مقالة منهجية

قياس إعادة التدوير عالي الدقة في غرفة صغيرة الحجم

DOI:

10.3791/67442

⸱

يوليو 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نوضح أن الغرفة 0.5 مل لقياس إعادة التنفس عالي الدقة تظهر نتائج تتوافق مع غرفة 2.0 مل إذا تم تطبيق تصحيح الخلفية O2 الآلي المناسب. يتطلب عينة أقل ، وهو أمر مفيد للدراسات ذات التوافر المحدود أو القدرات التنفسية المنخفضة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التحقيق في تدفقات الجهاز التنفسي أمرا حاسما لفهم التفاعل المعقد بين عمليات التمثيل الغذائي. قد تستفيد دراسات الخلايا والأنسجة ذات توافر العينة المحدود ومعدلات التنفس المنخفضة من أحجام تجريبية صغيرة. درسنا ما إذا كانت الغرفة سعة 0.5 مل تعطي نتائج متوافقة مع حجرة 2.0 مل بتركيزات عينة متطابقة تستخدم في قياس التنفس عالي الدقة مع Oroboros. كان تدفق الخلفية O2 أعلى بمقدار 4 أضعاف في غرف سعة 0.5 مل من غرف 2.0 مل عند تشبع الهواء ولكنه كان قابلا للتكرار ، مما يسمح بتصحيح الخلفية بدقة. كانت سرعة التحريك المثلى بين 550 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) و 750 دورة في الدقيقة في الغرفة سعة 0.5 مل. تم قياس تدفقات الجهاز التنفسي في الخلايا الحية والخلايا المنفذة والميتوكوندريا المعزولة بالتوازي في غرفتي 0.5 مل و 2.0 مل ، باستخدام بروتوكولات المعايرة بالتحليل الحجمي للركيزة مع 14 إلى 20 معايرة بالتحليل الحجمي. O2 كانت التدفقات في أنواع الغرف المختلفة متطابقة ضمن حدود الكشف. توفر الغرفة التي يبلغ حجمها 0.5 مل ، والتي تتطلب عينة أقل بأربع مرات من الغرفة التي يبلغ حجمها 2.0 مل ، ميزة كبيرة للدراسات ذات الكميات المحدودة من العينة أو القدرات التنفسية المنخفضة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التحقيق في مسارات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا أمرا أساسيا لتسليط الضوء على آليات التمثيل الغذائي الكامنة وراء الأمراض المختلفة أو الشيخوخة أو الاستجابات للإجهاد ، وبالتالي توفير أهداف محتملة للتدخلات العلاجية وتحسين القدرات التشخيصية1،2،3. يسمح قياس التنفس عالي الدقة (HRR) بتحليل مفصل للتحكم في مسار الميتوكوندريا والاقتران في الفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) عبر مجموعة متنوعة من أنواع العينات والمستحضرات4. حجم الغرفة التجريبية هو سمة تصميم أساسية لأدوات قياس التنفس. حجم الغرفة الذي تم إنشاؤه مسبقا هو 2.0 مل في Oroboros. تم تحسين هذا الحجم ليستلزم تدفق منخفض للخلفية الآلية O2 وضمان تجانس الوسط المقلب. هذه من بين معايير الجودة الرئيسية للقياس الدقيق للتنفس في ظروف الأكسجين المنخفض وفرط التأكسج المطلوبة لحركية الأكسجين في الميتوكوندريا وألياف العضلات المنفذة ، على التوالي5،6،7،8،9. علاوة على ذلك ، تتطلب العديد من عمليات الإدخالات متعددةالمستشعرات 10 مساحة الغرفة 2.0 مل (الجدول 1).

في هذه الدراسة ، قمنا بفحص جدوى تقليل حجم الغرفة ل HRR من 2.0 مل إلى 0.5 مل. هل يمكن تطبيق عدد الخلايا المنخفض أو كميات الأنسجة في فحوصات قياس التنفس في غرفة أصغر دون المساس بالدقة؟ يعد توضيح هذا السؤال مهما للتحقيق في الأنسجة البشرية والخزعات السائلة والخلايا الأولية ومزارع الخلايا بطيئةالنمو 1. وبالمثل ، من المحتمل أن يكون تقليل حجم الغرفة مفيدا في دراسات العينات ذات الأنشطة التنفسية المنخفضة في الميتوكوندرياالمعيبة 11 ومسارات الميتوكوندريا ذات القدرات المنخفضة بطبيعتها ، مثل أكسدة الأحماض الدهنية في الدماغ12. ومع ذلك ، قد تتضاءل الدقة عند حجم الغرفة المنخفض بسبب الزيادة غير المتناسبة في القطع الأثرية للانتشار الخلفي O2 ومعايرة الحجم غير الدقيقة13،14. لذلك ، قمنا بتحليل الأداء الآلي ل Oroboros مع الغرفة ذات الحجم الصغير (sV) التي تمت معايرتها بحجم تجريبي بسيط يبلغ 0.5 مل ، مقارنة بغرفة الحجم الكلاسيكي (cV) التي تمت معايرتها عند 2.0 مل. على وجه الخصوص ، قمنا بتحليل الخلفية الآلية O2 التدفق وسرعة التحريك المثلى.

تستخدم بروتوكولات معايرة الركيزة ومفك الاقتران ومثبطات الركيزة (SUIT) لتقييم معدلات التنفس والحالات في تحليل OXPHOS. تألفت بروتوكولات SUIT من 14 إلى 20 معايرة لكل مقايسة تنفسية واستلزمت تدفقات O2 في الجهاز التنفسي تتراوح من عدد قليل من pmol∙s-1∙mL-1 إلى مئات pmol∙s-1∙mL-1. تشمل حالات التحكم في الاقتران معدل التسرب L ، أي المكون المشتت للتنفس ، والذي لا يتوفر لفوسفوريل الأدينوزين -5'-ثنائي الفوسفات (ADP) إلى الأدينوزين -5'-ثلاثي الفوسفات (ATP) وينتج عن تسرب البروتون ، وانزلاق البروتون ، ودورة الكاتيون ، وتسرب الإلكترون. تمثل سعة OXPHOS P تنفس الميتوكوندريا عندما يقترن نقل الإلكترون المقاس باستهلاك O2 (الأكسدة) بتخليق ATP (الفسفرة) في وجود ADP. يتم قياس قدرة نقل الإلكترون E في الحالة المنفصلة عن طريق معايرة البروتونوفور في وجود ركائز الميتوكوندريا15. يتم تحديد استهلاك الأكسجين المتبقي rox بعد إضافة مثبطات المركب الأول والمركب III روتينون ومضاد مايسين أ.

قمنا بقياس تنفس الخلايا ومستحضرات الميتوكوندريا في غرفتي sV و cV . الصفائح الدموية عبارة عن شظايا سيتوبلازمية من الخلايا الضخمة وتمثل مصدرا يمكن الحصول عليه بسهولة للميتوكوندريا البشرية. لذلك ، تم تطبيق الصفائح الدموية كنموذج للخلايا الحية (أو جزيئات الخلية) ذات أغشية البلازما السليمة. يعمل تنفس خلايا الدم كمؤشر حيوي لأمراض الميتوكوندريا الجهازية ويرتبط باللياقة الحيوية للأعضاء النشطة الأيضية16،17،18،19 ، على الرغم من أنه لا يمكن تعميم هذهالنتائج 20،21،22. تم اختيار الخلايا الليفية البشرية لتطبيقها كنموذج خلوي للخلل الوظيفي في الميتوكوندريا1،23،24،25. يعد سلامة أغشية البلازما ضروريا لبقاء الخلية ، لكن نفاذيتها الانتقائية تسمح بتبادل الجزيئات بين العصارة الخلوية والوسط المحيط. ومن ثم ، تمت دراسة الخلايا الليفية ذات أغشية البلازما المنفذة كيميائيا كمثال على الخلايا المنفذة ، مقارنة بالميتوكوندريا المعزولة المستخدمة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا والمطلوبة لفصل المجموعات السكانية الفرعية للميتوكوندريا26،27.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة للدراسة التي أجريت على الصفائح الدموية البشرية ، قدم ثمانية متطوعين موافقة خطية مستنيرة للمشاركة في الدراسة ، والتي وافقت عليها هيئة المراجعة الأخلاقية السويدية (رقم 2013/181). تم شراء خطين من خلايا الخلايا الليفية الجلدية البشرية من حديثي الولادة الذكور من ATCC واستخدامهما وفقا للموافقة الأخلاقية لوزارة الصحة في الجمهورية التشيكية (المشروع: AZV MZ CR NU22-07-00474). تم إجراء الإجراءات التي شملت الفئران وفقا لقانون التجارب على النمساوي ووفقا للاتفاقية الأوروبية لحماية الفقارية المستخدمة للأغراض التجريبية والعلمية الأخرى (Tierversuchsgesetz 2012; التوجيه 2010/63 / EU; BMWFM-66.011 / 0128-WF / V / 3b / 2016). تم تطبيق مبدأ 3Rs لتقليل عدد التجارب.

1. معايرة الحجم

  1. قم بتركيب الغرف ذات الحجم الصغير (sV) أو الغرف ذات الحجم الكلاسيكي (cV) على Oroboros (الشكل 1 أ ، ب ؛ الجدول 1).
  2. قم بتشغيل Oroboros واتصل ب DatLab.
  3. جفف الغرف.
  4. الماصة 0.54 مل من H2O في sV (0.50 مل حجم تجريبي فعال بالإضافة إلى 0.04 مل من الحجم الميتا الشعري) أو 2.07 مل من H2O في cV (2.00 مل حجم فعال بالإضافة إلى 0.07 مل من الحجم العرقي الميت).
    ملاحظة: لتجنب فقدان السائل بين الجزء العلوي من الأسطوانة الزجاجية وحامل حجرة البولي أوكسي ميثيلين (POM)، أدخل طرف الماصة بعمق كاف للمس جدار الحجرة الزجاجية.
  5. قم بتشغيل أدوات التقليب.
  6. قبل إغلاق الغرفة ، قم بترطيب الحلقات O للسدادات مع الحفاظ على شعيرات الدموية جافة. قم بفك حلقات معايرة الحجم وأدخل السدادات لأسفل حتى يملأ السائل الشعيرات الدموية للسدادة ويظهر قطرة صغيرة في الوعاء في الطرف العلوي من الشعيرات الدموية (الجدول 1).
  7. شد حلقات معايرة الحجم لإصلاح موضعها بحيث يتم الحصول على الحجم المعاير في عمليات إدخال متتالية للسدادات.

2. الإعداد العام ل Oroboros

  1. ابدأ تشغيل برنامج DatLab .
  2. اضبط درجة الحرارة التجريبية (37 درجة مئوية) وسرعة دوران التحريك على 550 دورة في الدقيقة (9.2 هرتز أو الدوران في الثانية) في الغرفة sV أو 750 دورة في الدقيقة (12.5 هرتز) في الغرفة cV. اضبط الفاصل الزمني لأخذ عينات البيانات على 2 ثانية مع تجانس أكثر من 80 ثانية (40 نقطة بيانات) في اختبارات الخلفية O2 الآلية أو 40 ثانية (20 نقطة بيانات) لقياس إعادة التسخين.
    ملاحظة: قضبان النمام المغناطيسية (AlNiCo مطلية بثنائي فلوريد البولي فينيلدين [PVDF]؛ الجدول 1) يتم تحريكها بواسطة مجال مغناطيسي دوار نابض بقوة مجال 3.5 mT على مستوى النمام في الغرفة.
  3. قم بإجراء معايرة الهواء28 في MiR05 أو في نفس وسط الحضانة المستخدم في التجارب اللاحقة.
  4. قم بإجراء معايرة الأكسجين الصفرية من حين لآخر ولكن ليس مباشرة قبل بدء التجارب.
    1. قم بإعداد محلول مخزون Na-dithionite طازج عن طريق إذابة مسحوق O2-Zero في مخزن مؤقت للفوسفات 50 ملي مولار (درجة الحموضة 8.0) بتركيز 2.5 ملي مولار أو 10 ملي مولار لغرف sV أو cV ، على التوالي.
    2. المعايرة Na-dithionite الزائدة للحصول على الإشارة الخام R0 أو التيار الصفري [μA] عند تركيز O2 0 μM14،28.

3. اختبار الخلفية O2 الآلي

  1. الغرفةالخامسة
    1. بعد معايرة الهواء ، أغلق الغرفة. راقب إشارة الأكسجين لمدة 60 دقيقة تقريبا حتى ينخفض تركيز O2 من تشبع الهواء إلى حوالي 150 ميكرومتر. اضبط أربع علامات J ° 1 إلى J ° 4 على القطعة "O2 منحدر سالب".
      ملاحظة: قم بإجراء اختبار الخلفية O2 الفعال هذا كل يوم قبل بدء التجربة.
    2. اختياري: باستخدام حقنة هاميلتون ، يتم تحضير المعايرة Na-dithionite وفقا للخطوة 2.4.1 للوصول إلى تركيز O2 يبلغ 100 ميكرومتر (الشكل 1C).
      ملاحظة: في بروتوكول آخر ، يتم معايرة Na-dithionite في الغرفة باستخدام المضخة الدقيقة بالحقن بالتحليل الحجمي (TIP2k; الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2) للمقارنة مع طريقة قياسية لتحديد الخلفية الآلية O2 تدفق28.
  2. الغرفة جالخامسة
    1. بعد معايرة الهواء ، أغلق الغرفة ، وانتظر تثبيت منحدر O2 ، واضبط علامة J ° 1 على قطعة الأرض "O2 منحدر neg."28. باستخدام حقنة هاميلتون ، يتم تحضير المعايرة Na-dithionite وفقا للخطوة 2.4.1. بخطوات 0.7 ميكرولتر لتتناسب مع نظام الأكسجين في الغرفة sV وخفض تركيز O2 إلى 150 ميكرومتر.
    2. أضف خطوة أخرى لمعايرة Na-dithionite (حوالي 7 ميكرولتر) لخفض تركيز O2 إلى 100 ميكرومتر (الشكل 1 د).
  3. أداة O2 تحليل بيانات الخلفية
    1. احسب منحدر الخلفية O2 الفعال في DatLab28. حدد Flux / Slope من القائمة العلوية.
    2. افتح نافذة تصحيح الخلفية O2. حدد ملف نشط كمصدر للخلفية O2 وحدد علامات J لاستخدامها لحساب الانحدار الخطي. قم بتطبيق تصحيح الخلفية O2.

figure-protocol-1
الشكل 1: غرف صغيرة الحجم (sV) والحجم الكلاسيكي (cV) واختبار الخلفية O2 الآلي. (أ) الدائرةالخامسة. (ب) الدائرة جالخامسة. (ج) الآثار التمثيلية للمنحدر سالب وعلامات J ° 1 ، sV (0.5 مل ؛ أخضر) و cV (2.0 مل ؛ أزرق). (د) تركيز الأكسجين المقابل وعلامات R1. ثلاث معايرة يدوية من Na-dithionite (حوالي 0.7 ميكرولتر، مخزون 10 مليمتر؛ cV) ومعايرة 7.0 ميكرولتر نهائية من مخزون 2.5 ملي مولار و10 ملي مولار في حجرتي sV وcV على التوالي. تم التخلص من المسامير الناجمة عن المعايرة بالتحليل الحجمي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. إضافة عينة إلى غرف Oroboros

ملاحظة: يمكن إضافة العينة إلى الغرفة بطريقتين: الاستبدال الجزئي للحجم (الصفائح الدموية والخلايا الليفية في هذه الدراسة) أو الاستبدال الكامل للحجم (الميتوكوندريا المعزولة في هذه الدراسة).

  1. استبدال الحجم الجزئي
    1. قم بإزالة السدادة التي تم إدخالها بالكامل. ماصة وتخلص من وحدة التخزين Vمن MiR05. Vخارج هو 60-70 ميكرولتر للصفائح الدموية و 80-150 ميكرولتر للأرومات الليفية ، محسوبة وفقا لتركيزات الخلايا في تعليق خلية المخزون.
    2. يعادل Vout ، قم بإدخال الماصة بنفس الحجم VJ.i من تعليق خلية المخزون (بتركيز خلية معروف) في الغرفة (الشكل 2).
    3. احسب تركيز الخلية التجريبية في الحجم الفعلي V ' (0.54 مل و 2.07 مل) ، أكبر من الحجم التجريبي الفعال V (0.5 مل و 2.0 مل).
      ملاحظة: يجب تخطيط تركيزات تعليق الخلية المخزونة وتركيز الخلية التجريبية للحصول على أحجام VJ.i = Vمخرجات متوافقة مع خطأ صغير في المعايرة بالتحليل الحجمي. في التجارب على الصفائح الدموية ، تم استخدام سدادة نموذجية للغرفة sV بحجم ميت شعري يبلغ 0.05 مل.
  2. استبدال الحجم الكامل
    1. قم بسحب الوسط بالكامل من الغرفة واستبدله بما لا يقل عن 0.54 مل أو 2.07 مل من محلول مخزون الميتوكوندريا المعزول عند تركيز العينة التجريبية في غرف sV أو cV ، على التوالي.
    2. أغلق الغرفة واسحب محلول مخزون الميتوكوندريا الزائد من وعاء السدادة.
      ملاحظة: يستبعد الاستبدال الكامل للحجم أي تباين في تركيز الميتوكوندريا قد يحدث عن طريق المعايرة في الغرفة المغلقة من خلال الشعيرات الدموية للسدادة باستخدام حقنة هاميلتون. وهذه الطريقة الأخيرة قابلة للتطبيق على العينات ذات القطر الصغير المحضرة في معلقات المخزون المركزة (مثل الميتوكوندريا المعزولة)؛ ومع ذلك ، فإنه يعرض الخلايا الهشة للتلف المحتمل لأغشية البلازما بسبب قوى القص التي تمارس في الإبرة التي يبلغ طولها 51 مم لحقنة هاميلتون (القطر الداخلي 0.41 مم). يتم تجنب ذلك عن طريق إزالة السدادة وسحب العينة في الغرفة عن طريق استبدال الحجم الجزئي أو الكامل. تمت دراسة ثلاثة أنواع من مستحضرات الميتوكوندريا. تم وصف مستحضرات العينة في الملف التكميلي 11،26،29،30.
  3. الخلايا الحية: الصفائح الدموية البشرية
    1. أدخل المبردات التي تحتوي على الصفائح الدموية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية وقم بإذابة المحتوى حتى يتبقى القليل من الجليد.
    2. افتح المبردات وأضف 1 مل من الوسط الدافئ مسبقا (DPBS + 10 ملي مولار EGTA ، 37 درجة مئوية) ببطء في قطرات.
    3. امزج الصفائح الدموية برفق وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل بحجم إجمالي يبلغ 10 مل وسط دافئ مسبقا (DPBS + 10 ملي مولار EGTA ، 37 درجة مئوية). جهاز طرد مركزي عند 1000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام دوار متأرجح للخارج (التسارع 6 ، الفرامل 2).
    4. أعد تعليق الصفائح الدموية في 0.25 مل من DPBS + 10 ملي متر EGTA (RT) وأضفها إلى الغرف عن طريق الاستبدال الجزئي للحجم إلى تركيز خلية تجريبية أولي يتراوح من 157 · 106 إلى 210 · 106 [إكس] [مل-1] في الغرفة 0.5 [مل] ومن 164 · 106 إلى 220 · 106 × مل -1 في الغرفة سعة 2.0 مل (انظر31 للحصول على تفاصيل حول الوحدة الابتدائية x).
      ملاحظة: تم تجهيز واحدة من Oroboros بغرفة sV و cV في الموضعين A و B ، على التوالي ، تستخدم بالتوازي مع Oroboros أخرى مجهزة بغرفة sV و cV في الوضعين B و A ، على التوالي.
  4. الخلايا المنفذة: الخلايا الليفية البشرية
    1. أضف الخلايا إلى غرف Oroboros عن طريق الاستبدال الجزئي للحجم إلى تركيز خلية اسمي يبلغ 0.75 · 106 × مل -1 في كلا النوعين من الغرف وحساب التركيز الفعلي (الخطوة 4.1.3).
      ملاحظة: تم استخدام أدوات Oroboros المختلفة بالتوازي ، كل منها مجهز إما بغرف sV أو cV .
  5. الميتوكوندريا المعزولة: قلب الفأر
    1. أضف 15 ميكرولتر من معلق الميتوكوندريا إلى 5985 ميكرولتر من وسط تنفس الميتوكوندريا (MiR05) ، مما ينتج عنه تركيز بروتين الميتوكوندريا يتراوح من 0.013-0.026 مجم ∙ مل -1.
    2. أضف تعليق الميتوكوندريا إلى غرف Oroboros عن طريق استبدال الحجم بالكامل.
      ملاحظة: تم تجهيز واحد من Oroboros بغرفة sV و cV في الموقعين A و B ، على التوالي ، تستخدم بالتوازي مع Oroboros أخرى مجهزة بغرفتي sV و cV في الوضعين B و A ، على التوالي.

figure-protocol-2
الشكل 2: إضافة تعليق الخلية عن طريق الاستبدال الجزئي للحجم. (أ) إضافة الدائرة سعة 0.5 مل sv و (ب) الدائرة سعة 2.0 مل جV. (1) غرفة مغلقة بأحجام من وسط التنفس V والسدادة الشعرية المملوءة Vstc ، لقياس الخلفية الآلية O2 تدفق JO2 °. (2) تمت إزالة السدادة ، تم تصريف Vstc في الغرفة مما أدى إلى الحجم الإجمالي V '= V + Vstc. (3) الإزالة الجزئية للمتوسط V= -V J.i. يبقى حجم V''= V'+Vفي الغرفة. (4) سحب عينة فرعية بحجم V J.i من تعليق خلية المخزون التنفسي في الغرفة مما ينتج عنه حجم إجمالي V # = V + V stc لتعليق الخلية المخفف. (5) غرفة مغلقة مع سدادة شعرية مملوءة (الحجم الميت Vstc) لقياس تدفق O2 الخاص بالحجم JV ، O2 في الحجم التجريبي V. تم تعديل هذا الرقم من الشكل 2 أ في عدد الخلايا والتطبيع في HRR41. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. بروتوكولات SUIT

  1. قم بمعايرة محاليل مخزون المواد الكيميائية المدرجة في الجدول التكميلي 1 في الغرف باستخدام محاقن هاميلتون المجهرية، مع ضبط أحجام المعايرة بالتحليل الحجمي للحصول على نفس التركيزات التجريبية في غرفتي sV وCV (انظر أساطير الشكل في الأشكال 6 و8 و10).
  2. حدد بروتوكول SUIT-003_D01832،33 (للصفائح الدموية في هذه الدراسة).
  3. حدد بروتوكولات SUIT-001_D0044،15،34،35 و SUIT-002_D0074،15،35،36 (للأرومات الليفية في هذه الدراسة).
  4. حدد بروتوكول SUIT-002_D0054،15،35،37 (للميتوكوندريا المعزولة في هذه الدراسة).

6. تحليل بيانات SUIT

  1. في DatLab ، قم بتعيين العلامات لتحديد أقسام المخططات المحددة.
  2. حدد Flux / Slope في القائمة العلوية. افتح نافذة Flux/Slope . قم بتطبيق تصحيح حجم المعايرة بالتحليل الحجمي لتخفيف العينات المعلقة بواسطة كل معايرة بالتحليل الحجمي في بروتوكول SUIT.
  3. حدد العلامات من القائمة العلوية. افتح إحصائيات العلامة لإظهار متوسط نقاط البيانات المحددة التي تم تصحيحها عن طريق طرح استهلاك الأكسجين المتبقي (rox).
  4. احسب التقاطع والميل بين النتائج المزدوجة التي تم الحصول عليها في غرفتي sV و cV عن طريق تحليل الانحدار المقلوب25،28 باستخدام جدول بيانات.
  5. قارن معدلات التنفس في حالة rox (الحد الأدنى من تدفقات O2) في غرف sV و cV بواسطة اختبار t للطالب المقترن باستخدام برنامج jamovi 2.3.1338.
    ملاحظة: نظرا لأن الغرفتين في أداة Oroboros مستقلتان وظيفيا (باستثناء فترات تسجيل درجة الحرارة و DatLab) ، يمكن النظر في القياسات في كل غرفة بشكل منفصل ، على غرار استخدام أدوات مختلفة. يمكن الإبلاغ عن النتائج النهائية كمتوسطات أو متوسطات لغرف متعددة مع معلومات عن تنوعها.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المتوقع أن تكون الإشارات الأولية R1 [μA] لأجهزة استشعار الأكسجين (POS) مستقلة عن حجم الطور المائي في حالة توازن مع الطور الغازي للهواء في الغرفة "المفتوحة" ، كما هو مؤكد في الجدول التكميلي 2. ومع ذلك ، في الغرفة المغلقة ، فإن الخلفية الآلية O2التدفق بالقرب من تشبع الهواء J°1[بمول ∙ ق-1∙مل-1] يعتمد على الحجم V (الجدول التكميلي 2). ال O2استهلاك المستشعر [PMOL∙s-1] يمكن التنبؤ بها من تدفق الإلكترون المقاس بالإشارة الخام المصححة صفرا R1-R0 [μA] ، رقم الشحنة 4 e-/س2وثابت فاراداي F = 96 485.33 C∙mol-1. 1 μA يعادل تدفق الإلكترون (e-) من 10.36 بمول ∙ ثانية-1. ينتج عن القسمة على رقم الشحن O2تدفق15,39 من 2.591 بمول-1·μA-1. كان المتوسط المسجل ل R1-R0 2.09 μA و 1.98 μA في غرفتي 0.5 مل و 2.0 مل ، على التوالي (الجدول التكميلي 2; R0 = 0.006 ± 0.007 μA في sV و R0 = 0.004 ± 0.003 μA في cV الغرف) ، المقابلة نظريا ل O2معدلات استهلاك 5.41 مليون مول-1و 5.13 بمول-1. ال O2يتم تحويل تدفق المستشعر إلى التدفق المتوقع للحجم عند تشبع الهواء (J°R1) في صورة 5.41 بمول-1/0.5 مل = 10.82 بمول ∙ ثانية-1∙مل-1و 5.13 بمول-1/ 2.0 مل = 2.56 بمول ∙ ثانية-1∙مل-1في SV و جV الغرفة ، على التوالي. مع نفس النوع من مستشعرات الأكسجين البولاروغرافي في غرفة 2.0 مل و 0.5 مل ، فإن الخلفية الخاصة بالحجم O2التدفق - محسوبة من R1-R0 الحالي (J°R1) - يزيد نظريا 4 أضعاف بنسبة عكسية لحجم الغرفة. J°هواء (عند تشبع الهواء ، حيث يكون الانتشار الخلفي صفرا ؛ قارن جدول 2 و الجدول التكميلي 3) لدرجة O2التركيز عند تشبع الهواء من الانحدار الخطي لاختبار الخلفية التجريبي (الشكل 3). J°هواء اقترب من القيم المتوقعة نظريا J°R1 لكلا المجلسين (جدول 2). ال J°هواء / J°R1كانت النسبة 0.85 ± 0.04 و 0.92 ± 0.12 في الفصلV و جV الغرفة ، على التوالي ، بما يتماشى مع سلسلة مستقلة من 52 قياسا في الغرفة 2.0 مل ، حيث كانت هذه النسبة 0.95 ± 0.12 (الجدول التكميلي 4). J°هواء كان أعلى بمقدار 3.9 مرة في الغرفة التي يبلغ حجمها 0.5 مل مقارنة بالغرفة التي يبلغ حجمها 2.0 مل. صافي O2انتشار الظهر J°50، محسوبة عند 50 ميكرومتر O2من الانحدار الخطي لاختبار الخلفية التجريبية ، كان أعلى بثلاث مرات فقط في غرفة 0.5 مل (جدول 2). تباين الخلفية الآلية O2كانت التدفقات متطابقة تقريبا في مجلدي الغرفة المختلفين ، مع انحراف معياري (SD) يبلغ 0.5 و 0.3 pmol∙s-1∙مل-1من أجل J°هواء و 0.9 و 0.8 بمول-1∙مل-1 من أجل J°50في SV و جV الغرفة ، على التوالي (جدول 2). على الرغم من الخلفية الآلية الأعلى O2المنحدرات في غرفة 0.5 مل ، اعتماد الخلفية O2التدفقات على cO2كان قابلا للتكرار بدرجة كبيرة في كلا النوعين من الغرف (الشكل 3D). ينتج عن هذا قيم منخفضة للمخلفات <±1 pmol∙s-1∙مل-1لكلا المجلسين (الجدول التكميلي 5)، تمشيا مع حدود الكشف عن جبال الأوروبوروس28.

قمنا بقياس تأثير سرعة التحريك على إشارة المعايرة الأولية R1 لنقطة البيع بين 350 دورة في الدقيقة (5.8 هرتز) و 950 دورة في الدقيقة (15.8 هرتز) في خطوات 100 دورة في الدقيقة (1.7 هرتز) مع الغرفة في التكوين "المفتوح". في هذا التكوين ، يكون O2 المذاب في الوسط في حالة توازن مع الطور الغازي. لذلك ، فإن التغييرات في الإشارة الأولية (ميكروأمبير [μA]) كدالة لسرعة التحريك لا تعكس الاختلافات الحقيقية في CO2. استجابت مستشعرات الأكسجين لتغيير في سرعة التحريك بانحراف بسيط عن R1 بالسرعة الافتراضية البالغة 750 دورة في الدقيقة ، بغض النظر عن حجم الغرفة (الشكل 4). في التكوين "المفتوح" ، كانت ضوضاء منحدر O2 ، المعرفة على أنها SD لكل خطوة بعد تثبيت الإشارة ، هي الأدنى عند 850 دورة في الدقيقة في كلا النوعين من الغرف وزادت عندما انحرفت سرعة التحريك عن هذه القيمة في أي من الاتجاهين (الشكل 5 أ). أقل من 550 دورة في الدقيقة ، تجاوزت ضوضاء منحدر O2 عتبة ±4 pmol∙s-1∙mL-1 ، مما يحدد الحد الأدنى لسرعة التحريك العملية. نظرا للقيود الفنية ، لم يتم الوصول إلى الحد العلوي ، مما يجعل 950 دورة في الدقيقة هي أقصى سرعة تحريك عملية (الشكل 5 أ). ضمن هذا النطاق ، كان انحراف إشارة O2 عن R1 <2.5٪. لم يغير إغلاق الغرف العلاقة بين الضوضاء وسرعة التحريك (الشكل 5 ب). كان ثابت الوقت الأسي τ 2.53 ± 0.05 ثانية عند 550 دورة في الدقيقة و 2.50 ± 0.05 ثانية عند 750 دورة في الدقيقة للغرفة سعة 0.5 مل (الشكل التكميلي 3).

يتضمن بروتوكول SUIT-003_D018 المطبق على الصفائح الدموية ما يصل إلى 14 خطوة معايرة بالتحليل الحجمي. إنه مصمم لدراسة التحكم في اقتران الخلايا الحية ، CE ، ونفاذية غشاء البلازما كمؤشر لبقاء الخلية32. تم مطابقة تدفق الأكسجين المقاس في نوعي الغرف (الشكل 6) بإحكام في جميع حالات الجهاز التنفسي (الشكل 7). مطلوب إعادة الأكسجين المتقطعة لتجنب نقص الأكسجة الوظيفي أو تقييد تركيز O2 التجريبي إلى نطاق محدد. تم إجراء إعادة الأكسجين عن طريق فتح الغرفة إلى الوضع "المفتوح" بعد معايرة العفن. عند إغلاق الغرفة ، استقر تدفق O2 في غضون 4 دقائق في الغرفة سعة 2.0 مل ، ولكن كانت هناك حاجة إلى ما يقرب من 10 دقائق في غرفة 0.5 مل قبل التثبيت وتحديد العلامة الجديدة (الشكل 6 والشكل التكميلي 4). إعادة الأكسجين في حالة rox عندما تكون تدفقات O2 منخفضة تتجنب انخفاض تركيز O2 خلال الوقت اللازم للتثبيت. كان rox المثبط للروتينون 0.9 ± 0.6 و 2.0 ± 0.6 pmol∙s-1∙mL-1 عند 98 ± 17 و 94 ± 17 ميكرومتر O2 (متوسط ± SD) في غرفة sV و cV ، على التوالي. زاد Rox بمقدار 3.1 ± 0.9 و 0.9 ± 0.4 pmol∙s-1∙mL-1 عند إعادة الأكسجين إلى 159 ± 8 و 147 ± 11 ميكرومتر O2 في غرفة sV و cV ، على التوالي. يتفق اعتماد الأكسجين ل rox الذي لوحظ في الصفائح الدموية مع النتائج على الخلايا الليفية البشرية والخلايا البطانية الوريديةالسرية 40.

لتحليل OXPHOS في الخلايا الليفية المنفذة ، استخدمنا بروتوكولين SUIT مع ما يصل إلى 17 و 20 خطوة معايرة بالتحليل الحجمي (SUIT-001 و SUIT-002 ، على التوالي35 ؛ الشكل 8)؛ وبالتالي، فإن تصحيح حجم المعايرة بالتحليل الحجمي مهم بشكل خاص لأنه في نهاية SUIT-002، بلغ التخفيف 14٪ و10.5٪ كحد أقصى في حجرة sV وCV، على التوالي. أدى عدد خلايا الخلايا الليفية البالغة 0.35 · 106 × و 1.44 · 106 × في غرف 0.5 مل و 2.0 مل ، على التوالي ، إلى نفس تركيز الخلية البالغ 0.75 · 106 × ∙ مل -1. عالج الجمع بين SUIT-001 و SUIT-002 20 حالة تنفسية ، وكلها مرتبطة ارتباطا وثيقا في الأنواع المكونة من غرفتين (ص2 = 0.950 ل SUIT-001 و r2 = 0.959 ل SUIT-002). في كلا البروتوكولين ، كان للمركب الرابع تشتت مرتفع نسبيا (الشكل 9). لم تكن إعادة الأكسجة مطلوبة في SUIT-001 بدءا من تدفق O2 منخفض الحجم من 18.7 ± 7.0 pmol∙s-1∙mL-1 في الحالة الروتينية (متوسط ± SD) ، مما يسمح بانخفاض تركيز O2 إلى 56 ميكرومتر حتى القسم المرتبط ب CIV من البروتوكول (الشكل 8 أ ؛ 8 أماء). ومع ذلك، في SUIT-002، أجريت إعادة الأكسجة قبل المعايرة بالتحليل الحجمي لفك الاقتران، مما أدى إلى زيادة تركيز O2 من 100 ميكرومتر إلى 180 ميكرومتر (الشكل 8B؛ 6Gp). بالنظر إلى الوقت الطويل اللازم لتثبيت التدفق بعد إعادة الأكسجين، يجب تجنب إعادة الأوكسجة أثناء المعايرة بالتحليل الحجمي للفك عن القرران.

تم تطبيق بروتوكول SUIT المختصر على الميتوكوندريا المعزولة (الشكل 10). تم تحديد تركيز بروتين الميتوكوندريا بعد الفحص التنفسي ، مما يجعل من المستحيل تحديد تركيز العينة الدقيق مسبقا في الغرفة. يختلف التدفق التنفسي الخاص بالحجم كدالة لتركيز الميتوكوندريا. لذلك ، تم تقديم البيانات على أنها تدفق خاص بالحجم وكتلة البروتين (الشكل 11). يعرض كلا التمثيلين الارتباط الوثيق بين القياسات التي تم الحصول عليها في غرف 0.5 مل و 2.0 مل (الشكل 11).

يمكن استخدام استهلاك الأكسجين المتبقي ROX المقاس بعد تثبيط المركب الثالث بواسطة antimycin A كمؤشر للأداء الآلي عند معدلات تنفس منخفضة للغاية. في جميع السلاسل التجريبية ، كان rox قابلا للمقارنة بين الغرف 0.5 مل و 2.0 مل (الصفائح الدموية: t (5) = -0.34 ، p = 0.74 ؛ الخلايا الليفية: SUIT-001: t (10) = 20.00 ، p = 0.06 ؛ SUIT-002: t (10) = 11.00 ، ص = 0.96 ؛ الميتوكوندريا المعزولة: t (4) = -1.18 ، p = 0.27). يتوافق تشتت البيانات إلى حد كبير مع عدم اليقين الفعال ل ±1 pmol∙s-1∙mL-1 13،28 ، كما هو موضح في الشكل 12. الملفات الأصلية متاحة للوصول المفتوح في مستودع Zenodo: 10.5281/zenodo.11634408. 

figure-results-1
الشكل 3: الخلفية الآلية O2 التدفق لغرفة sV (0.5 مل ؛ أخضر وأسود) و cV (2.0 مل ؛ أزرق). يتراوح تركيز O2 من تشبع الهواء (حوالي 180 ميكرومتر) إلى حوالي 50 ميكرومتر. الرموز المفتوحة: O2 تركيزات تم الحصول عليها بدون Na-dithionite. الرموز الصلبة: تركيزات O2 يتم التحكم فيها عن طريق المعايرة بالتحليل الحجمي اليدوي ل Na-dithionite. الدوائر السوداء: O2 تركيزات يتم التحكم فيها عن طريق معايرة Na-dithionite باستخدام TIP2k في غرفة 0.5 مل (N = 8). تم تجميع نتائج اختبارات الخلفية الآلية من (أ) السلسلة 1 (sV: N = 2 ؛ cV: N = 2) قبل استخدام الخلايا الحية (ce) ؛ (ب) السلسلة 2 (sV: N = 38 ؛ cV: N = 50) قبل استخدام الخلايا المنفذة (PCE) ؛ (ج) السلسلة 3 (sV: N = 10 ؛ cV: N = 10) قبل استخدام الميتوكوندريا المعزولة (IMT). (د) بيانات متراكبة من اللوحات ألف إلى جيم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 4: تأثير سرعة دوران التحريك على إشارة POS عند تشبع الهواء (الغرفة "المفتوحة") في الغرفة سعة 0.5 مل (خضراء) و 2.0 مل (زرقاء). الاستجابة [٪] بالنسبة لإشارات معايرة الهواء المصححة R0 R1-R0 [μA] عند 750 دورة في الدقيقة (sV: N = 4؛ cV: N = 4). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 5: ضوضاء منحدر O2 كدالة لسرعة دوران التقليب. الضوضاء المعبر عنها كانحراف معياري في (أ) الغرفة "المفتوحة"؛ (ب) غرفة مغلقة (0.5 مل ، أخضر ؛ 2.0 مل ، أزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 6: O2 استهلاك الصفائح الدموية البشرية المحفوظة بالتبريد في غرفة 0.5 مل. الآثار التمثيلية لتركيز O2 [μM] (الخطوط الزرقاء) و O2 التدفق لكل خلية [amol∙s-1∙x-1] محسوبة على أنها تدفق O2 [pmol∙s-1∙mL-1] مقسوما على تركيز الخلية 157∙106 x∙mL-1 (الخطوط الحمراء، مصححة لتدفق الخلفية المفيدة O2؛ تم التخلص من المسامير الناجمة عن المعايرة بالتحليل الحجمي). تم الاحتفاظ بتركيز O2 فوق 50 ميكرومتر عن طريق إعادة الأوكسجين المتقطعة (الهواء ، الغرفة "المفتوحة" ، الظل الأزرق). تسلسل حالات الجهاز التنفسي (المعايرة بالتحليل الحجمي والمعدلات ؛ بروتوكول SUIT-003_D018): ce1 ، التنفس الروتيني R للخلايا الحية. CE1P ، البيروفات 5 ملي مولار كركيزة خارجية. ce2Omy10 (اللوحة A) ، معايرة Omy في خطوات 5 نانومتر ؛ تسرب التنفس L. CE3U0.3 (اللوحة A) وCE3U0.1 (اللوحة B)، معايرة البالية بفك الاقتران إلى التركيز الأمثل ل CCCP البالغ 0.3 و0.1 ميكرومتر، على التوالي؛ قدرة ET E. CE3Glc ، الجلوكوز 11 ملي ؛ E تثبيط تدريجيا عن طريق فك الاقتران. ce4تعفن ، روتينون 0.5 ميكرومتر مثبط CI ؛ استهلاك الأكسجين المتبقي ROX. ج5S ، سكسينات 10 ملم ؛ تحفيز E في الخلايا المنفذة لغشاء البلازما. 1حفر15 (لوحة A) و 1Dig10 (لوحة B)، معايرة الديجيتونين في خطوات 5 ميكروغرام· مل-1 إلى تركيزات مثالية تبلغ 15 و10 ميكروغرام· مل-1، على التوالي من أجل نفاذية غشاء البلازما الكاملة؛ سعة المسار السكسينات ET SE. 1ج ، السيتوكروم ج 10 ميكرومتر ؛ اختبار سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. 2آما ، مضاد مايسين أ 2.5 ميكرومتر يثبط CIII ؛ روكس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 7: ارتباط تنفس الصفائح الدموية البشرية المحفوظة بالتبريد المقاسة في حجرة 0.5 مل و 2.0 مل. تم تقييم تدفق O2 المصحح بواسطة Rox في بروتوكول SUIT-003_D018 (الشكل 6) ؛ ن = 6. (أ) مع oligomycin Omy؛ (ب) بدون أومي. متوسط منحدرات figure-results-6 واعتراضات figure-results-7 انحدار المربعات الصغرى المقلوبة ومعاملات التحديد r2 محسوبة من جميع البيانات. تمثل الخطوط السوداء المتقطعة خطوط الهوية. تمثل الخطوط الحمراء خطوط الانحدار المحسوبة. تم استبعادO 2 التدفقات في الحالة بعد إضافة الجلوكوز (انظر الشكل 6). يتم فصل البروتوكولات التي تحتوي على oligomycin وبدونها في اللوحين A و B لتجنب تداخل نقاط البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: O2 استهلاك الخلايا الليفية في غرفة 0.5 مل. الآثار التمثيلية ل cO2 (الخطوط الزرقاء [ميكرومتر]) و O2 تدفق لكل خلية محسوبة على أنها تدفق O2 [pmol∙s-1∙mL-1] مقسوما على تركيز الخلية (0.75 · 106 × ∙ مل -1) ، تم تصحيحها لتدفق الخلفية الآلية O2 (تم التخلص من الخطوط الحمراء ، المسامير الناتجة عن المعايرة بالتحليل الحجمي). تم الاحتفاظ بتركيز O2 فوق 50 ميكرومتر عن طريق إعادة الأوكسجين المتقطعة (الهواء ، الغرفة "المفتوحة" ، الظل الأزرق). تسلسل حالات الجهاز التنفسي (المعايرة بالتحليل الحجمي والمعدلات). (أ) بروتوكول SUIT-001_D004: CE1، التنفس الروتيني R. + حفر ، ديجيتونين 10 ميكروغرام · مل -1 (CE إلى PCE) ، التنفس الذاتي المتبقي . 1 مساء ، بيروفات 5 ملم ومالات 2 ملم ؛ تنفس تسرب المسار NL. 2D ، ADP 2.5 ملم ؛ قدرة Oxphos للمسار NP. 2 ج ، السيتوكروم ج 10 ميكرومتر ؛ اختبار سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. 3U1.5، معايرة المعايرة بالتحليل الحجمي لفك الاقتران إلى التركيز الأمثل ل CCCP 1.5 ميكرومتر؛ قدرة ET المرتبطة ب NADH NE. 4G ، الغلوتامات 10 ملي ؛ N (PGM) E. 5S ، سكسينات 10 ملم ؛ NS-pathway سعة ET NSE. 6 تعفن ، روتينون 0.5 ميكرومتر ؛ سعة المسار السكسينات ET SE. 7GP ، جليسيروفوسفات 10 ملي متر ؛ SGpE. 8Ama ، antimycin A 2.5 ميكرومتر ؛ روكس. 9AsTM ، أسكوربات 2 ملي مولار و TMPD 0.5 ملي متر ؛ ركائز لتحفيز CIV ؛ ظلت الغرفة مفتوحة لمدة 20 دقيقة للسماح بتوازن الأكسدة والاختزال دون استنفاد الأكسجين4 ؛ O2 تدفق خارج المقياس بعد إغلاق الغرفة (205 أمول · ثانية -1 ÷ ÷ ÷ × -1). 10 أزد ، أزيد 100 ملم ؛ تدفق الخلفية الكيميائية المعتمدة على الأكسجين. (ب) بروتوكول SUIT-002_D007: CE1, R. + حفر ، رين. + D ، تحفيز الرين. + M.1 ، مالات 0.1 ملي مولار و 1 أكتوبر ، أوكتانويلكارنيتين 0.5 ملي ؛ سعة OXPHOS المسار FP = J (1Oct) -J (+ M.1). 1 ج. 2 م 2 ، مالات 2 ملي مولار تدعم المسار N التناظري ؛ (ن)ب. 3P و 4G ، التنشيط التدريجي ل FNP. 5S ، FNSP. 6Gp ، FNSGpP. 7U1.5 ، FNSGpE. 8 تعفن ، SGpE. 9 آما ، روكس. 10AsTm O2 التدفق خارج المقياس 207 amol ·s -1 · x-1. 11Azd, chb. بشكل عام ، النشاط الوريدي المركب هو الفرق في المعدلات ، J (AsTm) -J (Azd) بتركيزات O2 المتطابقة بشكل وثيق. انظر الشكل 6 لمزيد من التفاصيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: ارتباط التنفس للأرومات الليفية المنفذة في غرفة 0.5 مل و 2.0 مل. تدفق O2 المصحح ب Rox في (أ) SUIT-001_D004 و (B) SUIT-002_D007 (N = 6). متوسط ميل figure-results-10 واعتراض figure-results-11 انحدار المربعات الصغرى المقلوبة ومعامل التحديد r2 محسوبا من جميع البيانات. يمثل الخط الأسود المتقطع خط الهوية. تمثل الخطوط الحمراء خطوط الانحدار المحسوبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-12
الشكل 10: O2 استهلاك الميتوكوندريا المعزولة لقلب الفأر في غرف 0.5 مل (أخضر) و 2.0 مل (زرقاء). الآثار التمثيلية ل (أ) تدفق O2 الخاص بالكتلة عند تركيز بروتين الميتوكوندريا 0.023 مجم ∙ مل -1 (تم تصحيحه لتدفق الخلفية الآلية O2 ، تم التخلص من المسامير الناتجة عن المعايرة بالتحليل الحجمي) و (ب) تركيز O2 [ميكرومتر]. تسلسل حالات الجهاز التنفسي (المعايرة بالتحليل الحجمي والمعدلات) باتباع بروتوكول SUIT-002_D005: IMT, المتبقية التنفس الذاتية رن. + D ، ADP 2.5 ملم ؛ تحفيز رين. + M.1 ، مالات 0.1 ملي مولار و 1 أكتوبر ، أوكتانويلكارنيتين 0.5 ملي ؛ سعة OXPHOS المسار FP = J (1Oct) -J (+ M.1). 1 ج ، السيتوكروم ج 10 ميكرومتر ؛ اختبار سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. 2M2 ، مالات عالية 2 ملي مولار تدعم المسار N الشابهة ؛ (ن)ب. 3P ، بيروفات 5 ملم ؛ جبهةب. 4G ، الغلوتامات 10 ملي ؛ جبهةب. 5S ، سكسينات 10 ملم ؛ FNSP. 6GP ، جلسيروفوسفات 10 ملي متر ؛ FNSGpP. 7U0.5، المعايرة بالتحليل الحجمي لفك الاقتران إلى التركيز الأمثل ل CCCP 0.5 ميكرومتر؛ FNSGpE. 8تعفن ، روتينون 0.5 ميكرومتر يثبط CI ؛ SGpE. 9Ama, antimycin A 2.5 μM تثبيط CIII; استهلاك الأكسجين المتبقي ROX. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-13
الشكل 11: ارتباط التنفس في الميتوكوندريا القلبية المعزولة للفأر المقاسة في غرف 0.5 مل و 2.0 مل. O2 التدفق في البروتوكول الموضح في الشكل 10 (N = 4). (أ) تدفق O2 الخاص بالحجم. (ب) تدفق O2 المصحح ب Rox مقسوما على تركيز بروتين الميتوكوندريا (0.013 - 0.026 مجم ∙ مل -1). متوسط ميل figure-results-14 واعتراض figure-results-15 انحدار المربعات الصغرى المقلوبة ومعامل التحديد r2 محسوبا من جميع البيانات. تمثل الخطوط السوداء المتقطعة خط الهوية. تمثل الخطوط الحمراء خط الانحدار المحسوب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-16
الشكل 12: استهلاك الأكسجين المتبقي rox في غرف 0.5 مل و 2.0 مل. تم قياس التدفق لكل حجم بعد إضافة antimycin A ، جنبا إلى جنب مع التجارب على الخلايا الحية (ce ، المربعات) ، والخلايا المنفذة (PCE ، والدوائر) ، والميتوكوندريا المعزولة (imt ، المثلثات). متوسط ميل figure-results-17 واعتراض figure-results-18 انحدار المربعات الصغرى المقلوبة. الخط المتقطع: خط الهوية. الخط الأحمر: خط الانحدار المحسوب. الظل: نطاق الدقة الآلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوحده النمطيهقالخامسجالخامس
الغرفة التجريبية المجلد الخامس0.5 مل2.0 مل
القطر الداخلي للأسطوانة الزجاجية12.0 ملم16.0 ملم
القطر الخارجي للأسطوانة الزجاجية24.0 ملم24.0 ملم
سمك الجدار الزجاجي6.0 ملم4.0 ملم
قضيب النمام المطلي ب PVDF11.5 × 6.2 ملم15.0 × 6.0 ملم
قطر الشعيرات الدموية السدادة1.00 ملم1.30 ملم
سدادة منطقة المقطع العرضي الشعري0.79 مم21.33 مم2
طول الشعيرات الدموية السدادة50.64 ملم48.86 ملم
حجم الشعيرات الدموية سدادة39.8 ميكرولتر64.9 ميكرولتر
سدادة الشعيرات الدموية الميتة الحجم Vstc بما في ذلك قطرة صغيرةأ0.04 مل0.07 مل
المجلد V' لمعايرة مستوى الصوت0.54 مل2.07 مل

أيجب أن يتوافق الانخفاض مع 5 ميكرولتر للغرفة cV وقريب من 0 ميكرولتر للغرفة sV.
الجدول 1: أبعاد وحدات الحجم الصغير (sV) والحجم الكلاسيكي (cV) مع سدادات بولي إيثر إيثر كيتون (PEEK).

J ° الهواء / [pmol∙s-1∙mL-1]J ° 50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
الغرفة التجريبية المجلد الخامس0.5 مل2.0 مل0.5 مل2.0 مل
دني9.222.37-3.17-1.17
متوسط9.252.36-3.08-1.04
الانحراف المعياري0.490.340.930.83
الحد الادني8.201.79-5.11-3.72
الحد الاقصي10.413.42-0.820.67

الجدول 2: J ° الهواء استقراء إلى تشبع الهواء و J ° 50 محسوبة بتركيز 50 ميكرومتر O2. البيانات المجمعة لاختبارات الخلفية الآلية في السلسلة 2 (PCE) و 3 (IMT) وقبل معايرة TIP2k (0.5 مل: N = 48; نصيحة 2 ك: ن = 8 ؛ 2.0 مل: N = 60).

ملف تكميلي 1: عينة من الاستعدادات. الصفائح الدموية البشرية والخلايا الليفية البشرية والميتوكوندريا معزولة من قلوب الفئران. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 1: اختبار الخلفية O2 الآلي باستخدام TIP2k. الآثار التمثيلية للاختبار الذي تم إجراؤه باستخدام TIP2k لمعايرة Na-dithionite (2.5 مل) في غرفة 0.5 مل. متوسط: MiR05 ، درجة الحرارة: 37 درجة مئوية ، سرعة التحريك: 750 دورة في الدقيقة. تم التخلص من المسامير الناجمة عن المعايرة بالتحليل الحجمي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: الخلفية الآلية O2 التدفق J ° 1 كدالة لتركيز O2. الغرفة sV (0.5 مل ؛ أخضر ، N = 48) والغرفة cV (2.0 مل ؛ أزرق ، N = 60) في السلسلة 2 (PCE ، دوائر) و 3 (IMT ، مثلثات) ، وقبل معايرة TIP2k في الغرفة 0.5 مل (دوائر سوداء ، N = 8). الخطوط الحمراء: متوسط ± SD. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: ثابت الوقت الأسي τ كدالة لسرعة دوران التحريك. قيم τ الفردية للغرفة 0.5 مل عند 37 درجة مئوية (N = 2). في الغرفة سعة 0.5 مل τ كان 2.53 ± 0.05 ثانية عند 550 دورة في الدقيقة ، و 2.50 ± 0.05 ثانية عند 750 دورة في الدقيقة ، و 2.47 ± 0.04 ثانية عند 850 دورة في الدقيقة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: O2 استهلاك الصفائح الدموية البشرية المحفوظة بالتبريد في غرفة 2.0 مل. التتبع التمثيلي لبروتوكول SUIT-003_D018، بما في ذلك معايرة أوليغومايسين (Omy). تم تصحيح التدفق [pmol∙s-1∙mL-1] للخلفية الآلية O2 ، التدفق ومقسوما على تركيز الخلية (164∙106 × ∙ مل -1). تم التخلص من المسامير الناجمة عن المعايرة بالتحليل الحجمي. تم الاحتفاظ ب cO2 فوق 60 ميكرومتر عن طريق إعادة الأكسجين المتقطعة (الهواء ، الغرفة "المفتوحة" ، الظل الأزرق). تسلسل حالات الجهاز التنفسي (المعايرة بالتحليل الحجمي والمعدلات): ce1 ، التنفس الروتيني R للخلايا الحية. ce1P ، البيروفات كركيزة خارجية. ce2Omy10 ، معايرة Omy في خطوات 5 نانومتر ؛ تسرب التنفس L. ce3U2.0، المعايرة بالتحليل الحجمي لفك الاقتران إلى التركيزات المثلى البالغة 2 ميكرومتر؛ قدرة ET E. ce3Glc ، الجلوكوز 11 ملي ؛ E تثبيط تدريجيا عن طريق فك الاقتران. ce4Rot ، روتينون 0.5 ميكرومتر يثبط CI ؛ استهلاك الأكسجين المتبقي ROX. ce5S ، سكسينات 10 ملم ؛ تحفيز E في الخلايا المنفذة لغشاء البلازما. 1Dig20، معايرة الديجيتونين بالتحليل الحجمي إلى التركيزات المثلى البالغة 20 ميكروغرام·مل-1، من أجل نفاذية غشاء البلازما الكامل؛ سعة المسار السكسينات ET SE. 1 ج ، السيتوكروم ج 10 ميكرومتر ؛ اختبار سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. 2Ama, antimycin A 2.5 μM تثبيط CIII; روكس. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: المواد الكيميائية المستخدمة في بروتوكولات المعايرة بالتحليل الحجمي لمثبطات الركيزة (SUIT). الاختصارات وتركيزات محلول المخزون لغرفتي sV و cV . الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: مقارنة بين R1-R0 و J ° 1 في غرف 0.5 مل و 2.0 مل. البيانات المجمعة لاختبارات الخلفية الآلية في السلسلة 2 (PCE) و 3 (IMT) وقبل معايرة TIP2k (0.5 مل: N = 48; نصيحة 2 ك: ن = 8 ؛ 2.0 مل: N = 60). تم حساب متوسط البيانات من السلسلة التجريبية 2 (PCE) و 3 (imt) فقط ، والتي أجريت عند متوسط ضغط جوي قدره 94.9 كيلو باسكال (إنسبروك ، النمسا) ، باستثناء البيانات من السلسلة 1 (ce) التي تم الحصول عليها عند مستوى سطح البحر. تم استخدام نفس النوع ولكن نقاط البيع الفردية المختلفة في غرف 0.5 مل و 2.0 مل. لذلك ، يجب مراعاة التباين بين أجهزة الاستشعار عند مقارنة غرفتي sV و cV . في حين أن J ° 1 = 2.26 ± 0.41 pmol∙s-1∙mL-1 التي تم الحصول عليها تجريبيا للغرفة 2.0 مل تتوافق بشكل وثيق مع القيمة المحسوبة ، فإن J ° 1 = 8.48 ± 0.53 pmol∙s-1∙mL-1 للغرفة 0.5 مل كانت أقل من المتوقع. وقد تم تفسير ذلك من خلال الملاحظات التالية. بعد إغلاق الغرفة ، يؤدي تدفق الخلفية O2 الأعلى في غرفة 0.5 مل إلى خفض تركيزات O2 عند علامات J ° 1 المحددة على فترات زمنية مماثلة (الشكل 1). كان تركيز الأكسجين عند J ° 1 في المتوسط 4.06٪ و 1.72٪ تحت تشبع الهواء في غرفة 0.5 مل و 2.0 مل ، على التوالي (الشكل التكميلي 2 ، الجدول التكميلي 2). عند انخفاض cO2 ، يقلل استهلاك O2 المتناقص بواسطة المستشعر وبعض الانتشار الخلفي O2 من J ° 1 المحدد تجريبيا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: تركيز الأكسجين [ميكرومتر] الذي تم عنده الحصول على المعايرة (R1) و J ° 1 واختلافهما في النسبة المئوية. البيانات المجمعة لاختبارات الخلفية الآلية في السلسلة 2 (PCE) و 3 (IMT) وقبل معايرة TIP2k (0.5 مل: N = 48; نصيحة 2 ك: ن = 8 ؛ 2.0 مل: N = 60). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: J ° 1 المقاس والمتوقع في الغرفة 2.0 مل. سلسلة مستقلة من اختبارات الخلفية الآلية مع O2k سلسلة A (مع سدادات التيتانيوم13) ، V = 2.0 مل (37 درجة مئوية ، محلول كلوريد الصوديوم مع O2 عامل الذوبان 0.92 ؛ N = 52). nO2 / Qe = 106 / (96485.33 ·4) = 2.591 بمول ∙μC-1 = 2.591 بمول ∙ ثانية -1∙μ -1. بناء على افتراض أن الانتشار الخلفي O2 لا يكاد يذكر عند cO2،1 ، وهو صحيح فقط عند cO2،1 ~ cO2 *. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 5: بقايا الانحدار الخطي (القيم المطلقة [pmol O2∙s-1∙mL-1]) المحسوبة لكل اختبار خلفية O2 آلي. البيانات المجمعة لاختبارات الخلفية الآلية في السلسلة 2 (PCE) و 3 (IMT) وقبل معايرة TIP2k. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تكون كمية العينة المتاحة لقياس إعادة التنفس محدودة ، على سبيل المثال ، في دراسات الخزعات أو الخلايا الأولية أو مزارع الخلايا التي تنمو ببطء مع انخفاض عدد الخلايا1. علاوة على ذلك ، تتأثر أنشطة الجهاز التنفسي بسبب إصابات الميتوكوندريا11 أو عند التحقيق في مسارات الميتوكوندريا ذات القدرات المنخفضة ، مثل أكسدة الأحماض الدهنية12. في هذه الحالات ، يوفر حجم غرفة قياس التنفس المنخفض مزايا لدقة تدفق O2. ومع ذلك ، تزداد تدفقات الخلفية الآلية O2 عند أحجام الغرفة السفلية وتسبب أخطاء عندما لا يتم قياسها بشكل موثوق ولا يتم تصحيحها بشكل صحيح كدالة لتركيز O2. تعد قابلية تكرار اختبارات الخلفية O2 الآلية وتصحيحات الخلفية مهمة بشكل خاص لأحجام الغرف المنخفضة. توفر القيم المتطابقة تقريبا للتدفق النظري (J ° R1) والتجريبي (J ° air) O2 دليلا على دقة القياس الاستباري مع 4 e- / O2 عند تفاعل الكاثود لنقطة البيع. كان الفرق بين J ° R1 و J ° air 1.64 ± 0.43 و 0.22 ± 0.31 pmol∙s-1∙mL-1 في غرفة sV و c V ، على التوالي ، مما يشير إلى دقة في القياسات التي تقع ضمن حد الكشف عن الغرفة 2.0 مل (±1 pmol∙s-1∙mL-1)28. مع نفس النوع من مستشعرات الأكسجين البولاروغرافي في غرفة 2.0 مل و 0.5 مل ، زاد تدفق الخلفية O2 الخاص بالحجم 4 أضعاف بنسبة عكسية لحجم الغرفة ، وكان التباين متطابقا تقريبا في مجلدي الغرفة ، مع SD يبلغ 0.5 و 0.3 pmol∙s-1∙mL-1 ل J ° air و 0.9 و 0.8 pmol∙s-1∙mL-1 ل J ° 50 في sV و cV الغرفة ، على التوالي (الجدول 2). على الأقل الأنشطة التنفسية - التي تم تصميم غرفة الحجم الصغير من أجلها - تصبح تأثيرات الخلفية الصغيرة كبيرة (الجدول التكميلي 3 ؛ الشكل التكميلي 2). لذلك ، يلزم إجراء تقييم روتيني لتدفق الخلفية الآلية O2 (الشكل 1) لتطبيق التصحيح المناسب28.

مطلوب تحريك عالي ومستمر للوسط للحفاظ على نظام متجانس وضمان إشارة أكسجين مستقرة. تم تحديد سرعة التحريك البالغة 750 دورة في الدقيقة للغرفة سعة 2.0 مل ، لكن السرعة المثلى لم تكن معروفة في الغرفة سعة 0.5 مل. تتطلب الأشكال الهندسية المختلفة للغرفة الزجاجية وقضيب النمام (الجدول 2) تقييما مستقلا لسرعة التحريك المثلى. استجابت مستشعرات الأكسجين للتغيرات في سرعة التحريك بين 550 دورة في الدقيقة و 950 دورة في الدقيقة ، مع انحراف بسيط عن إشارة O2 R1 عند 750 دورة في الدقيقة ، بغض النظر عن حجم الغرفة. كان ثابت الوقت الأسي τ الذي تم تقييمه للغرفة sV متفقا مع τ المبلغ عنه للغرفة 2.0 مل بنفس سرعة التحريك13. تشير هذه النتائج إلى أن التقليب فعال بنفس القدر في كلا الأشكال الهندسية للغرفة وأن سرعة التحريك الافتراضية البالغة 750 دورة في الدقيقة (غرفة 2.0 مل) يمكن تطبيقها على الغرفة سعة 0.5 مل. في كل من تكوينات الغرفة "المفتوحة" و "المغلقة" ، كان للغرفة 0.5 مل نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى ، مما يشير إلى دقة أعلى كميزة للغرفة 0.5 مل (الشكل 5) ، على الرغم من أنه لا يمكن استبعاد تأثير التباين الفردي في نقاط البيع. نظرا لأن الضوضاء لم تزداد عند خفض سرعة التقليب من 750 دورة في الدقيقة إلى 550 دورة في الدقيقة ، فقد يكون تقليل سرعة التقليب إلى 550 دورة في الدقيقة في الغرفة 0.5 مل مفيدا لتقليل إجهاد القص دون المساس بنسبة الإشارة إلى الضوضاء.

تم قياس معدلات استهلاك O2 متطابقة تقريبا في غرف 0.5 مل و 2.0 مل في ثلاثة نماذج تجريبية عند تطبيق تصحيح الخلفية المناسب. تشير النتائج التي تم الحصول عليها من الصفائح الدموية الصغيرة التي يبلغ قطرها 2 ميكرومتر42 ، والخلايا الليفية الحية والنفاذة ، والميتوكوندريا المعزولة إلى أنه من المتوقع الحصول على معدلات تنفس متسقة في غرف 0.5 مل و 2.0 مل في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ومستحضرات الميتوكوندريا. ومع ذلك ، لم يتم اختبار ألياف العضلات المنفذة في هذه الدراسة. يتطلب القياس الدقيق ل rox التحكم في مستويات الأكسجين40 والدقة الآليةالعالية 1. قد يكون تدفق O2 الخاص بالحجم ل rox منخفضا مثل حد الكشف. إعادة الأوكسجين ليست ضرورية عند استخدام عدد الخلايا المنخفض أو كميات منخفضة بشكل عام من العينات في التجربة. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يوصى بإجراء إعادة الأوكسجين في حالات الجهاز التنفسي ذات التدفق المنخفض O2 لتجنب الانخفاض السريع في تركيز O2 خلال الفترة المطلوبة لتثبيت تدفق O2. يستغرق تثبيت تدفق O2 بعد إعادة الأكسجين وقتا أطول في غرفة 0.5 مل.

كمساهمة في مراقبة الجودة ، يجب إيلاء اهتمام خاص لتخفيف العينة في التعليق أثناء الاستبدال الجزئي للحجم. بعد إزالة السدادة التي تم إدخالها بالكامل ، يتم إعطاء الحجم الإجمالي V 'لوسط التنفس في الغرفة من خلال الحجم التجريبي V وحجم الشعيرات الدموية السدادة Vstc (الجدول 2). لذلك ، يتم تخفيف حجم المخزون V J.i في الحجم الفعلي V '، وهو أكبر من V ، مما ينتج عنه عامل تخفيف V / V 'من 0.5 / 0.54 = 0.926 و 2.0 / 2.07 = 0.966 في غرف 0.5 مل و 2.0 مل ، على التوالي (الشكل 2). في التجارب التي أجريت على الصفائح الدموية ، تم استخدام سدادة نموذجية للغرفة sV بحجم ميت شعري يبلغ 0.05 مل ، وهو ما يتوافق مع عامل تخفيف قدره 0.909.

هناك حاجة إلى كميات أقل بأربع مرات تقريبا من الخلايا الحية والخلايا المنفذة والميتوكوندريا المعزولة في 0.5 مل مقارنة بالغرفة 2.0 مل بتركيزات عينة متطابقة (الكمية لكل حجم) ، مما ينتج عنه نتائج قابلة للمقارنة كميا لاستهلاك O2 التنفسي الذي تم تطبيعه لعدد الخلايا أو كتلة البروتين. وهذا يدل على أن الدائرة sv هي أداة قيمة للدراسات التي تكون فيها كمية العينات المتاحة محدودة. من ناحية أخرى ، فإن تطبيق كمية مماثلة من العينة في الغرفة sV يزيد من تدفق O2 الخاص بالحجم وبالتالي يقلل من عدم اليقين في القياسات عندما تكون أنشطة الجهاز التنفسي منخفضة.

اقتصر نظام الأكسجين في الدراسة الحالية على نطاق O2 من تشبع الهواء إلى 30 ميكرومتر. يتطلب التطبيق على مستويات الأكسجين خارج هذا النطاق مزيدا من التقييم للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة الطبيعية أو نقص الأكسجة43 والأنسجة المنفذة عند فرط التأكسج9. العديد من التكوينات متعددة المستشعرات لوحدات Oroboros NADH- و Q- ؛ الأس الهيدروجيني ، NO ، و TPP + - الأقطابالكهربائية 10،44 - لا يمكن استيعابها في الغرفةالخامسة وتتطلب غرفة 2.0 مل.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EL موظف في Oroboros Instruments. EG هو المؤسس والرئيس التنفيذي لشركة Oroboros Instruments.

تم توظيف LFGS من قبل Oroboros Instruments خلال المشروع. EÅF و EE موظفان في Abliva AB ، Lund ، السويد ، التي لديها اتفاقية تجارية مع Oroboros Instruments.

تعلن لويدز ريجستر عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Manuela Passrugger على جمع البيانات المتعلقة بالميتوكوندريا المعزولة ، و Patrizia Guerth على الدعم الفني في اختبار سرعة دوران التحريك و Mateus Grings لتحليل ثابت الوقت من اختبارات المحرك. نشكر شريكنا ، WGT Elektronik GmbH & Co KG ، كولساس ، النمسا ، للحصول على معلومات حول البيانات الفنية للغرف الزجاجية والسدادات وشدة المجال المغناطيسي. نشكر Luiza HD Cardoso و Alejandra Romero-Martinez و Ondrej Sobotka و Alba Timon-Gomez و Jaime Willis على تعليقاتهم. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 859770 ، مشروع NextGen-O2k. المساهمة في COST Action CA15203 MitoEAGLE بدعم مالي من البعثات العلمية قصيرة الأجل (LFGS ، LR).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/Software
ADPMerck ، ألمانيا117105
المضادات الحيوية ومضادات الفطريات 100xBiosera ، فرنساXC-A4110CAUTION H317 قد يسبب رد فعل تحسسي للجلد
Antimycin ASigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةA8674تحذير H300   قاتل إذا ابتلع ، H400 قصير المدى (حاد) خطر مائي   ؛
AscorbateSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةA7631
ATPSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية  ؛ A 2383
BSA خالية من الأحماض الدهنيةSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةA 6003ألبومين مصل الأبقار
CaCO3< / sub>Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةC 4830
CCCPSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةC2759سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl هيدرازون تحذير H301 + H311 + H331 سام في حالة ابتلاعه أو ملامسته للجلد أو في حالة استنشاقه
عداد الخلايا الآلي للكونتيسة   ؛ثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكيةAMQAX100
السيتوكروم جسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةC7752
DatLab   ؛Oroboros Instruments, Austriaالإصدار 7.4برنامج للحصول على البيانات وتحليلها
DatLab Oroboros Instruments ، النمساالإصدار 8.1برنامج للحصول على البيانات وتحليلها
Protein AssayBio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكيةمجموعة فحص البروتين5000112 ؛ تنبيه H314 يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين
ديجيتونينسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةD5628تحذير H301 سام إذا ابتلع
DithiothreitolSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةD 0632تحذير H318 يسبب تلفا خطيرا للعين
DMEMPan Biotech ، ألمانياP04-05551Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسط
DMSOسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةD2650ثنائي ميثيل سلفوكسيد
DPBSLonza Bioscience ، سويسراLONBE17-512Fمن الكالسيوم Dulbecco s محلول ملحي مخزن بالفوسفات
EGTASigma-Aldrich, USAE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, الولايات المتحدة الأمريكيةA5256701مصل الأبقار الجنيني
GlucoseSigma-Aldrich, USA  G7528
الغلوتامات  سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةG1626
جليسيروفوسفاتسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-215789
Heraeus Multifuge 3s كبيرثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكيةHM3Sجهاز طرد مركزي
Hettich Rotina 380R & nbsp ؛Andreas Hettich GmbH & Co. KG ، ألمانيا1701جهاز طرد مركزي
ImidazoleHoneywell Fluka ، النمسا56750CAUTION H302 ضار إذا ابتلع ، H314 يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين ، H360D قد يتلف الطفل الذي لم يولد بعد
jamovi   ؛مشروع جاموفيالإصدار 2.3.13البرمجيات
K+-MESSigma-Aldrich, الولايات المتحدة الأمريكيةM 8250
Leucosep tube Greiner Bio-One GmbH ، النمساZ642843-300EAأنبوب الطرد المركزي مع حاجز البولي إيثيلين
Malate  ؛سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةM1000تحذير H319 يسبب تهيجا خطيرا للعين.
مانيتولسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةم 4125
MgCl2< / sub> شارلاو ، إسبانياMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments ، النمسا60101-01تنفس الميتوكوندريا
Mixer  ؛Swelab Instruments ، السويد440Sطاولة هزاز
السيد Frosty FrozenContainer Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية5100-0001حاوية التجميد
OroborosOroboros Instruments ، النمساتناول NextGen-O2k و O2k بشكل جماعي مع المصطلح ' أوروبوروس
Oroboros Chamber cVOroboros Instruments ، النمسا23100-01غرفة الحجم الكلاسيكية
Oroboros Chamber sVOroboros Instruments ، النمسا33100-01غرفة صغيرة
Oroboros TIP2k-ModuleOroboros Instruments ، النمسا11100-03المعايرة بالتحليل الحجمي والحقن microPump
O2< / sub>-Zero PowderOroboros Instruments ، النمسا26600-02  Na-dithionite CAUTION H251 التسخين الذاتي: قد تشتعل النيران ، H302 ضار إذا ابتلع ، H319 يسبب تهيجا خطيرا للعين
أوكتانويلكارنيتينبيوترود - APExBIO Technology ، ألمانياB6371
OligomycinSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةO4876
PhosphocreatineSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP 7936
PyruvateSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP2256تنبيه قد يسبب H317 رد فعل تحسسي للجلد
RotenoneSigma-Aldrich, الولايات المتحدة الأمريكيةR8875تحذير H300 قاتل إذا ابتلع
خطوط خلايا الخلايا الليفية الجلدية   ATCC ، الولايات المتحدة الأمريكية
أزيد الصوديومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةS2002تحذير H300 + H310 + H330 قاتل في حالة الابتلاع أو ملامسة الجلد أو في حالة استنشاقه
Subtilisin ASigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP 5380تحذير H318 - يسبب تلفا خطيرا للعين ، H334 - قد يسبب أعراض الحساسية أو الربو أو صعوبات في التنفس إذا تم استنشاقه
SuccinateSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةS2378
السكروزسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةS 7903
Swelab Alfa عداد خلايا الدم   ؛بول التشخيص AB ، السويد1420041
Taurine   ؛سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةT 0625
Tecan Infinite TM F200Tecan ، سويسرامقياس الطيف الضوئي
TMPDSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةT3134N ، N ، N '، N'-TETRAMETHYL-P-PHENYLENEDIAMINE DIHYDROCHLORIDE تحذير H315 يسبب تهيج الجلد ، H319 يسبب تهيجا خطيرا للعين
TrypsinSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةT4799تنبيه قد يسبب H334 أعراض الحساسية أو الربو أو صعوبات في التنفس إذا تم استنشاقه
VacuetteGreiner Bio-One GmbH ، النمسا15452520
DC خال وسط يتم الحجم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts. PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).
  2. Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).
  3. Meszaros, A. T., et al. The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation. Transplant International. 37, 12380(2024).
  4. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  5. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
  6. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  7. Gnaiger, E. Oxygen Conformance of Cellular Respiration. Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).
  8. Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia. J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria. Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).
  11. Suomalainen, A., Nunnari, J. Mitochondria at the crossroads of health and disease. Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).
  12. Cardoso, L. H. D., et al. Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).
  13. Gnaiger, E. Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply. Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).
  14. Gnaiger, E. Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function. Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis. Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).
  16. Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study. Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).
  17. Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).
  18. Heimler, S., et al. Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women. Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).
  19. Palacka, P., et al. Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).
  20. Fischer, C., et al. Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver. Metabolites. 12 (3), 270(2022).
  21. JedIicka, J., et al. Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs. Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).
  22. Westerlund, E., et al. Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers. Heliyon. 10 (5), e26745(2024).
  23. Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts. Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).
  24. Yépez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).
  25. Gnaiger, E. Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts. MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).
  26. Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle. J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).
  27. Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).
  28. Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry. Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).
  29. Mela, L., Seitz, S. Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue. Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).
  30. Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration. Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).
  31. Gnaiger, E. The elementary unit — count and numbers in the International System of Units. BEC preprints. , (2025).
  32. Vernerova, A., et al. Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods. Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).
  33. Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018 (2024).
  34. Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004 (2024).
  35. Timón-Gómez, A., et al. Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation. Exp Physiol. , 1-33 (2025).
  36. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007 (2024).
  37. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005 (2024).
  38. The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , https://www.jamovi.org/ (2024).
  39. Gnaiger, E. Preface: A biologist´s view. Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).
  40. Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).
  41. Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR (2020).
  42. Williams, O., Sergent, S. R. Histology Platelets. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).
  43. Donnelly, C., et al. The ABC of hypoxia - what is the norm. Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).
  44. Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells. Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Oroboros

مقالات ذات صلة