مقالة منهجية

نظام الفيزيولوجيا الدقيقة للقلب لدراسة انتشار Ca2+ عن طريق التحفيز البصري غير الجيني

DOI:

10.3791/67823

⸱

مارس 21, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Center for Nano Science and Technology, Istituto Italiano di Tecnologia, 3Disease Biophysics Group, John A. Paulson School of Engineering and Applied Science, Harvard University, 4Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering “Giulio Natta”, Politecnico di Milano, 5Department of Physics, Politecnico di Milano, 6Department of Physics and Astronomy, University of Bologna

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح استخدام الضوء للتحكم في خلايا القلب وأنسجته التحفيز غير الملامس، وبالتالي الحفاظ على الحالة الطبيعية ووظيفة الخلايا، مما يجعلها نهجا قيما لكل من التطبيقات البحثية والعلاجية الأساسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة للقلب في المختبر موثوقة للغاية للبحث العلمي وتطوير الأدوية والتطبيقات الطبية. على الرغم من قبولها على نطاق واسع من قبل المجتمع العلمي ، إلا أن هذه الأنظمة لا تزال محدودة في طول العمر بسبب عدم وجود تقنيات تحفيز غير جراحية. توفر محولات الطاقة الضوئية طريقة تحفيز فعالة ، حيث تقدم نهجا لاسلكيا بدقة زمنية ومكانية عالية مع تقليل الغزو في عمليات التحفيز. في هذه المخطوطة ، نقدم طريقة بصرية بالكامل لتحفيز واكتشاف نشاط نموذج الفيزيولوجيا الدقيقة للقلب في المختبر. على وجه التحديد ، قمنا بتصنيع أنسجة متباينة الخواص الصفيحية هندسيا عن طريق بذر الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (hiPSC-CMs) التي تم إنشاؤها في ثقافة تعليق المفاعل الحيوي ثلاثية الأبعاد. استخدمنا محول ضوئي ، وهو مشتق من أزوبنزين البرمائية ، المسمى Ziapin2 ، للتحفيز وصبغة Ca2+ (X-Rhod 1) لمراقبة استجابة النظام. توضح النتائج أن Ziapin2 يمكنه تعديل استجابات Ca2+ في النظام المستخدم دون المساس بسلامة الأنسجة أو قابليتها للحياة أو السلوك. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن نهج التحفيز القائم على الضوء يوفر دقة مماثلة مقارنة بالتحفيز الكهربائي ، المعيار الذهبي الحالي. بشكل عام ، يفتح هذا البروتوكول آفاقا واعدة لتطبيق Ziapin2 والتحفيز الضوئي القائم على المواد في أبحاث القلب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر استخدام الضوء لتحفيز الخلايا والأنسجة الحية كمغير كبير لقواعد اللعبة في البحوث الطبية الحيوية ، حيث يوفر قدرات تحفيز بدون لمس بدقة زمنية ومكانيةدقيقة 1،2،3،4،5،6. واحدة من التقنيات الرائدة المستخدمة لجعل الخلايا الحساسة للضوء هي علم البصريات الوراثي ، والذي يتضمن تعديل الخلايا وراثيا للتعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء أو المضخات7،8. أظهر هذا النهج فعالية مثيرة للإعجاب في تنظيم الخلايا داخل الأنسجة الحية. ومع ذلك ، فإن اعتمادها على نقل الجينات الفيروسية أعاق اعتمادها على نطاق واسع في التطبيقات البحثية والسريرية.

للتغلب على هذا القيد ، تم استخدام المواد العضوية وغير العضوية كمحولات طاقة حساسة للضوء لتطوير تقنيات تحفيز غير وراثية قائمة على المواد بوساطة الضوء9،10. أظهرت محولات الطاقة الضوئية العضويةذات البنية النانوية 11،12،13،14،15 مؤخرا نجاحا ملحوظا في تحفيز الاستجابات الخلوية عبر تطبيقات متنوعة ، بما في ذلك الخلايا العصبية وخلايا عضلة القلب وخلايا العضلات والهيكل العظمي.

هنا ، نقترح Ziapin216،17،18 ، وهو مشتق من أزوبنزين ، للتحقيق في انتشار Ca2+ في أنسجة القلب الصفيحية المهندسة هندسيا. يسمح التركيب البرمائي للجزيء بالاستهداف الدقيق لغشاء بلازما الخلية ، بينما يتيح قلب الأزوبنزين الأيزومرة الناجم عن الضوء ، مما يؤدي إلى تغييره التوافقي16،17،18. في خلايا القلب ، يغير هذا الأيزومرة من رابطة الدول المستقلة إلى سمك غشاء البلازما ، مما يؤدي إلى سلسلة من التأثيرات التي تولد جهد فعل ، والتي بدورها تؤدي إلى عملية الإثارة والانكماش19،20،21.

بالإضافة إلى ذلك ، نصف عملية تصنيع منصة هندسية للنمو متباين الخواص لأنسجة القلب22 ونفصل الإعداد التجريبي المستخدم لتحفيز نشاطها ومراقبتها بصريا ، مع التركيز بشكل خاص على اكتساب ديناميكيات Ca2+ داخل الأنسجة23،24. أخيرا ، نقارن الإشارات المكتسبة بتلك التي يتم الحصول عليها من خلال التحفيز الكهربائي ، والذي يعتبر المعيار المرجعي. بشكل عام ، يسلط هذا البروتوكول الضوء على تطبيق محول طاقة جديد مستجيب للضوء في تعزيز فهمنا للسلوك الخلوي للقلب ، خاصة في سياق الأنسجة الهندسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثقافة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hiPSC) المستخدمة هي خط iPSC للذكور البشريين من النوع البري الذي يحتوي على نظام كريسبر / كاس9 المحفز للدوكسيسيكلين (Dox) ، والذي تم إنشاؤه عن طريق إدخال CAGrtTA :: TetO-Cas9 في موضع AAVS1 (Addgene: # 73500). أجريت الدراسة وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى بوسطن للأطفال. تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى قبل مشاركتهم في الدراسة. تم تحفيز توليد خلايا عضلة القلب المشتقة من hiPSC (hiPSC-CMs) كما هو موضح سابقا25،26. سيتم تلخيص البروتوكول بإيجاز في القسم التالي:

1. توليد وتحضير الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

  1. اغسل hiPSCs التي يتم زراعتها في قوارير T75 مرة واحدة باستخدام PBS. افصل الخلايا عن طريق الحضانة بعامل المخلب Versene لمدة 10-15 دقيقة والبذور في أوعية المفاعل الحيوي المعالجة مسبقا بمحلول 1٪ من المادة الخافضة للتوتر السطحي غير الأيونية بكثافة 50 مليون IPSCs / وعاء في 100 مل من وسط E8 مكمل بمثبط ROCK 10 ميكرومتر Y-27632.
  2. اضبط معلمات المفاعل الحيوي التالية: التحريض 60 دورة في الدقيقة ، ودرجة الحرارة 37 درجة مئوية ، ودرجة الحموضة 7 ، وتراكب الغازات (O2 و CO2) عند 3 لتر / ساعة قياسية.
  3. بعد يوم واحد في المزرعة ، تأكد من أن قطر الجسم الجنيني (EB) قد وصل إلى 100-300 ميكرومتر وعالج الخلايا بوسط RPMI الأساسي (وسط RPMI 1640 المكمل ب B27 ناقص الأنسولين) ، الذي يحتوي على 7 ميكرومتر CHIR99021 لمدة 24 ساعة ، متبوعا بتغيير الوسائط إلى RPMI لمدة 24 ساعة أخرى. أضف وسيط RPMI الأساسي الذي يحتوي على 5 ميكرومتر IWR-1-endo لمدة 48 ساعة أخرى لبدء عملية التمايز نحو سلالة القلب. بعد 48 ساعة، قم بتغيير الوسيط مرة أخرى إلى RPMI الأساسي.
  4. في اليوم السابع من التمايز ، استكمل الخلايا المزروعة في وسط RPMI الأساسي بالأنسولين البشري 1: 1,000 (حجم / حجم). قم بتحديث الوسائط كل يومين أو كل يوم مع تغيير متوسط بنسبة 50٪ إذا وصل استهلاك الأكسجين إلى أكثر من 30٪.
  5. في اليوم 15 ، قم بفصل خلايا المفاعل الحيوي إنزيميا لمدة 3 ساعات باستخدام محلول Collagenase II الذي يحتوي على HBSS و Collagenase II (200 وحدة / مل) و HEPES (10 مل) ومثبط ROCK Y-27632 (10 ميكرومتر) و N-benzyl-p-toluenesulfonamide (BTS ، 30 ميكرومتر). للقيام بذلك ، قم أولا بغسل hiPSC-CM EBs المتمايز 2x باستخدام HBSS الدافئ مسبقا واحتضانها في محلول Collagenase II (حجم 200 ميكرولتر من EBs / 12 مل من محلول Collagenase II) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حتى تظهر الخلايا المفردة من تفكك EB الكامل.
  6. أوقف تفاعل التفكك بإضافة حجم متساو من المخزن المؤقت للحجب (RPMI-1640 بدون B27 و DNase II ، مع 6 ميكرولتر من DNase II لكل مل من RPMI-1640) إلى معلق الخلية الواحدة. عد hiPSC-CMs المتمايزة ، أجهزة الطرد المركزي (200 × جم ، 5 دقائق) ، واستعد للتطبيقات النهائية عن طريق تجميد الخلايا عند -80 درجة مئوية في الأيزوبروبانول لمدة 24 ساعة ونقلها إلى خزانات النيتروجين السائل حتى يتم البذر.

2. تصنيع الأنسجة الصفيحية الهندسية

  1. قم بلصق طبقتين من شريط المختبر ، واحدة بيضاء والأخرى زرقاء ، على لوح أكريليك شفاف بسمك 1 مم ومقاوم للخدش والأشعة فوق البنفسجية. باستخدام آلة نقش ليزر CO2 ، قم بقص لوح الأكريليك في دوائر (قطر 20 مم ليناسب 12 ميجاوات) ونمط الرقاقة (مربعات 3 × 7.5 مم ، ثلاثة لكل شريحة) على الشريط كما هو مصمم في برنامج الرسومات المتجهة (على سبيل المثال ، CorelDraw) ؛ معلمات قطع الأكريليك: 100 قوة ، 20 سرعة ، و 1,000 بكسل لكل بوصة ؛ معلمات قطع الشريط: 8 طاقة و 6 سرعات و 1,000 بكسل لكل بوصة. قم بإزالة طبقتين من الشريط اللاصق داخل الخط الأعمق باستخدام ملاقط ، وانقع الرقائق في مبيض نقي لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة لإزالة الخطوط السميكة والبقع الداكنة من القطع ، وترك خط حاد ، واشطف الرقائق في دورق بالماء منزوع الأيونات (DI) طوال الليل أو لمدة 3 ساعات على الأقل.
    ملاحظة: لا تقم بالتبييض لمدة تزيد عن ساعتين ، لأن ذلك سيؤدي إلى حفر المواد اللاصقة على الجدران الجانبية ، مما يمنع الجيلاتين من الالتصاق بشكل صحيح.
  2. قم بتقطيع الرقائق لمدة 10 دقائق وطوابع polydimethylsiloxane (PDMS ، Sylgard 184) بميزات أخدود الخط (عرض حافة 25 ميكرومتر ، وعرض أخدود 4 ميكرومتر ، وعمق أخدود 5 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة في 70٪ إيثانول نظيف. انقل الرقائق والطوابع إلى منطقة نظيفة تحت غطاء المحرك واتركها تجف تحت تدفق الهواء لمدة ~ 1-2 ساعة.
  3. وزن 1 جم من الجيلاتين من جلد الخنازير (قوة الجل ~ 175 جم بلوم ، النوع أ) في أنبوب سعة 50 مل. أضف 5 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) واخلطه جيدا لضمان الذوبان الفوري للجيلاتين. ضع الأنبوب في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإكمال عملية الذوبان. وبالمثل ، قم بوزن 1 جم من ترانسجلوتاميناز الميكروبات (MTG) في أنبوب منفصل سعة 50 مل. أضف 12.5 مل من PBS ، واخلطها جيدا ، ثم ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لضمان الذوبان الكامل ل MTG.
  4. قم بتوصيل أنبوب الجيلاتين لمدة 15 دقيقة ، ثم أعده إلى الحمام المائي 65 درجة مئوية قبل الاستخدام. ضع أنبوب MTG في مجفف مع فك الغطاء قليلا وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية ببطء. لاحظ الفقاعات التي تتم إزالتها من محلول MTG تحت الفراغ. بعد التفريغ ، أعد أنبوب MTG إلى الحمام المائي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: راقب العملية واضبط الفراغ لتجنب الغليان القوي.
  5. قم بتغطية ورقة شبكية ببارافيلم نظيف ، ضع الرقائق على الشبكة ، واحتفظ بالختم في مكان قريب جاهز للاستخدام. أضف 5 مل من MTG إلى 5 مل من محلول الجيلاتين ، مع سحب العينة بعناية لتجنب الفقاعات ؛ بعد ذلك، قم بسحب الجيلاتين بسرعة على الرقاقة، باستخدام ما يكفي لتغطية مساحة الرقاقة (حوالي 0.5 مل لكل منهما). بعد ذلك ، ضع ختم PDMS22 المزخرف بالخط (عرض الخط 25 ميكرومتر ، الارتفاع 5 ميكرومتر ، التباعد 4 ميكرومتر) في الأعلى وقم بتطبيق وزن 200 جرام لضمان أن الجيلاتين منقوش بالتوازي مع المحور الطولي للأنسجة. بمجرد تشكيل جميع الرقائق ، قم بتغطيتها بوعاء زجاجي لتجنب الاضطرابات البيئية واتركها متشابكة طوال الليل.
    ملاحظة: استخدم المحلول المختلط الجيلاتين-MTG في غضون 5 دقائق ؛ خلاف ذلك ، سيتم تغيير النمط المستهدف بسبب حالة الترابط الأعلى للجيلاتين.
  6. انقل شطيرة الرقائق وختم PDMS إلى طبق P150 جديد مملوء ب PBS وترطيب الجيلاتين لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة لتسهيل فصل ختم PDMS عن الشريحة. قم بإزالة أي جيلاتين زائد غير مصبوب حول الرقاقة وانقل الشريحة النظيفة إلى طبق P150 جديد مليء ب PBS. قم بتخزين طوابع PDMS في 70٪ إيثانول.
  7. عقم الرقائق عن طريق نقعها في الإيثانول لمدة 10 دقائق تحت غطاء المحرك.
    ملاحظة: لا تتجاوز 10 دقائق في الإيثانول ، لأن التعرض الأطول قد يؤدي إلى تشويه الجيلاتين.
  8. انقل الرقائق إلى PBS ، وانقعها لمدة 10 دقائق ، ثم اشطفها 3 مرات. قم بإعداد محاليل الطلاء عن طريق خلط 20 ميكروغرام / مل من الفيبرونيكتين مع مصفوفة غشاء القاعدية المخففة 1: 100 في وسائط الاستزراع (حوالي 0.5 مل لكل بئر). قم بتغطية الرقائق لمدة ساعتين في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  9. قم بإذابة الجليد والبذور (8 × 105 hiPSC-CMs لكل سم2) في وسط RPMI ب Y-27632 (10 ميكرومتر) ، ثم استبدلها ب RPMI بدون Y-27632 بعد 24 ساعة.
  10. بعد ثلاثة أيام من بذر الخلايا ، قم بإزالة الشريط الأبيض باستخدام الملقط.

3. توليف وتطبيق محول الطاقة الضوئي

ملاحظة: تم تصنيع Ziapin2 وفقا لإجراء منشور سابقا16،18 وتم إعطاؤه ل hiPSC-CMs مباشرة في وسط الاستزراع.

  1. أضف 25 ميكرومتر من Ziapin2 إلى مزرعة الخلية واحتضنه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 7 دقائق.
  2. اغسل الجزيئات الزائدة برفق واشطفها بوسط زراعة طازج.

4. فحص الجدوى

ملاحظة: Alamar Blue هو اختبار قائم على الريزازورين يمكنه اختراق الخلايا ويعمل كمؤشر أكسدة واختزال لمراقبة صلاحية الخلية. يذوب Resazurin في المخازن المؤقتة الفسيولوجية ، مما ينتج عنه محلول أزرق غامق يضاف مباشرة إلى الخلايا في المزرعة. تقلل الخلايا القابلة للحياة ذات التمثيل الغذائي النشط من الريزازورين إلى ريسوفورين ، وهو وردي وفلورسنت.

  1. خلايا صفيحة في صفيحة 96 بئرا مغلفة مسبقا ب 20 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين و 1: 100 مصفوفة غشاء القاعدي المخففة في وسط الاستزراع. تخلط عن طريق الرج ثم تضاف Alamar Blue إلى كل بئر بكمية تساوي 10٪ من حجم البئر.
  2. احتضن الثقافات مع Alamar Blue لمدة 4 ساعات.
  3. عالج الخلايا باستخدام محول الطاقة الضوئي والمركبة (DMSO) كما هو موضح سابقا. قم بتطبيق التحفيز الضوئي (ضوء نابض 1 هرتز لمدة دقيقة واحدة) من خلال ألياف ضوئية (سماوي ، 470 نانومتر) لتقييم تأثير استيعاب Ziapin2 والتعرض للضوء على قابلية hiPSC-CM للبقاءة.
  4. اقرأ التألق باستخدام قارئ الألواح عند الإثارة 560 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر.

5. تقييم تباين أنسجة القلب الصفيحية الهندسية

ملاحظة: يحدد هذا البروتوكول نهجا منهجيا لتقييم تباين أنسجة القلب الصفيحية المهندسة باستخدام التلوين المناعي والفحص المجهري متحد البؤر وتحليل النوى27.

  1. اغسل الركيزة باستخدام PBS عدة مرات قبل التثبيت باستخدام 4٪ (v / v) paraformaldehyde يحتوي على 0.05٪ (v / v) Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق.
  2. منع الارتباط غير المحدد عن طريق احتضان العينات التي تحتوي على 5٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS لمدة 30 دقيقة.
  3. احتضان العينات باستخدام Hoechst (1: 500) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  4. يغسل باستخدام PBS قبل التركيب على شرائح المجهر باستخدام عامل مضاد للبهتان. اتركي الشرائح تجف طوال الليل واحفظيها على حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  5. صور عينات باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار بتكبير 20x. حدد اتجاه الخلايا باستخدام OrientationJ Measure28 ، وهو مكون إضافي FiJi.

6. تسجيلات رسم الخرائط البصرية

ملاحظة: تم إجراء رسم الخرائط البصرية بعد 5 أيام في الثقافة على hiPSC-CMs المصنفة على رقائق الأنسجة المصبوبة بالجيلاتين.

  1. لاتباع هذا البروتوكول ، تأكد من أن جهاز رسم الخرائط البصرية يتكون من مجهر عدسات ترادفية معدل مزود بكاميرا عالية السرعة ومصدر ضوء الإثارة ، مصباح زئبق 200 ميجاوات. ضع مرآة ثنائية اللون أمام كاميرا التصوير Ca2+ المخصصة للتأكد من تعرض المستحضر لضوء الإثارة وجمع التألق المنبعث القادم من العينة.
  2. احتضان العينة ب 2 ميكرومتر X-Rhod 1 مضاف إلى وسط الاستزراع لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: قم بتعريض العينة للضوء فقط أثناء الحصول على الصورة لتجنب التبييض الضوئي للصبغة.
  3. احتضان المغذ الضوئي كما هو موضح سابقا في القسم 3.
  4. اغسل بوسط زراعة طازج وانقل الرقائق إلى وسط RPMI 1640 الخالي من الفينول الأحمر المكمل ب B27 مطروحا منه الأنسولين.
  5. ضع رقائق المناديل في طبق يتم التحكم في درجة حرارته وابدأ التسجيل عند درجة حرارة فسيولوجية (37 درجة مئوية) ، واحصل على صور بمعدل إطارات يبلغ 2.5 إطارا / ثانية.
  6. للسرعة البصرية ، قم بتطبيق تحفيز النقطة البصرية في أحد طرفي الأنسجة باستخدام مصدر ضوء LED (465/25 نانومتر) مما يسمح بتحفيز Ziapin2. قم بتسريع الأنسجة بتردد 0.5 أو 1 هرتز عبر ألياف ضوئية منظمة مؤقتا موضوعة على بعد 1 مم من الأنسجة. بالنسبة للسرعة الكهربائية ، قم بتطبيق تحفيز نقطي باستخدام قطب كهربائي ثنائي القطب من البلاتين الموجود في وسط الطرف البعيد من النسيج المستطيل. يضمن هذا الموضع أن انتشار موجة Ca2+ ينشأ من نقطة منتصف عرض الأنسجة ، والتي تتوافق مع الجانب الأقصر من المستطيل. يجب تطبيق التحفيز بتردد 0.5 هرتز ، بسعة 10 فولت ومدة نبضة 100 مللي ثانية.
  7. بعد التسجيلات ، قم بتطبيق مرشح مكاني بحجم 3 × 3 بكسل لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  8. حدد سرعة توصيل الموجة Ca2+ عند كل بكسل لكل نبضة ، مع حساب معدل التغيير على طول كلا الاتجاهين x و y. للقيام بذلك ، قم بقياس التدرج المكاني لشدة إشارة Ca2+ في هذه الاتجاهات وربطه بالتأخير الزمني لانتشار الإشارة. من خلال الجمع بين معدلات التغيير الاتجاهي هذه ، حدد مدى سرعة انتقال الموجة عبر المجال الخلوي في كلا البعدين.

7. تصدير البيانات ومعالجتها

  1. استخراج البيانات وتحليلها باستخدام البرنامج المشار إليه.
  2. قم بتطبيق مرشح مكاني بحجم 3 × 3 بكسل لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  3. استخرج آثار Ca2+ العابرة (CaT) كمتوسط لمنطقة اهتمام محددة يدويا (ROI).
  4. قم بقياس معلمات CaT في منطقة مركزية ذات أهمية (ROI) تبلغ 50 × 50 بكسل (≈ 25 مم2).
  5. لكل CaT ، قم بتحليل سعة CaT ، ووقت الارتفاع (ذروة t) ، ووقت أقصى منحدر للاضمحلال (أقصى منحدر للاضمحلال) ، والوقت حتى 90٪ من الاضمحلال العابر (وقت الاضمحلال90).

8. التحليل الإحصائي

  1. تقييم طبيعية التوزيع باستخدام اختبار إحصائي مناسب ، مثل اختبار الحالة الطبيعية ، لتحديد ما إذا كان يجب تطبيق الطرق البارامترية أو غير المعلمية.
  2. تقييم الدلالة الإحصائية بين شرطين باستخدام اختبار Student's t أو Mann-Whitney U-test للبيانات المستمرة أو الفئوية ، على التوالي. عند مقارنة أكثر من مجموعتين ، استخدم ANOVA أحادي الاتجاه أو اختبار Kruskal-Wallis اعتمادا على افتراضات البيانات ، متبوعا باختبارات لاحقة مناسبة لتحديد الاختلافات الزوجية الكبيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير وتنفيذ عملية متعددة الخطوات لتصنيع أنسجة القلب الصفيحية الهندسية باستخدام مزيج من الزخرفة بالليزر ، وقولبة الجيلاتين ، وتقنيات بذر الخلايا. تم إنشاء هذه التقنية في الأصل من قبل McCain et al.22 و Lee et al.24 ، وأعيد تنفيذ هذه التقنية ، باتباع بروتوكولاتهم لبناء الأنسجة الدقيقة الصفيحية الهندسية. تدمج العملية الزخرفة الدقيقة القائمة على الليزر للتوجيه الهيكلي ، والجيلاتين كمادة سقالة ، وبذر الخلايا المتحكم فيه لخلق بيئة أنسجة محاكاة حيوية. (الشك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا النهج منصة قوية للنهوض بأبحاث القلب ، مما يوفر رؤى حول الديناميكيات المعقدة لأنسجة القلب مما يفتح إمكانيات جديدة للدراسات الميكانيكية القلبية طويلة المدى في المختبر التي يمكن أن تؤدي إلى استراتيجيات علاجية جديدة. لضمان نجاح هذه المنهجية ، من الأهمية بمكان إعادة إنتاج بيئة فيزيولوجية دقيقة تحاكي عن كثب ظروف القلب البشري في الجسم الحي . لذلك ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لتصميم ومحاذاة الأنسجة لتكرار تباين الخواص الطبيعي لبنية القلب ، وهو أمر حيوي للتوصيل الكهربائي الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CB و GL و FL هم مخترعون رقم براءة اختراع "المركبات الضوئية". EP 3802491 (02/07/2020).

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون بامتنان مايكل روزناخ على الرسوم التوضيحية في الشكل 1 والشكل 3 ، والبروفيسور ويليام تي بو على إمداد hiPSC. تم دعم هذا العمل من قبل اتحاد رقائق الأنسجة NCATS (UH3 TR003279) إلى KKP ، ووزارة الجامعات والبحث الإيطالية من خلال مشروع PRIN 2022 (ID 2022-NAZ-0595) إلى FL ، ومشروع PRIN 2020 (ID 2020XBFEMS) إلى CB و GL ، ومشروع Fondo Italiano per la Scienza (ID FIS00001244) إلى GL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف جدوى الخلية الزرقاءالحراري فيشر العلميDAL1025مقايسة الجدوى الخلية
B-27 الملحق ، ناقص الأنسولينثيرمو فيشر A1895601 العلميلزراعة الخلايا
ألبومين مصل الأبقارسيجما-ألدريتشA9056-50Gلتلوين الخلايا
برنامج محلل BrainVision منتجات الدماغhttps://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/تصدير البيانات والتعامل
معها BTSSigma203895-5MG
CHIR99021تقنيات الخلايا الجذعية72054
لوح أكريليك واضح مقاوم للخدش والأشعة فوق البنفسجية ، 12 بوصة × 12 بوصة × 0.01 بوصةماكماستر كار4076N11تصنيع رقائق
الأنسجة الكولاجيناز النوع الثاني & nbsp ؛ورثينجتونCLS-2 / LS004176
DNase IIVWR89346-540
أساسي 8 متوسط Thermo FisherScientific A1517001لزراعة الخلايا
FibronectinVWR47743-654طلاء
الجيلاتين من قوة جل جلد الخنازير 175 نوع ASigma-AldrichG2625-100Gتصنيع رقائق الأنسجة
Geltrex LDEV خالي من hESC ، مخفض عامل النمو مصفوفة غشاء القاعدةThermo Fisher ScientificA1413302
Coating HBSS ثيرمو فيشر14175-095
هيبس (1 م)ثيرمو فيشر 15630080
هوشست 33342 تقنيات الحياةH1399لتلوين الخلايا
محلول الأنسولين البشريسيجما ألدريتشI9278-5ML
IWR-1-endoتقنيات الخلايا الجذعية72564
بارافورماديهايد 16٪ محلول مائي (PFA) VWR100503-917لتلوين الخلايا
PBS ، معقم ، 500 ملThermo Fisher Scientific10010049تصنيع رقائق الأنسجة
ملحي مخزن بالفوسفاتThermo Fisher Scientific10010049
Pluronic F-127 (محلول 20٪ في DMSO)Thermo Fisher ScientificP3000MPالخافض للتوتر السطحي غير الأيوني
مثبط ROCK Y-27632تقنيات الخلايا الجذعية72304
RPMI 1640 متوسط ، مكمل GlutaMAX61870127 علمي لزراعةالخلايا
RPMI 1640 متوسط ، بدون فينول أحمرThermo Fisher Scientific11835030رسم الخرائط البصرية
Versene SolutionThermo Fisher Scientific15040066عامل مخلب
VWR شريط وضع العلامات على المختبر للأغراض العامةVWR89098-058تصنيع رقائق الأنسجة
X-Rhod-1 AMThermo Fisher ScientificX14210رسم الخرائط البصرية
علمي محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Maria, F., Lodola, F., Zucchetti, E., Benfenati, F., Lanzani, G. The evolution of artificial light actuators in living systems: from planar to nanostructured interfaces. Chem Soc Rev. 47 (13), 4757-4780 (2018).
  2. Manfredi, G., et al. The physics of plasma membrane photostimulation. APL Mater. 9 (3), 030901(2021).
  3. Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int J Nanomed. 9 Suppl 1 (Suppl 1), 65-83 (2014).
  4. Ford, S. M., Watanabe, M., Jenkins, M. W. A review of optical pacing with infrared light. J. Neural Eng. 15 (1), 011001(2018).
  5. Antognazza, M. R., et al. Shedding light on living cells. Adv Mater. 27 (46), 7662-7669 (2015).
  6. Zhang, J., Wang, J., Tian, H. Taking orders from light: progress in photochromic bio-materials. Mater Horiz. 1 (2), 169-184 (2014).
  7. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  8. Ambrosi, C. M., Entcheva, E. Optogenetics' promise: pacing and cardioversion by light. Future Cardiol. 10 (1), 1-4 (2014).
  9. Hopkins, J., et al. Photoactive organic substrates for cell stimulation: Progress and perspectives. Adv Mater Technol. 4 (5), 1800744(2019).
  10. Vurro, V., Venturino, I., Lanzani, G. A perspective on the use of light as a driving element for bio-hybrid actuation. Appl Phys Lett. 120 (8), 080502(2022).
  11. Bruno, G., et al. All-optical and label-free stimulation of action potentials in neurons and cardiomyocytes by plasmonic porous metamaterials. Adv Sci. 8 (21), 2100627(2021).
  12. Ronchi, C., et al. Nongenetic optical modulation of pluripotent stem cells derived cardiomyocytes function in the red spectral range. Adv Sci. 11 (3), 2304303(2023).
  13. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  14. Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nat Protoc. 14 (5), 1339-1376 (2019).
  15. Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (45), 22531-22539 (2019).
  16. DiFrancesco, M. L., et al. Neuronal firing modulation by a membrane-targeted photoswitch. Nat Nanotechnol. 15 (4), 296-306 (2020).
  17. Paternò, G. M., et al. Membrane environment enables ultrafast isomerization of amphiphilic azobenzene. Adv Sci. 7 (8), 1903241(2020).
  18. Vurro, V., et al. Molecular design of amphiphilic plasma membrane-targeted azobenzenes for nongenetic optical stimulation. Front Mater. 7, 631567(2021).
  19. Vurro, V., et al. Optical modulation of excitation-contraction coupling in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. iScience. 26 (3), 106121(2023).
  20. Vurro, V., et al. Light-triggered cardiac microphysiological model. APL Bioeng. 7 (2), 026108(2023).
  21. Florindi, C., et al. Role of stretch-activated channels in light-generated action potentials mediated by an intramembrane molecular photoswitch. J. Transl. Med. 22 (1), 1068(2024).
  22. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).
  23. Park, S. -J., et al. Insights into the pathogenesis of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia from engineered human heart tissue. Circulation. 140 (5), 390-404 (2019).
  24. Lee, K. Y., et al. An autonomously swimming biohybrid fish designed with human cardiac biophysics. Science. 375 (6581), 639-647 (2022).
  25. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  26. Prondzynski, M., et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 15 (1), 5929(2024).
  27. Pasqualini, F. S., Sheehy, S. P., Agarwal, A., Aratyn-Schaus, Y., Parker, K. K. Structural phenotyping of stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Rep. 4 (3), 340-347 (2015).
  28. Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40 (7), 2552-2556 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Ziapin2

مقالات ذات صلة