JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection

الكشف السريع والمحدد عن عدوى أسينتوباكتر بوماني باستخدام تضخيم بوليميراز إعادة التركيب / نظام قائم على Cas12a

Published: April 25, 2025
doi:
10.3791/67542
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, , , , , , , , , , , , , ,
1Department of General Practice,The First Hospital of Jilin University2Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases,The First Hospital of Jilin University3Bioinformatics Laboratory,The First Hospital of Jilin University

Summary

لتسهيل الكشف السريع والدقيق عن Acinetobacter baumannii ، نقدم بروتوكولا يستخدم تضخيم البوليميراز Recombinase (RPA) جنبا إلى جنب مع نوكلياز LbaCas12a الداخلي لتحديد عدوى A. baumannii .

Abstract

تشتهر بكتيريا Acinetobacter baumannii ، وهي بكتيريا سالبة الجرام ، بالتسبب في التهابات شديدة مع ارتفاع معدلات الوفيات. يعد الكشف السريع والدقيق عن A. baumannii أمرا بالغ الأهمية للعلاج الفوري ومكافحة العدوى بشكل فعال والحد من مقاومة المضادات الحيوية. ومع ذلك ، لا توجد طريقة مناسبة للكشف السريع والسهل في الموقع عن A. baumannii. يوفر نظام CRISPR Trans Reporter (DETECTR) المستهدف من نوكلياز الحمض النووي نهجا سريعا ودقيقا وحساسا للكشف عن A. baumannii من خلال دمج قدرات التعرف الخاصة بالهدف ل Cas12a مع كفاءة التضخيم متساوي الحرارة لتضخيم البوليميراز المدمج (RPA). يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل اكتشاف A. baumannii باستخدام RPA جنبا إلى جنب مع نوكلياز LbaCas12a. يتم وصف الخطوات التالية في هذه المقالة: استخراج الحمض النووي ، واختيار تسلسل DNA معين ، وتصميم التمهيدي و CRISPR RNA (crRNA) ، وبناء البلازميد المؤتلف الإيجابي ، وإعداد مقايسة Cas12a-RPA ، وتحسين نظام تضخيم RPA ، وتصور مقايسة RPA-CRISPR / Cas12a باستخدام أداة الكشف عن التألق مثل أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، وتقييم تقييم الحساسية والخصوصية.

Introduction

في علم الأحياء الدقيقة السريري ، يمثل الكشف عن عدوى Acinetobacter baumannii تحديا كبيرا. يمكن أن تسبب هذه البكتيريا سالبة الجرام التهابات ذات أعراض سريرية شديدة ، حتى مع ارتفاع معدلات الوفيات ، خاصة بين المرضى الذين يعانون من نقص المناعة1. تستغرق طرق الكشف التقليدية القائمة على المزرعة عن العدوى المسببة للأمراض وقتا طويلا وقد تفتقر إلى الحساسية ، مما قد يؤخر العلاج بالمضادات الحيوية ويضر بنتائج المرضى. يعد التعرف السريع والدقيق على A. baumannii أمرا بالغ الأهمية للعلاج الفعال ومكافحة الفاشية. تم استكشاف التقنيات الجزيئية التي تستخدم تضخيم الحمض النووي لتلبية هذه الحاجة. ومع ذلك ، غالبا ما تحتاج هذه الأساليب إلى معدات متطورة للتدوير الحراري وقد تكون محدودة بفنيين مدربين تدريبا جيدا ومختبرات راسخة. للتغلب على هذه التحديات ، تركز الأبحاث بشكل متزايد على تطوير طرق تضخيم متساوي الحرارة2،3،4.

تضخيم البوليميراز المركب (RPA) هي طريقة أنشأها Piepenburg et al 5 وتستخدم لتضخيم الحمض النووي ، على غرار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ولكن دون الحاجة إلى دورة درجة الحرارة. تتضمن هذه الطريقة 50 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 100 ملي أسيتات البوتاسيوم ، 14 ملي أسيتات المغنيسيوم ، 2 ملي مولار DTT ، 5٪ PEG20000 (بولي إيثيلين جلايكول عالي الوزن الجزيئي) ، 200 ميكرومتر dNTPs ، 3 ملي مولار ATP ، 50 ملي فوسفوكرياتين ، 100 ميكروغرام / مل كرياتين كيناز ، 120 ميكروغرام / مل UvsX ، 30 ميكروغرام / مل UvsY ، 900 ميكروغرام / مل Gp32 ، 30 ميكروغرام / مل Bsu LF ، بادئات 450 نانومتر وقوالب الحمض النووي. تبدأ عملية التضخيم بارتباط بروتين إعادة الإدماج UvsX بالبادئات في وجود 3 ملي مولار ATP و 5٪ PEG20000 تشكيل مركب أولي إعادة الإدماج. ثم يسهل هذا المركب الجمع بين الاشعال والتسلسلات المتجانسة على الحمض النووي المزدوج الشريطة.

بمساعدة UvsY ، يسهل إعادة التركيب UvsX التبادل بين التمهيدي وخيط القالب ، مما يؤدي إلى إزاحة خيط واحد من الحمض النووي المستهدف. يساعد Gp32 في الحفاظ على بنية الحمض النووي أحادية الشريطة. أخيرا ، ينفصل المؤركب ، ويرتبط بوليميراز الحمض النووي (Bsu LF) القادر على إزاحة خيوط الحمض النووي بنهاية 3 ‘من التمهيدي ، مما يؤدي إلى إطالة الفوسفات في وجود ثلاثي الفوسفات منقوص الأكسجين ريبونوكليوزيد (dNTPs). تتكرر هذه العملية بشكل دوري ، مما يحقق تضخيما أسيا. يمكن إكمال جميع عمليات التضخيم في غضون 20-40 دقيقة وفي درجات حرارة ثابتة نسبيا تتراوح بين 37 درجة مئوية و 42 درجة مئوية. يتطابق نطاق درجة الحرارة هذا تقريبا مع درجات الحرارة الفسيولوجية ، مما يسمح بإجراء RPA في بيئة بسيطة ، مما يجعل RPA أداة متعددة الاستخدامات وفعالة للكشف عن الحمض النووي وتحليله.

يعمل نظام التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) والبروتين المرتبط بكريسبر (CRISPR-Cas) كآلية مناعية تكيفية في البكتيريا والعتائق ، بما في ذلك أنظمة الفئة الأولى والفئة الثانية. تتضمن الفئة الثانية بروتينات مثل Cas12 (أ ، ب ، و) و Cas13 (أ ، ب) ، و Cas14 ، والتي تحدد وتشق الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي المستهدف مسترشدا ب CRISPR RNA (crRNA) 6،7،8 . LbaCas12a (أو Cpf1) هو نوكلياز داخلي للحمض النووي الموجه ب crRNA. يعمل crRNA كRNA موجه داخل نظام CRISPR-Cas ، حيث يعقد مع بروتينات Cas. إنه يستفيد من منطقة المباعد الخاصة به للاقتران مع الحمض النووي المستهدف ، مما يوجه مركب البروتين بشكل فعال إلى التسلسلات المستهدفة. يعمل التسلسل 5′-UAAUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ كتكرار crRNA محفوظ ، وهو عنصر ثابت في جميع LbaCas12a crRNAs. بعد هذا التكرار ، يوجد جزء خاص بالهدف يختلف بناء على هدف الحمض النووي المقصود. يتراوح طول تسلسل الاستهداف هذا من 18 إلى 24 نيوكليوتيد.

يقع تسلسل PAM (الشكل المجاور للspacer) (TTTV ، حيث يمكن أن يكون V A أو C أو G) في نهاية 5 ‘من الخيط غير التكميلي لهدف الحمض النووي. يقطع Cas12a الهدف من الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تسلسل PAM. بعد ذلك ، تقوم بروتينات Cas المنشطة بتنفيذ انقسام غير محدد للحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNA) 9،10،11،12. وبالتالي ، فإن ssDNA المسمى بالفلوروفور والتبريد يخضع للانقسام ، مما يؤدي إلى انبعاث إشارة فلورية بعد الانقسام الجانبي8،13. يمكن قياس شدة التألق باستخدام قارئ التألق للكشف الدقيق عن الحمضالنووي 14. والجدير بالذكر أن Cas12a يستخدم على نطاق واسع لتحليل الحمض النووي ، مع ربطه وانقسامه للتسلسلات المستهدفة يتوقف على التعرف على الشكل المجاور للسبيس الأولي (PAM) ، بينما يعمل Cas13a بشكل مستقل عن هذا المطلب.

تسهل أنظمة CRISPR-Cas15،16،17 الانقسام داخل تفاعل واحد18،19،20،21. يمكن أن يؤدي الجمع بين الاثنين المذكورين أعلاه إلى إنشاء أداة قوية تعرف باسم A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) للكشف عن الحمض النووي22،23،24. يوضح هذا البروتوكول استخدام RPA جنبا إلى جنب مع نشاط DNase ل Cas12a لاستهداف وشق تسلسل موجه ب crRNA على وجه التحديد داخل جين 16s rDNA ل A. baumannii ، مما يتيح الكشف الحساس والدقيق لمسببات الأمراض.

تقدم طريقة A. baumannii-DETECTR العديد من المزايا مقارنة بطرق الكشف التقليدية25،26. أولا ، تعمل الخاصية متساوية الحرارة ل RPA على تبسيط الإجراءات التشغيلية وتقليل التكاليف من خلال آلية التضخيم المستقلة عن التدوير الحراري5. ثانيا ، يزيد نوكلياز Cas12a من خصوصية الفحص عن طريق الاستهداف بوساطة crRNA وإقران قاعدةWatson-Crick 7. أخيرا ، فإن استخدام طريقة الأنبوب الواحد ل A. baumannii-DETECTR لا يوفر الوقت فحسب ، بل يقلل أيضا بشكل كبير من خطر تلوث Amplicon19.

يحدد البروتوكول خطوات استخراج الحمض النووي ، واختيار تسلسل الحمض النووي المستهدف ، وتصميم البادئات و crRNAs ، وبناء البلازميدات المؤتلفة الإيجابية ، وإنشاء اختبار Cas12a-RPA ، وتحسين تحسين تضخيم RPA ، وتصور النتائج المرئية باستخدام أدوات الكشف عن التألق مثل جهاز PCR في الوقت الفعلي ، كاملة مع تقييمات الحساسية والخصوصية.

تبشر طريقة A. baumannii-DETECTR بتحسين نتائج المرضى من خلال تسهيل العلاج الفعال في الوقت المناسب ، والسيطرة القوية على العدوى ، واحتواء انتشار مقاومة المضادات الحيوية. يمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة مبدأ توجيهي شامل لتنفيذ تقنية Cas12a-RPA ، مما يعزز فائدتها في مختلف إعدادات الرعاية الصحية. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أنه يجب تحسين كل خطوة بناء على ظروف المختبر المحددة وتنوع العينات لضمان نتائج متسقة وموثوقة.

Protocol

1. بناء A. baumannii -DETECTR

ملاحظة: بناء A. baumannii-DETECTR هو عملية من أربع خطوات تتضمن تصميم التمهيدي و crRNA ، وبناء بناء البلازميد المؤتلف الإيجابي ، وإعداد محاليل التفاعل ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بواسطة RPA ، وتصور مقايسة RPA-CRISPR / Cas12a. يتم توضيح الرسم التخطيطي لمقايسة DETECTR في الشكل 1.

  1. تصميم التمهيدي و crRNA (انظر الملف التكميلي 1)
    1. صمم 12 زوجا من الاشعال باستخدام أدوات التصميمعلى أساس مبادئ تصميم التمهيدي. احصل على أربعة بادئات أمامية (F0-F3) وثلاثة بادئات عكسية (R1-R3) لتكوين اثني عشر زوجا من البادئات (F0R1 ، F0R2 ، F0R3 ، F1R1 ، F1R2 ، F1R3 ، F2R1 ، F2R2 ، F2R3 ، F3R1 ، F3R2 ، F3R3).
      1. تأكد من أن نهاية التمهيدي 5 بوصات تحتوي على قواعد C أو T داخل أول 3-5 نيوكليوتيدات بدلا من امتداد G المستمر. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من أن النيوكليوتيدات الثلاثة الأخيرة في نهاية 3 هي قواعد G و C بشكل مثالي لتعزيز التضخيم.
      2. صمم بادئات بدون تسلسلات مكملة ذاتيا لتجنب تكوين دبوس الشعر ولا يزيد عن أربع قواعد تكميلية أو متجانسة بينهما. ابتعد عن تكامل نهاية 3 بوصات لتجنب تضليل التمهيدي.
    2. قم بتقييم كل زوج من البرايمر للتأكد من نوعيته باستخدام أداة Primer-BLAST التابعة للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) لتقييم فعالية وخصوصية الاشعال.
      ملاحظة: يمكن ل Primer-BLAST استخدام قاعدة بيانات NCBI للعثور على التسلسلات التي تتطابق مع البادئات المصممة ، مما يساعد المستخدمين على تقييم فعالية وخصوصية الاشعال.
    3. بعد الفحص التمهيدي ، صمم CRISPR RNA (crRNA) أو دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) باستخدام تسلسل سقالة LbaCas12a crRNA (5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′) كتسلسل ثابت. قم بدمج جزء محدد للهدف (5′-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3′) ، مما يضمن أن شكل PAM يقع في الطرف 5 من الخيط غير التكميلي.
      ملاحظة: يتم عرض تسلسل جميع قليل النوكليوتيدات و crRNA في الجدول 1.
  2. بناء البلازميد المؤتلف الإيجابي
    1. قم بتضخيم مقطع 16s rDNA باستخدام مجموعة التمهيدي A. baumannii 16s rDNA-F (التمهيدي الأمامي) و A. baumannii 16s rDNA-R (التمهيدي العكسي).
      1. أضف 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر F و 10 ميكرومتر R ، و 10 ميكرولتر من 5x FastpFu Buffer ، و 1 ميكرولتر من البوليميراز pFu السريع، و 4 ميكرولتر من 2.5 ملي مولار dNTPs ، و 1 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر A. baumannii الحمض النووي الجيني ، و 32 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى نظام PCR سعة 50 ميكرولتر.
      2. اضبط شروط دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، متبوعا ب 33 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة و 20 ثانية. أخيرا ، قم بإجراء 10 دقائق عند 72 درجة مئوية للتمديد النهائي.
    2. لتنقية منتج PCR الإيجابي ، استخدم مجموعة تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، استنساخ الحمض النووي المنقى في ناقل pUC57 ، والذي تم هضمه باستخدام إنزيمات BamHI و SalI.
      ملاحظة: ستؤدي هذه العملية إلى إنشاء بلازميد مؤتلف إيجابي يحتوي على منطقة محفوظة.
    3. قم بتخفيف البلازميد المؤتلف الموجب بشكل متسلسل بزيادات عشرة أضعاف مع ddH2O المعقم لتحقيق تركيز نسخة واحدة / ميكرولتر إلى 107 نسخ / ميكرولتر. قم بتخزين البلازميد المخفف عند -20 درجة مئوية للتجارب اللاحقة.
  3. تحضير الحل
    1. قم بإعداد المحلول A على النحو التالي: لكل تفاعل ، أضف 29.5 ميكرولتر من محلول الإماهة الخالي من التمهيدي ، و 2.4 ميكرولتر من 10 ميكرومتر A. baumannii-F و 10 ميكرولتر A. baumannii-R ، و 12.2ميكرولتر من ddH2O لتحقيق حجم نهائي يبلغ 46.5 ميكرولتر. دوامة وتدور لفترة وجيزة. بعد ذلك ، أضف خليط التفاعل إلى أنابيب تفاعل الإنزيم من مجموعة RPA. ماصة للخلط.
      ملاحظة: يتم استخدام بادئات A. baumannii-F و R في الفحص الذي يستهدف A. baumannii الجين. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 للاطلاع على التسلسل.
    2. قم بإعداد الحل B على النحو التالي: لكل تفاعل ، أضف 0.24 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من مبلغ ssDNA ، و 2 ميكرولتر من 10x Cas12a Reaction Buffer ، و 1 ميكرولتر من 1 ميكرومتر crRNA ، و 1 ميكرولتر من 1 ميكرومتر Cas12a ، و 10.76ميكرولتر من ddH2O لتحقيق حجم نهائي يبلغ 15 ميكرولتر.
      ملاحظة: تم شراء المجسات (مراسل ssDNA) وتألفت من مراسل DNA أحادي الشريطة تم وضع علامة عليه بفلوروفور 5-Carboxyfluorescein (FAM) في نهاية 5 ‘و Black Hole Quencher 1 (BHQ1) في نهاية 3’. في حالة وجود العديد من العينات التي تحتاج إلى كشف ، قم بإعداد كمية كبيرة من المحلول B ، ثم قسم العينات إلى حصص لاحقا.
  4. تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة (RPA)
    1. أضف 1 ميكرولتر من البلازميد المؤتلف الموجب البالغ 107 نسخ / ميكرولتر إلى المحلول A بأزواج أولية مختلفة ؛ تخلط جيدا. ثم أضف 2.5 ميكرولتر من 280 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم (MgOAc) إلى المحلول واخلطه جيدا.
      ملاحظة: تبدأ تفاعلات RPA بمجرد إضافة MgOAc.
    2. احتضان عند 39 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، قم بتنقية المنتجات المكبرة باستخدام مواد أولية مختلفة باستخدام RPA مع مجموعة تنقية ، ثم قم بتشغيل الأمبليكونات النظيفة على جل الاغاروز بنسبة 1٪ عند 120 فولت لمدة 10 دقائق لتحديد النطاق الأكثر سطوعا والأوسع كأفضل زوج أولي.
      ملاحظة: للحصول على رقم نسخ القالب المنخفض ، بعد 4 دقائق ، قم بإزالة أنبوب EP ، والدوامة ، والدوران لفترة وجيزة ؛ ثم استبدله في جهاز التسخين لمدة 16 دقيقة أخرى. بعد التضخيم ، يجب فتح الأنابيب بحذر شديد لتجنب تلويث أسطح العمل بمكبرات الصوت. سيقلل هذا الإجراء من خطر إحداث نتائج إيجابية كاذبة في الإجراءات التجريبية اللاحقة.
  5. تحسين نظام تضخيم تقنية RPA
    ملاحظة: تم ضبط زوج التمهيدي الأمثل F3R3 الذي تم اختياره في الخطوة السابقة على تركيزات نهائية مختلفة لتفاعل تضخيم RPA لفحص التركيز والوقت الأمثل للتمهيدي. NC هو عنصر تحكم فارغ لتركيز التمهيدي المقابل.
    1. حافظ على تركيزات المكونات الأخرى ثابتة والحجم الإجمالي 46.5 ميكرولتر في المحلول A. اضبط حجم ddH2O الخالي من RNase وفقا لذلك لتحقيق التركيزات التمهيدية النهائية البالغة 10 ميكرومتر F3 و 10 ميكرومتر R3 عند 0.40 ميكرومتر (2.0 ميكرولتر) و 0.44 ميكرومتر (2.2 ميكرولتر) و 0.48 ميكرومتر (2.4 ميكرولتر) و 0.52 ميكرومتر (2.6 ميكرولتر) ، على التوالي.
    2. احتضان عند 39 درجة مئوية لأوقات مختلفة: 10 دقائق ، 20 دقيقة ، 30 دقيقة.
    3. قم بتنظيف منتجات RPA باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي وقم بإجراء الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز 1٪ عند 120 فولت لمدة 10 دقائق لتحديد التركيز الأمثل للبرايمر وأوقات الحضانة من خلال تحليل خصائص العصابات.
  6. تصور مقايسة RPA-CRISPR/Cas12a
    1. أضف 5 ميكرولتر من منتج RPA إلى المحلول B واخلطه جيدا حتى يتجانس.
    2. ضع العينات في أداة PCR الكمية الفلورية ، واضبط قناة FAM ، واقرأ القيم كل دقيقة لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 60x ليصبح المجموع 60 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن أن تستمر إشارة التألق الأخضر عدة أيام. للتأكد من أن النظام يعمل بشكل فعال ، من الأفضل إجراء اختبار مجاني للحمض النووي و RNase.

2. تقييم خصوصية منصة الكشف المستندة إلى RPA-CRISPR / Cas12a

ملاحظة: لاختبار خصوصية A. baumannii-DETECTR ، خضعت الأحماض النووية ل A. baumannii ، المكورات العقدية الرئوية ، المكورات العنقودية الذهبية ، Rickettsia mooseri ، Enterobacter ، الإشريكية القولونية ، Pseudomonas aeruginosa ، Klebsiella ، الكلاميديا psittaci ، الفيلقية ، Cockerella burnetii ، Serratia ، والعينات البشرية لاختبار DETECTR.

  1. استخدم قوالب الحمض النووي التي تم الحصول عليها من أنواع مختلفة باستخدام مجموعة الحمض النووي المشار إليها أو عزلها عن طريق غلي البكتيريا في الماء. تأكد من أن جميع القوالب لها تركيزات متساوية. استخدم الماء كعنصر تحكم سلبي.
  2. أضف 10 نانوغرام أو 1 ميكرولتر من قوالب الحمض النووي إلى المحلول A الذي يحتوي على بادئات F3R3. أضف 2.5 ميكرولتر من MgOAc ، واخلطه جيدا ، واحتضن الخليط عند 39 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. بعد 20 دقيقة ، أضف 5 ميكرولتر من المنتج من الخطوة السابقة إلى المحلول B واخلطه.
  4. ضع في أداة PCR الكمي الفلوري ، واضبط القناة على FAM ، واقرأ القيمة مرة واحدة كل دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ليصبح المجموع 60 × لمدة 60 دقيقة.

3. تقييم حساسية منصة الكشف القائمة على RPA-CRISPR / Cas12a

  1. استخدم البلازميد المؤتلف الإيجابي ، الذي تم تحضيره بتركيز 1-107 نسخ / ميكرولتر ، كقالب للتفاعل. استخدم الماء للتحكم السلبي.
  2. قم بتنفيذ الطريقة باتباع الخطوات 2.2-2.4.
    ملاحظة: تم تصميم مجموعة التمهيدي RPA-F3 و RPA-R3 لتضخيم جزء أقصر من 174 زوجا أساسيا من البلازميد المؤتلف الموجب.

4. الاستعدادات أثناء وجود العينة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية والكشف عن LFS

  1. أخرج العدد المطلوب من شرائط الاختبار وقم بتسميته بشكل مناسب.
  2. نقل 10 ميكرولتر من المنتجات المضخمة من الخطوتين 2 و 3 إلى أنابيب PCR منفصلة ، على التوالي. ثم أضف 40 ميكرولتر من ddH2O إلى كل أنبوب.
    ملاحظة: في حالة استخدام نظام تفاعل معد ذاتيا ، يوصى باستكشاف نسبة التخفيف المثلى.
  3. قم بإجراء الاختبار.
    1. قم بإخضاع أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على المنتجات المضخمة لمصباح عازل لتقييم وجود الفلورة.
    2. أدخل شرائط الاختبار في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل مع توجيه طرف وسادة العينة لأسفل.
    3. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق لقراءة النتيجة. بعد هذا الوقت ، تأكد من أن مستوى السائل لا يتجاوز الحد الأقصى للخط قبل المضي قدما.
    4. قم بتفسير النتائج على أنها سلبية إذا كان الخط T لا يظهر اللون. تفسير النتائج على أنها إيجابية إذا كان الخط T مرئيا للعين المجردة ، مما يشير إلى أن مسبار الحمض النووي قد تم شقه بواسطة إنزيم Cas ، وتم تنشيط إنزيم Cas. اعتبر النتيجة غير صالحة إذا لم يظهر الخط C أو الخط T اللون.

Representative Results

Discussion

وهناك قيود مختلفة على طرق التشخيص التقليدية للعدوى ب A. baumannii تجعلها أقل سهولة وإمكانية للاختبار في نقاط الرعاية27. على سبيل المثال ، يتمتع تفاعل البوليميراز المتسلسل بحساسية وخصوصية جيدة ولكنه يتطلب معدات متخصصة للتدوير الحراري وسير عمل معقدة يجب تشغيلها من قبل محترفين. الطريقة الجديدة المعروضة هنا ، والتي تجمع بين RPA و CRISPR-LbaCas12a وتحرير الجينوم مع إعادة التركيب ، والمعروفة باسم A. baumannii-DETECTR ، تسمح بالتلاعب الجيني الفعال. يوفر طريقة كشف سريعة وحساسة ومحددة لعدوى Acinetobacter baumannii ، وكذلك لتشخيص مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. يتم توضيح سير العمل في الشكل 1.

طريقتنا مفيدة بشكل خاص في تشخيص العدوى وإدارتها ، والتي من شأنها أن تسهل تعافي المريض وتخفف من انتشار A. baumannii من خلال التغلب على أوجه القصور في تقنيات التشخيص الحالية. تم العثور على نظام A. baumannii-DETECTR لتحديد A. baumannii بخصوصية وحساسية عالية (الشكل 5 والشكل 6). كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن A. baumannii فقط أظهر تغيرا إيجابيا في طية التألق أثناء التقييم في الوقت الفعلي ، بينما أظهرت جينومات جميع الأنواع الأخرى نتائج سلبية (الشكل 5).

لتقييم حساسية منصة الكشف RPA-CRISPR / Cas12a ، تم استخدام البلازميدات المؤتلفة pUC57-16s rDNA ، والتي تكون إيجابية ل A. baumannii ، كأهداف لتحديد حد الكشف (LOD) للنظام. في مقايسة RPA-CRISPR / Cas12a المستندة إلى التألق ، تراوح الاكتشاف من نسخة واحدة لكل ميكرولتر إلى 107 نسخ لكل ميكرولتر ، مع تحسن ملحوظ في شدة التألق لوحظ في مجموعة 1 نسخة / ميكرولتر مقارنة بمجموعة التحكم السلبية (الشكل 6). الأهم من ذلك ، بالنسبة للتشخيص في الوقت الفعلي ، يمكن تصور نتائج الكشف مباشرة عبر جهاز محمول باليد ، بغض النظر عن المعدات المختبرية ، وهو أمر ضروري للتشخيص في الوقت الفعلي.

يجب مراعاة العديد من العوامل الحاسمة فيما يتعلق بالبروتوكول26. أولا ، من الضروري منع التلوث المتبادل أثناء عملية جمع العينات ، نظرا للحساسية العالية لمقايسة A. baumannii-DETECTR. بالإضافة إلى ذلك ، يجب حماية كواشف التفاعل من التعرض المباشر لأشعة الشمس. ويعد الالتزام بجميع الخطوات الإجرائية أمرا بالغ الأهمية لتحقيق أفضل النتائج الممكنة. يجب دمج عنصر تحكم إيجابي ، يتكون من بلازميد يحتوي على شظايا جينية خاصة ب A. baumannii ، للتحقق من الوظيفة المناسبة لنظام A. baumannii-DETECTR في التطبيقات العملية.

يوضح البروتوكول أنه يمكن تحسين المعلمات لظروف معملية وأنواع عينات محددة ، مثل تركيز التمهيدي ووقت التفاعل والمتغيرات الأخرى. في هذه التجربة ، تم اختيار التركيبة التمهيدية المثلى وتركيزات التمهيدي وأوقات التفاعل لتضخيم RPA لإنتاج أعلى كفاءة تضخيم وخصوصية. تم تحديد ذلك عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز (الشكل 2 والشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام البلازميد المؤتلف الإيجابي ، الذي يحتوي على منطقة محفوظة من A. baumannii الجينوم كعنصر تحكم لضمان الدقة في البروتوكول. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري التجارية توفر طريقة موحدة وموثوقة لاستخراج الحمض النووي في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، في الدراسات المستقبلية ، قد تتطلب أنواع العينات المختلفة ، مثل العينات السريرية أو البيئية ، طرق استخراج محددة28 لعزل الحمض النووي A. baumannii بشكل فعال.

في حالة عدم وجود إشارات مضان يمكن اكتشافها من التحكم الإيجابي ، من المحتمل أن تكون المثبطات موجودة في خليط التفاعل ، مما يستلزم تغيير الكواشف. على العكس من ذلك ، إذا كانت شدة التألق غير كافية للتمايز الواضح ، فقد يكون تمديد مدة الحضانة مفيدا. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الحضانة المطولة أيضا إلى إيجابيات كاذبة26.

تتطلب منهجيات الكشف الحالية ل A. baumannii استخدام معدات PCR باهظة الثمن ومواقع تشغيل ثابتة وموظفين متخصصين. في المقابل ، تسهل الطريقة المقترحة هنا التشخيص الدقيق والحساس ل A. baumannii في البيئات الميدانية ، مما يجعلها في متناول مجموعة سكانية أوسع.

تجعل خصائص التضخيم متساوي الحرارة والبيانات التي تم جمعها من خلال التألق سير عمل A. baumannii-DETCTER بسيطا ومنخفضا من المعدات بالإضافة إلى تمكين إجراء الكشف السريع عن مسببات الأمراض في المناطق النائية أو أثناء تفشي المرض. اكتسبت RPA-LFS29،30،31،32 ، وهي تقنية جديدة لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، قوة دفع كبيرة في الكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية والطفيلية نظرا لبساطتها التشغيلية وانخفاض متطلباتها الزمنية. يوضح البروتوكول تفاصيل إشارة التألق للعينة تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) أو الكشف عن Transilluminator وشرائط التدفق الجانبي (LFS). يمكن أن يتجنب الاعتماد على الأدوات عالية الدقة والفنيين المتخصصين ، حيث ينتج عن الفحص البصري في وقت قصير (الشكل 7) ، وبالتالي يلغي الحاجة إلى معدات المختبرات باهظة الثمن والمعقدة والسكان التشغيليين. علاوة على ذلك ، فإن طريقة الأنبوب الواحد ليست موفرة للوقت فحسب ، بل تقلل أيضا من خطر تلوث الأمبليكون33.

يجب أن تهدف الدراسات المستقبلية إلى تحسين الطريقة لجعلها قابلة للتطبيق لأنواع مختلفة من العينات والظروف البيئية المختلفة ، مثل استكشاف تقنيات استخراج الحمض النووي الأكثر كفاءة وأقل تكلفة. لا يقتصر استخدام A. baumannii-DETECTR على التشخيص السريري فحسب ، بل يمكن استخدامه أيضا للتقييم البيئي ومراقبة وإدارة تفشي المرض ، مما يمكن المجتمعات والمستشفيات من التعرف بسرعة على A. baumannii. علاوة على ذلك ، من خلال تعديل crRNA والبادئات ، يمكن تكييف نهج التشخيص الجزيئي هذا للكشف عن الالتهابات البكتيرية التنفسية المختلفة ، مثل المكورات العقدية الرئوية والمكورات العنقودية الذهبية و Enterobacter.

باختصار ، يمكن ل A. baumannii-DETECTR التعرف على A. baumannii بأسرع ما يمكن وبدقة نظرا لحساسيته العالية وخصوصيته وتصميمه سهل الاستخدام وقابليته للنقل. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز النتائج الصحية للمريض من خلال تسهيل العلاج الفعال في الوقت المناسب ، ومكافحة العدوى ، والتخفيف من انتشار مقاومة المضادات الحيوية ، مع معالجة التهديد المتزايد لعدوى A. baumannii .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenie, D., Alexandr, N., Harald, S. An increasing threat in hospitals: Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 5 (12), 939-951 (2007).
  2. Li, P., et al. Rapid detection of Acinetobacter baumannii and molecular epidemiology of carbapenem-resistant A. baumannii in two comprehensive hospitals of Beijing, China. Front Microbiol. 6, 997 (2015).
  3. Wu, X., et al. A diagnostic test that uses isothermal amplification and lateral flow detection sdaA can detect tuberculosis in 60 min. J Appl Microbiol. 130 (6), 2102-2110 (2020).
  4. Huang, B., et al. A cas12a-based fluorescent microfluidic system for rapid on-site human papillomavirus diagnostics. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (20), 6287-6297 (2023).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  6. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), aaf5573 (2016).
  7. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), eaar6245 (2018).
  8. Xiong, D., et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a. PLoS Biol. 18 (12), e3000978 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with crispr-Cas13a/C2C2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  10. Harrington, L. B., et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 362 (6416), 839-842 (2018).
  11. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Res. 28 (4), 491-493 (2018).
  12. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  13. Huang, Z., et al. Ultra-sensitive and high-throughput crispr-p owered COVID-19 diagnosis. Biosens Bioelectron. 164, 112316 (2020).
  14. Zhang, W. S., et al. Reverse transcription recombinase polymerase amplification coupled with CRISPR-Cas12a for facile and highly sensitive colorimetric SARS-CoV-2 detection. Anal Chem. 93 (8), 4126-4133 (2021).
  15. Marraffini Luciano, A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 526 (7571), 55-61 (2015).
  16. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147 (2016).
  17. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 13 (11), 722-736 (2015).
  18. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discovery. 4 (1), 20 (2018).
  19. Li, L., Li, S., Wu, N., Wu, J., Wang, J. Holmesv2: A CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation. ACS Synth Biol. 8 (10), 2228-2237 (2019).
  20. Liang, M., Li, Z., Wang, W., Liu, J., Zhang, L. X. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nat Communications. 10 (1), 3672 (2019).
  21. Aquino-Jarquin, G. CRISPR-Cas14 is now part of the artillery for gene editing and molecular diagnostic. Nanomedicine. 18, 428-431 (2019).
  22. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  23. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  24. Swarts, D. C., John, V. D. O., Jinek, M. Structural basis for guide RNA processing and seed-dependent DNA targeting by CRISPR-Cas12a. Mol Cell. 66 (2), 221-233 (2017).
  25. Jiang, Y., et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum. Nat Commun. 8, 15179 (2017).
  26. Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00947-e01017 (2017).
  27. Ashraf, A., et al. A novel multiplex pcr assay for simultaneous detection of nine clinically significant bacterial pathogens associated with bovine mastitis. Mol Cell Probes. 33, 57-64 (2017).
  28. Zhu, L., et al. A rapid on-site visualization platform based on RPA coupled with CRISPR-Cas12a for the detection of genetically modified papaya ‘huanong no.1’. Talanta. 277, 126437 (2024).
  29. Zheng, C., et al. Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection. Analyst. 146 (5), 1514-1528 (2021).
  30. Wang, Y., et al. Establishment and clinical application of a RPA-LFS assay for detection of capsulated and non-capsulated Haemophilus influenzae. Front Cell Infect Microbiol. 12, 878813 (2022).
  31. Wang, F., et al. Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans. Anal Biochem. 633, 114428 (2021).
  32. Ma, B., et al. A simple and efficient method for potential point-of-care diagnosis of human papillomavirus genotypes: Combination of isothermal recombinase polymerase amplification with lateral flow dipstick and reverse dot blot. Anal Bioanal Chem. 411 (28), 7451-7460 (2019).
  33. Sun, Y., Yu, L., Liu, C., Ye, S., Huang, W. One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a. J Transl Med. 19 (1), 74 (2021).

Tags

Immunology and Infection
Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, X., Duan, M., Zhao, Y., Zhang, K., Liu, F., Jie, J., Li, C., Chen, D., Li, D., Hua, S., Wang, C., Guan, Q., Wu, J., Liu, B., Song, L. Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System. J. Vis. Exp. (218), e67542, doi:10.3791/67542 (2025).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image