيرة ، تحققنا من أن خلايا iMG المشتقة من الدم المحيطي تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ في ملف تعريف التعبير الجيني لعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة المعروفة في نفس المريض الذي خضع لجراحات الدماغ18. يمكن تحليل خلايا iMG للوظائف الديناميكية على المستوى الجزيئي ، مثل البلعمة وإنتاج السيتوكين ، ومن المتوقع أن تعوض عن عيوب أبحاث الدماغ بعد الوفاة ودراسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.

لقد اكتشفنا آليات فيزيولوجية مرضية ديناميكية غير معروفة سابقا تتضمن الخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بمرض ناسو هاكولا5 أو الألم العضليالليفي 19 أو الاضطراب ثنائي القطب20,21 أو مرض مويامويا22. علاوة على ذلك ، بناء على منهجيتنا الأصلية ، استخدمت مختبرات مختلفة خلايا iMG (حددت بعض المختبرات أسماء بديلة لهذه الخلايا) كأداة بحث عكسية حاسمة23،24،25،26،27. نجح Sellgren et al. في إنشاء خلايا iMG وفقا لتوصياتنا وأجرى تحليلا دقيقا ، والذي كشف أن هذه الخلايا تشبه إلى حد كبير الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ البشري23. في الآونة الأخيرة ، أكدنا التشابه بين خلايا iMG البشرية والخلايا الدبقية الأولية في الدماغ باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي18.

تهدف هذه الدراسة إلى توثيق منهجية توليد خلايا iMG من الدم المحيطي البشري لتسهيل الأبحاث العكسية التي تركز على الأمراض العصبية والنفسية. تقدم هذه التقنية إمكانات كأداة تحليلية معقولة يمكنها إنتاج نماذج خلوية دبقية صغيرة دون عناء في فترة وجيزة ، حتى في المختبرات غير المجهزة التي تفتقر إلى أجهزة نقل الجينات أو الموظفين الأكفاء.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة كيوشو وامتثل لجميع أحكام إعلان هلسنكي. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المشاركين ، بما في ذلك المتطوعين والمرضى الأصحاء ، لتحليل دمائهم ونشر بياناتهم. يتم سرد المواد والمعدات في جدول المواد ، ويتم تفصيل تركيبات الحلول في الجدول 1.

1. إعداد الوسائط والمخازن المؤقتة للتجارب

  1. تحضير وسط العزل عن طريق استكمال RPMI-1640 بمصل بقري جنيني معطل حراري بنسبة 10٪ (56 درجة مئوية ، 30 دقيقة) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت العازل عن طريق استكمال المحلول العازل الأساسي بمحلول مخزون مصل البقر (BSA) بنسبة 0.5٪ وتعقيمه عن طريق الترشيح (0.22 ميكرومتر).

2. عزل الخلايا أحادية النواة من الدم الكامل

  1. انقل 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب طرد مركزي متدرج الكثافة 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: عزل 15 مل من الدم لكل أنبوب طرد مركزي متدرج الكثافة 50 مل. زيادة عدد الأنابيب عندما يكون حجم الدم مرتفعا.
  2. تجانس الدم الذي تم جمعه في أنابيب الهيبارين عن طريق الانقلاب وإزالة الغطاء من أنبوب جمع الدم بملاقط معقمة بالنار.
  3. صرف حجم متساو (10-15 مل) من الدم إلى وسط تدرج الكثافة في أنبوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
  4. اضبط مستوى تباطؤ جهاز الطرد المركزي على 1 من 4 مستويات وأجهزة الطرد المركزي على 1000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: عند معدل التباطؤ هذا، يتم احتجاز سرعة دوران تبلغ 180 × جم (1000 دورة في الدقيقة) في 3 دقائق.
  5. قم بإعداد عدد متساو من أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل مثل أنابيب الطرد المركزي المتدرجة الكثافة 50 مل واملأ كل أنبوب ب 10 مل من PBS (-).
  6. قم بإزالة الطبقة العليا من البلازما حتى حوالي 1 سم فوق طبقة بافي بعد الطرد المركزي.
    ملاحظة: أدخل ماصة شفط عموديا في الأنبوب وانضح بعناية من وسط سطح السائل. لا تبالغ في الاستنشاق لتجنب إزعاج المعطف الفاخر.
  7. صب كل المواد الطافية المتبقية من أنبوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة 50 مل في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 10 مل من PBS (-).
  8. إعادة ضبط مستوى تباطؤ جهاز الطرد المركزي إلى 3 من 4 مستويات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق في RT. خلال هذه الخطوة ، قم بإعداد أنبوب طرد مركزي واحد سعة 50 مل وأنبوبي طرد مركزي سعة 15 مل ومصفاة خلية 100 ميكرومتر.
  9. بعد الطرد المركزي ، حدد درجة حرارة جهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية. ابحث عن حبيبات بيضاء ذات محيط أحمر في أسفل أنبوب الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط وقم بفك الحبيبات برفق عن طريق النقر.
  10. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر على أنبوب مخروطي سعة 50 مل باستخدام ملاقط معقمة بالحريق.
  11. دمج 13 مل من وسط العزل في أحد أنابيب الطرد المركزي وغسل الجدار الداخلي لجمع الخلايا بشكل صحيح. خذ تعليق الخلية واغسل أنابيب الطرد المركزي المتبقية بطريقة متتالية. بعد جمع الخلايا من جميع الأنابيب ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلوية في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
    ملاحظة: يجب تبريد وسيط العزل طوال عملية العزل (الخطوات 2.11-2.16).
  12. اغسل كل أنبوب مرة أخرى ب 13 مل من وسط العزل كما هو موضح في الخطوة 2.11. جمع ما مجموعه 26 مل من تعليق الخلية.
  13. قم بتوزيع كميات متساوية في أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل ، وقم بتعداد الخلايا ، واحسب التركيز المناسب للمخزن المؤقت المعزول (60 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل 107 خلايا إجمالية) للخطوة 2.16.
    ملاحظة: من الأفضل التعامل مع الأنبوب المخروطي سعة 15 مل لأن حجم السائل صغير وفقاعات السائل بسهولة عند السحب في الخطوة 2.16.
  14. جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  15. أثناء الطرد المركزي ، قم بتطهير الحامل المغناطيسي تماما (خاصة الجزء الملامس للعمود) بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضعه على المقعد ليجف في الهواء. حافظ على عازل العزل على الجليد.
  16. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط (في هذه المرحلة ، ابحث عن الكريات الحمراء ~ 1 مم بسبب وجود خلايا الدم الحمراء) ، وأضف الكمية المناسبة من المخزن المؤقت للعزل ، وقم بفك الحبيبات برفق عن طريق سحب ~ 20x.

3. عزل الخلايا الوحيدة باستخدام ميكروبيدات CD11b

  1. كاشف حجب FcR البشري الدوامي لمدة 10 ثوان قبل التطبيق. دمج الكمية المطلوبة من الكاشف (20 ميكرولتر من كاشف حجب FcR لكل 107 خلايا إجمالية) واحتضانها في غرفة عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. دوامة الميكروبيدات CD11b لمدة 10 ثوان قبل التطبيق. قم بدمج الكمية المطلوبة من الكاشف (20 ميكروبيدات CD11b لكل 107 خلايا إجمالية) ، واحتضانها في غرفة 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة أثناء التقليب باليد كل 5 دقائق.
  3. بعد الحضانة ، أضف 10 مل من المخزن المؤقت للعزل ، وقم بتعليقه بواسطة ماصة لطيفة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. أثناء الطرد المركزي ، ضع العمود المغناطيسي على الحامل المغناطيسي واشطفه ب 3 مل من المخزن المؤقت للعزل.
    ملاحظة: امتنع عن لمس الجزء المغناطيسي من العمود وضع العمود بشكل صحيح. إذا دخلت الفقاعات إلى العمود ، فقم بإزالتها باستخدام ماصة. يتم تفويض المخزن المؤقت للعزل ليتم تبريده طوال عملية العزل (الخطوات 3.4-3.9).
  5. قم بإزالة طافد ما بعد الطرد المركزي عن طريق الشفط ، ودمج 1 مل من المخزن المؤقت للعزل ، واخلطه عن طريق السحب برفق ، ثم ضع التعليق على العمود.
  6. اغسل العمود 3x بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت للعزل في كل مرة يكون فيها خزان العمود فارغا.
  7. ضع العمود في أنبوب مخروطي سعة 15 مل دون لمس الجزء المغناطيسي ؛ دمج 5 مل من المخزن المؤقت للعزل في العمود وإجبار السائل على الخروج عبر العمود مع إدخال مكبس في الأنبوب.
  8. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية الذي تم جمعه في الأنبوب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. نضح الطافع وإعادة تعليق الخلايا في وسط العزل. نظرا لأنه سيتم استرداد ~ 5-10٪ من عدد الخلايا التي تم حسابها في الخطوة 2.13 ، اضبط حجم التعليق وفقا لعدد الخلايا.
    ملاحظة: يجب استخدام وسط العزل في RT وعدم تسخينه لتجنب التغير السريع في درجة الحرارة من 4 درجات مئوية.
  10. تعداد الخلايا والقسمة 500 ميكرولتر من معلق الخلية في كل بئر من 24 صفيحة بئر بتركيز 40 × 104 خلايا / مل واحتضانها طوال الليل.
    ملاحظة: يجب سحب معلقات الخلايا بشكل مناسب وفقا لحجم البذر المعدل المطلوب للألواح المختلفة. على سبيل المثال ، 1 مل لبئر واحد في لوحة 12 بئر و 250 ميكرولتر لبئر واحد في شريحة غرفة 8 آبار.
  11. أخيرا ، تخلص من المعدات الملوثة أو تطهيرها وفقا لسياسة التعامل مع النفايات المعدية التي وضعتها المنشأة.

4. تحريض خلايا iMG من الخلايا الوحيدة

  1. تحضير وسط الحث عن طريق استكمال وسط الحث القاعدي بمحلول مضاد حيوي مضاد حيوي 1٪ ، و 10 نانوغرام / مل من GM-CSF البشري المؤتلف ، و 100 نانوغرام / مل IL-34 البشري المؤتلف.
  2. استبدل وسط العزل من البذر في اليوم السابق بوسط الحث. قم بإمالة اللوحة للأمام واستنشاق الوسط المستنفد على الفور من الحافة الأمامية لقاع البئر باستخدام ماصة باستور. استبدل الوسط بمعدل 1 لوحة كحد أقصى (= 24 بئرا) في المرة الواحدة ، وقم على الفور بدمج 500 ميكرولتر من وسط الحث بلطف.
    ملاحظة: يجب اختيار الخلايا الوحيدة الملتصقة في هذه الخطوة.
  3. احتضان الخلايا لمدة 14 يوما لإكمال الحث.
  4. استبدل الوسط مرة أخرى ب 500 ميكرولتر من وسط الحث بعد 14 يوما. بعد ذلك ، لصيانة الخلايا بعد الحث ، استبدل وسط الحث ب 500 ميكرولتر من وسط الحث الطازج كل أسبوع.

5. الكيمياء المناعية

  1. قم بإزالة الوسط من شريحة الغرفة المكونة من 8 آبار والمصنفة بالخلايا في الخطوة 3.10 عن طريق الشفط واشطفها باستخدام PBS (-).
  2. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT مع 4 ٪ بارافورمالدهيد.
  3. قم بإزالة الكاشف المثبت وشطف الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام PBS (-).
  4. تتخلل الخلايا مع PBS (-) التي تحتوي على 0.1٪ Triton X-100 في RT.
  5. احتضان الخلايا المتداخلة بمحلول مانع (3٪ BSA / PBS (-)) لمدة 1 ساعة في RT.
  6. احتضان الخلايا طوال الليل بالأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتم تخفيف جميع الأجسام المضادة في محلول مانع.
  7. شطف الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني (-) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  8. احتضان الخلايا المغسولة بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة الموسومة بالفلورسنت لمدة 1 ساعة في RT (جدول المواد).
  9. شطف الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق مع PBS (-) لإزالة الأجسام المضادة الثانوية.
  10. احتضان الخلايا بمحلول DAPI (1: 10000) المخفف ب PBS (-) لمدة 5 دقائق في RT.
  11. شطف الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني (-).
  12. قم بتركيب البئر باستخدام وسيط التركيب وتصور الخلايا تحت مجهر مضان.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأهم من ذلك ، هناك قدر كبير من عدم التجانس على مستوى الشخص ومستوى التوقيت في خصائص خلايا iMG بما في ذلك الأشكال والتعبيرات الجينية. تفترض خلايا iMG في بعض الأفراد مظهرا متفرعا العديد (الشكل 1 أ) ، بينما تظل كروية في حالات أخرى (الشكل 1 ب). قد تختلف خصائص iMG حتى داخل الفرد الواحد ، مما يجعل خلايا iMG أداة محورية للكشف عن المؤشرات الحيوية لحالة المرض. وعلى العكس من ذلك ، فإن فحص هذه الاختلافات بين الأفراد يستدعي الحد من الأخطاء الفنية. يتم تعريف خلايا iMG على أنها وحيدات مستحثة ب GM-CSF و IL-34 لمدة لا تقل عن 14 يوما. لتقليل الأخطاء الفنية ، يوصى بتوحيد وقت الحث ، واستخدام نفس الكميات من الكواشف ، والامتناع عن استخدام الكواشف منتهية الصلاحية.

يؤكد التحقق من صحة التلوين المناعي أيضا أن خلايا iMG تعبر عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرة ، بما في ذلك P2RY12 و TMEM119 (الشكل 2). أظهرت الأبحاث السابقة أن الخصائص المورفولوجية والتعبير الجيني لخلايا iMG مرتبطة بالفيزيولوجيا المرضية للاضطراب ثنائي القطب20,21. لوحظت أقدم الخلايا المتفرعة في اليوم 3 بعد علاج GM-CSF و IL-34 ، ويمكن لخلايا iMG في الحالة المثلى البقاء على قيد الحياة لأكثر من 1 شهر عندما يتم التغيير المتوسط مرة واحدة في الأسبوع. يمكن استخدام خلايا iMG لتحليل التعبير الجيني. على سبيل المثال ، تحت التحفيز باستخدام إنترفيرون جاما أو IL-4 ، غيرت خلايا iMG نمط التعبير الجيني ، والذي يمكن استخدامه للتقييم الوظيفي للخلايا الدبقية الصغيرة المستقطبة M1 و M2 5,22. علاوة على ذلك ، تؤدي حبات FITC إلى تعديلات مورفولوجية تشبه الأميبويد وتنظم التعبير عن TNFα والجينات الأخرى5. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم البلعمة عن طريق قياس شدة مضان الخرز 5,22. علاوة على ذلك ، نظرا لأن خلايا iMG هي خلايا قابلة للحياة ، يمكن ملاحظة حركتها الفعلية وتغيراتها المورفولوجية من خلال التقاط صور للخلية (الشكل 3) أو من خلال التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني (الفيديو 1).

figure-results-1
الشكل 1: مورفولوجيا خلايا iMG. (أ) أظهرت iMG المتشعبة النموذجية أجسام سوما دقيقة والعديد من الضمانات المتفرعة. (ب) تباينت بعض العينات في المظهر مثل النوع الأميبي. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التلوين الخلوي المناعي لخلايا iMG. تعبر خلايا iMG عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرة النموذجية: (أ) TMEM 119 ، (ب) P2RY12. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: التعديلات المورفولوجية في خلايا iMG. iMG تغيير مورفولوجيتها أثناء عملية الحث. تظهر نتوءات الخلية (أ) حوالي اليوم 3 وتستطيل في اليومين (ب) 7 و (ج) 14 مع استمرار الحث. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيديو 1: التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني لخلايا iMG. يبدو أن خلية iMG المتشعبة في المركز تقيم اتصالا مع الخلايا المحيطة أثناء توسيع عملياتها وتقليصها. علاوة على ذلك ، قامت الخلية بالبلعمة للخلايا التالفة. كانت فترات التقاط الصور 46 ثانية ، وكان وقت التصوير حوالي 14 ساعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الجدول 1: تكوين الحلول يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد تكون التقنيات التحليلية التي تستخدم خلايا iMG بمثابة أدوات بحث عكسية قوية 5,6. لتوليد كميات كافية من خلايا iMG البشرية ، يجب على المجربين تصميم دراساتهم مع مراعاة بعض القضايا. عينات الدم المستمدة من البشر حساسة للغاية. وبالتالي ، فإن العينات التي تم الحصول عليها تتطلب المعالجة الفورية والمعالجة الدقيقة لتجنب التلوث. على وجه التحديد ، يجب فصل عينات الدم فور سحبها وعدم تركها دون مراقبة لفترات طويلة. تبدأ التجارب تقليديا في غضون 3 ساعات من جمع الدم لتأكيد صحتها. ومع ذلك ، من الممكن تخزين عينات الدم عند 4 درجات مئوية لأكثر من 3 ساعات وإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة قبل بدء بروتوكولات الفصل.

لضمان نتائج مستقرة ، يوصى باستخدام الكواشف مثل وسائط الاستزراع في غضون شهر من فتحها والتخلص منها عند انتهاء الصلاحية. عند فصل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، يمكن ملاحظة تجميع الخلايا في عينات معينة. في مثل هذه الحالات ، يجب تخفيف عينة الدم الكاملة باستخدام برنامج تلفزيوني (-) لمنع التجميع. أثناء تحريض التمايز إلى الخلايا الدبقية الصغيرة ، لا يتم استبدال وسط الاستزراع لمدة 14 يوما لتجنب التحفيز غير الضروري للخلايا. بعد الانتهاء من تحريض التمايز ، قد يؤدي الاستبدال المتوسط بوسط جديد إلى استعادة الخلايا الضعيفة والحفاظ على صلاحيتها لفترة من الوقت.

تمثل تقنية iMG المحددة في هذه الدراسة قيودا. "الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة" المستحثة تجريبيا قابلة للمقارنة ولكنها ليست متطابقة تماما مع الخلايا الدبقية الصغيرة الفعلية في الدماغ البشري. بالإضافة إلى ذلك ، وثقت الأبحاث السابقة منهجية لتحريض الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية ، واقترحت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولاتها وأسمائها المميزة الخاصة بها بناء على طرق iMG الأصلية28. على سبيل المثال ، تستخدم بعض البروتوكولات M-CSF29،30،31،32 أو TGF-β33 ، والتي تم الإبلاغ عنها لتعزيز النمط الظاهري الشبيه بالخلايا الدبقية الصغيرة في مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC أو على الطلاء مثل Geltrex24,34 ؛ قد تكون هذه العوامل فعالة في تحفيز الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة.

تعد تقنية iMG الأصلية مفيدة نظرا لبروتوكولها البسيط وسهل التكاثر مع اثنين فقط من السيتوكينات وبدون طلاء ، مما يتيح مجموعة متنوعة من التجارب العكسية باستخدام دم الإنسان. على العكس من ذلك ، سهلت التطورات في التكنولوجيا تطوير العديد من المنتجات. تتضمن طرق الفصل المغناطيسي الاختيار الإيجابي المستند إلى العمود ، على غرار بروتوكولنا ، بالإضافة إلى الاختيار السلبي والطرق الخالية من الأعمدة. علاوة على ذلك ، بدلا من الفصل المغناطيسي ، يمكن النظر في طريقة بديلة للفصل باستخدام التصاق البلاستيك. يضمن الاختيار الإيجابي القائم على العمود النقاء ، لكن هذه التقنية تستغرق وقتا طويلا ، ويؤثر التحفيز بواسطة الخرزات المغناطيسية بشكل كبير على الخلايا35. على العكس من ذلك ، قد يكون الاختيار السلبي والالتصاق البلاستيكي أقل ضررا للخلايا. ومع ذلك ، قد تكون هذه الأساليب أقل نقاء35,36. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التعديل بناء على بروتوكولات أخرى في المستقبل.

تثبت النتائج المذكورة أعلاه أن الميزة السائدة لتقنية iMG هذه هي مدتها القصيرة ومنهجيتها الفعالة من حيث التكلفة وقدرتها على معالجة عدد كبير من العينات للدراسات عالية الإنتاجية. لذلك ، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لاكتساب المعرفة من العينات البشرية ثم إجراء المزيد من دراسات التحقق باستخدام نماذج حيوانية مختلفة. علاوة على ذلك ، قد تكون النتائج التي تم الحصول عليها من التحقيقات التي أجريت على النماذج الخلوية والحيوانية من خلال تطبيق تقنية iMG مفيدة. وبهذه الطريقة، يمكن تطبيق تقنية iMG الخاصة بنا على الأبحاث الانتقالية ثنائية الاتجاه بطريقة من السرير إلى المقعد ومن المقعد إلى السرير.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من المنح المساعدة التالية للبحث العلمي: (1) الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (KAKENHI; JP18H04042 و JP19K21591 و JP20H01773 و JP22H00494 إلى TAK ، JP22H03000 إلى M.O.) ؛ (2) الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED; JP21wm0425010 إلى TAK ، JP22dk0207065 إلى M.O.) و (3) وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية CREST (JPMJCR22N5 إلى TAK). لم تضطلع هيئات التمويل بأي أدوار في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطات. نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) على تحرير اللغة الإنجليزية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1٪ Triton X-100Sigma-Aldrich30-5140-5
4٪ paraformaldehydeNacalai Tesque09154-14
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x)gibco15240-062يوصف بأنه "محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات"
محلول شطف autoMACSMiltenyi Biotec130-091-222وصفت بأنها "حل عازلة أساسية" وتستخدم ل "عازل العزل"
CD11b MicroBeadsMiltenyi Biotec130 & ndash ؛ 049-601
محلول DAPIDOJINDO28718-90-3
ناكالايتيسكي من فوسفات Dulbecco14249-24يوصف بأنه "PBS (& ناقص؛)"
مصل الأبقار الجنينيbiowestS1760-500
كاشف حجب FcR البشريMiltenyi Biotec130 & ndash ؛ 059-901
LeucosepGreiner Bio-One227290الموصوفة بأنها "أنبوب طرد مركزي متدرج كثافة"
أعمدة MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401الموصوفة بأنها "عمود مغناطيسي"
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376الموصوفة بأنها "محلول مخزون ألبومين مصل الأبقار (BSA)"
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303يوصف بأنه "حامل مغناطيسي"
Penicillin-StreptomycinNacalai Tesque26253 & ndash ؛ 84
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144الموصوفة بأنها "وسائط تصاعد"
مؤتلفة البشرية GM-CSFR & D Systems215-GM
مؤتلف بشري IL-34R & D Systems5265-IL
RPMI 1640 متوسط + مكمل GlutaMAX (وسط مكمل مسبقا)Thermo Fisher Scientific61870036بأنه "وسيط الحث الأساسي"
RPMI-1640Nacalai Tesque30264-56
<قوي >أجسام مضادة< قوي >
مضاد ل P2RY12سيجما-ألدريتشHPA014518الجسم المضاد الأساسي ، الأرنب ، 1:100
الجسم المضاد المضاد TMEM119Sigma-AldrichHPA051870الجسم المضاد الأساسي ، أرنب ، 1: 100
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 568invitrogenA-11011الجسم المضاد الثانوي ، الأرنب ، 1: 1000
محلول ملحي يوصف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
  2. Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
  3. Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
  4. Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
  5. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957(2014).
  6. Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).
  7. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  8. Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
  9. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  10. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
  11. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  12. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
  13. Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
  14. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317(2011).
  15. Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
  16. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  17. Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756(2023).
  18. Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
  19. Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).
  20. Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676(2016).
  21. Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
  22. Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).
  23. Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  24. Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
  25. Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).
  26. You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).
  27. Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).
  28. Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
  29. Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8(2017).
  30. Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).
  31. Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
  32. Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).
  33. Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
  34. Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
  35. Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
  36. Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة