Method Article

إنشاء ومقارنة طرق الكشف عن نشاط T6SS القائمة على التألق في Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/67772

⸱

June 20th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقترح طريقة الكشف الكمي القائمة على وضع العلامات الفلورية (خاصة لوسيفيراز) لتقييم نشاط T6SS البكتيري بكفاءة ودقة ، وهو مناسب للتحليل عالي الإنتاجية للسلالات السريرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نظام الإفراز من النوع السادس (T6SS) آلية حاسمة تتوسط التفاعلات بين الخلايا في البكتيريا سالبة الجرام ، لا سيما في الأنواع المسببة للأمراض مثل Acinetobacter baumannii. أظهرت الدراسات السابقة أن البلازميد الكبير pAB3 في سلالة A. baumannii ATCC 17978 يشفر بروتينا شبيها ب TetR يمنع التعبير عن جينات T6SS الأساسية. في المقابل ، يمكن لسلالة WTR ، التي تفتقر إلى pAB3 ، أن تعبر بثبات عن بروتين المستجيب T6SS Hcp وتظهر القدرة على قتل الإشريكية القولونية. الجين tssM ، أحد الجينات الأساسية ل T6SS ، ضروري لنشاطه. يؤدي حذفه مباشرة إلى تعطيل T6SS. ومع ذلك ، فإن طرق الكشف عن نشاط T6SS التقليدية ، مثل فحوصات القتل ، تعاني من إنتاجية منخفضة وحساسية غير كافية. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير طرق الكشف الكمي بناء على الملصقات الفلورية.

لتحسين اكتشاف نشاط T6SS ، قمنا بتطوير ثلاث طرق لوضع العلامات على الفلورسنت: (1) طريقة الكشف الكمي تعتمد على وضع العلامات على لوسيفيراز ، والتي تتميز بالخصوصية العالية والحساسية والاستنساخ ، مما يجعلها مناسبة للتحليل عالي الإنتاجية. (2) طريقة كشف تستند إلى توسيم البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، والتي ، على الرغم من كونها عرضة للتداخل البيئي ، توفر ميزة الإنتاجية العالية ؛ (3) الكشف عن قياس التدفق الخلوي ، والذي يمكنه تقييم صلاحية البكتيريا كميا ولكنه معقد ومكلف من الناحية التشغيلية. بعد مقارنة شاملة ، أثبتت طريقة وضع العلامات المستندة إلى Luciferase أنها الأكثر دقة وحساسية وسهولة في الاستخدام. عند تطبيقها على 20 عزلة سريرية من A. baumannii ، تم تأكيد هذه الطريقة لتقييم نشاط T6SS بسرعة ودقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نظام إفراز النوع السادس (T6SS) نظاما مهما لإفراز البروتين في البكتيريا سالبة الجرام ، ويشارك على نطاق واسع في المنافسة البكتيرية ، والعداء ضد المضيفين حقيقيات النواة ، وتنظيم الاستجابات المناعية للمضيف1،2. عن طريق حقن بروتينات المستجيب السامة في البكتيريا المجاورة أو الخلايا حقيقية النواة ، يساعد T6SS البكتيريا في الحفاظ على ميزة تنافسية في البيئات المعقدة. في السنوات الأخيرة ، أدى الدور المهم ل T6SS في القدرة على التكيف البكتيري والإمراضية والتفاعلات الميكروبية إلى جعله نقطة ساخنة للبحث ، خاصة في مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة ، حيث توفر وظائفه أهدافا محتملة لتطوير استراتيجيات جديدة مضادة للبكتيريا3،4،5.

Acinetobacter baumannii (Ab) هو عامل ممرض انتهازي سالب الجرام موزع على نطاق واسع في المستشفيات. نظرا لمقاومته العالية للأدوية وقدرته القوية على التكيف ، فقد أصبح مسببا مهما في المستشفيات في جميع أنحاء العالم6،7،8. يعتمد بقاء A. baumannii في البيئات الميكروبية المعقدة على أنظمة إفراز متعددة ، من بينها T6SS يلعب دورا رئيسيا في منافسته مع الميكروبات الأخرى والتفاعلات مع المضيف. بفضل مجموعة الجينات T6SS المحفوظة للغاية والوظائف المحددة جيدا ، أصبح A. baumannii نموذجا مثاليا لدراسة آليات T6SS. علاوة على ذلك ، فإن الهيكل الفريد ل T6SS في A. baumannii يوفر منظورا مميزا لمزيد من الكشف عن تنوع ووظائف T6SS.

تحتوي مجموعة الجينات T6SS ل A. baumannii على 12 جينا بروتينا أساسيا (مثل tssA-tssM ، التي تفتقر إلى tssJ) والعديد من الجينات ذات الوظائف غير المعروفة (مثل tagX و tagN و tagF وما إلى ذلك)2،9،10. من بينها ، يعد البروتين المنظم المشترك للهيموليسين (Hcp) مكونا مهما في T6SS ، ويعتبر إفرازه سمة مميزة ل T6SS الوظيفي. أظهرت الدراسات أن البلازميد الكبير pAB3 في A. baumannii يثبط تعبير T6SS عن طريق ترميز بروتين تنظيمي يشبه TetR. في المقابل ، يمكن للسلالات التي فقدت pAB3 (مثل WTR-) أن تعبر بثبات عن Hcp وتفرزها ، مما يدل على نشاط T6SS كبير11. الجين tssM هو أحد الجينات الأساسية ل T6SS ، ويؤدي حذفه مباشرة إلى تعطيل T6SS.

ومع ذلك ، فإن طرق الكشف عن نشاط T6SS التقليدية (مثل فحوصات القتل) لها قيود مثل الإنتاجية المنخفضة ، وضعف قابلية التكرار ، والحساسية غير الكافية ، مما يحد بشدة من الدراسة المتعمقة والتطبيق الواسع النطاق ل T6SS5. لذلك ، أصبح تطوير طرق الكشف عن نشاط T6SS الفعالة والدقيقة حاجة ملحة في البحث الحالي. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء ومقارنة طرق الكشف عن نشاط T6SS بناء على وضع العلامات الفلورية للتغلب على أوجه القصور في الطرق التقليدية. من خلال تقنية وضع العلامات الفلورية ، حققنا مراقبة كمية في الوقت الفعلي لنشاط T6SS ، مما يوفر أداة أكثر دقة وموثوقية لدراسة التفاعلات البكتيرية. وقد أثبتت هذه الدراسة فعالية طرق وضع العلامات على الفلورسنت، ومن خلال مقارنة مزايا وعيوب استراتيجيات وضع العلامات الفلورية المختلفة، قدمت وجهات نظر جديدة ودعما منهجيا للبحوث المستقبلية. إنه لا يوفر وسائل تقنية جديدة لأبحاث T6SS فحسب ، بل يضع أيضا أساسا علميا لفهم الآليات المعقدة للتفاعلات البكتيرية وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة مضادة للبكتيريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. مصادر السلالات والبلازميدات

  1. استخدم السلالة القياسية A. baumannii ATCC 17978 ، الإشريكية القولونية (pZY01) ، والسلالة السريرية ل A. baumannii المعزولة من قسم الطب المخبري في المستشفى الأول بجامعة جيلين.
  2. استخدم البلازميد pZY01-GFP (الذي يحمل جين مقاومة الكاناميسين ، القادر على التعبير المستقر في A. baumannii) ، والذي تم تعديله وحفظه في المختبر ، والبلازميد pGEN-luxCDABE الذي تم شراؤه تجاريا (يحمل جين مقاومة الأمبيسيلين).
  3. استزراع A. baumannii و E. coli في وسط Luria-Bertani (LB) أو وسط بسيط يحتوي على: 50 ملي مولار من فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 15 ملي مولار (NH4) 2SO4 ، 2 ملي مولار MgSO4 ، 0.2٪ (وزن / حجم) سكسينات الصوديوم كمصدر وحيد للكربون ، و 0.01٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة12. إضافة مضادات حيوية بالتركيزات التالية عند الضرورة: الإشريكية القولونية: الأمبيسلين (100 ميكروغرام/مل) والكاناميسين (50 ميكروغرام/مل)؛ A. baumannii: الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل).
    ملاحظة: الإشريكية القولونية (pZY01) والإشريكية القولونية (pZY01-GFP) تعبر عن مقاومة الكاناميسين. لا يحتوي الإشريكية القولونية (pZY01) على علامة فلورية لذا يمكن الإشارة إليها باسم الإشريكية القولونية في النص التالي.

2. تحضير السلالات البكتيرية قبل التجربة

  1. استرجع السلالات البكتيرية من الفريزر -80 درجة مئوية قبل يومين من التجربة. تلقيح السلالات البكتيرية على ألواح أجار LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المقابلة. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تأكد من أن جميع الخلايا تحتفظ بالبلازميدات في بداية التجربة.
  2. اختر مستعمرتين مفردتين مستقلتين من كل سلالة بكتيرية قبل يوم واحد من التجربة. تلقيح كل مستعمرة على حدة في أنبوبين فرديين يحتويان على 5 مل من الوسط السائل LB. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. استخدم هذه الثقافات للتجارب اللاحقة.
    ملاحظة: قم بتحسين وقت الحضانة بناء على معدل نمو البكتيريا لضمان الحصول على كمية كافية من الكتلة الحيوية البكتيرية.

3. تحضير الإشريكية القولونية (GFP) / الإشريكية القولونية (لوسيفيراز) سلالات

  1. التحول
    1. أضف 50 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد (pZY01-GFP أو pGEN-luxCDABE ، القياس الكمي عبر NanoDrop في A260 / A280) إلى 100 ميكرولتر من بكتريا قولونية DH5α الخلايا المختصة ، على التوالي ، واخلطها برفق.
    2. احتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة ، وصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، ثم ضعه على الفور على الجليد لمدة 30 ثانية.
    3. أضف 700 ميكرولتر من مرق LB الخالي من المضادات الحيوية واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع رج عند 180 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.
  2. الطلاء والثقافة
    1. جهاز الطرد المركزي عند 420 × جم لمدة دقيقتين ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من مرق LB الخالي من المضادات الحيوية.
    2. انشر منتج التحويل pZY01 (GFP) على ألواح أجار LB التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين.
    3. انشر منتج التحويل pGEN-luxCDABE على ألواح أجار LB التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. التحقق من المستنسخة الإيجابية
    1. اختر مستعمرات مفردة واستخرج الحمض النووي كقوالب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في اليوم التالي. قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل والتحقق من الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
    2. تأكد من السلالات الإيجابية وقم بتصنيفها على أنها الإشريكية القولونية (GFP) والإشريكية القولونية (لوسيفيراز).
      ملاحظة: تأكد من أن جودة الخلايا المختصة عالية للتحويل الفعال. تجنب السوائل البكتيرية الزائدة أثناء الطلاء لمنع التداخل مع عزل مستعمرة واحدة.

4. النشاف الغربي

  1. تحضير العينة
    1. اجمع الثقافات البكتيرية وأجهزة الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية) لفصل حبيبات الخلية عن المادة الطافية.
    2. أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت للتحميل إلى كل من حبيبات الخلية والمادة الطافية. يغلي على حرارة 100 درجة مئوية في حمام معدني لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي (1500 [غ], 10 دقائق , 4 [ك]) وجمع الطافية كبروتين عينات.
    3. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام حمض البيسينكونينيك (BCA) أو طريقة برادفورد واضبطه على نفس التركيز.
  2. الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE)
    1. تحضير المواد الهلامية SDS-PAGE بتركيزات مناسبة (على سبيل المثال ، جل فصل 12٪ ، جل تكديس 5٪)13.
    2. قم بتحميل 20 ميكروغرام من عينات البروتين في آبار الهلام جنبا إلى جنب مع علامة بروتين ملطخة مسبقا 1-2 ميكرولتر. قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 100-120 فولت حتى يصل المؤشر الأزرق البروموفينول إلى قاع الجل.
      ملاحظة: المخزن المؤقت للتشغيل: Tris 25 ملم ، جلايسين 192 ملي ، SDS 0.1٪ (وزن / حجم) ، ماء مقطر إلى 1 لتر.
  3. نقل (الحاف الغربي)
    1. قم بإزالة الجل من الألواح الزجاجية وانقعه في مخزن مؤقت للنقل. قم بإعداد غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) أو نيترو السليلوز (NC) ، وتنشيط غشاء PVDF بالميثانول ، ثم نقعه في مخزن مؤقت للنقل.
      ملاحظة: المخزن المؤقت للنقل: 25 ملي تريس ، 192 ملي جلايسين ، 20٪ ميثانول
    2. قم بتجميع جهاز النقل في هيكل "شطيرة" (ورق ترشيح - هلام - غشاء - ورق ترشيح). نقل عند 100 فولت لمدة 60-90 دقيقة (ضبط الوقت بناء على الوزن الجزيئي للبروتين ؛ يبلغ الوزن الجزيئي لبروتينات الخلية المضيفة (HCP) حوالي 17 كيلو دالتون).
      ملاحظة: ضع خزان النقل في الماء المثلج وأضف كمادات الثلج للحفاظ على درجة حرارة منخفضة. إذا كان وقت النقل طويلا ، فاستبدل أكياس الثلج في منتصف الطريق.
  4. حظر
    1. بعد النقل ، ضع الغشاء في محلول مانع للحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪. قم بكتلة في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  5. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن (TBS) يحتوي على محلول ملحي 0.1٪ Tween 20 (TBST) ، 5 دقائق في كل مرة. احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية المخففة (الجسم المضاد للفأر المضاد ل HCP ، تخفيف 1: 1000 ؛ الجسم المضاد لنازعة هيدروجين الأنباء (ICDH) ، 1: 1000 تخفيف) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو RT لمدة ساعتين.
  6. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. اغسل الغشاء بمخزن TBST المؤقت 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما. احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مخفف (بيروكسيداز الفجل الحار [HRP] المترافق المضاد للفأر IgG ، تخفيف 1: 3000) في RT لمدة 2 ساعة.
  7. الكشف
    1. اغسل الغشاء بمخزن TBST المؤقت 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما. قم بإعداد الركيزة الكيميائية ECL وتطبيقها بالتساوي على الغشاء.
    2. اكتشف الإشارات باستخدام نظام التصوير الكيميائي والتقاط الصور (بروتين HCP له وزن جزيئي يبلغ حوالي 17 كيلو دالتون ، ICDH هو إنزيم استقلابي سيتوبلازمي بوزن جزيئي متوقع يبلغ حوالي 45 كيلو دالتون في A. baumannii).
      ملاحظة: ICDH هو علامة مهمة لمراقبة الجودة لا يمكن اكتشافها إلا في جزء الحبيبات الخلية (الذي يحتوي على بكتيريا سليمة) وليس في الجزء الطافي (الذي يحتوي على بروتينات مفرزة) ، مما يدل على عدم حدوث أي تحلل للخلية أثناء تحضير العينة. يجب أن يكون إفراز Hcp (17 kDa) مرئيا فقط في المواد الطافية من السلالات النشطة T6SS.

5. تحضير ألواح 96 بئر مع وسط LB أجار

  1. أضف بسرعة وسط LB أجار الخالي من المضادات الحيوية المعقمة ، الدافئ مسبقا ، في طبق معقم مكون من 96 بئرا ، 50 ميكرولتر لكل بئر. اسمح للوحة بالجلوس عند RT لمدة 1 ساعة على الأقل لضمان التصلب الكامل للوسط.
  2. استخدم الألواح ذات الجدران السوداء ذات القاع الشفاف للكشف عن مضان GFP.
  3. استخدم ألواح 96 بئرا مقاومة للضوء للكشف عن مضان لوسيفيراز لتجنب تداخل التألق عبر البئر.
    ملاحظة: تجنب توليد الفقاعات عند إضافة الوسط لضمان سمك هلام موحد ، مما يعزز التلامس والنمو الأمثل للبكتيريا.

6. اختبار القتل A. baumannii

  1. اختبار القتل القياسي
    1. ثقافة WTR- و ΔtssM سلالات متحولة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز في وسط LB مكمل ب 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، تنمو الإشريكية القولونية بشكل منفصل في وسط LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين في ظل ظروف متطابقة.
    2. اغسل المزارع البكتيرية مرتين باستخدام PBS المعقم وأعد تعليقها في وسط LB طازج خال من المضادات الحيوية. اضبط OD600 إلى 1.0 للتوحيد القياسي.
    3. امزج سلالات WTR- و ΔtssM الطافرة مع بكتريا قولونية بنسبة 1: 1.
    4. ضع 10 ميكرولتر من المعلق البكتيري المختلط على ألواح أجار LB الخالية من المضادات الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
    5. اكشط البقع البكتيرية وأعد تعليقها في 1 مل من PBS. قم بإجراء خمس عمليات تخفيف تسلسلية 10 أضعاف.
    6. ضع 10 ميكرولتر من المعلقات البكتيرية المخففة على ألواح LB التي تحتوي على الكاناميسين واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    7. تحليل النشاط المضاد للبكتيريا المعتمد على T6SS للسلالات الطافرة WTR- و ΔtssM عن طريق عد المستعمرات.
      ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل للمعلقات البكتيرية لتجنب الأخطاء التجريبية. قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة مستقلة على الأقل لكل عينة لضمان موثوقية البيانات.
  2. الكشف الكمي عن نشاط T6SS باستخدام وضع العلامات على اللوسيفيراز
    1. توحيد OD600 من بكتريا قولونية (لوسيفيراز) ، WTR- ، طفرات ΔtssM ، وسلالات أخرى (على سبيل المثال ، ATCC 17978 ، الإشريكية القولونية ، Ab # 40 ، Ab # 170 ، Ab # 180) إلى 1.0. أضف 5 ميكرولتر من المعلق البكتيري إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على أجار LB الخالي من المضادات الحيوية. بعد التجفيف بالهواء في الظلام ، قم بقياس التلألؤ البيولوجي القائم على اللوسيفيراز للتحقق من خصوصية اللمعان للإشريكية القولونية (لوسيفيراز).
    2. إجراء تخفيف تسلسلي لمدة 5 أضعاف من الإشريكية القولونية (لوسيفيراز). ضع 10 ميكرولتر من المعلق البكتيري المخفف على صفيحة سعة 96 بئرا مع LB أجار وصفيحة فارغة من 96 بئرا (كلاهما مقاوم للضوء). قياس التلألؤ البيولوجي القائم على اللوسيفيراز لتقييم حساسية طريقة الكشف القائمة على اللوسيفيراز وتأكيد ما إذا كان أجار LB يتداخل مع إشارة التلألؤ.
    3. امزج الإشريكية القولونية (لوسيفيراز) مع طفرات WTR- و ΔtssM و 20 سلالة سريرية (OD600 موحدة إلى 1.0) بنسبة 1: 1. قم بتخفيف 10 أضعاف ، وأضف 5 ميكرولتر إلى لوحة 96 بئرا ، وقم بإعداد ثلاث نسخ مكررة تقنية.
    4. بعد تجفيف الهواء في الظلام ، قم بقياس التلألؤ البيولوجي. احتضن عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 4-6 ساعات ، ثم قم بقياس التلألؤ البيولوجي مرة أخرى (الطول الموجي للانبعاث: 562 نانومتر).
    5. قم بتقييم النشاط المضاد للبكتيريا المعتمد على T6SS كميا من خلال مقارنة قيم التلألؤ البيولوجي قبل وبعد الزراعة المشتركة.
      ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل للمعلقات البكتيرية لتجنب الأخطاء التجريبية. قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة مستقلة على الأقل لكل عينة لضمان موثوقية البيانات. استخدم اختبار t الخاص بالطالب للتحليل الإحصائي.
  3. الكشف عن نشاط T6SS باستخدام وضع العلامات على GFP
    1. اتبع نفس الإجراء مثل تجربة وضع العلامات على لوسيفيراز (الطول الموجي للإثارة: 480 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 509 نانومتر).
    2. امزج بكتريا قولونية (GFP) مع طفرات WTR- و ΔtssM (OD600 موحدة إلى 1.0) بنسبة 1: 1. ضع 10 ميكرولتر على ألواح LB أجار الخالية من المضادات الحيوية. بعد تجفيف الهواء في RT ، التقط الصور باستخدام قناة مضان GFP (برنامج Alex488 ، الإثارة: 488 نانومتر ، الانبعاث: 509 نانومتر) لنظام تصوير متعدد الوظائف.
    3. احتضن عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 4-6 ساعات ، ثم التقط الصور مرة أخرى. تقييم نشاط T6SS بناء على التغيرات في شدة مضان البقع البكتيرية.
      ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات في الظلام لتجنب التداخل مع إشارات الفلورة. تأكد من الخلط الشامل للمعلقات البكتيرية لتجنب الأخطاء التجريبية. قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة مستقلة على الأقل لكل عينة لضمان موثوقية البيانات.
  4. كشف قياس التدفق الخلوي
    1. امزج WTR- مع بكتريا قولونية (GFP) و ΔtssM الطفرات مع بكتريا قولونية (GFP) بنسبة 1: 1. خذ كمية مناسبة من المعلق البكتيري المختلط وقم بتخفيفه إلى تركيز مناسب (عادة OD600 من 0.1-0.5) باستخدام PBS معقم أو 1× عازلة.
      ملاحظة: يشير المخزن المؤقت 1× إلى Flow Cytomettry Staining Buffer (1×) ، وتشمل المكونات: 1× PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي مولار Na2HPO4 ، 1.8 ملي هيلو سمبير2PO4 ، درجة الحموضة 7.4) ، مكملة ب: 2-5٪ (حجم / حجم) FBS معطل بالحرارة (أو 1٪ BSA كبديل) ، 2 ملي مولار EDTA.
    2. جهاز الطرد المركزي المعلق البكتيري المختلط المخفف عند 300 × جم لمدة دقيقتين وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS المعقم أو 1× عازلة واخلطها برفق. قم بتصفية المحلول المعلق من خلال مصفاة خلية 35 ميكرومتر لإزالة الركام وضمان تعليق أحادي الخلية.
    3. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي ، وقم بتسخين الليزر مسبقا ، ومعايرة الجهاز.
      1. اضبط معلمات الكشف: استخدم ليزر 488 نانومتر لإثارة GFP. قناة الكشف: FL1 (عادة مرشح 530/30 نانومتر للكشف عن مضان GFP). قم بتعيين معلمات التشتت الأمامي (FSC) والمبعثر الجانبي (SSC) لتمييز الخلايا البكتيرية.
      2. استخدم الإشريكية القولونية غير المسماة كعنصر تحكم سلبي ، واضبط الجهد والكسب ، وتأكد من أن السكان سالبين GFP في خط الأساس لإشارة التألق.
    4. امزج العينة المفلترة برفق وانقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي.
      1. قم بتحليل العينات باستخدام إعدادات الجهاز التالية: اضبط عتبة FSC-H عند 19,000 لاستبعاد الحطام ، بقيم كسب 100 (FSC) و 110 (SSC) و 80 (FITC).
      2. بالنسبة للبوابات ، استبعاد في البداية الحطام والإشارات غير المستهدفة في مخطط الانتثار FSC-A مقابل SSC-A ، متبوعا بتحليل السكان في قناة FITC. الحصول على ما لا يقل عن 10,000 حدث من السكان المستهدفين (محددين بخصائص FSC/SSC) لكل عينة.
    5. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال ، FlowJo و BD FACSDiva).
      1. مؤامرة FSC مقابل مخططات مبعثرة SSC لبوابة مجموعة البكتيريا المستهدفة. ارسم الرسوم البيانية الفلورية FL1 للتمييز بين المجموعات السكانية الإيجابية للبرنامج التمثيلي العمومي والسلبي ل GFP.
      2. احسب النسبة المئوية للخلايا الموجبة ل GFP ومتوسط شدة التألق (MFI).
    6. جهاز الطرد المركزي للتعليق البكتيري المختلط المتبقي عند 300 جم لمدة دقيقتين وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من الماء المعقم ووضعها على ألواح LB أجار الخالية من المضادات الحيوية.
    7. احتضن عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 5 ساعات ، ثم اكشط البقع البكتيرية وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من 1× PBS. خذ 100 ميكرولتر من المحلول المعلق ، وقم بتخفيفه بشكل مناسب ، وقم بإجراء الكشف عن قياس التدفق الخلوي ، وكرر الخطوات 6.4.4-6.4.5.
    8. قارن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP وشدة التألق قبل وبعد الزراعة المشتركة. تقييم تأثير قتل طفرات WTR- و ΔtssM على بكتريا قولونية (GFP).
      ملاحظة: تأكد من وجود تعليق أحادي الخلية لتجنب تراكم الخلايا الذي يؤثر على نتائج الكشف. قم بمعايرة الجهاز قبل الكشف لضمان دقة وقابلية تكرار إشارات التألق. تجنب تعريض العينات للضوء القوي أثناء التجربة لمنع تبريد مضان GFP. قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة على الأقل لكل عينة لضمان موثوقية البيانات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما تتضمن الطرق التقليدية للكشف عن نشاط T6SS الزراعة المشتركة للحيوانات المفترسة والسلالات المستهدفة على ألواح أجار LB الخالية من المضادات الحيوية لمدة 5 ساعات ، متبوعة بكشط البقع البكتيرية وإعادة تعليقها وإجراء التخفيفات التسلسلية. ثم يتم رصد المعلق البكتيري المخفف على ألواح أجار انتقائية. من خلال حساب مستعمرات السلالة المستهدفة على الصفائح في اليوم التالي ، يمكن تقييم نشاط T6SS نوعيا. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود ، بما في ذلك الإجراءات المرهقة ، والاعتماد على العد اليدوي للمستعمرات ، وصعوبة التحليل الكمي. لمع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام الإفراز من النوع السادس (T6SS) عبارة عن آلية معقدة متعددة البروتينات تتحقق وظائفها بشكل أساسي من خلال إفراز البروتينات المستجيبة. تتوسط هذه البروتينات المستجيبة المنافسة بين البكتيريا عن طريق قتل أو تثبيط الأنواع البكتيرية الأخرى ، وبالتالي تزويد البكتيريا المضيفة بميزة تنافسية في المجتمعات الميكروبية15. بالإضافة إلى دوره في المنافسة ، أظهرت الدراسات أن T6SS يشارك في عمليات خلوية مختلفة ، بما في ذلك الاستعمار البكتيري ، والتكيف البيئي ، وتكوين الأغشية الحيوية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر ونشكر جميع المؤلفين وكذلك المختبر بأكمله على مساعدتهم في الدعم الفني ومراجعة المخطوطات. تم دعم هذا العمل من قبل مشروع Bethune التابع لجامعة Jilin 2024B20 ومشروع تطوير العلوم والتكنولوجيا في مدينة Changchun 23YQ10 والأمراض المزمنة غير السارية - المشروع الوطني للعلوم والتكنولوجيا 2024ZD0529700.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10٪ ، 15٪ SDS-PAGE Gel PreparationKit EpizymePG112-20
° ؛ C فريزرهايرHYCD-290
37 درجة ؛ حاضنة CBluepard181254254
4 درجة ؛ ثلاجة CHaierHYC390-80
° فريزر CHaierDW-86L726G (726L)
لوحة 96 بئرJETTCP010096
AgarBiofrox8211KG001
بيرسلفات الأمونيوم (APS) Thermo7727-54-0
خزانة السلامة البيولوجيةESCOAC2-4S1   ؛
التوازن الإلكترونيSartorius AGBSA124S-CW
جهاز الرحلان الكهربائيBIO-RADPOWER
آلة تقشر الثلجGRANTXB70
مقياس التدفق الخلويBECKMAN COULTERAW38143
قياس التدفق الخلوي تلطيخ البروتينيكPF00018
نظام تصوير جلBIO-RADGel Doc 2000
GlycineZikeZK-L2577
جهاز طرد مركزي عالي السرعةEppendorf5405IN106358
HRP مترافق أرنب / فأر الأجسام المضادة الثانويةproteintechSA00001-2
رطل مرقSolarbioL8291
درجة حرارة منخفضة عالية السرعة أجهزة طردمركزي Thermo17R
الميثانولالحراريR40121
ميكرو الأشعة فوق البنفسجية Vis مقياس الطيفالضوئي الحرارينانو قطرة واحد
الطرد المركزيالصغير allshengMini-6K
قارئ الصفيحة الدقيقةBio-TekH1M
NuPAGE LDS عينة عازلةحراريNP0007
عازلة الفوسفات (PBS)ZikeZK-L1649
معايير البروتين المزدوج البروتينBio-Rad1610374
SDS تحميل العينة العازلةBeyotimepoo15L
مسحوق الحليب الخالي من الدسمالحراريLP0033B
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)Zikezk6885
حمام مائي ترموستاتيJingHongDK-420S
جهاز النقلBio-RadPowerPac HC
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (تريس) ZikeZK-L2557
جهاز الرحلان الكهربائي العموديBio-RadMii-PROTEAN Tetra
PAC1000 محلول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapitein, N., Mogk, A. Type VI secretion system helps find a niche. Cell Host Microbe. 16 (1), 5-6 (2014).
  2. Carruthers, M. D., Nicholson, P. A., Tracy, E. N., Munson, R. S. Jr Acinetobacter baumannii utilizes a type VI secretion system for bacterial competition. PLoS One. 8 (3), e59388(2013).
  3. Kandolo, O., et al. Acinetobacter type VI secretion system comprises a non-canonical membrane complex. PLoS Pathog. 19 (9), e1011687(2023).
  4. Boyer, F., Fichant, G., Berthod, J., Vandenbrouck, Y., Attree, I. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome-wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources. BMC Genomics. 10, 104(2009).
  5. Russell, A. B., Peterson, S. B., Mougous, J. D. Type VI secretion system effectors: poisons with a purpose. Nat Rev Microbiol. 12 (2), 137-148 (2014).
  6. Pogue, J. M., Kaye, K. S., Cohen, D. A., Marchaim, D. Appropriate antimicrobial therapy in the era of multidrug-resistant human pathogens. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 302-312 (2015).
  7. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
  8. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clin Microbiol Rev. 30 (1), 409-447 (2017).
  9. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol Syst Biol. 4, 174(2008).
  10. Weber, B. S., et al. Genetic dissection of the type VI secretion system in Acinetobacter and identification of a novel peptidoglycan hydrolase, TagX, required for its biogenesis. mBio. 7 (5), e01253-e01316 (2016).
  11. Scherzinger, E., et al. Replication of the broad host range plasmid RSF1010: requirement for three plasmid-encoded proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (3), 654-658 (1984).
  12. Weber, B. S., Ly, P. M., Irwin, J. N., Pukatzki, S., Feldman, M. F. A multidrug resistance plasmid contains the molecular switch for type VI secretion in Acinetobacter baumannii. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9442-9447 (2015).
  13. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 10 (unit 10.2A), (2012).
  14. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  15. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends Microbiol. 24 (1), 51-62 (2016).
  16. Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  17. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and regulation of the type VI secretion system. Annu Rev Microbiol. 66, 453-472 (2012).
  18. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes Dev. 21 (5), 601-614 (2007).
  19. Repizo, G. D., et al. Differential role of the T6SS in Acinetobacter baumannii virulence. PLoS One. 10 (9), e0138265(2015).
  20. Lin, J., et al. A Pseudomonas T6SS effector recruits PQS-containing outer membrane vesicles for iron acquisition. Nat Commun. 8, 14888(2017).
  21. Bernard, C. S., Brunet, Y. R., Gueguen, E., Cascales, E. Nooks and crannies in type VI secretion regulation. J Bacteriol. 192 (15), 3850-3860 (2010).
  22. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  23. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
  24. Meighen, E. A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes. Faseb J. 7 (11), 1016-1022 (1993).
  25. Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS One. 5 (8), e12441(2010).
  26. Pletzer, D., et al. The Pseudomonas aeruginosa PA14 ABC transporter NppA1A2BCD is required for uptake of peptidyl nucleoside antibiotics. J Bacteriol. 197 (13), 2217-2228 (2015).
  27. Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J Biol Chem. 265 (27), 16581-16587 (1990).
  28. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Sci Rep. 6, 37246(2016).
  29. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type VI SecretionT6SS ActivityAcinetobacter BaumanniiFluorescence DetectionLuciferase LabelingGFP LabelingFlow CytometryBacterial Killing AssayHcp SecretionTssM Gene
Video Coming Soon

Related Articles