مقالة منهجية

تحديد مواقع تكامل الفيروسات العدسية ذات الصلة وظيفيا في مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية

DOI:

10.3791/67552

⸱

يناير 10, 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرات الإدراجية هي أداة أساسية في علم الوراثة الأمامية لتحديد العناصر الجينومية الوظيفية. هنا ، نصف الشاشة المستندة إلى الإدراج للعناصر الوظيفية والنصوص (InSET) ، وهي طريقة للكشف عن مواقع تكامل الفيروسات داخل مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على فيروس العدس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد مدى التسلسلات الوظيفية داخل الجينوم البشري موضوعا محوريا ولكنه مثير للجدل في علم الأحياء. على الرغم من أن الشاشات الجينية العكسية عالية الإنتاجية قد قطعت خطوات كبيرة في استكشاف هذا الأمر ، إلا أنها غالبا ما تحد من نطاقها إلى العناصر الجينومية المعروفة وقد تحدث تأثيرات غير محددة. هذا يؤكد الحاجة الملحة لأدوات الجينوم الوظيفية الجديدة التي تتيح فهما أعمق وغير متحيز لوظائف الجينوم. يقدم هذا البروتوكول الشاشة المستندة إلى الإدراج للعناصر والنصوص الوظيفية (InSET) ، وهي طريقة لتحديد مواقع تكامل الفيروسات داخل مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على فيروس العدس. يسهل InSET التقاط مواقع تكامل الفيروسات العدسية على مستوى الجينوم ، مع تسلسل الجيل التالي المستخدم لاكتشاف وتحديد التسلسلات المرافقة. يتيح تصميم InSET تحليل اختلافات وفرة موقع التكامل في شاشات النمط الظاهري على نطاق واسع ، مما يجعلها أداة قوية لعلم الوراثة المستقبلية ولتحديد العناصر الجينومية الوظيفية. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية ل InSET في قدرتها على الكشف عن العناصر الجينومية غير المحددة سابقا ، بما في ذلك exons الوظيفية الجديدة لكل من الحمض النووي الريبي المشفر للبروتين وغير المشفر ، بغض النظر عن التعليقات التوضيحية السابقة. بشكل عام ، يتمتع InSET بقيمة كبيرة في دراسة التعقيد المعقد للجينوم البشري والنسخ ، حيث تنتظر العديد من العناصر الجينومية التوصيف الوظيفي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظل علم الجينوم الوظيفي مجالا حاسما ومليئا بالتحديات ، حتى في عصر ما بعد الجينوم ، حيث لا يزال جزء كبير من المناطق الجينومية يفتقر إلى التوصيف الوظيفي. يكمن أحد الأسباب الرئيسية لهذه التحديات في الطبيعة المعقدة للجينوم البشري والنسخ ، والتي تتميز بالنسخ المنتشر والتضفير البديل العالمي في كل من مناطق ترميز البروتين وغير المشفرة< sup class = "xref" >1،2،3،4,5. تم تسليط الضوء على هذا التعقيد على نطاق واسع من خلال دراسات التخصيب المستهدفة بالحمض النووي الريبي< sup class = "xref">6,

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية على طريقة InSET. للحصول على التغطية المثلى ، قم بإعداد خمس مكتبات متوازية من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني ، ثم قم بتجميعها لتسلسل الجيل التالي. تم إكمال هذا الإجراء بنجاح بشكل مستمر في الاختبارات السابقة ، على الرغم من أنه قد يقوم المستخدمون بإدخال نقاط إيقاف مؤقت بناء على تقديرهم. يمكن العثور على معلومات مفصلة عن الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

< p class = "jove_title" >1. التقاط مواقع تكامل فيروس العدسات في الجينوم

  1. استخدم الحمض النووي الجيني المعزول من مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على الفيروسات العدسية (1 ميكروغرام....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم مراقبة الجودة لمكتبة NGS، الذي يتم إجراؤه عادة من قبل مزود التسلسل، بمثابة فحص الجودة القياسي قبل التسلسل. لإثبات تأثير جودة المكتبة ، تمت مقارنة عينتين. تم إعداد المكتبة عالية الجودة ، المسماة s2-20-15 ، باستخدام بروتوكول PCR المتداخل القياسي ، والذي يتكون من خطوتين متتابعتين للتضخيم: الأولى مع 20 دورة ، تليها الثانية مع 15 دورة. في المقابل ، تم إعداد المكتبة منخفضة الجودة ، المسماة s1-30 ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الخطوة مع 30 دورة لدمج محولات Illumina.

كما هو موضح في .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في التحليل الوراثي الأمامي ، يعد المشي في الجينوم أمرا ضروريا لتحديد مواقع التكامل في مكتبات خلايا الطفرات الإدخالية. غالبا ما تتطلب طرق المشي الجينومية الكلاسيكية مثل I-PCR و LAM-PCR هضم إنزيم التقييد وربطه ، مما قد يقلل من تعقيد المكتبة ويؤدي إلى تحيزات بسبب الاعتماد على موقع الإنزيم27،28،29. تتغلب طريقة InSET على هذه القيود عن طريق القضاء على خطوات الهضم والربط المقيدة. إنه يشبه PCR (FLEA-PCR) 37 المرت.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي إفصاح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. مدعوم من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000441) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة فوجيان ، الصين (2023J01130) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية بجامعة Huaqiao (ZQN-924) ، وصناديق البحث العلمي لجامعة Huaqiao (18BS205). P.K. مدعوم من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170619) ، وصندوق الأبحاث لكبار العلماء الدوليين من National Natural مؤسسة العلوم الصينية (32150710525) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة فوجيان ، الصين (2020J02006).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 م EDTAInvitrogenAM9260Gلجعل المخزن المؤقت للربط / الغسيل
1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)Invitrogen15568025لجعل المخزن المؤقت للربط / الغسيل
10 مرات ؛ Klenow Fragment Buffer تاكارا2140A
10 مرات ؛ Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659لصنع ملزمة / غسل عازلة
القندس Beaver Beaver StreptavidinBeaver22307-11 & mu ؛ m
BEDToolsالبرمجيات ، v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMالبرمجيات ، v0.7.12
dNTP خليطTakara40302.5 ملي مولار لكل
من Equalbit dsDNA HS Assay KitVazymeEQ111-02
fastp
Software HiSeq X TenIlluminaمنصة SY-412-1001Illumina ، تم الاستعانة بمصادر خارجية لشركة Novogene Corporation (بكين)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850منصة Illumina ، بالاستعانة بمصادر خارجية لشركة Novogene Corporation (بكين)
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware ، الإصدار 1.1
Taq DNA PolymeraseTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi 30189328لصنع الربط / الغسيل العازلة
UltraPure Water المقطرInvitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapranov, P., et al. Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22. Science. 296 (5569), 916-919 (2002).
  2. Bertone, P., et al. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 306 (5705)....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Lentivirus Integration SitesInsertional MutagenesisFunctional GenomicsForward Genetic ScreenGenome Wide ScreeningNext Generation SequencingFunctional Genomic ElementsPCR AmplificationMagnetic Bead PurificationHuman Genome Analysis

مقالات ذات صلة