لتسهيل الكشف السريع والدقيق عن Acinetobacter baumannii ، نقدم بروتوكولا يستخدم تضخيم البوليميراز Recombinase (RPA) جنبا إلى جنب مع نوكلياز LbaCas12a الداخلي لتحديد عدوى A. baumannii .
تشتهر بكتيريا Acinetobacter baumannii ، وهي بكتيريا سالبة الجرام ، بالتسبب في التهابات شديدة مع ارتفاع معدلات الوفيات. يعد الكشف السريع والدقيق عن A. baumannii أمرا بالغ الأهمية للعلاج الفوري ومكافحة العدوى بشكل فعال والحد من مقاومة المضادات الحيوية. ومع ذلك ، لا توجد طريقة مناسبة للكشف السريع والسهل في الموقع عن A. baumannii. يوفر نظام CRISPR Trans Reporter (DETECTR) المستهدف من نوكلياز الحمض النووي نهجا سريعا ودقيقا وحساسا للكشف عن A. baumannii من خلال دمج قدرات التعرف الخاصة بالهدف ل Cas12a مع كفاءة التضخيم متساوي الحرارة لتضخيم البوليميراز المدمج (RPA). يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل اكتشاف A. baumannii باستخدام RPA جنبا إلى جنب مع نوكلياز LbaCas12a. يتم وصف الخطوات التالية في هذه المقالة: استخراج الحمض النووي ، واختيار تسلسل DNA معين ، وتصميم التمهيدي و CRISPR RNA (crRNA) ، وبناء البلازميد المؤتلف الإيجابي ، وإعداد مقايسة Cas12a-RPA ، وتحسين نظام تضخيم RPA ، وتصور مقايسة RPA-CRISPR / Cas12a باستخدام أداة الكشف عن التألق مثل أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، وتقييم تقييم الحساسية والخصوصية.
في علم الأحياء الدقيقة السريري ، يمثل الكشف عن عدوى Acinetobacter baumannii تحديا كبيرا. يمكن أن تسبب هذه البكتيريا سالبة الجرام التهابات ذات أعراض سريرية شديدة ، حتى مع ارتفاع معدلات الوفيات ، خاصة بين المرضى الذين يعانون من نقص المناعة1. تستغرق طرق الكشف التقليدية القائمة على المزرعة عن العدوى المسببة للأمراض وقتا طويلا وقد تفتقر إلى الحساسية ، مما قد يؤخر العلاج بالمضادات الحيوية ويضر بنتائج المرضى. يعد التعرف السريع والدقيق على A. baumannii أمرا بالغ الأهمية للعلاج الفعال ومكافحة الفاشية. تم استكشاف التقنيات الجزيئية التي تستخدم تضخيم الحمض النووي لتلبية هذه الحاجة. ومع ذلك ، غالبا ما تحتاج هذه الأساليب إلى معدات متطورة للتدوير الحراري وقد تكون محدودة بفنيين مدربين تدريبا جيدا ومختبرات راسخة. للتغلب على هذه التحديات ، تركز الأبحاث بشكل متزايد على تطوير طرق تضخيم متساوي الحرارة2،3،4.
تضخيم البوليميراز المركب (RPA) هي طريقة أنشأها Piepenburg et al 5 وتستخدم لتضخيم الحمض النووي ، على غرار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ولكن دون الحاجة إلى دورة درجة الحرارة. تتضمن هذه الطريقة 50 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 100 ملي أسيتات البوتاسيوم ، 14 ملي أسيتات المغنيسيوم ، 2 ملي مولار DTT ، 5٪ PEG20000 (بولي إيثيلين جلايكول عالي الوزن الجزيئي) ، 200 ميكرومتر dNTPs ، 3 ملي مولار ATP ، 50 ملي فوسفوكرياتين ، 100 ميكروغرام / مل كرياتين كيناز ، 120 ميكروغرام / مل UvsX ، 30 ميكروغرام / مل UvsY ، 900 ميكروغرام / مل Gp32 ، 30 ميكروغرام / مل Bsu LF ، بادئات 450 نانومتر وقوالب الحمض النووي. تبدأ عملية التضخيم بارتباط بروتين إعادة الإدماج UvsX بالبادئات في وجود 3 ملي مولار ATP و 5٪ PEG20000 تشكيل مركب أولي إعادة الإدماج. ثم يسهل هذا المركب الجمع بين الاشعال والتسلسلات المتجانسة على الحمض النووي المزدوج الشريطة.
بمساعدة UvsY ، يسهل إعادة التركيب UvsX التبادل بين التمهيدي وخيط القالب ، مما يؤدي إلى إزاحة خيط واحد من الحمض النووي المستهدف. يساعد Gp32 في الحفاظ على بنية الحمض النووي أحادية الشريطة. أخيرا ، ينفصل المؤركب ، ويرتبط بوليميراز الحمض النووي (Bsu LF) القادر على إزاحة خيوط الحمض النووي بنهاية 3 ‘من التمهيدي ، مما يؤدي إلى إطالة الفوسفات في وجود ثلاثي الفوسفات منقوص الأكسجين ريبونوكليوزيد (dNTPs). تتكرر هذه العملية بشكل دوري ، مما يحقق تضخيما أسيا. يمكن إكمال جميع عمليات التضخيم في غضون 20-40 دقيقة وفي درجات حرارة ثابتة نسبيا تتراوح بين 37 درجة مئوية و 42 درجة مئوية. يتطابق نطاق درجة الحرارة هذا تقريبا مع درجات الحرارة الفسيولوجية ، مما يسمح بإجراء RPA في بيئة بسيطة ، مما يجعل RPA أداة متعددة الاستخدامات وفعالة للكشف عن الحمض النووي وتحليله.
يعمل نظام التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) والبروتين المرتبط بكريسبر (CRISPR-Cas) كآلية مناعية تكيفية في البكتيريا والعتائق ، بما في ذلك أنظمة الفئة الأولى والفئة الثانية. تتضمن الفئة الثانية بروتينات مثل Cas12 (أ ، ب ، و) و Cas13 (أ ، ب) ، و Cas14 ، والتي تحدد وتشق الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي المستهدف مسترشدا ب CRISPR RNA (crRNA) 6،7،8 . LbaCas12a (أو Cpf1) هو نوكلياز داخلي للحمض النووي الموجه ب crRNA. يعمل crRNA كRNA موجه داخل نظام CRISPR-Cas ، حيث يعقد مع بروتينات Cas. إنه يستفيد من منطقة المباعد الخاصة به للاقتران مع الحمض النووي المستهدف ، مما يوجه مركب البروتين بشكل فعال إلى التسلسلات المستهدفة. يعمل التسلسل 5′-UAAUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ كتكرار crRNA محفوظ ، وهو عنصر ثابت في جميع LbaCas12a crRNAs. بعد هذا التكرار ، يوجد جزء خاص بالهدف يختلف بناء على هدف الحمض النووي المقصود. يتراوح طول تسلسل الاستهداف هذا من 18 إلى 24 نيوكليوتيد.
يقع تسلسل PAM (الشكل المجاور للspacer) (TTTV ، حيث يمكن أن يكون V A أو C أو G) في نهاية 5 ‘من الخيط غير التكميلي لهدف الحمض النووي. يقطع Cas12a الهدف من الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تسلسل PAM. بعد ذلك ، تقوم بروتينات Cas المنشطة بتنفيذ انقسام غير محدد للحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNA) 9،10،11،12. وبالتالي ، فإن ssDNA المسمى بالفلوروفور والتبريد يخضع للانقسام ، مما يؤدي إلى انبعاث إشارة فلورية بعد الانقسام الجانبي8،13. يمكن قياس شدة التألق باستخدام قارئ التألق للكشف الدقيق عن الحمضالنووي 14. والجدير بالذكر أن Cas12a يستخدم على نطاق واسع لتحليل الحمض النووي ، مع ربطه وانقسامه للتسلسلات المستهدفة يتوقف على التعرف على الشكل المجاور للسبيس الأولي (PAM) ، بينما يعمل Cas13a بشكل مستقل عن هذا المطلب.
تسهل أنظمة CRISPR-Cas15،16،17 الانقسام داخل تفاعل واحد18،19،20،21. يمكن أن يؤدي الجمع بين الاثنين المذكورين أعلاه إلى إنشاء أداة قوية تعرف باسم A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) للكشف عن الحمض النووي22،23،24. يوضح هذا البروتوكول استخدام RPA جنبا إلى جنب مع نشاط DNase ل Cas12a لاستهداف وشق تسلسل موجه ب crRNA على وجه التحديد داخل جين 16s rDNA ل A. baumannii ، مما يتيح الكشف الحساس والدقيق لمسببات الأمراض.
تقدم طريقة A. baumannii-DETECTR العديد من المزايا مقارنة بطرق الكشف التقليدية25،26. أولا ، تعمل الخاصية متساوية الحرارة ل RPA على تبسيط الإجراءات التشغيلية وتقليل التكاليف من خلال آلية التضخيم المستقلة عن التدوير الحراري5. ثانيا ، يزيد نوكلياز Cas12a من خصوصية الفحص عن طريق الاستهداف بوساطة crRNA وإقران قاعدةWatson-Crick 7. أخيرا ، فإن استخدام طريقة الأنبوب الواحد ل A. baumannii-DETECTR لا يوفر الوقت فحسب ، بل يقلل أيضا بشكل كبير من خطر تلوث Amplicon19.
يحدد البروتوكول خطوات استخراج الحمض النووي ، واختيار تسلسل الحمض النووي المستهدف ، وتصميم البادئات و crRNAs ، وبناء البلازميدات المؤتلفة الإيجابية ، وإنشاء اختبار Cas12a-RPA ، وتحسين تحسين تضخيم RPA ، وتصور النتائج المرئية باستخدام أدوات الكشف عن التألق مثل جهاز PCR في الوقت الفعلي ، كاملة مع تقييمات الحساسية والخصوصية.
تبشر طريقة A. baumannii-DETECTR بتحسين نتائج المرضى من خلال تسهيل العلاج الفعال في الوقت المناسب ، والسيطرة القوية على العدوى ، واحتواء انتشار مقاومة المضادات الحيوية. يمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة مبدأ توجيهي شامل لتنفيذ تقنية Cas12a-RPA ، مما يعزز فائدتها في مختلف إعدادات الرعاية الصحية. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أنه يجب تحسين كل خطوة بناء على ظروف المختبر المحددة وتنوع العينات لضمان نتائج متسقة وموثوقة.
1. بناء A. baumannii -DETECTR
ملاحظة: بناء A. baumannii-DETECTR هو عملية من أربع خطوات تتضمن تصميم التمهيدي و crRNA ، وبناء بناء البلازميد المؤتلف الإيجابي ، وإعداد محاليل التفاعل ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بواسطة RPA ، وتصور مقايسة RPA-CRISPR / Cas12a. يتم توضيح الرسم التخطيطي لمقايسة DETECTR في الشكل 1.
2. تقييم خصوصية منصة الكشف المستندة إلى RPA-CRISPR / Cas12a
ملاحظة: لاختبار خصوصية A. baumannii-DETECTR ، خضعت الأحماض النووية ل A. baumannii ، المكورات العقدية الرئوية ، المكورات العنقودية الذهبية ، Rickettsia mooseri ، Enterobacter ، الإشريكية القولونية ، Pseudomonas aeruginosa ، Klebsiella ، الكلاميديا psittaci ، الفيلقية ، Cockerella burnetii ، Serratia ، والعينات البشرية لاختبار DETECTR.
3. تقييم حساسية منصة الكشف القائمة على RPA-CRISPR / Cas12a
4. الاستعدادات أثناء وجود العينة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية والكشف عن LFS
وهناك قيود مختلفة على طرق التشخيص التقليدية للعدوى ب A. baumannii تجعلها أقل سهولة وإمكانية للاختبار في نقاط الرعاية27. على سبيل المثال ، يتمتع تفاعل البوليميراز المتسلسل بحساسية وخصوصية جيدة ولكنه يتطلب معدات متخصصة للتدوير الحراري وسير عمل معقدة يجب تشغيلها من قبل محترفين. الطريقة الجديدة المعروضة هنا ، والتي تجمع بين RPA و CRISPR-LbaCas12a وتحرير الجينوم مع إعادة التركيب ، والمعروفة باسم A. baumannii-DETECTR ، تسمح بالتلاعب الجيني الفعال. يوفر طريقة كشف سريعة وحساسة ومحددة لعدوى Acinetobacter baumannii ، وكذلك لتشخيص مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. يتم توضيح سير العمل في الشكل 1.
طريقتنا مفيدة بشكل خاص في تشخيص العدوى وإدارتها ، والتي من شأنها أن تسهل تعافي المريض وتخفف من انتشار A. baumannii من خلال التغلب على أوجه القصور في تقنيات التشخيص الحالية. تم العثور على نظام A. baumannii-DETECTR لتحديد A. baumannii بخصوصية وحساسية عالية (الشكل 5 والشكل 6). كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن A. baumannii فقط أظهر تغيرا إيجابيا في طية التألق أثناء التقييم في الوقت الفعلي ، بينما أظهرت جينومات جميع الأنواع الأخرى نتائج سلبية (الشكل 5).
لتقييم حساسية منصة الكشف RPA-CRISPR / Cas12a ، تم استخدام البلازميدات المؤتلفة pUC57-16s rDNA ، والتي تكون إيجابية ل A. baumannii ، كأهداف لتحديد حد الكشف (LOD) للنظام. في مقايسة RPA-CRISPR / Cas12a المستندة إلى التألق ، تراوح الاكتشاف من نسخة واحدة لكل ميكرولتر إلى 107 نسخ لكل ميكرولتر ، مع تحسن ملحوظ في شدة التألق لوحظ في مجموعة 1 نسخة / ميكرولتر مقارنة بمجموعة التحكم السلبية (الشكل 6). الأهم من ذلك ، بالنسبة للتشخيص في الوقت الفعلي ، يمكن تصور نتائج الكشف مباشرة عبر جهاز محمول باليد ، بغض النظر عن المعدات المختبرية ، وهو أمر ضروري للتشخيص في الوقت الفعلي.
يجب مراعاة العديد من العوامل الحاسمة فيما يتعلق بالبروتوكول26. أولا ، من الضروري منع التلوث المتبادل أثناء عملية جمع العينات ، نظرا للحساسية العالية لمقايسة A. baumannii-DETECTR. بالإضافة إلى ذلك ، يجب حماية كواشف التفاعل من التعرض المباشر لأشعة الشمس. ويعد الالتزام بجميع الخطوات الإجرائية أمرا بالغ الأهمية لتحقيق أفضل النتائج الممكنة. يجب دمج عنصر تحكم إيجابي ، يتكون من بلازميد يحتوي على شظايا جينية خاصة ب A. baumannii ، للتحقق من الوظيفة المناسبة لنظام A. baumannii-DETECTR في التطبيقات العملية.
يوضح البروتوكول أنه يمكن تحسين المعلمات لظروف معملية وأنواع عينات محددة ، مثل تركيز التمهيدي ووقت التفاعل والمتغيرات الأخرى. في هذه التجربة ، تم اختيار التركيبة التمهيدية المثلى وتركيزات التمهيدي وأوقات التفاعل لتضخيم RPA لإنتاج أعلى كفاءة تضخيم وخصوصية. تم تحديد ذلك عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز (الشكل 2 والشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام البلازميد المؤتلف الإيجابي ، الذي يحتوي على منطقة محفوظة من A. baumannii الجينوم كعنصر تحكم لضمان الدقة في البروتوكول. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري التجارية توفر طريقة موحدة وموثوقة لاستخراج الحمض النووي في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، في الدراسات المستقبلية ، قد تتطلب أنواع العينات المختلفة ، مثل العينات السريرية أو البيئية ، طرق استخراج محددة28 لعزل الحمض النووي A. baumannii بشكل فعال.
في حالة عدم وجود إشارات مضان يمكن اكتشافها من التحكم الإيجابي ، من المحتمل أن تكون المثبطات موجودة في خليط التفاعل ، مما يستلزم تغيير الكواشف. على العكس من ذلك ، إذا كانت شدة التألق غير كافية للتمايز الواضح ، فقد يكون تمديد مدة الحضانة مفيدا. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الحضانة المطولة أيضا إلى إيجابيات كاذبة26.
تتطلب منهجيات الكشف الحالية ل A. baumannii استخدام معدات PCR باهظة الثمن ومواقع تشغيل ثابتة وموظفين متخصصين. في المقابل ، تسهل الطريقة المقترحة هنا التشخيص الدقيق والحساس ل A. baumannii في البيئات الميدانية ، مما يجعلها في متناول مجموعة سكانية أوسع.
تجعل خصائص التضخيم متساوي الحرارة والبيانات التي تم جمعها من خلال التألق سير عمل A. baumannii-DETCTER بسيطا ومنخفضا من المعدات بالإضافة إلى تمكين إجراء الكشف السريع عن مسببات الأمراض في المناطق النائية أو أثناء تفشي المرض. اكتسبت RPA-LFS29،30،31،32 ، وهي تقنية جديدة لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، قوة دفع كبيرة في الكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية والطفيلية نظرا لبساطتها التشغيلية وانخفاض متطلباتها الزمنية. يوضح البروتوكول تفاصيل إشارة التألق للعينة تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) أو الكشف عن Transilluminator وشرائط التدفق الجانبي (LFS). يمكن أن يتجنب الاعتماد على الأدوات عالية الدقة والفنيين المتخصصين ، حيث ينتج عن الفحص البصري في وقت قصير (الشكل 7) ، وبالتالي يلغي الحاجة إلى معدات المختبرات باهظة الثمن والمعقدة والسكان التشغيليين. علاوة على ذلك ، فإن طريقة الأنبوب الواحد ليست موفرة للوقت فحسب ، بل تقلل أيضا من خطر تلوث الأمبليكون33.
يجب أن تهدف الدراسات المستقبلية إلى تحسين الطريقة لجعلها قابلة للتطبيق لأنواع مختلفة من العينات والظروف البيئية المختلفة ، مثل استكشاف تقنيات استخراج الحمض النووي الأكثر كفاءة وأقل تكلفة. لا يقتصر استخدام A. baumannii-DETECTR على التشخيص السريري فحسب ، بل يمكن استخدامه أيضا للتقييم البيئي ومراقبة وإدارة تفشي المرض ، مما يمكن المجتمعات والمستشفيات من التعرف بسرعة على A. baumannii. علاوة على ذلك ، من خلال تعديل crRNA والبادئات ، يمكن تكييف نهج التشخيص الجزيئي هذا للكشف عن الالتهابات البكتيرية التنفسية المختلفة ، مثل المكورات العقدية الرئوية والمكورات العنقودية الذهبية و Enterobacter.
باختصار ، يمكن ل A. baumannii-DETECTR التعرف على A. baumannii بأسرع ما يمكن وبدقة نظرا لحساسيته العالية وخصوصيته وتصميمه سهل الاستخدام وقابليته للنقل. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز النتائج الصحية للمريض من خلال تسهيل العلاج الفعال في الوقت المناسب ، ومكافحة العدوى ، والتخفيف من انتشار مقاومة المضادات الحيوية ، مع معالجة التهديد المتزايد لعدوى A. baumannii .
The authors have nothing to disclose.
-20 °C Freezer | Haier | HYCD-290 | China |
Agarose Basic | BioFroxx | 1110GR100 | China |
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by company | www.comatebio.com | ||
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BHQ | China |
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BIO | China |
Electrophoresis apparatus | BIO-RAD | POWER PAC1000 | USA |
Fluorescence quantitative PCR instrument | BIO-RAD | CFX Connect | USA |
Gel Imaging System | BIO-RAD | Gel Doc 2000 | USA |
https://ezassay.com/rna | |||
https://www.ezassay.com/primer | |||
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast | |||
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM) | EZassay Biotech. Co. Ltd. | HD-FMBO | China |
LbaCas12a (Cpf1) enhanced protein | EZassay Biotech. Co. Ltd. | CAS-12E-001 | China |
LED Transilluminator | LABGIC | BL-20 | China |
Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Microcentrifuge | allsheng | Mini-6k | China |
PCR strip tubes | PCR strip tubes | PST-0208-FT-C | China |
TGrade Dry Bath Incubator | Tiangen biochemical technology | OSE-DB-01 | China |
Tianamp Bacteria DNA Kit | Tiangen biochemical technology | DP302-02 | China |
TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD. | DP302 | China |
TransStart FastPfu DNA Polymerase | TransGen Biotech. Co. Ltd. | AP221 | China |
TwistAmp Basic Kit | TwistDX | TABAS03KIT | UK |
Universal DNA Purification Kit | Tiangen biochemical technology | DP214-03 | China |