استخدام مكتبات رؤية الكمبيوتر لتبسيط القياس الكمي للنوى

Summary

توضح هذه المقالة طرقا خطوة بخطوة لأتمتة القياس الكمي للنوى المستندة إلى الصور باستخدام برنامج قابل للتنفيذ مفتوح المصدر تم التحقق من صحته عبر مجموعة من كثافات الخلايا. يوفر هذا البرنامج بديلا يعالج الحواجز المتعلقة بالتكلفة ، وإمكانية الوصول للمستخدمين ذوي المهارات التكنولوجية المحدودة ، والتحقق من الصحة الخاصة بالتطبيق التي قد تحد من فائدة التقنيات الحالية.

Abstract

تتطلب فحوصات الخلايا الحية وتحليلات الخلايا المستندة إلى الصور تطبيع البيانات للتفسير الدقيق. الطريقة الشائعة الاستخدام هي تلطيخ النوى وتحديدها كميا ، متبوعا بتطبيع البيانات لعدد النوى. غالبا ما يتم التعبير عن عدد النوى هذا على أنه عدد خلايا للخلايا أحادية النواة. في حين أن القياس الكمي اليدوي يمكن أن يكون شاقا ويستغرق وقتا طويلا ، فقد لا يفضل جميع المستخدمين الطرق المؤتمتة المتاحة ، أو قد تفتقر إلى التحقق من صحة هذا التطبيق المحدد ، أو قد تكون باهظة التكلفة. هنا ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة لالتقاط صور قابلة للقياس الكمي للنوى الملطخة ببقع الحمض النووي الفلورية وبالتالي تحديد النوى باستخدام برنامج آلي لعد الكائنات تم تطويره باستخدام مكتبات رؤية الكمبيوتر Python. نقوم أيضا بالتحقق من صحة هذا البرنامج عبر مجموعة من كثافات الخلايا. على الرغم من أن الوقت المحدد لتنفيذ البرنامج يختلف بناء على عدد الصور وأجهزة الكمبيوتر ، إلا أن هذا البرنامج يدمج ساعات العمل لعد النوى في ثوان لتشغيل البرنامج. بينما تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام صور الخلايا الثابتة والملطخة ، يمكن أيضا قياس صور النوى الملطخة في الخلايا الحية وتطبيقات التألق المناعي باستخدام هذا البرنامج. في النهاية ، يوفر هذا البرنامج خيارا لا يتطلب درجة عالية من المهارة التكنولوجية وهو بديل مفتوح المصدر تم التحقق من صحته لمساعدة علماء الأحياء الخلوية والجزيئية في تبسيط سير عملهم ، وأتمتة المهمة الشاقة والمستهلكة للوقت المتمثلة في قياس النوى.

Introduction

تعد التجارب الوظيفية والقائمة على الصور أمرا بالغ الأهمية لفهم تأثيرات العلاجات التجريبية على الكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء للخلية بأكملها. يعتمد التفسير الصحيح للبيانات من تجارب بيولوجيا الخلية على دقة وقابلية تكرار البروتوكول التجريبي ، بما في ذلك تطبيع البيانات. على سبيل المثال ، تسمح تحليلات استهلاك الأكسجين ومعدلات التحمض خارج الخلية في الخلايا الحية عند خط الأساس وبعد العلاج بأدوية معينة بتقييم الجوانب المختلفة لعملية التمثيل الغذائي للطاقة^1،2. يمكن أن يساعد قياس نشاط الإنزيمات مثل نازعة هيدروجين اللاكتات في المادة الطافية لمزارع الخلايا في تحديد سلامة غشاء الخلية<....

Protocol

ملاحظة: يمكن العثور على الملفات التكميلية على الرابط التالي https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. التقاط الصور وحفظها باستخدام المجهر الفلوري

1. قم بإعداد عينات الخلايا أو الأنسجة ليتم تصويرها ، بما في ذلك تلطيخ صبغة الحمض النووي المرغوبة. للحصول على الصور المستخدمة هنا ، نمت الخلايا العضلية C2C12 (CRL-1772 ، مجموعة الثقافة الأمريكية من النوع الأمريكي) في ألواح مكونة من 6 آبار لمدة 48-72 ساعة في ظل ظروف الاستزراع القياسية (5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 37 درجة مئوية ، مرببة) ، مع أو بدون 50 ملي مولار EtOH⁶ ، ومثبتة في الميثانول المثلج كما هو موضح سابقا

Results

ينتج كل تشغيل للصور الدفعية: 1) مجموعة من ملفات الصور مع الخطوط المطبقة التي توضح الخطوط العريضة للنوى المحددة (الشكل 5) ، و 2) ملف .csv (جدول بيانات) يربط أسماء ملفات الصور والأعداد المرتبطة بها. سيسمح عرض الخطوط للمستخدم بتقييم جودة العد بصريا. على وجه التحديد ، يجب أن تحتوي الصور التي تم الحصول عليها وفقا للقسم 1 على جميع (أو كل تقريبا) النوى المحاطة بخط أخضر صلب يشير إلى أن النواة قد تم عدها بواسطة البرنامج. تم استخدام هذه الخطوط لضبط البرنامج هنا.

Discussion

يتمتع برنامج قياس النوى الخاص بنا بالعديد من المزايا مقارنة بالخيارات الحالية: فهو لا يتطلب سوى الحد الأدنى من المهارات التكنولوجية ، ويتم التحقق من صحته للمهمة المحددة المتمثلة في تحديد كمية النوى ، وهو مفتوح المصدر. هذا الأخير يتغلب على الحواجز المتعلقة بالتكلفة. في النهاية ، يوفر هذا البرنامج لعلماء الأحياء الخلوية والجزيئية خيارا إضافيا لتحديد النوى بسرعة ودقة في الصور الملتقطة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. لا يفضل جميع المستخدمين برامج عد الخلايا أو النوى الآلية المتاحة حاليا ، وب.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
الكمبيوتر الذي يمكنه الوصول إلى ملف النتائج من الطريقة 2 أو 3	-		انظر الخطوة 2.6 (للطريقة 2) أو الخطوة 3.3.9 أو 3.4.9 (للطريقة 3)
الكمبيوتر المزود بإمكانية الوصول إلى الإنترنت ، والمتصفح الحديث	-		على سبيل المثال ، كمبيوتر Google Chrome
مع إمكانية الوصول إلى الإنترنت ، والمتصفح الحديث ، ويختلف نظام التشغيل Windows		لنظام	التشغيل Mac أو Linux أو نظام تشغيل آخر ، استخدم الطريقة 3
الكمبيوتر مع برنامج لالتقاط الصور	Zeiss	AxioVision	برامج أخرى مقبولة ؛ يجب أن تكون متوافقة مع المجهر الفلوري
موقع الملف للإخراج (جدول بيانات النتائج وملامح الصورة)	-		يمكن أن يكون مجلدا جديدا فارغا
المجهر الفلوري	Zeiss	Axiovert 200M	المجاهر المضان الأخرى مقبولة ؛ يجب أن تكون مجهزة بمكعبات الترشيح المناسبة ، والهدف المطلوب ، والكاميرا & nbsp ؛
مجلد يحتوي على جميع الصور المراد تحديدها	كميا -		انظر الخطوة 1.12
الإصدار 3.10 من Python أو أعلى		-	متاح للتنزيل والتثبيت المجاني في https://www.python.org/downloads/  ؛
العينات المراد	تصويرها -		ثابتة أو حية أو ملطخة أو ملطخة بأصباغ الحمض النووي الفلورية
برنامج جداول البيانات	Microsoft	Excel	برنامج جداول البيانات المماثل مقبول أيضا