مقالة منهجية

تحديد مواقع تكامل الفيروسات العدسية ذات الصلة وظيفيا في مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية

DOI:

10.3791/67552

⸱

يناير 10, 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرات الإدراجية هي أداة أساسية في علم الوراثة الأمامية لتحديد العناصر الجينومية الوظيفية. هنا ، نصف الشاشة المستندة إلى الإدراج للعناصر الوظيفية والنصوص (InSET) ، وهي طريقة للكشف عن مواقع تكامل الفيروسات داخل مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على فيروس العدس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد مدى التسلسلات الوظيفية داخل الجينوم البشري موضوعا محوريا ولكنه مثير للجدل في علم الأحياء. على الرغم من أن الشاشات الجينية العكسية عالية الإنتاجية قد قطعت خطوات كبيرة في استكشاف هذا الأمر ، إلا أنها غالبا ما تحد من نطاقها إلى العناصر الجينومية المعروفة وقد تحدث تأثيرات غير محددة. هذا يؤكد الحاجة الملحة لأدوات الجينوم الوظيفية الجديدة التي تتيح فهما أعمق وغير متحيز لوظائف الجينوم. يقدم هذا البروتوكول الشاشة المستندة إلى الإدراج للعناصر والنصوص الوظيفية (InSET) ، وهي طريقة لتحديد مواقع تكامل الفيروسات داخل مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على فيروس العدس. يسهل InSET التقاط مواقع تكامل الفيروسات العدسية على مستوى الجينوم ، مع تسلسل الجيل التالي المستخدم لاكتشاف وتحديد التسلسلات المرافقة. يتيح تصميم InSET تحليل اختلافات وفرة موقع التكامل في شاشات النمط الظاهري على نطاق واسع ، مما يجعلها أداة قوية لعلم الوراثة المستقبلية ولتحديد العناصر الجينومية الوظيفية. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية ل InSET في قدرتها على الكشف عن العناصر الجينومية غير المحددة سابقا ، بما في ذلك exons الوظيفية الجديدة لكل من الحمض النووي الريبي المشفر للبروتين وغير المشفر ، بغض النظر عن التعليقات التوضيحية السابقة. بشكل عام ، يتمتع InSET بقيمة كبيرة في دراسة التعقيد المعقد للجينوم البشري والنسخ ، حيث تنتظر العديد من العناصر الجينومية التوصيف الوظيفي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظل علم الجينوم الوظيفي مجالا حاسما ومليئا بالتحديات ، حتى في عصر ما بعد الجينوم ، حيث لا يزال جزء كبير من المناطق الجينومية يفتقر إلى التوصيف الوظيفي. يكمن أحد الأسباب الرئيسية لهذه التحديات في الطبيعة المعقدة للجينوم البشري والنسخ ، والتي تتميز بالنسخ المنتشر والتضفير البديل العالمي في كل من مناطق ترميز البروتين وغير المشفرة< sup class = "xref" >1،2،3،4,5. تم تسليط الضوء على هذا التعقيد على نطاق واسع من خلال دراسات التخصيب المستهدفة بالحمض النووي الريبي< sup class = "xref">6,7,8,9. من المسلم به بشكل متزايد أن العديد من العناصر الجينومية الجديدة لا تزال غير مخططة وغير مشروحة وظيفيا < sup class = "xref" >10 ، < sup class = "xref" > 11 ، < sup class = "xref" > 12بالإضافة إلى الأجزاء المشروحة جيدا من الجينوم البشري.

في السنوات الأخيرة ، شوهدت تطورات في أدوات علم الوراثة العكسية ، مثل تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وأنظمة CRISPR / Cas < sup class = "xref" >13,14,15,16,17,18,19,20 ،<فئة sup = "xref">21. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها عيوب ملحوظة ، بما في ذلك التأثيرات غير المحددة والتكاليف المرتفعة المرتبطة بإنشاء مكتبات معقدة من الحمض النووي الريبي القصير (shRNAs) أو RNAs ذات الدليل الفردي (sgRNAs) < sup class = "xref" >22،23،24،25. بالإضافة إلى ذلك ، تركز هذه الأساليب في الغالب على العناصر الجينومية المشروحة. في المقابل ، يتمتع علم الوراثة الأمامي بميزة تحديد العناصر الجينومية الوظيفية الجديدة غير المشروحة. نظرا لتعقيد الجينوم البشري والنسخ ، بالإضافة إلى العدد الهائل من العناصر الجينومية الجديدة ، فإن هذه القدرة على علم الوراثة الأمامية لها أهمية كبيرة.

يتم إنشاء مكتبات خلايا علم الوراثة الأمامية بشكل متكرر من خلال التكامل العشوائي للفيروسات القهقرية ، مما يجعل الكشف الفعال عن مواقع التكامل على مستوى الجينوم أمرا بالغ الأهمية لمقايسة علم الوراثة الأمامية. يتضمن اكتشاف مواقع التكامل هذه عادة أدوات المشي الجينومية< sup class = "xref">26. في حين كانت هناك تطورات كبيرة في هذه الأدوات ، إلا أن القليل منها تم تحسينه لتطبيقات التسلسل من الجيل التالي (NGS) ثم يتم تطبيقه لاحقا في دراسات الطفرات الإدخالية. غالبا ما يستخدم الطفرات الإدراجية في خطوط الخلايا طرقا مثل PCR (I-PCR) العكسي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل بوساطة التضخيم الخطي (LAM-PCR) للكشف عن مواقع التكامل<فئة الدعم = "xref">27،28،29. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق عادة خطوات هضم إنزيم تقييد أو ربط ، والتي يمكن أن تقلل من الكفاءة وتدخل تحيزات في النتائج.

لتعزيز الكشف الفعال عن مواقع التكامل على مستوى الجينوم في شاشات علم الوراثة الأمامية ، تم تقديم طريقة تسمى طريقة الشاشة القائمة على الإدراج للعناصر الوظيفية والنصوص (InSET) هنا. من خلال دمج المشي الجينوم مع NGS ، يتيح InSET تحديد مواقع تكامل الفيروسات عالية الإنتاجية في مكتبات الطفرات الإدخالية القائمة على الفيروسات العدسية. بالمقارنة مع الطرق الحالية27,28,29 ، فإن InSET بسيط وبسيط نسبيا ، مما يلغي خطوات هضم إنزيم التقييد أو الربط ، مما يجعله أكثر ملاءمة ويمكن الوصول إليه. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن شاشة علم الوراثة الأمامية الحالية في خلايا الثدييات تقتصر على عدد قليل جدا من خطوط الخلايا أحادية الصيغة الصبغية أو شبه أحادية الصيغة الصبغية < sup class = "xref" >27 ، < sup class = "xref" > 28 ، < sup class = "xref" > 29 ، < sup class = "xref" >30 ، < sup class = "xref" >31 ، فقد ثبت أن InSET يعمل في خطوط الخلايا اختلال الصيغة الصبغية < sup class = "xref" >32.

توفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لتنفيذ طريقة InSET. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوضح تطبيق InSET في دراسات الطفرات الإدراجية. يعمل InSET كأداة قوية لتحديد exons الجديدة داخل العناصر الجينومية ، بما في ذلك كلا من الحمض النووي الريبي المشفر للبروتين وغير المشفر في خطوط الخلايا البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية على طريقة InSET. للحصول على التغطية المثلى ، قم بإعداد خمس مكتبات متوازية من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني ، ثم قم بتجميعها لتسلسل الجيل التالي. تم إكمال هذا الإجراء بنجاح بشكل مستمر في الاختبارات السابقة ، على الرغم من أنه قد يقوم المستخدمون بإدخال نقاط إيقاف مؤقت بناء على تقديرهم. يمكن العثور على معلومات مفصلة عن الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

< p class = "jove_title" >1. التقاط مواقع تكامل فيروس العدسات في الجينوم

  1. استخدم الحمض النووي الجيني المعزول من مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على الفيروسات العدسية (1 ميكروغرام) ، كما هو موضح في دراسة سابقة < sup class = "xref" >32 ، كقالب لتفاعل PCR خطي في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 1x Taq Buffer ، و 2.5 U Taq DNA Polymerase ، و 4 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 ملي مولار لكل منهما) ، و 0.3 ميكرومتر من التمهيدي البيوتينيل 3-LTR_prime (الجدول 1) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR.
    ملاحظة: الصلبات التمهيدي 3-LTR_prime إلى منطقة LTR لتسلسل الفيروس العدسي. إذا تم تلبيطها إلى 5 'LTR ، فإن الجزء المضخم يتضمن التسلسل الجيني المحيط. إذا تم تلديها إلى 3 'LTR ، فإن الجزء المضخم يحتوي على تسلسل داخلي للفيروس ، والذي لا يمكن محاذاته مع جينوم المضيف ، وبالتالي سيتم تصفيته أثناء تحليل بيانات التسلسل النهائي. يمكن أيضا تعديل هذا التمهيدي للتكيف مع أنواع أخرى من النواقل المستخدمة لإنشاء مكتبة خلايا طفرات إدخالية.
  2. قم بإجراء 50 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل الخطي في جهاز تدوير حراري قياسي PCR ، مع إضافة 2.5 وحدة من Taq DNA Polymerase في البداية ومرة أخرى مباشرة بعد 25 دورة. شروط PCR هي كما يلي: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ 50 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق < / > ملاحظة: للحفاظ على نشاط بوليميراز الحمض النووي Taq أثناء التفاعلات المطولة ، يوصى بإضافة الإنزيم في كل من بداية ومنتصف التفاعل.
  3. انقل منتجات PCR إلى أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 مل.
  4. امزج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل جيدا مع 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي البيوتين والستربتافيدين.
  5. احتضان الخليط لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، ورج عند 400 دورة في الدقيقة في حمام معدني.
    ملاحظة: أخرج الأنبوب ليخلط جيدا مع الماصة كل 15 دقيقة.
  6. استخدم حاملا مغناطيسيا لجمع الخرز ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
  7. اغسل الخرزات ب 300 ميكرولتر من محلول الربط / الغسيل (10 ملي من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 ملي من EDTA ، 1 متر من كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ Tween-20) 6 مرات وتخلص من المادة الطافية.
  8. يغسل ب 300 ميكرولتر (65 درجة مئوية) من الماء المقطر الخالي من DNase / RNase مرتين وتخلص من المادة الطافية.
  9. بالنسبة لتخليق الخيط الثاني ، أعد تعليق الخرزات في حجم تفاعل 24 ميكرولتر يحتوي على 1x Klenow Fragment Buffer ، و 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 ملي مولار لكل منهما) ، و 6.25 ميكرومتر من P5_N6 التمهيدي (الجدول 1) في أنبوب PCR.
    ملاحظة: قم بإعداد محلول مخزون 100 ميكرومتر من P5_N6 التمهيدي. يتكون التمهيدي P5_N6 من تسلسل محول P5 ثابت في نهاية 5 'وتسلسل سداسي عشوائي في نهاية 3'. يمكن أن يرتبط السداسي العشوائي بمجموعة متنوعة من التسلسلات المستهدفة ، مما يجعله مناسبا لتضخيم شظايا الحمض النووي المختلفة التي تم إنشاؤها من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الخطي.
    10. قم
  10. باحتضان الخليط مسبقا عند 15 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز تدوير حراري PCR.
  11. أضف 2 وحدة من جزء Klenow (جزء كبير من بكتريا قولونية DNA بوليميراز).
  12. احتضان المخاليط في جهاز تدوير حراري PCR في الظروف التالية: المنحدر ببطء عند 0.5 درجة مئوية / دقيقة من 15 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية متبوعا ب 30 دقيقة حضانة ؛ ثم المنحدر ببطء عند 0.5 درجة مئوية / دقيقة إلى 37 درجة مئوية متبوعا بحضانة 1 ساعة.
  13. انقل منتجات PCR إلى أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 مل.
  14. استخدم حاملا مغناطيسيا لالتقاط الخرزات ، ثم تخلص من المادة الطافية.
  15. اغسل الخرزات برفق ب 300 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من DNase / RNase 4 °C. اجمع الخرزات وتخلص من المادة الطافية.

2. بناء مكتبة NGS مع تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل

  1. أعد تعليق الخرزات من الخطوة 1.15 في حجم تفاعل PCR سعة 25 ميكرولتر يحتوي على 1x Taq Buffer ، و 1.25 U Taq DNA Polymerase ، و 0.5 ميكرومتر من التمهيدي P5 (الجدول 1) ، و 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 ملي مولار لكل منهما) ، و 0.5 ميكرومتر من التمهيدي 3-LTR_Nest (الجدول 1) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  2. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز التدوير الحراري PCR في ظل الظروف التالية: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 20 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  3. استخدم 5 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من الخطوة 2.2 كقالب للجولة التالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بحجم 50 ميكرولتر يحتوي على 1x Taq Buffer و 2.5 U Taq DNA Polymerase و 4 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 ملي مولار لكل منهما) و 0.4 ميكرومتر من Illumina_P5 التمهيدي (الجدول 1) و 0.4 ميكرومتر من التمهيدي Illumina_P7-3 لتر (الجدول 1).
  4. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز التدوير الحراري PCR في ظل الظروف التالية: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 15 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  5. انقل منتجات PCR إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة ، ويمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية.
  6. قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أحجام 1.2x من حبات الحمض النووي النظيفة ، مما يجعل الحجم النهائي يصل إلى 21 ميكرولتر
    ملاحظة: خذ 10 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من كل مكتبة من المكتبات الخمس المعدة بالتوازي ، ودمجها معا ، وقم بتنقيتها إلى حجم نهائي يبلغ 21 ميكرولتر. يتم تكييف بروتوكول التنقية لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من تعليمات الشركة المصنعة لخرز الحمض النووي النظيف (انظر جدول المواد).
    1. قم بموازنة الخرزات من 2-8 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    2. امزج الخرزات جيدا عن طريق التقليب أو الدوامة.
    3. الماصة 1.2x أحجام من الخرز في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل.
    4. أضف منتجات PCR إلى الخرزات واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    5. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بربط الحمض النووي بالخرز.
    6. ضع العينات على حامل مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية بمجرد أن يصبح المحلول صافيا (حوالي 5 دقائق).
    7. أضف 200 ميكرولتر من 80٪ إيثانول لغسل الخرز ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ، وقم بإزالة المادة الطافية.
      ملاحظة: يجب تحضير الإيثانول بنسبة 80٪ طازجا.
    8. كرر الخطوة 2.6.7 مرة واحدة.
    9. جفف الخرزات بالهواء في درجة حرارة الغرفة مع فتح الغطاء لمدة 5 دقائق.
    10. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي ، وأضف 22 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من DNase / RNase ، واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
    11. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي حتى يصبح المحلول صافيا (حوالي دقيقتين) ، ثم انقل 21 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل.< / > ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة ، ويمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية.
  7. استخدم 1 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقاة لقياس التركيز باستخدام مقياس الفلور مع مجموعة الكشف عن مضان dsDNA المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يتبع بروتوكول قياس التركيز تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة الكشف عن dsDNA.
    1. قم بإعداد مستحضر محلول العمل عن طريق خلط الكاشف والمخزن المؤقت (المتوفرين في المجموعة) بنسبة 1: 200.
    2. قم بإعداد معايير الفحص عن طريق خلط 10 ميكرولتر من المعيار # 1 و 10 ميكرولتر من المعيار # 2 (المتوفرة في المجموعة) ، مع كل منهما 190 ميكرولتر من محلول العمل. دوامة الخليط برفق لمدة 2-3 ثوان.
    3. قم بإعداد عينة الفحص عن طريق خلط 1 ميكرولتر من منتجات PCR المنقاة مع 190 ميكرولتر من محلول العمل. دوامة الخليط برفق لمدة 2-3 ثوان.
    4. احتضان معايير الفحص وعينات الفحص لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، مع إبقائها محمية من الضوء.
    5. قم بتشغيل مقياس الفلور.
    6. حدد برنامج dsDNA High Sensitivity من القائمة الرئيسية.
    7. للمعايرة، أدخل المعيار #1 في الجهاز، واضغط على الزر قراءة القياسي لقياس المعيار الأول، ثم أدخل المعيار #2 واضغط على الزر قراءة القياسي لقياس المعيار الثاني.
    8. لقياس العينة، اضغط على زر تشغيل العينات للانتقال إلى صفحة قياس العينة. أدخل كل أنبوب يحتوي على عينة الفحص ، واضغط على زر الأنبوب للقراءة للحصول على التركيز.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة ، ويمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية.
  8. قم بتنفيذ NGS على منصات Illumina باستخدام استراتيجية 150 نقطة أساس (PE150) المقترنة على مقياس 30 جيجا بايت (GB).
    ملاحظة: عادة ما يتم الاستعانة بمصادر خارجية لهذه الخطوة لشركات التسلسل.
< p class = "jove_title" >3. تحليل البيانات

ملاحظة: تم استخدام التحليل في خطوط الخلايا البشرية كمثال في هذا القسم.

  1. رسم خرائط مواقع تكامل الفيروسات
    1. قم بتصفية قراءات التسلسل بأكثر من 50٪ من القواعد منخفضة الجودة (درجة Phred <20) ، أو أكثر من 15 قاعدة "N" ، أو أقصر من 150 قاعدة باستخدام أداة fastp < sup class = "xref" >33 (انظر جدول المواد).
    2. حدد فقط القراءات المقترنة مع قراءة 2 التي تبدأ بعلامة LTR "GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG
      ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      ملاحظة: يعتمد هذا التسلسل على تسلسل المتجه المستخدم لإنشاء مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية.
    3. قم بقص تسلسل علامة LTR من القراءات المحددة من الخطوة 3.1.2.
    4. قم بمحاذاة القراءات المقتطعة مع GRCh37/hg19 باستخدام BWA-MEM 34 (انظر جدول المواد) مع الإعدادات الافتراضية.
    5. احتفظ فقط بأزواج القراءة التي يتم فيها تعيين كل من قراءة 1 وقراءة 2 بشكل فريد إلى الجينوم مع التكوين والتباعد الصحيحين ، المشار إليهما بواسطة FLAG 147 و FLAG 163.
    6. حدد موضع الإدراج كأول قاعدة محاذاة للقراءة المقتطعة 2.
    7. قم بتطبيع عدد القراءات في كل موقع إدراج فريد إلى العدد الإجمالي للقراءات المحاذاة بشكل فريد في كل عينة.
  2. تحديد الإدخالات التي تؤثر على اللياقة الخلوية (IACFs)
    ملاحظة: في التحليل الإحصائي ، ينصح بإجراء مقارنات زوجية بين التكرارات البيولوجية الثلاثة لكل من العينات الضابطة والمعالجة لتحديد المواضع المخصبة أو المستنفدة بشكل كبير. عدد التكرارات المذكورة أعلاه ضئيل. يوصى باستخدام أكبر عدد ممكن من التكرارات عمليا لضمان موثوقية ودقة النتائج.
    1. قم بتحويل عدد القراءة الطبيعي لكل موضع إلى سجل10 قيم.
    2. قم بتعيين قيم السجل10 للمواضع مع قراءات صفرية على أنها -5.
    3. قم بإجراء اختبار t للطالب المقترن على الوجهين على قيم السجل10.
    4. اضبط القيم p لمقارنات متعددة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg داخل بيئة R.
    5. حدد المراكز ذات عتبة معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) البالغة 25٪ كقيم IACFs.
  3. تحديد المجموعات التي تؤثر على اللياقة الخلوية (CACFs)
    ملاحظة: تمت التوصية بثلاث مكررات بيولوجية من العينات الضابطة والمعالجة لهذا التحليل.
    1. تحديد مجموعات الإدراج المخصبة أو المستنفدة بشكل كبير بين العينات الضابطة والمعالجة باستخدام SICER35 (انظر جدول المواد) مع عتبة FDR تبلغ 1٪. الأمر الخاص بتحليل SICER هو "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      ملاحظة: معاني المعلمات في الأمر أعلاه هي كما يلي: ["InputDir"] ["ملف سرير مواقع إدراج العينة المعالجة"] ["ملف سرير مواقع إدراج عينة التحكم"] ["OutputDir"] ["الأنواع"] ["عتبة التكرار"] ["حجم النافذة (bp)"] ["حجم الجزء"] ["جزء الجينوم الفعال"] ["حجم الفجوة (bp)"] ["القيمة الإلكترونية"].
    2. احصل على مناطق عنقودية مشتركة بين اثنين من النسخ المتماثلة البيولوجية على الأقل مع وظيفة "التقاطع" لمجموعة BEDTools < sup class = "xref" >36 (انظر جدول المواد) والإشارة إلى مناطق الكتلة هذه على أنها CACFs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم مراقبة الجودة لمكتبة NGS، الذي يتم إجراؤه عادة من قبل مزود التسلسل، بمثابة فحص الجودة القياسي قبل التسلسل. لإثبات تأثير جودة المكتبة ، تمت مقارنة عينتين. تم إعداد المكتبة عالية الجودة ، المسماة s2-20-15 ، باستخدام بروتوكول PCR المتداخل القياسي ، والذي يتكون من خطوتين متتابعتين للتضخيم: الأولى مع 20 دورة ، تليها الثانية مع 15 دورة. في المقابل ، تم إعداد المكتبة منخفضة الجودة ، المسماة s1-30 ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الخطوة مع 30 دورة لدمج محولات Illumina.

كما هو موضح في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في التحليل الوراثي الأمامي ، يعد المشي في الجينوم أمرا ضروريا لتحديد مواقع التكامل في مكتبات خلايا الطفرات الإدخالية. غالبا ما تتطلب طرق المشي الجينومية الكلاسيكية مثل I-PCR و LAM-PCR هضم إنزيم التقييد وربطه ، مما قد يقلل من تعقيد المكتبة ويؤدي إلى تحيزات بسبب الاعتماد على موقع الإنزيم27،28،29. تتغلب طريقة InSET على هذه القيود عن طريق القضاء على خطوات الهضم والربط المقيدة. إنه يشبه PCR (FLEA-PCR) 37 المرت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي إفصاح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. مدعوم من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000441) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة فوجيان ، الصين (2023J01130) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية بجامعة Huaqiao (ZQN-924) ، وصناديق البحث العلمي لجامعة Huaqiao (18BS205). P.K. مدعوم من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170619) ، وصندوق الأبحاث لكبار العلماء الدوليين من National Natural مؤسسة العلوم الصينية (32150710525) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة فوجيان ، الصين (2020J02006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 م EDTAInvitrogenAM9260Gلجعل المخزن المؤقت للربط / الغسيل
1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)Invitrogen15568025لجعل المخزن المؤقت للربط / الغسيل
10 مرات ؛ Klenow Fragment Buffer تاكارا2140A
10 مرات ؛ Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659لصنع ملزمة / غسل عازلة
القندس Beaver Beaver StreptavidinBeaver22307-11 & mu ؛ m
BEDToolsالبرمجيات ، v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMالبرمجيات ، v0.7.12
dNTP خليطTakara40302.5 ملي مولار لكل
من Equalbit dsDNA HS Assay KitVazymeEQ111-02
fastp
Software HiSeq X TenIlluminaمنصة SY-412-1001Illumina ، تم الاستعانة بمصادر خارجية لشركة Novogene Corporation (بكين)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850منصة Illumina ، بالاستعانة بمصادر خارجية لشركة Novogene Corporation (بكين)
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware ، الإصدار 1.1
Taq DNA PolymeraseTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi 30189328لصنع الربط / الغسيل العازلة
UltraPure Water المقطرInvitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapranov, P., et al. Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22. Science. 296 (5569), 916-919 (2002).
  2. Bertone, P., et al. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).
  3. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  4. Kapranov, P., et al. The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA. BMC Biol. 8, 149(2010).
  5. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  6. Kapranov, P., et al. Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays. Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).
  7. Denoeud, F., et al. Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions. Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).
  8. Mercer, T. R., et al. Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome. Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).
  9. Deveson, I. W., et al. Universal alternative splicing of non-coding exons. Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).
  10. Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques. Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).
  11. Amaral, P., et al. The status of the human gene catalogue. Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).
  12. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  13. Bassik, M. C., et al. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  14. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  15. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  16. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells. Science. 355, 6320(2017).
  17. Bester, A. C., et al. An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance. Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).
  18. Liu, Y., et al. Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites. Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).
  19. Xu, D., et al. A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response. Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).
  20. Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth. Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).
  21. Recinos, Y., et al. CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements. Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).
  22. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  23. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).
  24. Stojic, L., et al. Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis. Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).
  25. Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward. Genome Biol. 21 (1), 93(2020).
  26. Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. Genome walking in eukaryotes. FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).
  27. Carette, J. E., et al. Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens. Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).
  28. Carette, J. E., et al. Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing. Nat Biotechnol. 29 (6), 542-546 (2011).
  29. Burckstummer, T., et al. A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells. Nat Methods. 10 (10), 965-971 (2013).
  30. Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter niemann-pick c1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
  31. Cao, J. Y., et al. A genome-wide haploid genetic screen identifies regulators of glutathione abundance and ferroptosis sensitivity. Cell Rep. 26 (6), 1544-1556.e8 (2019).
  32. Xu, D., et al. Evidence for widespread existence of functional novel and non-canonical human transcripts. BMC Biol. 21 (1), 271(2023).
  33. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  34. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. arXiv preprint arXiv:1303.3997. , (2013).
  35. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification chip-seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  36. Quinlan, A. R., Hall, I. M. Bedtools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  37. Pule, M. A., et al. Flanking-sequence exponential anchored-polymerase chain reaction amplification: A sensitive and highly specific method for detecting retroviral integrant-host-junction sequences. Cytotherapy. 10 (5), 526-539 (2008).
  38. Demeulemeester, J., De Rijck, J., Gijsbers, R., Debyser, Z. Retroviral integration: Site matters: Mechanisms and consequences of retroviral integration site selection. Bioessays. 37 (11), 1202-1214 (2015).
  39. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42 (16), 10209-10225 (2014).
  40. Ambrosi, A., et al. Estimated comparative integration hotspots identify different behaviors of retroviral gene transfer vectors. PLoS Comput Biol. 7 (12), e1002292(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Lentivirus Integration SitesInsertional MutagenesisFunctional GenomicsForward Genetic ScreenGenome Wide ScreeningNext Generation SequencingFunctional Genomic ElementsPCR AmplificationMagnetic Bead PurificationHuman Genome Analysis

مقالات ذات صلة