مقالة منهجية

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري ذات الغلة العالية والضرر المنخفض

5.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66835

⸱

يوليو 5, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة إجراء تشريح حادا فريدا للحفاظ على سلامة هلام وارتون (WJ) ، مما يؤدي إلى تلف أقل ل WJ وكمية أكبر وقابلية بقاء الخلايا الجذعية الوسيطة المحصودة (MSCs). توضح الطريقة إنتاجية فائقة وقدرة تكاثرية مقارنة بطرق التشريح الحاد التقليدية.

الملخص

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي مجموعة من الخلايا متعددة القدرات ذات الخصائص التجديدية والمناعية الرائعة. اكتسب هلام وارتون (WJ) من الحبل السري (UC) اهتماما متزايدا بالمجال الطبي الحيوي كمصدر بارز ل MSCs. ومع ذلك ، نشأت تحديات مثل العرض المحدود ونقص التوحيد القياسي في الأساليب الحالية. تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لتعزيز عائد MSC عن طريق تشريح WJ السليم من الحبل السري. تستخدم الطريقة تشريحا حادا لإزالة الطبقة الظهارية ، مما يحافظ على سلامة WJ بالكامل ويؤدي إلى زيادة كمية وصلاحية MSCs المحصودة. يقلل هذا النهج بشكل كبير من نفايات WJ مقارنة بطرق التشريح الحادة التقليدية. لضمان نقاء WJ-MSCs وتقليل التأثير الخلوي الخارجي ، تم إجراء إجراء يستخدم التوتر الداخلي لتقشير البطانة بعد قلب UC. بالإضافة إلى ذلك ، تم قلب طبق بتري لفترة قصيرة أثناء زراعة النباتات لتحسين التعلق ونمو الخلايا. أظهر التحليل المقارن تفوق الطريقة المقترحة ، حيث أظهر عائدا أعلى من WJ و WJ-MSCs مع قابلية جدوى أفضل من الطرق التقليدية. يؤكد التشكل المماثل ونمط التعبير لعلامات سطح الخلية في كلتا الطريقتين توصيفها ونقاوتها لمختلف التطبيقات. توفر هذه الطريقة نهجا عالي الغلة وعالي الجدوى لعزل WJ-MSC ، مما يدل على إمكانات كبيرة للتطبيق السريري ل MSCs.

المقدمة

منذ العزلة الأولى للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) من هلام وارتون (WJ) في عام 1991 ، اكتسبت هذه الخلايا الجذعية متعددة القدرات اهتماما كبيرا من الباحثين بسبب خصائصها التجديدية وقدرتها على التمايز متعدد السلالات1. يمكن عزل MSCs من مصادر مختلفة ، بما في ذلك نخاع العظام والدم المحيطي ولب الأسنان والأنسجة الدهنية والجنين (الإجهاض البشري) والأنسجة المرتبطة بالولادة2. برز الحبل السري (UC) كخزان واعد بسبب طبيعته غير الغازية ، وإنتاجية الخلايا الوفيرة وقدرة التمايز ، مما يدل على معدل عال من الانتشار ، وإمكانية التمايز ، وخصائص التعديل المناعي3. تظهر MSCs الجنينية خصائص جذعية ومناعية قوية ، مما يجعلها المحور الأساسي للتجارب السريرية والبحوث الأساسية التي أجريت على مدار العقدين الماضيين2،4،5. تتمتع MSCs المشتقة من UC بإمكانات علاجية فائقة مقارنة بالمصادر الأخرى ل MSC ، مثل نخاع العظام أو الأنسجة الدهنية 6,7.

يتكون UC من ظهارة السلى ، وثلاث أوعية (شريانان ووريد واحد) ، والمادة الجيلاتينية المعروفة باسم WJ3. ومن المثير للاهتمام ، أن UC تشكل الأوعية الدموية البسيطة ، التي تتكون فقط من البطانة والظهارة المتوسطة ، ولكن ليس الغلالة adventitia. لا يحتوي WJ على الليمفاوية أو الأعصاب8. تقدم UC بنية فريدة مثالية للفصل القطاعي. تقع UC-MSCs بشكل أساسي في WJ. يمكن عزل MSCs من مقصورات مختلفة من WJ ، بما في ذلك السلى ، subamnion (السلى و subamnion المعينان أيضا كمنطقة بطانة الحبل) ، والمنطقة المحيطة بالأوعية الدموية في WJ8. كل منطقة من WJ لها هيكلها الخاص ، وخصائصها المناعية الكيميائية ، ووظيفتها 3,6.

ينظر إلى MSCs المعزولة من WJ في جامعة كاليفورنيا على نطاق واسع على أنها ذات فائدة سريرية فائقة مقارنة بتلك الموجودة في المناطق الأخرى3. تمت دراسة WJ-MSCs على نطاق واسع في الإعدادات قبل السريرية والسريرية لعلاج الأمراض المختلفة بسبب إمكانات التمايز متعددة الخطوط ، والخصائص المناعية ، وتأثيرات الباراكرين ، والتأثيرات المضادة للالتهابات ، والخصائص المناعيةالمتميزة 2,3. لقد ثبت أن WJ-MSCs واعدة في علاج مجموعة من الأمراض ، بما في ذلك مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GvHD) ، ورفض الكسب غير المشروع ، ومرض كرون ، وأمراض المناعة الذاتية ، وأمراض القلب والأوعية الدموية9،10،11،12،13،14. مع استمرار زيادة الطلب السريري على WJ-MSCs ، فإن نقص المعروض من الحبال السرية يشكل حاليا عائقا أمام تطبيقاتها على نطاق واسع.

يعتمد عائد WJ-MSCs على الطريقة المستخدمة لاستخراج الخلايا15. بينما يمكن عزل WJ-MSCs من خلال زراعة الزرع أو هضم الإنزيم ، فإن الطريقة الأخيرة لها وقت انتشار أطول قد يزيد من خطر تلف الخلايا ويقلل من صلاحية الخلية16. ومع ذلك ، فقد أظهرت العديد من الدراسات أن طريقة زراعة النباتات تزيد من غلة الخلايا وقابليتها للحياة ، وأن عوامل الباراكرين المنبعثة من أنسجة الزرع تساعد أيضا في تعزيز تكاثر الخلايا17,18.

طبقت هذه الدراسة نهج تشريح فريد للحصول على WJ بالكامل ، مما أسفر عن MSCs مع قدرة تكاثرية معززة ، وجدوى ، وكمية ، مع تقليل الضرر الذي يلحق ب WJ. تقدم هذه الطريقة المبتكرة استراتيجية مبسطة لعزل WJ-MSCs ، وتلبية الاحتياجات الحرجة في تطبيقات MSC.

البروتوكول

تم الحصول على عينات من المتبرعين الأصحاء بالموافقة من مستشفى شينزين لونغ قانغ للرعاية الصحية للأمومة والطفل ، قوانغدونغ ، الصين. تمت الموافقة على استخدام العينات البشرية للدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شنتشن وجامعة بكين للطب الصيني (SZLDH2020LSYM-095) ولجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى شنتشن لونغ قانغ للرعاية الصحية للأمومة والطفل (LGFYYXLLS-2020-005). أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. جمع الحبل السري البشري

  1. الحصول على عينات من الحبل السري البشري من المستشفى التعاوني تحت ظروف معقمة.
    ملاحظة: اختر متبرعا يقل عمره عن 35 عاما ، ويفضل أن يكون بريميبارا ، وليس لديه تاريخ من التهاب الكبد أو الأمراض المنقولة جنسيا أو الاضطرابات الوراثية. يجب أن تكون نتائج فحص القبول لفيروس التهاب الكبد B وفيروس التهاب الكبد C والفيروس المضخم للخلايا سلبية. اختر العملية القيصرية كطريقة للتسليم.
  2. حدد قطعة مستقيمة وسليمة من UC يبلغ طولها حوالي 10-15 سم.
  3. أغلق كلا الطرفين بملقط مرقئ وربط بعقدة جراحية في الطرف الداخلي بين الملقط مباشرة بعد ولادة مولود كامل المدة بعملية قيصرية. (تم جمع UC كما هو موضح في الشكل 1 ، الخطوة 1).
    ملاحظة: يضمن تشغيل العملية القيصرية أن المجموعة معقمة. استخدم عقدة جراحية بحجم 0 أو 2-0 خياطة لتحسين قوة الشد.
  4. قطع الحبل السري المربوط بين الملقط والعقد باستخدام مقص جراحي (الشكل 1 ، الخطوة 1).
  5. اشطفه بمحلول ملحي لإزالة أي جلطات دموية ملوثة على السطح وانقله على الفور إلى أنبوب بلاستيكي معقم سعة 50 مل يحتوي على 20 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: لم يتم استخدام أي مضاد حيوي أثناء النقل.
  6. أغلق الأنبوب. ضعه على الثلج في صندوق بوليسترين واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية قبل نقله إلى المختبر.
    ملاحظة: قم بتشريح الحبل في غضون 4 ساعات من التجميع.

2. عزل هلام وارتون عن الحبل السري

  1. قم بمعالجة الحبل السري باتباع الخطوات التالية:
    1. قم بإعداد صينية معقمة بأدوات جراحية ، وأطباق 90 مم معبأة بشكل معقم ، وماصات 1000 ميكرولتر ، و PBS معقم ، ومحلول إيثانول 75٪ ، ووسط ثقافة MSC بشري خال من الأجانب.
      ملاحظة: يسمح الملقط المسنن ومشابك البعوض بالتعامل مع الحبل الزلق بكفاءة.
    2. قم بتطهير السطح من العناصر المطلوبة ومنطقة العمل قبل وضع العناصر داخل خزانة السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: اترك هواء منطقة العمل يطهر لبضع دقائق قبل بدء العمل.
    3. تطهير سطح الأنبوب وإزالة العينة في طبق بتري في خزانة السلامة الحيوية. اغمر العينة بالعقد في 75٪ إيثانول لمدة 30 ثانية ثم اشطفها عدة مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم في طبق بتري جديد.
      ملاحظة: يجب ربط الحبل قبل الغمر في 75٪ من الإيثانول ، ويجب أن يقتصر وقت الغمر على 30 ثانية إلى 1 دقيقة لتطهير الحبل بالكامل دون تلف.
    4. قطع العقد وقطع الحبل بين عقدتين بشكل عرضي إلى قطع قصيرة طولها حوالي 2 سم بالمقص الجراحي والملقط.
      ملاحظة: يجب التخلص من نهايات الحبل مع عقدة. لا ينبغي أن يكون طول UC طويلا جدا أو قصيرا جدا ؛ كلا الشرطين قد يزيد من صعوبة العملية.
    5. قم بلف الوريد (وعاء أكبر) باستخدام PBS باستخدام ماصات 1000 ميكرولتر حتى يصبح السائل الخارج من الطرف الآخر من الحبل شفافا تماما19.
  2. تشريح الحبل السري.
    1. نقل واحدة من القطع المقطوعة بالفعل إلى طبق بتري جديد.
      ملاحظة: يجب كشف شريانين ووريد واحد بشكل مرئي على المقطع العرضي8 (الشكل 2 ب).
    2. أضف الكمية المناسبة من برنامج تلفزيوني للحفاظ على الحبل رطبا طوال العملية.
    3. أمسك الحبل بالملقط واسحب الشرايين على طول محوره الرئيسي بمساعدة مشابك البعوض.
      ملاحظة: حاول السحب من الطرف الآخر من الحبل إذا تمزق الشريان ، لأن جدار الشريان يتمتع بمرونة كبيرة.
    4. ثبت الحبل أفقيا بحيث يكون الجانب السميك متجها لأعلى عن طريق إدخال شفرة واحدة من الملقط في الوريد السري ثم تثبيته بإحكام ، مع التأكد من تثبيت الملقط على الجانب السميك.
    5. قم بعمل شق خطي على طبقة الظهارة الأمنيوسية من طرف إلى آخر على طول حافة الشفرة الأخرى للملقط باستخدام مشرط (الشكل 3).
      ملاحظة: حافظ على سلامة هلام وارتون عن طريق قطع أقل قدر ممكن من WJ.
    6. ابدأ في زاوية واحدة من فجوة القطع. ارفع زاوية الظهارة الأمنيوسية بمشابك مسننة واستمر في القطع أفقيا قليلا باستخدام مقص القرنية على طول السطح الداخلي للظهارة.
      1. افصل ظهارة وارتون الهلامية والأمنيوسية بالمشابك وقم بتوسيعها تدريجيا إلى الدائرة الكاملة لأحد طرفي جامعة كاليفورنيا. انزع الطبقة الظهارية بالطول (الشكل 3).
        ملاحظة: هلام وارتون هو نسيج ضام مخاطي محاط بظهارة السلىالكثيفة 8. يجب أن تكون العملية برمتها سلسة ، ولكن يمكن استخدام مشابك البعوض للتشريح الحاد إذا واجه المرء صعوبات أثناء التقشير.
    7. أدخل كلتا نصلتي الملقط داخل الوريد ، وقم بتثبيت جزء من WJ ، ثم اقلبه من الداخل للخارج لكشف ظهارة الوريد السري (الشكل 3).
    8. انزع ظهارة الوريد بسهولة ، لأن التوتر الداخلي يخلق فصلا بين ظهارة الوريد و WJ حول الأوعية الدموية (الشكل 3).
  3. تشريح UC باستخدام الطريقة التقليدية للمقارنة20.
    1. اختر عينة أخرى مقطوعة بالفعل بنفس وزن الحبل السابق تقريبا وانقلها إلى طبق بتري جديد.
    2. قطع على طول الوريد السري طوليا مع مقص ونشر UC لفضح الأوعية و WJ.
    3. قم بإزالة الوريد السري واثنين من الشرايين ، وقم بإزالة WJ من الطبقة البطانية بالمقص والمشرط.

3. عزلة وثقافة UC-MSCs

  1. ضع WJ الذي تم جمعه في طبق بتري 90 مم المسمى مسبقا وقطعه إلى قطع 1-3 مم بالمقص والملقط.
  2. اقلب الطبق مع الغطاء في الأسفل وضعه في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتقوية الارتباط بين القطع والسطح البلاستيكي.
  3. اقلب الطبق ، وأضف برفق كمية مناسبة من وسيط ثقافة MSC البشري لمزيد من الثقافة.
    ملاحظة: استخدم أقل سرعة للتأكد من أن القطع لا تزال متصلة.
  4. قم بتغيير وسيط ثقافة MSC البشري كل 3 أيام. تبادل ثلثي الوسط ومراقبة ظهور نمو الخلايا الليفية كل 2 أيام في أول 7 أيام ، وتغيير الوسط الكامل ، ومراقبته على أساس يومي بعد ذلك.
    ملاحظة: تجنب تحريك طبق بتري لأول 7 أيام. لوحظ النمو المميز للخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية في حوالي 4 أيام.
  5. الثقافة الفرعية حتى يصل التقاء إلى 80٪.
    ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة من 7 إلى 10 أيام.
    1. قم بتسخين PBS مسبقا ، و 0.25٪ من التربسين ، وثقافة MSC البشرية الخالية من الأجانب إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    2. شطف مع برنامج تلفزيوني بعد استنشاق طاف مع ماصات ، وفصل الخلايا مع تسخين مسبق 0.25 ٪ التربسين حتى يمكن إزاحة الخلايا عن طريق النقر على طبق بتري.
    3. قم بتعطيل التربسين عن طريق خلط وسط استزراع MSC المسخن مسبقا بنسبة 4: 1 ، وجمع تعليق الخلية ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تعتبر هذه الخلايا مرورا 0 (P0).
    4. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الخلايا في وسط زراعة MSC البشري ، وقم بالتلقيح في أطباق بتري جديدة بكثافة بذر تبلغ 1 × 104 خلايا / سم2 للتكاثر.
  6. باستخدام مقياس الدم ، احسب إجمالي عدد الخلايا في الطريقتين بعد التضخيم في الممر الأول والثاني والثالث. تحديد مورفولوجيا الخلية تحت المجهر في الممرات الأولى والثالثة والخامسة.
    ملاحظة: يجب أن يكون مورفولوجيا هذه الخلايا مشابهة لخلايا P0.
  7. استخدم الخلايا في الممر الخامس لقياس التدفق الخلوي والتجارب الأخرى.

4. التعبير عن علامات سطح الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. افصل خلايا المرور 5 (P5) بنسبة 0.25٪ من التربسين ، واغسل الخلايا بمحلول تلطيخ الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الكريات بمحلول تلطيخ الخلايا إلى 100 ميكرولتر لكل منها.
  2. قم بتسمية كل أنبوب وإضافة الكميات المناسبة من الأجسام المضادة ، والتي تم اقترانها مع Allophycocyanin (APC) أو فلوريسئين أيزوثيوسيانات (FITC) أو phycoerythrin (PE): CD44-APC ، CD73-APC ، CD90-FIFC ، CD105-FIFC ، CD11B-PE ، CD19-PE ، CD43-PE ، HLA-DR-PE باتباع تعليمات الشركة المصنعة21. احتضان لمدة 15-20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بطرد الخلايا الملطخة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ونضح المادة الطافية باستخدام ماصة ، واغسلها مرة واحدة بمحلول تلطيخ الخلايا.
  4. كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا مع 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلية.
  5. قم بتشغيل الخلايا من خلال مقياس التدفق الخلوي وتحليل الخلايا الملطخة بالأجسام المضادة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

5. تحديد منحنى نمو الخلية بطريقة عد الخلايا

  1. قم بإعداد تعليق أحادي الخلية لخلايا P5 باستخدام طريقتين عن طريق تخفيفها في وسط ثقافة MSC البشري.
  2. بذر 8000 خلية لكل بئر في صفيحة من 24 بئرا ، مع ما مجموعه 21 بئرا من كل طريقة يتم زرعها.
    ملاحظة: امزج الخلايا برفق عن طريق النفخ والشفط بالماصات قبل البذر.
  3. حصاد الخلايا من ثلاثة آبار بعد 24 ساعة من البذر. قم بإجراء عد الخلايا باستخدام مقياس الدم لحساب القيمة المتوسطة.
    ملاحظة: هز اللوحة قبل عد الخلايا. يمكن تمديد مدة الاهتزاز لمنع تكوين مجاميع الخلايا.
  4. كرر عد الخلايا كل 24 ساعة لمدة إجمالية قدرها 7 أيام. ارسم منحنى النمو باستخدام الوقت (d) على المحور السيني وعدد الخلايا (x104 / mL) على المحور Y.

النتائج

يتم تلخيص إجراءات جمع وزراعة UC-MSCs ، وكذلك تحليلها اللاحق ، في الشكل 1. تم تشريح UC بدقة إلى عدة أقسام باستخدام الطريقة الفريدة. يوضح الشكل 2 مخطط التشغيل المحدد للإجراءات الرئيسية. تم رصد وتسجيل نمو الخلايا من الثقافات المزروعة بشكل روتيني. لوحظت خلايا ملتصقة على شكل مغزل بعد حوالي 4 أيام من زراعة النباتات وزحفت بشكل متزايد إلى شكل دوامة. تم تحديد هذه الخلايا أيضا على أنها P0 واستمرت في التكاثر للمرور اللاحق مع الحفاظ على حجم ومورفولوجيا موحدة أثناء الانتشار والمرور. أظهرت الطرق التقليدية والحالية اختلافات ضئيلة من حيث حجم الخلية والتشكل (الشكل 3).

تتضمن طريقة التشريح التقليدية كشط WJ بعيدا عن الأوعية الدموية والظهارة الداخلية لجامعة كاليفورنيا. يمثل عائد WJ فرقا كبيرا بين الطريقتين عن طريق تعديل الوزن. يمكن حساب عائد WJ عن طريق قياس النسبة المئوية لوزن WJ في الحبل 2 سم (2.4 جم ± 0.2 جم). أظهرت مقارنة بين نسبة عائد WJ بين الطرق الحالية والتقليدية زيادة كبيرة في عائد WJ باستخدام النهج الجديد (الشكل 4A). أظهر التحليل الإضافي من خلال حساب الكمية الإجمالية ل WJ-MSCs التي تم حصادها بكلتا الطريقتين من الوزن المكافئ ل UC في وقت واحد فجوة واضحة في كمية الخلية مع زيادة أعداد المرور (الشكل 4B). أشار منحنى النمو إلى أن معدل انتشار MSCs في الطريقة الجديدة كان أعلى بكثير منه في الطريقة التقليدية تحت نفس كثافة التلقيح بعد يومين (الشكل 4C). توضح هذه التجارب مزايا الطريقة الحالية ، والتي تتيح طريقة فعالة لزيادة العرض الفعال لنفس المادة.

باتباع المعايير الدنيا للجمعية الدولية للعلاج بالخلايا والجينات (ISCT) لتعريف MSCs ، يوضح النمط المناعي ل MSCs تعبيرا إيجابيا عن CD105 و CD44 و CD90 و CD73 (أكثر من 95٪) ، بينما يغيب عن CD45 و CD19 و CD34 و CD11b و HLA-DR (أقل من 2٪) 22. تم التحقيق في MSCs المشتقة من WJ عن طريق قياس التدفق الخلوي الكمي (الشكل 5) ؛ كانت الخلايا المعزولة بكلتا الطريقتين إيجابية للغاية للمستضدات السطحية CD105 و CD44 و CD90 و CD73 (جميعها أعلى من 99٪) ، مع التعبير عن جزيئات السطح CD45 و CD19 و CD34 و CD11b و HLA-DR تم التعبير عنها دون المستويات القابلة للاكتشاف (البيانات غير معروضة). بناء على نتائج علامات سطح الخلية ، يمكن اعتبار الخلايا الملتصقة بدقة على أنها MSCs ، ويمكن ضمان تحديدها ونقاوتها.

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لتشريح وعزل WJ-MSCs من الحبل السري. الخطوة 1: يتم جمع عينة الحبل السري البشري من المولود الجديد وشطفها بمحلول ملحي ، يليها نضح الوريد. ثم يتم قطع الحبل إلى قطع 2 سم. الخطوة 2: يتم الحصول على جيلي وارتون النقي (WJ) باستخدام الطريقة الحالية ، والتي تنطوي على فصل الشرايين والظهارة الأمنيوسية وظهارة الوريد. الطريقة التقليدية تستخدم أيضا للمقارنة. يتم تشريح الحبل السري وفقا لذلك. الخطوة 3: يتم تقطيع WJ التشريح إلى قطع 1-3 مم ، ويوضع الطبق رأسا على عقب في الحاضنة لمدة 30 دقيقة لتقوية الارتباط بين القطع والسطح البلاستيكي. ثم يتم استزراع قطع WJ وتمريرها بكثافة بذر 1 × 104 خلايا / سم2 حتى تصل إلى التقاء 80٪. الخطوة 4: يستخدم قياس التدفق الخلوي لتوصيف خلايا P5 عن طريق تحليل علامات سطح الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC). الخطوة 5: يتم تحديد القدرة التكاثرية للخلايا عن طريق رسم منحنى نمو الخلية باستخدام طريقة عد الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تشريح الحبل السري والعرض التخطيطي للتشريح. (أ) يفصل المقطع العرضي ل UC ، الذي يسلط الضوء على الشرايين (A) ، والوريد (V) ، وهلام وارتون (WJ) ، والتشريح اللاحق UC إلى مقصورات مختلفة. ب: عرض تخطيطي لإزالة الطبقة الطلائية السلوية. يتم إجراء شق على طول الخط المتقطع على الظهارة الأمنيوسية ، ويفصل الظهارة بدءا من الزاوية الجانبية للحبل. ج: عرض تخطيطي لإزالة الوريد الطلائي. يؤدي قلب الحبل من الداخل إلى الخارج (يشير اتجاه السهم إلى اتجاه القوة) إلى تعريض ظهارة الوريد للإزالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: السمات المورفولوجية ل WJ-MSCs المستزرعة والمارة الأولية. يمكن ملاحظة نمو الخلايا الليفية المميزة من النباتات الخارجية في حوالي اليوم 4 (يشار إليها بالأسهم) وتظهر بشكل متزايد نمط نمو يشبه الدوامة. تمت إزالة النباتات وزراعتها الفرعية. كانت الخلايا المعزولة متجانسة فيما يتعلق بالحجم المرئي والمورفولوجيا. لوحظ اختلاف ضئيل في حجم ومورفولوجيا الخلايا بين الطريقتين. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل مقارن بياني لعائد WJ وخصائص نمو MSCs المستزرعة. (أ) مقارنة مردود WJ باستخدام 2 سم UC بوزن أولي قدره 2.4 جم ± 0.2 جم بكلتا الطريقتين. عائد WJ = (وزن WJ) / (الوزن الأولي للسلك غير المعالج. نسبة عائد WJ (٪) = (عائد WJ) / (متوسط عائد WJ للطريقة الحالية) × 100. (ب) مقارنة عد الخلايا بعد الزراعة والمرور تحت نفس الحالة بكلتا الطريقتين. ج: منحنيات نمو خلايا P5 في كلتا الطريقتين. تضمنت جميع التجارب ثلاث نسخ بيولوجية مكررة ، وتم تحليل الاختلافات الإحصائية بطريقة ANOVA ثنائية الاتجاه (***p < 0.001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تحليل تعبير سطح الخلية ل MSC بواسطة قياس التدفق الخلوي. تخضع خلايا P5 التي يتم جمعها بالطرق التقليدية والحالية لتحليل قياس التدفق الخلوي. كانت المستضدات السطحية CD44 و CD105 و CD90 و CD73 إيجابية للغاية (جميعها أعلى من 99٪) ، بينما كانت تعبيرات جزيئات سطح CD45 و CD19 و CD34 و CD11b و HLA-DR أقل من حد الكشف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تمثل MSCs مجالا ديناميكيا للبحث له آثار عميقة على الطب التجديدي22. خصائصها الفريدة تجعلها نقطة محورية للبحث العلمي ولديها القدرة على إحداث ثورة في علاج مجموعة واسعة من الأمراض والإصابات7. WJ-MSCs هي مجموعة فرعية متميزة من MSCs ، والتي يمكن الحصول عليها من النسيج الضام الجيلاتيني داخل UC الواقعة بين ظهارة الأوعية الدمويةوالأمنيوسية 23. يكمن التطبيق السريري ل MSCs في تحقيق أعداد كافية من الخلايا24. ومع ذلك ، مع زيادة عدد المرور ، بدأت الخلايا في إظهار درجة معينة من ظاهرة الشيخوخة ، وانخفضت القدرة التكاثرية ل MSCs تدريجيا بعد P524. لذلك ، فإن تحسين الأساليب لتعزيز عائد MSC أمر حتمي.

الطريقة الأكثر فعالية لعزل WJ-MSCs هي تشريح WJ بالكامل مع الحفاظ على سلامتها6. تظهر الأبحاث أن هذه الخلايا الحدودية من مناطق حدود الحبل السري لها خاصية هجرة أعلى ومعدل انتشار أعلى من WJ-MSCs23 بين الأوعية. ومع ذلك ، لم يتم توحيد مناطق وطرق تشريح WJ ، ولا يزال من غير الواضح ما إذا كانت مجموعات الخلايا الجذعية داخل WJ-MSCs تشترك في نفس الصفات بسبب عدم وجود حدود نسيجية واضحة بين الأقسام3.

أشارت الدراسات السابقة إلى اختلافات كبيرة في خصائص WJ-MSCs المشتقة من مقصورات مختلفة من الحبل السري ، حيث تظهر الخلايا الموجودة بالقرب من السطح الأمنيوسي قدرة تكاثرية محسنة3. تهدف الطريقة الفريدة الحالية لتشريح UC وعزل WJ-MSCs إلى تقليل كل من فقدان بطانة WJ وتلف الخلايا ، مما يعزز إنتاجية الخلية وقابليتها للحياة. يوضح هذا البروتوكول طريقة سهلت معالجة UC إلى WJ سليمة تقريبا. تتضمن الخطوة الأساسية للبروتوكول إزالة الطبقة الظهارية من خلال التقشير والتشريح الحاد. خطوة الابتكار هي تقشير الطبقة الظهارية بالطول باستخدام مشابك البعوض. هذا النهج فعال في الحد من تلف الخلايا المجاورة الناجم عن التشريح الحاد التقليدي بالمقص25.

بطانة الوريد هشة ويصعب التخلص منها. بعد إزالة الظهارة الأمنيوسية من الوريد السري ، يتم قلب الحبل السري عبر الوريد لكشف البطانة. ثم يتم استخدام التوتر الداخلي الناتج عن WJ لتقشير بطانة الوريد ، وبالتالي تقليل التداخل من تداخل الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) أثناء عمليات زراعة الخلايا اللاحقة.

تم اعتماد طريقة الاستزراع الخارجي حيث أن لها عائدا أعلى مقارنة بالطرق الأخرى المتاحة18. ستتم إزالة الخلايا غير المرتبطة تدريجيا من خلال تبادل وسيط ثقافة MSC البشري ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا26. يمكن أن تعيق النباتات التي تفشل في الالتصاق بالبلاستيك نمو الخلايا في التجربة السابقة. يجب مراعاة تأثير بخار الماء المنبعث من الأنسجة بسبب التغيرات بين درجات الحرارة الداخلية والخارجية للحاضنة. للحفاظ على الحالة الجافة لطبق بتري ، تم تنفيذ خطوة مبتكرة لقلب الطبق رأسا على عقب لمدة 30 دقيقة أثناء الحضانة مع الغطاء في الأسفل. أدى هذا الانقلاب للطبق إلى تجنب تكثيف بخار الماء عند التلامس بين الأنسجة وسطح طبق بتري ، والذي بدوره يسمح بربط أفضل للإكسوسومات بالسطح البلاستيكي لتحسين نمو الخلايا.

تتم مقارنة الطريقة الحالية مع طريقة التشريح التقليدية عن طريق قياس النسبة المئوية لوزن WJ الذي تم الحصول عليه وكمية MSCs المستزرعة والمارة. تم عرض غلة أعلى بكثير من WJ وكمية أخرى من MSCs المحصودة من خلال الطريقة الجديدة. على الرغم من أن أي بروتوكول لعزل مجموعات الخلايا الجذعية من كل من هذه الحجرات يحمل خطر تلوث الخلايا من الأجزاء الأخرى ، فقد أظهرت النتائج نقاء MSCs المعزولة ، والتي تتميز بالتعبير العالي عن علامات اللحمة المتوسطة (جميعها أعلى من 99٪) والحد الأدنى من الكشف عن علامات المكونة للدم والبطانية (البيانات غير معروضة). أثبتت النتائج أن WJ-MSCs نقية ومناسبة لمختلف التطبيقات ، بما يتماشى مع إرشاداتISCT 21. أظهرت MSCs المستزرعة خلايا شبيهة بالخلايا الليفية في فترة قصيرة ، وتشكلت الخلايا بشكل متزايد في خلايا على شكل دوامة ، مما يعرض إمكانات تكاثرية كبيرة وخصائص مهاجرة.

يعرض البروتوكول المبين في هذه الدراسة العديد من أوجه القصور. أولا ، الكفاءة المطلوبة للمشغل عالية ، كما يتضح من فصل الظهارة الأمنيوسية. هذا قد يعيق اعتمادها على نطاق واسع في البحوث أو التطبيقات السريرية. ثانيا ، يعتمد البروتوكول بشكل كبير على التلاعب اليدوي أثناء التشريح ، مما قد يؤدي إلى عدم الاتساق بين التجارب أو المشغلين. ومن شأن توحيد عملية التشريح أن يعزز موثوقية البروتوكول25 وإمكانية استنساخه. علاوة على ذلك ، فإن عدم وجود مقارنات أخرى مع الطريقة التقليدية يترك أسئلة دون إجابة.

في الختام ، توفر الطريقة الحالية طريقة فعالة لفصل WJ السليم عن الظهارة والأوعية الأمنيوسية ، مما يؤدي إلى حصاد يشمل هلام وارتون حول الأوعية الدموية وتحت السلى. يساهم إدخال خطوة الحضانة المقلوبة بشكل أكبر في تحسين ارتباط MSC. يوضح التحليل المقارن بالطرق التقليدية المزايا الكبيرة للبروتوكول المقترح من حيث الحصول على عائد أعلى من WJ وحصاد المزيد من MSCs بقدرة تكاثرية أفضل. تسلط النتائج الضوء أيضا على نقاء MSCs المعزولة ، كما يتضح من نمط مميز من تعبير علامة سطح الخلية. يمكن أن تعزز هذه الطريقة إنتاجية MSC والقدرة التكاثرية ، مما يوفر طريقة فعالة من حيث التكلفة لزيادة إنتاج MSC.

الإفصاحات

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82172107) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ ، الصين (2021A1515011927 ، 2021A1515010918 ، 2020A1515110347) ، صندوق شنتشن للبحوث الطبية (SMRF. D2301015) ، ولجنة الابتكار في العلوم والتكنولوجيا لبلدية شنتشن (JCYJ20210324135014040 ، JCYJ20220530172807016 ، JCYJ20230807150908018 ، JCYJ20230807150915031) ، والصندوق الخاص لمنطقة لونغ قانغ للتنمية الاقتصادية والتكنولوجية (LGKCYLWS2022007).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
APC المضادة للإنسان CD44 الأجسام المضادة Biolegend 338806
ألواح زراعة الخلايا ذات 24 بئراThermo Scientific142475
APC المضادة للإنسان CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) الأجسام المضادة   ؛Biolegend 344006
APC Mouse IgG1 ، & kappa ؛ النمط المتماثل Ctrl (FC) الأجسام المضادةBiolegend  400122
الأوتوكلافHIRAYAMAHVE-50
عداد الخلايا الأوتوماتيكيCountstarFL-CD
BAMBANKER حل الحفظ بالتبريدWako302-14681
عازلة تلطيخ الخلاياBiolegend   ؛420201
آلة الطرد المركزيEppendorf5424R
مقعد نظيفشنغهاي ZhiChengC1112B
CO2< / sub> حاضنةحراري علميHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
فرن الانفجار الكهربائي الحراريشنغهاي جينغ هونغDHG-9423A
FITC المضادة للإنسان CD105 الأجسام المضادة Biolegend 323204
FITC المضاد للإنسان CD90 (Thy1) الأجسام المضادة Biolegend 328108
FITC ماوس IgG1 ، & kappa ؛ النمط المتماثل Ctrl (FC) الأجسام المضادةBiolegend  400110
التدفقالخلوي BeckmanCytoFLEX
الدمالفوقية Marienfeld640410
مخزن غسيل نفاذية التلوين داخل الخلايا (10 مرات ؛) Biolegend 421002
المجهر البيولوجي المقلوبZEISSAxio Vert. A1
خزان تخزين النيتروجين السائلالحراري العلميCY50935-70
محلول ملحي عادي (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE مضاد للإنسان CD11b الأجسام المضادةBiolegend   ؛393112
PE المضاد للإنسان CD19 المضاد  Biolegend 392506
PE المضاد للإنسان CD34 الأجسام المضادةBiolegend   ؛343606
PE المضاد للإنسان CD45 الأجسام المضادةBiolegend   ؛368510
PE الأجسام المضادة HLA-DR المضادة للإنسان  Biolegend 307606
PE Mouse IgG1 ، & kappa ؛ النمط المتماثل Ctrl (FC) الأجسام المضادةBiolegend  400114
PE Mouse IgG2a ، & kappa ؛ النمط المتماثل Ctrl (FC) الأجسام المضادةBiolegend  400214
التوازن الإلكتروني الدقيقSatoriusPRACTUM313-1CN
آلة صنع الثلج ندفة الثلجZIEGRAZBE 30-10
معقم 50 مل أنبوب بلاستيكيGreniner227270
حمام مائي ترموستاتيشنغهاي YiHengHWS12
Trypsin 1: 250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios HPCFDCGL50
نظام تنقية المياه فائقة النقاء والنقيةMilli-QMilli-Q مرجع
زينو خال من MSC البشري متوسطFUKOKU & nbsp ؛T2011301
قياس مقياس

المراجع

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
  3. Kim, D. -W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  4. Drobiova, H., et al. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217(2023).
  5. Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
  6. Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992(2015).
  7. Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290(2020).
  8. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  9. Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817(2023).
  10. Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249(2021).
  11. Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463(2021).
  12. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  13. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  14. Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71(2022).
  15. Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
  16. Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
  17. Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
  18. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
  19. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525(2009).
  20. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224(2017).
  21. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  23. Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652(2022).
  24. Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
  25. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  26. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334(2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة