مقالة منهجية

نموذج فئران ذو كفاءة مناعية للعلاج الحراري الخلالي بالليزر للورم الأرومي الدبقي

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67381

⸱

نوفمبر 15, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الورم الأرومي الدبقي هو شكل مدمر من سرطان الدماغ الأولي ، ويظهر العلاج الحراري الخلالي بالليزر كبديل واعد للاستئصال الجراحي التقليدي للورم الأرومي الدبقي غير القابل للجراحة. يصف هذا البروتوكول نموذج فأر ما قبل السريري المحسن الذي يمكن استخدامه لدراسة آثار العلاج أو العلاجات المساعدة والاندماجية.

الملخص

يمثل الورم الأرومي الدبقي (GB) ، وهو الشكل الأكثر عدوانية من سرطان الدماغ الأولي ، ما يقرب من نصف جميع أورام الدماغ الأولية عالية الدرجة لدى البالغين وليس له علاج. العلاج الحراري الخلالي بالليزر (LITT) هو علاج معتمد من إدارة الغذاء والدواء (FDA) لمرض الجريان الخلالي ويستخدم في المرضى الذين قد لا يكونون مرشحين للاستئصال الجراحي التقليدي. في حين تم إثبات الفعالية السريرية ل LITT ، فإن البحث الذي يتجاوز دراسات الحالة السريرية وسلسلة الحالات محدود ويعوقه عدم وجود نموذج حيواني راسخ. يستخدم هذا البروتوكول الفئران C57BL / 6 وخط الخلايا السرطانية للورم الدبقي CT2A المتزامن لتلخيص GB البشري عن كثب مع استخدام ليزر عقيق الألمنيوم Yttrium (Nd: YAG) المشبع بالنيوديميوم 1064 نانومتر ، كما هو مستخدم في أحد نظامي LITT المعتمدين من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، مما يوفر أهمية ممتازة قبل السريرية. سيوفر الإنشاء الناجح لنموذج الفئران LITT هذا منصة قيمة للتحقيق في السمات الفريدة لاستئصال LITT وتأثيراته على البيئة المكروية للورم ، مما قد يؤدي إلى تحسين الاستراتيجيات العلاجية.

المقدمة

السرطان هو السبب الرئيسي الأول للوفاة في كندا. يمثل الورم الأرومي الدبقي (GB) ، وهو الشكل الأكثر شيوعا من أورام الدماغ العدوانية ، 48٪ إلى 60٪ من جميع أورام الدماغ الأولية عالية الدرجة لدىالبالغين 1. تشخيص GB قاتم بشكل خاص مع بقاء صافي لمدة 5 سنوات بنسبة 4.8٪ مع العلاجات التقليدية ، بما في ذلك الاستئصال الجراحي والعلاج الكيميائي والإشعاعي1،2.

العلاج الحراري الخلالي بالليزر (LITT) هو إجراء معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) باستخدام الليزر لاستئصال الورم الموضعي العالي الحرارة في المرضى الذين يعانون من أورام الدماغ غير القابلة للجراحة ويوفر بديلا علاجيا جذابا للاستئصال الجراحيالتقليدي 3. ومع ذلك ، لا يوجد نموذج فئران مفصل ومميز جيدا لعلاج LITT ل GB ، مما يعيق البحث قبل السريري.

يهدف هذا البروتوكول إلى عرض نموذج فئران ما قبل السريري المحسن لعلاج GB باستخدام LITT. لقد اخترنا استخدام الفئران C57BL / 6 وخط خلايا الورم الدبقي المتزابقي CT2A لهذا النموذج في المقام الأول لأن CT2A يلخص عن كثب GB البشري عالي الجودة مع ميزات نسيجية مماثلة ، وغزو ، ومقاومة كيميائية وإشعاعية ، وميزات شبيهة بالجذع مع التجديد الذاتي وإعادة تأسيس الأورام4. توفر هذه الخصائص منصة ممتازة لمجموعة متنوعة من الدراسات التي تتضمن استجابات مناعية أو استراتيجيات علاجية جديدة. علاوة على ذلك ، فإن الجوانب الفنية لبروتوكول LITT هذا قابلة للتكيف بسهولة مع نماذج الفئران الأخرى4،5،6 ، والتي سيتم مناقشتها بمزيد من التفصيل.

تشمل مزايا هذا البروتوكول نتائج متسقة مع نموذج علاج LITT بسيط ولكنه فعال. إن ليزر عقيق العقيق الإيتريوم الألمنيوم (Nd: YAG) المشبع بالنيوديميوم 1064 نانومتر هو نفسه المستخدم سريريا في أحد النظامين المعتمدين حاليا من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، مما يسمح بإجراء تجارب موازية بشكل وثيق للتطبيق السريري ل LITT لعلاج الورم الدبقي عالي الجودة. العيب الأساسي لهذا البروتوكول هو الحذر الشديد الذي يجب اتخاذه أثناء كل من زرع الخلايا السرطانية وعلاج LITT لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للطبيعة العدوانية لخط خلايا CT2A ، فإن البروتوكول حساس للغاية للوقت. يجب الانتهاء من معظم التجارب في غضون 20 يوما كحد أقصى ، مما قد يحد من التحقيقات في بعض الاستجابات المناعية التكيفية أو الآليات الخلوية والجزيئية الأخرى التي تحدث على مدى فترة زمنية أطول.

البروتوكول

تمت الموافقة على أخلاقيات لهذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية في جامعة مانيتوبا وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعها المجلس الكندي لرعاية (CCAC). استخدم هذا البروتوكول الفئران C57BL / 6 ذات الكفاءة المناعية البالغة من العمر 8-12 أسبوعا وخط خلايا الورم الدبقي الزاوي CT2A لنموذج قبل السريري مع مجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك التجارب التي تركز على التحليل النسيجي أو التغيرات المناعية أو التدخلات العلاجية التوافقية. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع أنواع الفئران الأخرى أو خطوط الخلايا بناء على المتطلبات التجريبية.

figure-protocol-1
الشكل 1: تخطيطي رسومي للتصميم التجريبي الأساسي. تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تحضير الخلية باختصار (اليوم 0)

  1. قبل البدء في زراعة الخلايا ، تأكد من تعقيم الخزانة وجميع الماصات المطلوبة بالكامل بالأشعة فوق البنفسجية والإيثانول.
  2. قم بتسخين DMEM / F12 باستخدام وسائط FBS بنسبة 10٪ ، ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، والتربسين إلى درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام حمام مائي.
  3. قم بإخراج الوسائط من قارورة T25 واشطف الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS. أضف 1 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضن لمدة 30-60 ثانية حتى تنفصل الخلايا عن القارورة.
  4. تأكد من الخلايا المنفصلة تحت المجهر الضوئي وأضف 4 مل من الوسائط لإيقاف النشاط الأنزيمي التربسين.
  5. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا تلقائي.
    1. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق ، ثم أضف 10 ميكرولتر إلى شريحة عد الخلايا.
    2. أدخل الشريحة في جهاز عد الخلايا وسجل إجمالي عدد الخلايا وعدد الخلايا الحية والنسبة المئوية للخلايا الحية.

ملاحظة: في حالة عدم توفر آلة عد الخلايا الآلي، يمكن إجراء العد اليدوي باستخدام مقياس كثافة الدم.

  1. احسب الخلايا المطلوبة لجميع الحقن المخطط لها.
    ملاحظة: بالنسبة إلى CT2A ، يوصى باستخدام 5000 خلية لكل 1.5 ميكرولتر في الحجم المحقون والحجم الإجمالي 100 ميكرولتر على الأقل لكل مستحضر.
  2. قم بتدوير الخلايا عند 134 × جم لمدة 5 دقائق لحبيبات الخلايا وشفط أكبر قدر ممكن من الوسط.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية بمستخلص غشاء القاعدي بنسبة 5٪ في PBS للحجم المطلوب في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. في حين أن الأنابيب الأصغر ستكون الأنسب لإعداد تعليق الخلية ، فإن أنبوب 2 مل أفضل للتخزين أثناء الجراحة حيث تقل احتمالية تكتل الخلايا في القاع الأكثر تقريبا وإعادة توزيعها بسهولة بنقرة لطيفة.
  4. احتفظ بالخلايا على الجليد للحقن ، وقم بإعداد معلقات الخلايا الطازجة كل 4-5 ساعات حسب الحاجة.

2. زرع تقويم العظام (اليوم 0)

  1. جهز المنطقة الجراحية وتأكد من أن جميع الأدوات المطلوبة معقمة وجاهزة للاستخدام.
  2. تخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران (3٪ مبخر في 1 لتر / دقيقةO 2) في غرفة أثناء مراقبة معدل التنفس (الهدف 60 نبضة في الدقيقة).
  3. الحصول على وزن وتسجيله لجرعات الدواء.
  4. احلق منطقة الجراحة بعناية لتجنب العينين والأذنين والشعيرات.
  5. انقل إلى إطار تجسيمي.
    1. ضع القواطع في فتحة قضيب العض واضبط مخروط الأنف حتى يتماسك ، مع شد برغي التثبيت لتثبيته.
    2. تحقق من عمق التخدير باستخدام قرصات إصبع القدم الخلفية الثنائية ، وإذا كان ذلك مناسبا ، قم بتأمين الجمجمة باستخدام دبابيس الأذن واضبط رأس على وضع محايد ومستو.
    3. راقب درجات حرارة قلب باستخدام مسبار درجة حرارة المستقيم المشحم ووفر الاحترار الإضافي عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تسخين تحت الجسم.
      تنبيه: احرص على عدم إفراط في شد مخروط الأنف ، لأنه حتى الضغط المعتدل على عظم الأنف قد يسبب توقف التنفس. إذا تم استخدام وسادة تسخين كهربائية (على سبيل المثال ، وسادة تسخين لتررم) ، فتأكد من دقة إعدادات درجة الحرارة وتظل درجة الحرارة المحددة ثابتة.
  6. ضع مرهم العين بكثرة على كلتا العينين لمنع الجفاف.
  7. تطبيق الحقن الوقائية والتحقق من عمق التخدير.
    1. حقن ميلوكسيكام تحت الجلد أو غيرها من مسكنات الألم طويلة المفعول وفقا لإرشادات المنشأة الحيوانية المحلية (على سبيل المثال ، 5.0 مجم / كجم ميلوكسيكام) باستخدام حقنة 28 جم × 1/2 بوصة.
    2. تطبيق حقنة 20 ملغ/كغ محلول ملحي عادي مسخن مسبقا لدعم السوائل الوقائية أثناء الإجراءات الطويلة.
    3. تقليل التخدير إلى 1.5٪ -2.0٪ إيزوفلوران للحفاظ على معدل التنفس المستهدف.
  8. باستخدام تقنية معقمة ، ثنى وإعداد المنطقة الجراحية.
    1. باستخدام قطعة قطن معقمة ، ضع محلول مطهر بوفيدون اليود أو الكلورهيكسيدين. ابدأ وسطيا في موقع الشق وقم بتدوير المسحة بعد كل تمريرة ، واعمل للخارج ، ثم باستخدام قطعة قطن معقمة جديدة ، ضع 70٪ من الإيثانول على الموقع بطريقة مماثلة.
    2. كرر الفرك باليود متبوعا ب 70٪ من الإيثانول مرتين إضافيتين (3 مرات إجمالا ، لكل منهما).
  9. أعد فحص عمق التخدير قبل الشروع في التعرض الجراحي. راقب عن كثب معدل التنفس طوال العملية واضبط التخدير حسب الضرورة.
  10. بدءا من خط الوسط والخلف قليلا للعينين ، قم بعمل شق سهمي متوسط 1-1.5 سم في الاتجاه الذيلي باستخدام مشرط شفرة # 15. بدلا من ذلك ، قم بتمديد شق مشرط قصير باستخدام مقص القزحية.
    ملاحظة: يجب أن تبدأ الشقوق عند خط الوسط ، ولكن بالنسبة للحقن الأحادي الجانب ، يمكن أن تكون بزاوية جانبية قليلا لتسهيل التصور المتزامن والوصول إلى Bregma وموقع الثقب.
  11. باستخدام قطعة قطن معقمة ، اعكس حواف الجرح لتصور الجمجمة وافرك أي نسيج ضام برفق من المنطقة.
    1. إذا لزم الأمر ، استخدم قطعة قطن معقمة مبللة ببيروكسيد الهيدروجين لتنظيف سطح الجمجمة وتصور خيوط الجمجمة.
  12. حدد موقع Bregma حيث تلتقي الغرز الإكليلية اليمنى واليسرى عند خط الوسط مع الخيط السهمي (انظر الشكل 2).
    1. باستخدام راتنج أكريليك ملون غير سام وعود أسنان خشبي معقم أو ما شابه ذلك ، ضع علامة صغيرة جدا على Bregma.
      ملاحظة: في بعض الحالات ، لا تعكس الغرز الإكليلية اليمنى واليسرى بعضهما البعض. في مثل هذه الحالات ، استخدم "خط الأنسب" لتقريب المكان الذي يجب أن تتقاطع فيه على طول المستوى السهمي المتوسط.
  13. تأكد من عدم إمالة أو تدوير موضع رأس (أي في مستوى مسطح).
    1. صفر إحداثيات النجوم في بريجما. يشير الإحداثي x إلى الحركة في المستوى الإنسي الجانبي (ML) ، والإحداثي y في المستوى الأمامي الخلفي (AP) ، والإحداثي z في المستوى الظهري البطني (DV).
    2. تأكد من أن Lambda في نفس مستوى DV مثل Bregma (على سبيل المثال ، z = 0 في كلا المعلمين). وبالمثل ، عند +2.0 مم (x = 2) و -2.0 مم (x = -2.0) جانبيا ل Bregma ، تأكد من أن الجمجمة في نفس المستوى ، مع تساوي إحداثيات DV / z تقريبا. تأكد من أن الجمجمة آمنة ولا تتحرك بعد أي تعديلات.
  14. حفر حفرة لدغ عند +2.0 مم (مل) و +0.5 مم (AP) من بريجما (الشكل 3).
    1. باستخدام ملحق حفر تجسيمي ، اخفض طرف البت بعناية حتى يتلامس مع بريجما وصفر الإحداثيات.
    2. ارفع البتة قليلا واضبط المثقاب على إحداثيات AP و ML المناسبة.
    3. اخفض المثقاب ببطء ، مع الحرص على الثقب فقط من خلال الجمجمة.
    4. بدلا من ذلك ، باستخدام حقنة ميكرولتر في الإطار التجسيمي ، قم بخفض الإبرة حتى تتصل ب Bregma وتصفير الإحداثيات.
    5. ارفع الإبرة قليلا واضبط على إحداثيات AP و ML المناسبة.
    6. اخفض الطرف حتى يلامس الجمجمة ولاحظ الموقع الدقيق.
    7. ارفع الإبرة قليلا وقم بعمل علامة صغيرة في الموقع المستهدف باستخدام علامة جراحية.
    8. ارفع أو قم بتدوير حامل الإبرة بعيدا عن الطريق ، وباستخدام مثقاب يدوي ، قم بتمرير الجمجمة ، مع الحرص على تجنب إتلاف الدماغ تحتها. تنبيه: بشكل عام ، تمتلك الفئران الذكور الأكبر سنا جماجم أكثر سمكا نسبيا وتتطلب حفرا أكثر شمولا. يجب أن يتم الحفر اليدوي بعناية ، مع تطبيق الحد الأدنى من الضغط ، لأن الاختراقات المفاجئة للجمجمة ستؤدي إلى إتلاف السحايا و / أو الدماغ الكامن.
      ملاحظة: يعد تمديد فتحة الأزيز ضروريا لاستيعاب المسبار الحراري أثناء إجراء LITT. يمكن القيام بذلك بسهولة أكبر أثناء جراحة الحقن الأولية ويسهل جراحة LITT بشكل أسرع وأكثر انسيابية. بدلا من ذلك ، يمكن تمديد ثقب الأزيز بنفس الطريقة أثناء جراحة LITT ، مما قد يقلل من خطر نمو الورم خارج الجمجمة.
  15. قم بإنشاء فتحة لتوءات ثانية عند +3.0 مم مل و +0.5 مم AP (1.0 مم جانبيا لموقع الحقن) للمزدوجة الحرارية.
    1. اتبع إجراء الحفر كما هو موضح في الخطوة السابقة.
    2. لتجنب الصعوبات المتعلقة بإعادة نمو العظام ، قم بإزالة العظم بين الفتحتين.
      ملاحظة: يوصى باستخدام +2.0 مم مل و +0.5 مم AP و -2.5 مم DV من Bregma كإحداثيات لزرع الورم. ينتج عن هذا الموقع في المخطط العلوي نموا ثابتا للورم ، والذي تتحمله جيدا - ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول مع مواقع أخرى.
  16. تحضير معلق خلايا الورم الدبقي للفأر CT2A في حقنة ميكرولتر (5000 خلية في 1.5 ميكرولتر).
    1. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعد مسبقا من الخلايا من الجليد ونفض الغبار برفق بطرف إصبع لإعادة التعليق.
    2. ارسم 2 ميكرولتر برفق في حقنة سعة 5 ميكرولتر أو 10 ميكرولتر مع الحرص على تجنب الفقاعات.
    3. اعبر عن 0.5 ميكرولتر لإزالة أي هواء والتأكد من أن الإبرة معدة وتعمل بشكل صحيح.
    4. امسح جذع الإبرة بمسحة كحولية لإزالة السائل المسحوب وأي خلايا على السطح الخارجي (والتي قد تسبب نمو الورم البريماني السحائي).
  17. قم بتحميل المحقنة في مضخة حقنة حاقن دقيق (أو ملحق تجسيمي يدوي) وقم بخفض الإبرة ببطء.
    1. اخفض الإبرة ببطء إلى العمق (z = -3.0 مم) وتوقف مؤقتا لمدة 1 دقيقة.
    2. اسحب الإبرة ببطء 0.5 مم (z = -2.50 مم) وحقن الخلايا (≤ 0.5 ميكرولتر / دقيقة). حافظ على المنطقة المحيطة بالحقنة جافة باستخدام رمح إسفنجي جراحي مجهري ، مع الحرص على عدم تعطيل الإبرة.
    3. انتظر ما لا يقل عن دقيقتين بعد اكتمال الحقن ، ثم اسحب المحقنة ببطء على مدى 3-4 دقائق. تأكد من أن فترات التراجع الأولى من 4 إلى 5 هي 100 ميكرومتر لكل تراجع لتجنب إزاحة الخلايا من موقع الحقن الأصلي.
    4. باستخدام مسحة كحولية ، امسح الجزء الخارجي من الإبرة برفق خاليا من أي دم أو سوائل واغسل المحقنة وتنظيفها وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدم PBS والماء المقطر بين الحقن لضمان عدم انسداد الإبرة. عند اكتمال الحقن ، اغسل الإبرة بسخاء بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة أي خلايا متبقية من الإبرة.
      تنبيه: قد يؤدي عدم تنظيف الإبرة بعد كل حقنة إلى انسداد. في حالة حقن أكثر من نوع خلية ، استخدم إبرة منفصلة لكل نوع لتجنب أي تلوث متبادل محتمل.
  18. أعد تقريب الشق ، مع الحرص على قطع حواف الجرح قليلا حتى تلمس الأدمة الأساسية. أغلق الجرح باستخدام مشبك الجرح أو 3 غرز متقطعة بخياطة 5-0. ضع محلول بوفيدون اليود على الجرح المغلق.
  19. أخرج من الإطار التجسيمي وضعه في قفص استرداد مبطن بالورق على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. تأكد من الحصول على الاستلقاء القصي قبل نقل مرة أخرى إلى قفص المنزل مع طبق صغير من الطعام الرطب الموجود على أرضية القفص.
  20. راقب مرتين يوميا على الأقل ، بدءا من يوم الجراحة ، لمدة يومين التاليين. أعد إدارة ميلوكسيكام بعد 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة ، أو وفقا لإرشادات المؤسسة.

figure-protocol-2
الشكل 2: رسم توضيحي لجمجمة فأر ومعالم تشريحية مهمة للجراحة التجسيمية. تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-3
الشكل 3: رسم توضيحي رسومي يشير إلى مواقع ثقوب الأزيز وجهاز الليزر. رسم توضيحي يوضح المواضع النسبية لمعلم بريجما ، (أ) ثقب الأزيز الأولي لألياف الليزر (أ) ، و (ب) الفتحة الثانية أو الممتدة للمسبار الحراري (ب). يظهر تصوير مقطوع لألياف الليزر والمجسات الحرارية على اليمين ، موضحا كيف يتم تثبيت المجسات في نهاية القدم التجسيمية مع ثقوب محفورة مسبقا بالحجم والتباعد المطلوبين. تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. مراقبة عبء الورم قبل LITT (اليوم 9)

  1. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T2 (MRI) ، باتباع الإرشادات المؤسسية ، لتقييم نمو الورم في اليوم السابق ل LITT.
    ملاحظة: يجب أن يكون قطر الأورام ~ 1.5-2.0 مم.
    1. احصل على مسح إكليلي مناسب لدماغ الفأر بالكامل باستخدام المعلمات التالية: تسلسل صدى الدوران السريع ، TR = 5000 مللي ثانية ، TE = 45 مللي ثانية ، قطارات الصدى = 7 ، مجال الرؤية = 30 × 30 مم2 ، حجم المصفوفة = 250 × 256 ، إجمالي الشرائح = 18 ، سمك الشريحة = 0.3 مم ، المتوسطات = 2.
      ملاحظة: يوصى أيضا بإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي الدوري بدءا من اليوم 6 تقريبا بعد الزرع لتأكيد نجاح التطعيم الخيفي ومراقبة نمو الورم - خاصة أثناء التجارب الأولية - حيث أن التغييرات الطفيفة في الإجراء قد تغير الجدول الزمني. CT2A عدواني للغاية ، وتحتاج إلى المراقبة عن كثب. يعمل الفحص الإكليلي المرجح T2 بشكل جيد لهذا الغرض. قد يكون استخدام خلايا CT2A الموسومة بالفلورسنت أو المسمى باللوسيفيرين جنبا إلى جنب مع نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) مناسبا أيضا حيث لا يتوفر الوصول إلى التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة. ومع ذلك ، فإن حركية النمو وخصائص الورم الأخرى ستختلف عن هذا البروتوكول.

4. جراحة LITT (اليوم 10)

  1. كما هو مذكور أعلاه في القسم 2 ، كرر الخطوات 2.1-2.13 لإعداد ل LITT.
    ملاحظة: قد يكون التئام الجروح من الجراحة السابقة في مراحل مختلفة بناء على الأنواع والاختلافات في الجدول الزمني التجريبي. ضع في اعتبارك الأنسجة الرقيقة أو الأكثر حساسية عند إعادة عمل الشق.
  2. باستخدام مسحة معقمة ذات رؤوس قطنية ، قم بتنظيف الجمجمة برفق ، وإزالة أي أنسجة تحجب Bregma أو ثقب الأزيز الذي تم صنعه مسبقا. إذا لزم الأمر ، أعد حفر ثقب الأزيز ، على الرغم من سرعة تكوين ورم CT2A ، من المتوقع حدوث القليل من نمو العظام إن وجد.
  3. مع وجود ملحق LITT في مكانه في الإطار التجسيمي ، قم بصفر الإحداثيات في Bregma لطرف ألياف الليزر.
    تنبيه: ألياف الليزر هشة للغاية وسوف تتشقق إذا تم ثنيها. احرص على التوقف بمجرد ملامسة طرف ألياف الليزر للجمجمة.
  4. ارفع الطرف قليلا وانتقل إلى إحداثيات ML و AP المطلوبة ، ثم اخفض المجسات ببطء إلى إحداثيات DV المستهدفة للوصول إلى الهدف (2.0 مم مل ، 0.5 مم AP ، -2.0 مم DV).
  5. اضبط معلمات معالجة LITT: الوضع: مستمر ؛ الطاقة: 1 واط
  6. قم بتبديل الليزر من وضع الاستعداد إلى النشط وقم بتشغيل الليزر لمدة 60 ثانية باستخدام دواسة القدم. إذا ارتفعت درجة الحرارة إلى ما بعد 46 درجة مئوية ، توقف مؤقتا لفترة وجيزة ، ثم أعد الانخراط ، في محاولة للحفاظ على درجة الحرارة بالقرب من 46 درجة مئوية قدر الإمكان.
  7. اسحب مجموعة الليزر ببطء وامسح ألياف الليزر والمزدوجة الحرارية برفق باستخدام مسحة كحولية. قم بتدوير التجميع بعيدا عن الطريق ، مع الحرص على عدم اتصال المجسات بالإطار.
  8. أغلق الجرح واسترجع كما هو موضح في الخطوات 2.18-2.20 بعد زرع الورم أعلاه.

5. تقييم ما بعد LITT (اليوم 11)

  1. قم بإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح بعد LITT T2 في اليوم التالي للعلاج ب LITT لتقييم استئصال الورم LITT الناجح باستخدام التسلسل والمعلمات من الخطوة 3.1 أعلاه.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تسلسل التعافي الانعكاسي الموهن بالسوائل (FLAIR) مفيدا أيضا في تقييم الوذمة بعد الجراحة.
  2. إجراء فحوصات المتابعة قبل نهاية الدراسة لمراقبة التغيرات بعد العلاج أو إعادة نمو الورم.

6. نهاية الدراسة (اليوم 11 / اليوم 15 / اليوم 20)

  1. قتل عند نقاط النهاية التجريبية المختارة وفقا لإرشادات المؤسسة.
    ملاحظة: لا يمكن تحقيق نقاط النهاية في وقت لاحق من اليوم 20 مع CT2A ، حتى مع تلقيحات منخفضة للغاية لعدد الخلايا ، حيث أن الضابطة (أي الجراحة الوهمية أو عدم العلاج) وبعض مجموعة العلاج قد تحتضر وتتطلب القتل الرحيم. لإجراء تجارب أطول، ضع في اعتبارك نماذج خلايا الورم الدبقي البديلة.
  2. جمع الأنسجة للتثبيت والمعالجة.
    1. إجراء التروية القلبية بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) وجمع الأنسجة ذات الاهتمام.
    2. بعد إصلاح أنسجة المخ عن طريق الغمر في 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    3. معالجة العينات باستخدام الممارسات القياسية للتحليل المضمن في البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE) أو التحليل المجمد الثابت.

7. التحليل

  1. تحقق من نجاح استئصال LITT باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي T2 والتحقق من صحته باستخدام التقنيات النسيجية الأساسية مثل صبغة الهيماتوكسيلين واليوزين.
  2. قم بإجراء أي تحليلات إضافية مطلوبة للتجارب (على سبيل المثال ، الكيمياء المناعية ، التألق المناعي).

النتائج

يمكن وصف زرع الورم CT2A الناجح وعلاجات LITT باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي T2 ، كما هو موضح في الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6. تم الحصول على صور التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام مغناطيس فائق التوصيل خال من التبريد 7T مع تجويف 17 سم وملف رأس ماوس تربيعي باستخدام معلمات التسلسل الموضحة في البروتوكول أعلاه. يجب أن يؤدي الالتزام الدقيق بهذه الطريقة إلى معدلات أخذ تقترب من 100٪ ، وتوطين متسق للورم ، وتكوين ورم كروي تقريبا ، كما هو موضح في الشكل 4. توفر هذه الخصائص الأساس الأمثل لعلاجات LITT اللاحقة وأي تحليلات أخرى. وبالمثل ، كما هو موضح في الشكل 5 ، يجب أن تكون عمليات الاستئصال LITT متسقة أيضا في كل من الحجم والموقع. سيتكون اللب المركزي للأنسجة المستعصية من نخر تخثري وتسييل ويمكن تصوره بسهولة على أنه انخفاض الكثافة (أي أسود) على التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T2. في الأيام التي تلي العلاج مباشرة ب LITT ، من المعتاد أيضا ، اعتمادا على علاج LITT الذي يتم إجراؤه ، رؤية منطقة شديدة الكثافة (أي بيضاء) داخل وحول الآفة المقابلة للوذمة المحيطة بالجراحة. يوضح الشكل 6 نتيجة سيئة ويسلط الضوء على بعض المزالق المحتملة عند تنفيذ هذا البروتوكول.

figure-results-1
الشكل 4: صور التصوير بالرنين المغناطيسي الإكليلي T2 لتكوين ورم CT2A المثالي.صور تمثيلية لتكوين الورم في ثلاثة فئران C57BL / 6 (A ، B ، C) بعد 12 يوما من الزرع. تشير الأسهم البيضاء إلى حدود الورم. لاحظ موقع الورم المتسق والتكوين الكروي تقريبا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 5: صور التصوير بالرنين المغناطيسي الإكليلية المرجحة T2 لاستئصال LITT المثالي (يوم واحد بعد LITT). صور تمثيلية لاستئصال ورم LITT في ثلاثة فئران C57BL / 6 (A ، B ، C) بعد 13 يوما من الزرع. لاحظ الحجم والموقع المتسقين للب الآفة النخرية. إن إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي قبل LITT واستئصال LITT في وقت مبكر قليلا من شأنه أن يوفر توازنا أفضل بين حجم الورم الأمثل لاستهداف الليزر والقدرة على الحصول على نقاط نهاية لاحقة بعد العلاج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 6: صور التصوير بالرنين المغناطيسي الإكليلية المرجحة ب T2 لعلاجات LITT المحسنة مسبقا. صور من ثلاثة فئران C57BL / 6 (A ، B ، C) عولجت بمعلمات ليزر متطابقة وأهداف تجسيمية قبل تحسينات البروتوكول ، كمثال على نتيجة غير مثالية. تشير الأسهم البيضاء إلى حدود الورم. تظهر المناطق الحدودية منطقة الوذمة. لوحظ تباين كبير ، بما في ذلك نمو الورم الأقل اتساقا واستهداف الاستئصال بالليزر الضعيف مما يؤدي إلى تلف غير متسق للأنسجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

هناك مجموعة من الأدبيات سريعة التوسع فيما يتعلق ب LITT. ومع ذلك ، فإنه يقتصر في المقام الأول على دراسات الحالة السريرية البشرية أو سلسلة الحالات. في الواقع ، تم عرض العديد من الفوائد المحتملة ل LITT ، بما في ذلك انخفاض معدلات المضاعفات والتكاليف بعد الجراحة مع منح بقاء خال من التقدم 7،8،9،10،11. هناك أيضا انخفاض في التكرار الموضعي مع النجاح الأكبر للعلاج الدوائي الجهازي ، على الرغم من أن الأسباب لم يتم فهمها جيدابعد 12. بالإضافة إلى ذلك ، تشمل النتائج الواعدة للتطبيقات السريرية خارج بريطانيا علاج النقائل وأنواع الأورام الأخرى3،12 ، والنخر الإشعاعي13 ، والصرع المقاومللحرارة 14 ، والتشوهات الوعائية15 ، وحتى اضطراب الوسواسالقهري 16. على العكس من ذلك ، فإن البحث باستخدام نموذج الفئران محدود للغاية حتى الآن ، مع وجود استثناءات قليلة ملحوظة ، وقد يكون من الصعب تكرارها. على سبيل المثال ، استخدمت دراسة حديثة حول تغيرات نفاذية الحاجز الدموي الدماغي بعد العلاج ب LITT مولد ليزر يباع في أوروبا للاستخدام السريري ، ولكن هذه الأداة غير معتمدة في أمريكاالشمالية 17. في حين أن مثل هذا النظام يبدو مناسبا تماما لأبحاثهم ، فمن المحتمل أن يكون الحصول على الجهاز باهظ التكلفة بالنسبة لمعظم الباحثين ، ويصعب تكرار أي ميزات مملوكة أو عالية الهندسة. على هذا النحو ، فإن البروتوكول التفصيلي لنموذج حيواني ما قبل السريري يمكن الوصول إليه ومحسن سيوفر فرصا بحثية قيمة.

تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول التحديد الدقيق ل Bregma للاستهداف القابل للتكرار أثناء كل من التطعيم الخيفي وجراحة الاستئصال LITT اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إيلاء اهتمام خاص لخطوات الحقن فيما يتعلق بسرعة التسليم والتوقف المؤقت أمر بالغ الأهمية لنجاح ترقيع الخلايا السرطانية ، والفشل في القيام بذلك يزيد بشكل كبير من خطر نمو الورم خارج الجمجمة وزيادة تباين الورم. من المهم أيضا التأكيد على أنه يجب التخطيط لجراحة LITT بينما لا يزال الورم صغيرا نسبيا (أي ~ 1.5-2.0 مم في القطر). من خلال تجربتنا ، غالبا ما تصبح أورام CT2A أكثر تنوعا في الشكل عندما تكون كبيرة ، كما أن الأورام الكبيرة جدا تزيد أيضا من صعوبة استخراج الدماغ ، خاصة إذا نما الورم من خلال السطح القشري. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن أقل من 24 ساعة ، مثل بين التصوير بالرنين المغناطيسي قبل العلاج وجراحة LITT ، هي وقت كاف لاستمرار نمو الورم الدبقي CT2A.

يمكن بسهولة إجراء العديد من التعديلات على هذا البروتوكول لتكييفه مع التصميمات التجريبية الأخرى. على وجه الخصوص ، يركز هذا البروتوكول على الخطوات الفنية اللازمة لنجاح عملية زرع تقويم العظام وجراحات LITT في نموذج فأر C57BL / 6 syngenegeneic CT2A. ومع ذلك ، يمكن استبدال النموذج الموصوف بسهولة لاستيعاب الأهداف التجريبية المختلفة. يمكن استخدام خطوط الخلايا السرطانية الزاعية الأقل عدوانية مثل K1491 لإجراء التجارب التي تتطلب نقاطا زمنية أطول ، مثل تلك التي تنطوي على استجابات مناعية فطرية وتكيفية. بدلا من ذلك ، بالنسبة للتجارب التي لا تركز على الاستجابات التكيفية لمضيف الورم ، فإن خطوط الخلايا المشتقة من المريض أو نماذج الطعم الغريب الأخرى في نماذج الفئران المعرضة للخطر المناعي هي خيار آخر قابل للتطبيق. للقارئ المهتم ، Haddad et al. (2021) يقدم مراجعة شاملة لنقاط القوة والقيود في العديد من نماذج فأر الورم الدبقي الشائعة والطعمالغريب 4. وهناك تعديل مباشر آخر، تبعا للتوافر المؤسسي والمبادئ التوجيهية، وهو استبدال التخدير الاستنشاقي ببدائل قابلة للحقن مثل مزيج من الكيتامين والزيلازين ± الأسيبرومازين. ومع ذلك ، عندما تتوفر عوامل الاستنشاق والمعدات المطلوبة (مثل مخروط الأنف التجسيمي) ، فإننا نوصي باستخدامها لعدة أسباب. أولا ، نعتقد أن التخدير الاستنشاقي هو البديل الأكثر أمانا لأنه لا يتطلب حقنا داخل الصفاق ، ولا يتطلب تكرار الجرعات لعمليات جراحية أطول أو أكثر تحديا ، ويمكن معايرته بسهولة بهامش أمان واسع18. بالإضافة إلى ذلك ، لا يتطلب التخدير الاستنشاقي استخدام مواد خاضعة للرقابة ويوفر استيقاظ سريعا وتعافيا بعد الجراحة.

يجب أن يكون استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا البروتوكول ضئيلا ، حيث تؤدي معظم المشكلات الناشئة عن تقنية الحقن السيئة إلى تكوين ورم غير منتظم أو نمو خارج الجمجمة. يمكن تصحيح مشكلات استهداف LITT من خلال التحديد الصحيح للمعالم ، وتثبيت ألياف الليزر المناسب ، والمراقبة الدقيقة لألياف الليزر أثناء الإدخال لضمان عدم تأثيرها على جانب الثقب ودفعها بعيدا عن المسار.

تشمل قيود الطريقة المستوى المتوسط إلى المتقدم من المهارة الجراحية والتقنية المطلوبة لأداء الإجراءات ، والوصول إلى المعدات المتخصصة مثل جهاز التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة ، وبروتوكول زرع تقويم العظام المطول ، والذي يحد من عدد الحقن التي يمكن إجراؤها في يوم واحد. نظرا لأن هذا البروتوكول يهدف إلى أن يكون نموذجا ما قبل السريري للورم الدبقي عالي الدرجة ، فهناك أيضا قيود متأصلة تتعلق بالطبيعة الأكثر عدوانية لبعض خطوط خلايا الورم الدبقي ، مثل CT2A. ستساعد التطعيمات المنخفضة لعدد الخلايا ، وموقع الحقن العميق داخل المخطط ، وتقنية الحقن الدقيقة ، والعلاج المبكر في التخفيف من هذه المشكلات ، ولكن قد يستمر نمو الورم خارج الجمجمة أو غير المنتظم في بعض الأحيان ، وهناك ما يبرر التصميمات التجريبية القصيرة. كما تمت مناقشته ، يمكن أيضا إجراء تعديل هذا البروتوكول بخط خلوي أقل عدوانية.

نظرا لأن هذا البروتوكول ، على حد علمنا ، هو الوصف التفصيلي الوحيد لنموذج الفئران قبل السريري ل LITT من GB ، فهو خطوة مهمة نحو توفير نموذج راسخ لأبحاث العلوم الأساسية المستقبلية.

الإفصاحات

نحن ممتنون للدعم المقدم من مونتيريس الطبية ، بما في ذلك التبرع العيني بمعدات الليزر.

شكر وتقدير

تشمل مصادر تمويل هذا المشروع مجلس العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC) - التحالف ، و Mitacs-Accelerate ، و Research Manitoba-IPOC ، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) CGS-M ، وزمالة الدراسات العليا بجامعة مانيتوبا. خط خلايا الورم الدبقي CT2A تبرع به الدكتور بيتر فيتشي بسخاء في جامعة ديوك ، دورهام ، نورث كارولاينا. نود أيضا أن نشكر مختبر خدمة الأنسجة ومرفق التصوير الأساسي للحيوانات الصغيرة والمواد في جامعة مانيتوبا على مساعدتهم الفنية الممتازة في هذا المشروع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
امتصاص الرماحFST18105-01الإسفنج المرقئ.
ملقط أنسجة AdsonFST11006-12
C57BL / 6 الفئرانسلالة مختبرات جاكسون# 000664من 6 إلى 12 أسبوعا من الذكور والإناث
قضيبات قطنية ذات رأس (6 بوصات)علوم المجهر الإلكتروني72308
CT2A خطتم التبرع بها بسخاء من الدكتور بيتر فيتشي ، جامعة ديوك.
مستخلص الغشاء القاعدي لعامل النمو المنخفض من Cultrex ، PathClearBiotechne ، R & أنظمة D3433-010-01
DMEM / F-12 ، HEPESGibco ، ThermoFisher Scientific11330032
شرائح الغرفة المزدوجة   ؛BIO-RAD1450003
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 ملEppendorf22363352
الكحول الإيثيلي اللامائيGreenfield GlobalP016EAANمخفف إلى 70٪ مع ddH2< / sub>O
مصل بقري الجنين ، مؤهل ، كنداGibco ، غلاف بلاستيكي ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-SealAmazon.ca12587704417
مثقاب عالي السرعةKopf Instrumentsموديل 1474
K & J الحرارية temerpature مترأوميغاHH509R
Metacam (meloxicam)WDDC114424
مضخة حقنة الحقن المجهريWPIUMP3T-1
حقنة ميكرولتر (سلسلة 700)هاميلتون87908الإبر المخصصة متوفرة. تساعد شطبة الإبرة شديدة الانحدار في التسليم الدقيق ، ويساعد طول الإبرة الأقصر في الاستقرار.
سائق إبرة / حامل إبرةFST12500-12الطرف الناعم هو الأنسب بسبب مساحة العمل الضيقة ، ولكن العديد من الأنماط مناسبة بناء على تفضيل المقبض.
Opixcare Plus مرهم opthalmicWDDC135941
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x)كواشف فيشر الحيويةBP399-4تمييع إلى 1x مع ddH 2< / sub>O
Povidone-iodineThermoFisher Scientific3955-16Aliquat في أنابيب أصغر للاستخدام مع أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية.
مشرط ملحي (عادي)WDDC126588
مشرط ، استخدام واحد (# 15 شفرة) مقصريشة ريشةNO15
، مقص جراحيجيد FST91460-11قزحية العين ، أو بون كلها مناسبة.
إطار تجسيميKopf Instrumentsموديل 940مع وحدة تحكم عرض رقمية ومخروط أنف الماوس وقضبان أذن.
حامل حقنة تجسيميةKopf Instrumentsموديل 1772-Fإذا لم تستخدم مضخة حقن.
خيوط (5-0 حيدة الشعيرات)EthiconMCP463Gأحادي الشعيرات البنفسجية أحادية مع حقنة طرف القطع
العكسي ، 28 G & nbsp ؛ (0.5 مل) BDBD 329461BD Lo-Dose U-100 محاقن الأنسولين
TC20 عداد الخلايا الآليBIO-RAD1450102
مسبار مزدوج حراري ، قطر دقيق (النوع K)أوميغاTJM-CA316-IM025G-150
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمرGibco ، ThermoFisher Scientific25200072
Vetbond بواسطة 3M ، غراء الأنسجة البيطرية   ؛WDDC126125
Wahl Peanut ClippersWDDC / Wahl100963متوفر أيضا مباشرة من الشركة المصنعة.
وسادة الاحترارBensen Medical70308 / 121873يمكن استخدام أي عنصر مماثل.
Webcol Alcohol يجهزعلوم المجهر الإلكتروني71005-20مسح تحضير الكحول ، 2 طبقة ، متوسط الحجم.
خلايا الورم الدبقي ،

المراجع

  1. Canadian Cancer Society. Cancer Statistics 2023. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).
  2. Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , https://www.gbmresearch.org (2024).
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).
  5. Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. A patient-derived xenograft model of glioblastoma. STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).
  6. Alcaniz, J., et al. Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures. Front Oncol. 13, 1129627(2023).
  7. Muir, M., et al. Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma. Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).
  8. Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors. Surg Neurol Int. 13, 311(2022).
  9. De Groot, J. F., et al. Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma. Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).
  10. Holste, K. G., Orringer, D. A. Laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).
  11. Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy. Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).
  12. Bastos, D. C. D. A., et al. Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy. Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).
  13. Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases. J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).
  14. Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health. J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).
  15. Ogasawara, C., et al. Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes. World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).
  16. Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).
  17. Salehi, A., et al. Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).
  18. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CT2A

مقالات ذات صلة