يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تعزيز التمثيل الضوئي وكفاءة استخدام المياه في قصب السكر المعدل وراثيا الذي يعبر عن نبات الأرابيدوبسيس DREB1A تحت إجهاد الجفاف

743 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67861

⸱

أكتوبر 3, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Agricultural Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering College, Pakistan Institute of Engineering and Applied Sciences (NIBGE-C, PIEAS), 2National Agricultural Research Center (NARC), 3Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences, Superior University, 4Department of Laboratory & Blood Bank, Dr. Sulaiman Al Habib Medical Group, Qassim 51431, Saudi Arabia, 5Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, University of the Punjab, 6Department of Biology, College of Science, Princess Nourah bint Abdulrahman University, P.O. Box 84428, Riyadh 11671, Saudi Arabia, 7Institute of Molecular Biology and Biotechnology (IMBB), The University of Lahore, 8School of Life Sciences, Nantong University

في هذه المقالة

ملخص

تقيم هذه الدراسة تحمل الجفاف بوساطة نبات الأرابيدوبسيس DREB1A في قصب السكر المعدل وراثيا. تحت الضغط ، لوحظ تحسين عملية التمثيل الضوئي وكفاءة استخدام المياه وتراكم الكتلة الحيوية. أظهر DR-21 أعلى تعبير DREB1A ، مما أدى إلى تحسين القدرة على الصمود في مواجهة الجفاف. توفر النتائج رؤى حول الآليات الجزيئية وتقدم استراتيجية محتملة لتطوير أصناف قصب السكر المقاومة للمناخ في المناطق المحدودة المياه.

الملخص

يفرض إجهاد الجفاف قيودا خطيرة على إنتاجية قصب السكر ، مما يستلزم تطوير أصناف مقاومة للإجهاد من أجل الزراعة المستدامة. تهدف هذه الدراسة إلى تعزيز تحمل الجفاف في قصب السكر من خلال إدخال جين نبات الأرابيدوبسيس DREB1A تحت سيطرة محفز rd29A المحفز للإجهاد. تم إنشاء خطوط قصب السكر المعدلة وراثيا عن طريق التحول بوساطة قصف الجسيمات وتم تقييمها لاحقا من خلال التقييمات الجزيئية والفسيولوجية والزراعية في ظل ظروف خاضعة للرقابة ومجهدة الجفاف.

أكد التحليل الجزيئي تكاملا مستقرا للجينات المعدلة وراثيا ، حيث تظهر الخطوط المعدلة وراثيا زيادة تصل إلى 10 أضعاف في تعبير DREB1A بالنسبة للنباتات البرية. أظهرت التقييمات الفسيولوجية أنه في ظل إجهاد الجفاف عند 60٪ من السعة الميدانية (FC) ، حافظت الخطوط المعدلة وراثيا على معدلات التمثيل الضوئي (PN) التي كانت أعلى بنسبة 224-270٪ ، وزادت التوصيل الفمي (gs) بنسبة 84-167٪ ، وتم تعزيز محتوى الماء النسبي (RWC) بنسبة 25-31٪ مقارنة بالضوابط غير المعدلة وراثيا. علاوة على ذلك ، أظهرت أوراق قصب السكر المعدل وراثيا تنظيما تناضحايا محسنا وكفاءة استخدام المياه. كشفت التقييمات الزراعية أيضا عن تحسينات كبيرة في نمو النبات وإنتاجيته. تحت إجهاد الجفاف (60٪ FC) ، أظهرت الخطوط المعدلة وراثيا ارتفاعا أكبر من قصب السكر بنسبة 76-109٪ ، مع قطر قصب أكبر بنسبة 71-86٪. زادت الكتلة الحيوية للبراعم بنسبة 39-87٪ ، وتم تعزيز الكتلة الحيوية الجذرية بنسبة 65-103٪.

بالإضافة إلى ذلك ، زادت نسبة Brix ، التي تدل على تراكم السكروز ، بنسبة 36-55٪ في النباتات المعدلة وراثيا عند 60٪ FC. تثبت هذه النتائج ارتباطا قويا بين تعبير DREB1A ، وتعزيز المرونة الفسيولوجية ، وتحسين الأداء الزراعي في ظل ظروف الجفاف. إن قدرة قصب السكر المعدل وراثيا العابر DREB1A على الحفاظ على نشاط التمثيل الضوئي العالي ، والكفاءة الفائقة في استخدام المياه ، وزيادة تراكم الكتلة الحيوية تؤكد إمكاناته كاستراتيجية وراثية لتطوير أصناف قصب السكر المقاومة للجفاف. تقدم هذه الدراسة رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء تحمل الجفاف وتوفر نهجا واعدا لضمان زراعة قصب السكر المستدامة في المناطق التي تعاني من ندرة المياه.

المقدمة

قصب السكر (Saccharum officinarum L.) هو ثاني محصول نقدي رئيسي في باكستان ، ويزرع بشكل أساسي بسبب محتواه العالي من السكروز. ومع ذلك ، نادرا ما يتحقق الإنتاج الأمثل بسبب النقص الدوري في المياه1،2. وهو عضو في عائلة عشب Poaceae ويتم تجميعه في كليد PACCAD من الفصيلة الفرعية Panicoideae3. غالبا ما يشار إلى أعضاء هذا الكليد باسم أعشاب الموسم الدافئ ويعرضون نظام التمثيل الضوئي C4 4. الوضع الأساسي لتثبيت ثاني أكسيد الكربون2 في قصب السكر هو التمثيل الضوئي C4 مع الحد الأدنى من التنفس الضوئي5. يمكن لأعشاب C4 ، مثل قصب السكر ، إصلاح ثاني أكسيد الكربون2 أكثر من أعشاب C3 ، مما ينتج عنه مستويات أعلى من السكروز ويظهر كفاءة أفضل في استخدام النيتروجين (NUE) وكفاءة استخدام المياه (WUE) 6،7،8. ومع ذلك ، فإن متطلبات رطوبة التربة لقصب السكر عالية جدا9،10،11.

نظرا لتغير المناخ ومحدودية توافر المياه ، فإن إنتاج أصناف قصب السكر عالية الغلة التي تتحمل الإجهاد المائي أمر بالغ الأهمية12،13،14. تحمل النبات للإجهاد المائي هو سمة متعددة الجينات تتأثر بشدة الإجهاد ووقته ومدته. نظرا للموقع الجغرافي لباكستان (30.3753 درجة شمالا ، 69.3451 درجة شرقا) ، فإن ممارسات التربية التقليدية غير مجدية بسبب انخفاض الإزهار وقابلية حبوب اللقاح15. لذلك ، يعتمد تحسين الأصناف من خلال التربية التقليدية على التباين الجيني والاختيار اللاحق للسمات الزراعية المرغوبة16. في هذا السياق ، يعد تحويل الجينات المرتبطة بالإجهاد من خلال الهندسة الوراثية أحد أكثر الأساليب البديلة الواعدة لتحسين تحمل إجهاد النبات17،18،19.

يتم تنظيم استجابات الإجهاد اللاأحيائي في النباتات من خلال عائلات عوامل النسخ المتعددة (TF) والعناصر المؤثرة في رابطة الدول المستقلة ، بما في ذلك WRKY و MYB و bHLH و ERF و NAC. تنظم TFs هذه الشبكات في الضبط التناضحي ، وكسح أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وتنظيم الفم ، ومسارات إشارات الإجهاد20،21،22،23،24،25،26. على سبيل المثال ، تعدل WRKY TFs إشارات الإجهاد عبر المسارات المعتمدة على ABA ، بينما تنظم بروتينات MYB التخليق الحيوي للفلافونويد ووظيفة الفم تحت إجهاد الجفاف27. وبالمثل ، تتفاعل عوامل bHLH و ERF مع إشارات الإيثيلين ، وبالتالي تعزيز القدرة على الصمود في وجه الجفاف28. نظرا لتعقيد الاستجابات للإجهاد ، فإن استهداف المنظمين الرئيسيين مثل DREB1A هو استراتيجية واعدة لتعزيز تحمل الجفاف.

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في دور نبات الأرابيدوبسيسDREB1A في قصب السكر المعدل وراثيا ، مع التركيز على تأثيره على عملية التمثيل الضوئي والعلاقات المائية وسمات الغلة في ظل ظروف الإجهاد المائي. تم الإبلاغ سابقا عن دور بروتينات ربط DRE (DREB) في تعديل تحمل الإجهاد المائي27،29،30. على سبيل المثال ، Kasuga et al. لاحظ أن DREB ينظم بشكل إيجابي تعبير تسلسل DRE في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا31. علاوة على ذلك ، اقترح العديد من الباحثين أن قصب السكر المعدل وراثيا الذي يفرط في التعبير عن DREB1A يظهر تعبيرا تأسيسيا للجينات المسببة للإجهاد ومستويات سكر أعلى من قصب السكر من النوع البري17،28،32،33.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

توليد rd29A: متجه التعبير DREB1A (الشكل 1)
تم تضخيم إطار القراءة المفتوح DREB1A كامل الطول (ORF ، 651 نقطة أساس) من نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا L. cDNA باستخدام بادئات خاصة بالجينات تتضمن مواقع تقييد BamHI و EcoRI: إلى الأمام 5 / -GGC GGATCCATGAACTCATTCTGCT-3 / وعكس 5 / -GGCGAATTCTTAATAACTCCATAACGA-3 /. وبالمثل ، تم تضخيم محفز rd29A (499 نقطة أساس) من الحمض النووي الجيني Arabidopsis باستخدام بادئات تحتوي على مواقع KpnI و BamHI: إلى الأمام 5 / -GCG GGTACCCCTATTAGAACGATTAAGGAG-3 / وعكس 5 / -GGC GGATCCGGTGGTTCCTCTGTTTGATCC-3 /. تم إجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم 25 ميكرولتر يحتوي على 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x PCR ، و 1.5 ملي مولار MgCl2 ، و 0.2 ملي مولار من كل dNTP ، و 0.4 ميكرومتر من كل برايمر ، و 1 وحدة من بوليميراز Taq DNA ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (حوالي 100 نانوغرام للحمض النووي الجيني أو 50 نانوغرام ل cDNA) ، مع إضافة ماء خال من النوكلياز إلى الحجم النهائي. كانت شروط التضخيم لكل من شظايا محفز DREB1A و rd29A على النحو التالي: تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ يليه تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تم حل المنتجات المضخمة على جل الاغاروز بنسبة 0.7٪ وتنقيتها بالهلام باستخدام مجموعة استخراج الجل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

تم استنساخ منتجات تفاعل المتسلسل المروج DREB1A و rd29A المضخمة في ناقل الاستنساخ ، pTZ57R / T ، باستخدام استنساخ TA ، وخضعت المنتجات لتسلسل Sanger للتأكيد. تسلسل DREB1A (رقم الانضمام. AM992886) إلى GenBank (تم إدراج مروج rd29A في مواقع KpnI و BamHI ، وتم إدخال تسلسل ترميز DREB1A في اتجاه مجرى النهر في مواقع BamHI و EcoRI ، وبالتالي استبدال المروج الأصلي 2x35S ووضع DREB1A تحت سيطرة rd29A. تم استئصال الكاسيت النهائي (rd29A :: DREB1A :: CamV) باستخدام KpnIو EcoRV واستنساخه في منطقة T-DNA للناقل الثنائي pGA482 لتوليد البناء المستخدم لتحويل النبات (الشكل 1). بعد تسلسل Sanger الأولي للتحقق من صحة المنتجات المستنسخة ، لم يتم إجراء مزيد من التحقق من التسلسل.

تحليل تسلسل الجينات
باستخدام أداة المعلوماتية الحيوية المشار إليها ، تم إجراء تحليل النشوء والتطور لتسلسل البروتين ل AtDREB1A و DREB1 من 13 نوعا مختلفا من الفلقة الدينية والأحادية ومقارنتها عبر طريقة الانضمام إلى الجيران. تم استرداد تسلسل الأحماض الأمينية من Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) و GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). تم إجراء تحليل محاذاة التسلسل المتعدد باستخدام برنامج Clustal Omega عبر الإنترنت. بمجرد الحصول على التسلسلات الأساسية من Phytozome و GenBank ، لا يلزم المزيد من استرجاع التسلسل.

تحضير المستخلصات ومسدس تحريض الكالس20,34
نمت صنف قصب السكر في الحقل التجريبي في NIBGE ، فيصل أباد. بعد 6 أشهر ، تم استئصال الجزء العلوي من العصا الصحية لاستعادة المنطقة القمية ، والتي تم قصها إلى البرعم الطرفي. في ظل ظروف معقمة ، تم تقشير لفات الأوراق إلى شرائح أسطوانية ~ 5 مم وتعقيم السطح بنسبة 70٪ من الإيثانول. من المنطقة الموجودة فوق النسيج الإنشائي القمي مباشرة ، تم تحضير ما يقرب من 10-15 قرصا قميا (~ 3 مم في الحجم) لكل قصب. تمت زراعة الأقراص على وسط تحريض الكالس (CIM) كما هو موضح سابقا1،20،34. بعد 4-6 أسابيع ، تم زراعة الكالي الجنيني الناتج في CIM جديد لمزيد من التكاثر. ملاحظة: وجد أن استخدام 70٪ من الإيثانول لتطهير الأسطح كاف ، ولم تكن هناك حاجة إلى خطوات تعقيم إضافية.

التحول الجيني ل rd29A: DREB1A في قصب السكر من خلال Gene Gun20،34
تم ترتيب الكالس الجنيني المتكاثر في وسط صفيحة بتري التي تحتوي على CIM. بعد 3 أيام ، تم قصف الكالي بناقل ثنائي قابل للتعبير عن النبات مطلي بالذهب ، pGA482 ، يحتوي على rd29A: DREB1A ، باستخدام PDS-1000 / He مسدس Biolistic كما هو موضح بالتفصيل34. بعد القصف ، تمت زراعة أجزاء صغيرة من الكالي على CIM لمدة 3 أيام ووضعها في الظلام عند 26 ± 2 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم استزراع الكالي على وسط اختيار الكالس (CSM) الذي يحتوي على 60 مجم / لتر من الجينتيسين ، ويتم استزراعه في CSM كل 10 أيام ، ووضعه في الظلام عند 26 ± 2 درجة مئوية.

بعد 30 يوما ، تمت زراعة الكالي السليم على وسط اختيار التجديد (RSM) الذي يحتوي على 60 مجم / لتر من المضاد الحيوي للحصول على البراعم. تم وضع الصفائح في غرفة نمو لمدة 4 أسابيع عند درجة حرارة مضبوطة (26 ± 2 درجة مئوية) ، 16 ساعة / 8 ساعة من فترة الضوء / الظلام ، 500 ميكرولتر م 2 ثانية -1 شدة الضوء ، والرطوبة الخاضعة للرقابة35. تمت زراعة البراعم الصحية المتجددة على وسط اختيار التجذير (RtSM) الذي يحتوي على 60 مجم / لتر من المضاد الحيوي في برطمانات زجاجية ووضعها في غرفة النمو في ظل الظروف المذكورة أعلاه. بعد 4-6 أسابيع ، تم نقل المحولات المفترضة إلى أواني بلاستيكية صغيرة تحتوي على تربة رملية معقمة ووضعها في غرفة النمو في ظل الظروف المذكورة أعلاه. لا يلزم المزيد من الزراعة الفرعية على وسط اختيار الكالس (CSM) بعد 10 أيام.

التأكيد الجزيئي لنباتات قصب السكر المعدلة وراثيا
كما هو موضح سابقا ، تم عزل الحمض النووي الجيني من الأوراق الصغيرة لنباتات قصب السكر المعدلة وراثيا المفترضة باستخدام طريقة استخراج CTAB36. تم تقييم جودة الحمض النووي وتركيزه باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop والرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين العلامة القابل للتحديد nptII (750 نقطة أساس) و DREB1A المعدل للجينات (651 نقطة أساس) باستخدام الاشعال الخاصة بالجينات المدرجة في الجدول 1. احتوى كل تفاعل تفاعل تفاعل PCR سعة 25 ميكرولتر على 1x PCR ، و 2.5 ملي مولار MgCl₂ ، و 0.2 ملي مولار dNTPs لكل منهما ، و 0.4 ميكرومتر من كل برايمر ، و 1 وحدة من بوليميراز Taq DNA ، و ~ 100 نانوغرام من الحمض النووي الجيني ، والماء منزوع الأيونات إلى الحجم. تم تشغيل التفاعلات في جهاز تدوير حراري في ظل الظروف التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية, 58 درجة مئوية ل 30 ثانية, 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية; متبوعا بتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم حل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ وتم تصورها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتأكيد التضخيم. ثم تم نقل النباتات المعدلة وراثيا إيجابية PCR (T0) إلى أواني فخارية كبيرة وتقويتها في بيئة زجاجية خاضعة للرقابة حتى النضج. عند النضج ، تم زرع أجزاء قصب السكر من خمسة أحداث T₁ مؤكدة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل تم اختيارها عشوائيا ونشرها في قطع صغيرة لمدة 12 شهرا لتوليد مجموعات استنساخية كافية لتجربة إجهاد الجفاف. ملاحظة: بمجرد تأكيد جينات nptII و DREB1A ، لم يتم إجراء تضخيم PCR إضافي.

دراسة تعبير DREB1A
تم تحديد التعبير النسبي ل DREB1A في الأوراق المجهدة لنباتات قصب السكر المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR). تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من ~ 100 مجم من أنسجة الأوراق باستخدام كاشف الاستخراج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم التحقق من جودة الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وقياسه باستخدام مقياس الطيف الضوئي. لكل عينة ، تم نسخ 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي عكسيا باستخدام مجموعة تخليق (كدنا) باتباع تعليمات المورد ، مع أوليجو (dT).

تم استخدام (كدنا) الناتج كقالب لتضخيم 188 نقطة أساس DREB1A باستخدام بادئات خاصة بالجينات: إلى الأمام 5'-ACAGAGGAGGTTCGTCGGAGA-3 ' والعكس 5'-GAGTCTCCAAGCCGAGTCAG-3'. احتوى كل تفاعل qPCR 25 ميكرولتر على 12.5 ميكرولتر من 2x SYBR Green qPCR Master Mix ، و 0.4 ميكرومتر من كل برايمر ، و 2 ميكرولتر من (كدنا) المخفف (~ 100 نانوغرام قالب) ، وماء خال من النوكلياز لرفع الحجم إلى 25 ميكرولتر. تم إجراء التفاعلات ثلاث مرات على جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، مع تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

لتأكيد كفاءة وخطية تفاعلات qPCR ، تم إنشاء منحنى قياسي في البداية باستخدام تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من الحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على جزء DREB1A المستنسخ. ومع ذلك ، لتحليل التعبير ، تم إجراء القياس الكمي النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCt 37. كان جين الأكتين بمثابة مرجع داخلي ، وتم تطبيع مستوى التعبير عن DREB1A في كل خط معدل وراثيا إلى مستوى التحكم من النوع البري. تم جمع جميع قيمC t باستخدام إعدادات خط الأساس والعتبة الأوتوماتيكية الموصى بها بواسطة برنامج الأجهزة. تم قبول منحنيات الذوبان ذات القمم المفردة الحادة فقط ، مما يؤكد الخصوصية. كان الحمض النووي الريبي عالي الجودة وغير المتدهور ضروريا للقياس الكمي الدقيق. تم استبعاد عينات الحمض النووي الريبي غير النقية أو المتدهورة لتجنب المساس بموثوقية تخليق (كدنا) وتحليل التعبير الجيني النهائي.

دراسة التغيرات بوساطة DREB1A في قصب السكر: تجربة الإجهاد المائي20،34
بعد عام واحد ، زرعت ثلاث نسخ مكررة من خمسة أجزاء من قصب السكر (عقدتان / جزء) من النباتات المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا (النوع البري) على عمق 5 سم في أواني ترابية تحتوي على 18 كجم من التربة (ECe 1.34; ريال 2.72; درجة الحموضة 7.8). تم تطبيق ثلاثة أنظمة للإجهاد المائي: 100 و 80 و 60٪ FC (الجدول 2). تمت دراسة نشاط التمثيل الضوئي لقصب السكر (PN و E و gs) والعلاقات المائية النباتية (Ψw و Ψs و RWC) بعد 12 شهرا. لا تغير أنظمة المياه المعمول بها ، لأنها ستؤثر على اتساق العلاجات.

تحديد نشاط التمثيل الضوئي
بعد 180 يوما من الإجهاد المائي ، تم قياس معلمات تبادل الغازات - معدل التمثيل الضوئي (PN) ، ومعدل النتح (E) ، والتوصيل الفموي (gs) - في كل من نباتات قصب السكر المعدلة وراثيا والنباتات البرية باستخدام نظام التمثيل الضوئي المحمول باليد. تم أخذ القياسات بين الساعة 09:00 و 11:00 صباحا باستخدام الورقة الثالثة الموسعة بالكامل من أعلى كل نبات. تم إدخال الورقة المختارة برفق في حجرة الأوراق الشفافة المدمجة (3 سم2 منطقة المشبك) ، مما يضمن التلامس الكامل دون تجعد أو عائق. تم تسجيل الظروف المحيطة في الوقت الحقيقي بواسطة النظام ، بينما تم الحفاظ على شدة الضوء عند حوالي 1,000 ميكرولتر م 2 ثانية - 1 تحت أشعة الشمس الطبيعية. سمح للجهاز بالتوازن لمدة 30-60 ثانية حتى تم الحصول على قراءات الحالة المستقرة لامتصاص ثاني أكسيد الكربون2 وتبادل بخار الماء. تقوم المستشعرات الداخلية للجهاز تلقائيا بتسجيل درجة حرارة الورقة والرطوبة النسبية وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 المحيط. لكل نمط وراثي ومعالجة ، تم تكرار القياسات على ثلاثة نباتات مستقلة بيولوجيا على الأقل ، وتم تخزين البيانات داخليا ثم تصديرها لاحقا لتحليلها. تم الحرص على الحفاظ على ظروف بيئية متسقة عبر النسخ المتماثلة لضمان موثوقية البيانات.

تحديد إمكانات المياه للأوراق والجهد التناضحي
تم تحديد إمكانات الماء (Ψw) للورقة الثالثة الموسعة بالكامل من أعلى النباتات باستخدام غرفة الضغط من نوع Scholander. ثم تم تجميد الأوراق عند -20 درجةمئوية في أنابيب 1.5 مل ، وتم استخدام عصارة الخلية التي تم الحصول عليها من الأوراق المجمدة لتحليل الجهد التناضحي (Ψs) باستخدام مقياس التناضح.

تحديد المحتوى المائي النسبي للأوراق
تم فحص المحتوى المائي لأوراق النبات المعدلة وراثيا والأوراق البرية بالتفصيل. تم قياس الأوزان الطازجة للأوراق ، وغمر الأوراق في الماء المقطر طوال الليل. بعد ذلك تم تسجيل الوزن المنتفخ للأوراق ، بينما تم تحديد الوزن الجاف عن طريق احتضان الأوراق عند 70 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. تم حساب RWC الورقي باستخدام الصيغة التالية:

figure-protocol-1
ملاحظة: لتحليل الجهد التناضحي بدقة باستخدام مقياس التناضح ، يجب تجميد الأوراق عند -20 درجة مئوية بمجرد تحديد إمكانات الماء.

سمات العائد
تم قياس سمات غلة قصب السكر في مرحلة الحصاد ، مثل ارتفاع القصب (سم) ، القطر ، عدد القصب القابل للطحن ، بريكس (٪) ، والكتلة الحيوية للبراعم والجذور.

التحليلات الإحصائية
تم إجراء التجارب الميدانية (التي تم التحكم فيها باستخدام سياج) باستخدام تخطيط تصميم كتلة كاملة عشوائية مع ثلاث نسخ مكررة لكل معالجة (خمسة نباتات لكل تكرار ؛ ن = 15). تم إجراء تحليل ثنائي الاتجاه للتباين لتحليل التغيرات في السمات الزراعية والفسيولوجية المختلفة عند مستوى معنوي P ≤ 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التوصيف الجزيئي لخطوط قصب السكر المعدلة وراثيا
تم إنشاء كاسيت التعبير rd29A: DREB1A واستنساخه في المتجه الثنائي القابل للتعبير عن النبات pGA482 (الشكل 1) ، والذي تم تحويله بعد ذلك إلى جينوم قصب السكر باستخدام تقنية التحويل بوساطة بيولوجيا ونجح في تطوير نباتات قصب السكر المعدلة وراثيا كما هو موضح (الشكل 2). تم تأكيد وجود الجينات المعدلة والمحولات في خطوط قصب السكر عن طريق تضخيم شظايا 750 نقطة أساس و 651 نقطة أساس الخاصة بعلامة npt...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تطوير تحمل الإجهاد المائي في النباتات أمرا بالغ الأهمية بسبب التوسع المستمر في المناطق المعرضة للجفاف في جميع أنحاء العالم. كنهج ممكن للتكنولوجيا الحيوية ، درسنا دور DREB1A في تحمل الإجهاد المائي في خطوط قصب السكر المعدلة وراثيا. أبلغت الدراسات السابقة عن دور عامل النسخ DREB1A في تحفيز التعبير عن جينات متعددة تمنح التسامح مع الإجهاد اللاأحيائي28،38،39،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

جامعة الأميرة نورة بنت عبدالرحمن الباحثون الداعمون للمشروع رقم (PNURSP2025R39)، جامعة الأميرة نورة بنت عبدالرحمن، الرياض، المملكة العربية السعودية.

توافر البيانات:
يتم توفير جميع البيانات في هذه الورقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ناقلات الاستنساخ ، pTZ57R / Tبيرمنتاس ، فيلنيوس ، ليتوانيا
محلل تبادل الغاز بالأشعة تحت الحمراءبيو راد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
مقياس التناضحبيو راد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
جهاز PCRبيو راد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
PDS-1000 / هو بندقية بيولوجيةشركة ThermoFisher Sceintific ، الولايات المتحدة الأمريكية
PCR في الوقت الحقيقيشركة ThermoFisher Sceintific ، الولايات المتحدة الأمريكية
مجموعة تخليق RevertAid (cDNA)CI-340 ، CID Bio-Science ، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية
غرفة ضغط من نوع شولاندرسكاي إنسترومنتس ، لاندريندود ويلز ، برمنغهام ، المملكة المتحدة
كاشف TRIzolويسكور -5500 ، لوجان ، يوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية

المراجع

  1. Ali, S., et al. Climate change and its impact on the yield of major food crops: evidence from Pakistan. Foods. 6 (6), 39(2017).
  2. Farooq, N., Gheewala, S. H. Water use and deprivation potential for sugarcane cultivation in Pakistan. Journal of Sustainable Energy & Environment. 10, 33-93 (2019).
  3. Grass Phylogeny Working Group. Phylogeny and subfamilial classification of the grasses (Poaceae). Ann Mo Bot Gard. 88 (3), 373-457 (2001).
  4. Gibson, D. Grasses and grassland ecology. , Oxford University Press. New York. (2009).
  5. CarmoSilva, A. E., Powers, S. J., Keys, A. J., Arrabaça, M. C., Parry, M. A. Photorespiration in C grasses remains slow under drought conditions. Plant Cell Environ. 31 (7), 925-940 (2008).
  6. Pinto, H., Powell, J. R., Sharwood, R. E., Tissue, D. T., Ghannoum, O. Variations in nitrogen use efficiency reflect the biochemical subtype while variations in water use efficiency reflect the evolutionary lineage of C4 grasses at interglacial CO2. Plant Cell Environ. 39 (3), 514-526 (2016).
  7. Jobe, T. O., Zenzen, I., Rahimzadeh Karvansara, P., Kopriva, S. Integration of sulfate assimilation with carbon and nitrogen metabolism in transition from C3 to C4 photosynthesis. J Exp Bot. 70 (16), 4211-4221 (2019).
  8. Ye, Z. P., et al. Quantifying light response of leafscale wateruse efficiency and its interrelationships with photosynthesis and stomatal conductance in C3 and C4 species. Front Plant Sci. 11, 374(2020).
  9. Dingre, S., Gorantiwar, S. Determination of the water requirement and crop coefficient values of sugarcane by field waterbalance method in a semiarid region. Agric Water Manag. 232, 106042(2020).
  10. Hess, T. M., et al. A sweet deal? Sugarcane, water and agricultural transformation in subSaharan Africa. Global Environmental Change. 39, 181-194 (2016).
  11. Tammisola, J. Towards much more efficient biofuel crops-can sugarcane pave the way. GM Crops. 1 (4), 181-198 (2010).
  12. Pissolato, M. D., et al. Enhanced nitric oxide synthesis through nitrate supply improves drought tolerance of sugarcane plants. Front Plant Sci. 11, 970(2020).
  13. Diniz, C. A., et al. RB0442drought tolerant sugarcane cultivar. Crop Breed Appl Biotechnol. 19 (4), 466-470 (2019).
  14. Deng, Q., Dou, Z., Chen, J., Wang, K., Shen, W. Drought tolerance evaluation of intergeneric hybrids of BC3F1 lines of Saccharum officinarum × Erianthus arundinaceus. Euphytica. 215 (12), 1-13 (2019).
  15. Shahid, M., Khan, F., Saeed, A., Fareed, I. Variability of red rotresistant somaclones of sugarcane genotype S97US297 assessed by RAPD and SSR. Genet Mol Res. 10 (3), 1831-1849 (2011).
  16. Khan, M. A., et al. Evaluation of new sugarcane genotypes developed through fuzz: correlation of cane yield and yield components. Pakistan J Applied Sci. 3 (4), 270-273 (2003).
  17. De Paiva Rolla, A. A., et al. Phenotyping soybean plants transformed with RD29A:AtDREB1A for drought tolerance in the greenhouse and field. Transgenic Res. 23 (1), 75-87 (2014).
  18. Bihmidine, S., et al. Activity of the Arabidopsis RD29A and RD29B promoter elements in soybean under water stress. Planta. 237 (1), 55-64 (2013).
  19. Chaves, M., Davies, B. Drought effects and water use efficiency: improving crop production in dry environments. Funct Plant Biol. 37 (2), iii-vi (2010).
  20. Raza, G., et al. Overexpression of an H+PPase gene from Arabidopsis in sugarcane improves drought tolerance, plant growth and photosynthetic responses. Turkish J Biol. 40 (1), 109-119 (2016).
  21. Augustine, S. M., et al. Overexpression of EaDREB2 and pyramiding of EaDREB2 with the pea DNA helicase gene (PDH45) enhance drought and salinity tolerance in sugarcane (Saccharum spp. hybrid). Plant Cell Rep. 34 (2), 247-263 (2015).
  22. Reis, R. R., et al. Induced overexpression of AtDREB2ACA improves drought tolerance in sugarcane. Plant Sci. 221 - 222, 59-68 (2014).
  23. Molinari, H. B. C., et al. Evaluation of the stressinducible production of proline in transgenic sugarcane (Saccharum spp.): osmotic adjustment, chlorophyll fluorescence and oxidative stress. Physiologia Plantarum. 130 (2), 218-229 (2007).
  24. Zhang, S. Z., et al. Expression of the Grifola frondosa trehalose synthase gene and improvement of droughttolerance in sugarcane (Saccharum officinarum L.). J Integr Plant Biol. 48 (4), 453-459 (2006).
  25. Iwasaki, T. The dehydrationinducible RD17 (COR47) gene and its promoter region in Arabidopsis thaliana (accession no. AB004872). Plant Physiol. 115, 1287(1997).
  26. YamaguchiShinozaki, K., Shinozaki, K. A novel cisacting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, lowtemperature or highsalt stress. Plant Cell. 6 (2), 251-264 (1994).
  27. Li, X., et al. Heterologous expression of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 gene enhances drought and freezing tolerance in transgenic Lolium perenne plants. Plant Biotechnol Rep. 5, 61-69 (2011).
  28. Saint Pierre, C., Crossa, J. L., Bonnett, D., YamaguchiShinozaki, K., Reynolds, M. P. Phenotyping transgenic wheat for drought resistance. J Exp Botany. 63 (5), 1799-1808 (2012).
  29. Qin, F., et al. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L. Plant J. 50 (1), 54-69 (2007).
  30. Shinozaki, K., YamaguchiShinozaki, K. Molecular responses to drought and cold stress. Curr Opin Biotechnol. 7 (2), 161-167 (1996).
  31. Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S., YamaguchiShinozaki, K., Shinozaki, K. Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stressinducible transcription factor. Nat Biotechnol. 17 (3), 287-291 (1999).
  32. Morran, S., et al. Improvement of stress tolerance of wheat and barley by modulation of expression of DREB/CBF factors. Plant Biotechnol J. 9 (2), 230-249 (2011).
  33. Liu, Q., et al. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNAbinding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and lowtemperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1391-1406 (1998).
  34. Raza, G. Engineering drought tolerance in sugarcane (Saccharum officinarum L.). , QuaidiAzam University. Islamabad, Pakistan. (2013).
  35. Basso, M. F., et al. Improved genetic transformation of sugarcane (Saccharum spp.) embryogenic callus mediated by Agrobacterium tumefaciens. Curr Protoc Plant Biol. 2 (3), 221-239 (2017).
  36. Richards, E., Reichardt, M., Rogers, S. Preparation of genomic DNA from plant tissue. Curr Protoc Mol Biol. 27 (1), 2.3.1-2.3.7 (1994).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  38. Blum, A. Drought resistance, wateruse efficiency and yield potential-are they compatible, dissonant or mutually exclusive. Australian J Agricultural Res. 56 (11), 1159-1168 (2005).
  39. Pinto, R. S., et al. Heat and drought adaptive QTL in a wheat population designed to minimize confounding agronomic effects. Theor Appl Genet. 121 (6), 1001-1021 (2010).
  40. Li, T., et al. a DREBbinding transcription factor from Daucus carota, enhances drought tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana and modulates lignin levels by regulating ligninbiosynthesisrelated genes. Environ Exp Bot. 169, 103896(2020).
  41. Nie, J., et al. The AP2/ERF transcription factor CmERF053 of Chrysanthemum positively regulates shoot branching, lateral root and drought tolerance. Plant Cell Rep. 37, 1049-1060 (2018).
  42. Kasuga, M., Miura, S., Shinozaki, K., YamaguchiShinozaki, K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stressinducible RD29A promoter improved drought and lowtemperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol. 45 (3), 346-350 (2004).
  43. Datta, K., et al. Overexpression of Arabidopsis and rice stressgeneinducible transcription factors confers drought and salinity tolerance to rice. Plant Biotechnol J. 10 (5), 579-586 (2012).
  44. Ravikumar, G., et al. Stressinducible expression of AtDREB1A transcription factor greatly improves drought stress tolerance in transgenic indica rice. Transgenic Res. 23 (3), 421-439 (2014).
  45. BhatnagarMathur, P., et al. Stressinducible expression of AtDREB1A in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) increases transpiration efficiency under waterlimiting conditions. Plant Cell Rep. 26, 2071-2082 (2007).
  46. Qin, F., et al. Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in coldresponsive gene expression in Zea mays L. Plant Cell Physiol. 45 (8), 1042-1052 (2004).
  47. Pellegrineschi, A., et al. Stressinduced expression in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress symptoms under greenhouse conditions. Genome. 47 (3), 493-500 (2004).
  48. Li, X. P., et al. Soybean DREbinding transcription factors that are responsive to abiotic stresses. Theor Appl Genetics. 110, 1355-1362 (2005).
  49. Gao, S. Q., et al. A cotton (Gossypium hirsutum) DREbinding transcription factor gene, GhDREB, confers enhanced tolerance to drought, high salt and freezing stresses in transgenic wheat. Plant Cell Rep. 28, 301-311 (2009).
  50. Dubouzet, J. G., et al. OsDREB genes in rice (Oryza sativa L.) encode transcription activators that function in drought, highsalt and coldresponsive gene expression. Plant J. 33 (4), 751-763 (2003).
  51. Morgan, J. M. Osmoregulation and water stress in higher plants. Annu Rev Plant Physiol. 35, 299-319 (1984).
  52. Gupta, A. S., Berkowitz, G. A. Osmotic adjustment, symplast volume and nonstomatal water stress inhibition of photosynthesis in wheat. Plant Physiol. 85 (4), 1040-1047 (1987).
  53. Gunasekera, D., Berkowitz, G. A. Evaluation of contrasting cellularlevel acclimation responses to leaf water deficits in three wheat genotypes. Plant Sci. 86 (1), 1-12 (1992).
  54. Brini, F., Hanin, M., Mezghani, I., Berkowitz, G. A., Masmoudi, K. Overexpression of wheat Na⁺/H⁺ antiporter TNHX1 and H⁺pyrophosphatase TVP1 improve salt and droughtstress tolerance in Arabidopsis thaliana plants. J Exp Bot. 58 (2), 301-308 (2007).
  55. Vadez, V., Rao, S., Sharma, K., BhatnagarMathur, P., Devi, M. J. DREB1A allows for more water uptake in groundnut by a large modification in the root/shoot ratio under water deficit. Journal of SAT Agricultural Research. 5 (1), 1-5 (2007).
  56. Vadez, V., Rao, J. S., BhatnagarMathur, P., Sharma, K. DREB1A promotes root development in deep soil layers and increases water extraction under water stress in groundnut. Plant Biol. 15 (1), 45-52 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DREB1A
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.